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PCR
Definicin
La reaccin en cadena de
la polimerasa (PCR) es una
tcnica que permite replicar
entre cientos de miles y
millones de veces, en el
transcurrir de pocas horas e in
vitro, pequeas cantidades de
ADN.
PCR
El aislamiento de grandes cantidades de segmentos especficos de
ADN puede ser realizado utilizando varias tcnicas, una de las cuales
es la Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR).
Componentes de la reaccin:
El tampn (buffer)
Los nucletidos (dNTPs)
Los cebadores (primers)
El ADN (muestra)
La polimerasa (taq Polimerasa)
La polimerasa Taq.
Proceso de la PCR
El proceso que tiene lugar durante la PCR se puede
resumir de la siguiente forma: partiendo de un ADN
molde, una enzima, la ADN Polimerasa incorpora
nucletidos complementarios a partir de la zona de
doble cadena originada por la unin de los cebadores
al molde.
El proceso se da en tres fases: Desnaturalizacin,
hibridacin y elongacin.
Parmetros de la reaccin:
Etapas
Desnaturalizacin
Alineamiento/Unin del cebador
Extensin/Elongacin
de la
cadena
Elongacin Final
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TERMOCICLADOR
12
Desnaturalizacin
Dos pequeos fragmentos de ADN, tpicamente de 10 pares
de bases, llamados primers, son sintetizados a travs de otra
tcnica.
Esos primers son pequeos fragmentos de ADN que son
complementarios a cada una de las extremidades de la
secuencia de ADN de inters.
En un tubo de reaccin son adicionados los primers,
nucletidos libres de todas las bases nitrogenadas (adenina,
guanina,, timina y citosina), el ADN y una enzima especial
resistente al calor llamada Taq polimerasa, que promueve la
sntesis de ADN.
La mezcla es calentada a 95C lo que provoca la
separacin de las dos cadenas de ADN.
Desnaturalizacin
Ocurre cuando las dos cadenas de ADN se separen. Se lleva
a cabo elevando la temperatura a alrededor de 94C. La re
naturalizacin se producir cuando la temperatura disminuya.
Alineamiento(anillamiento)
Enseguida, la mezcla es enfriada hasta 55C, temperatura en
la cual los primers se unirn a las regiones complementarias de
las molculas de ADN que estn separadas.
Alargamiento (polimerizacin)
La temperatura se eleva entonces hasta 72C y la Taq
polimerasa comienza a sintetizar un nuevo ADN, comenzando
por las regiones en doble cadena, en donde cada uno de los
primers se uni al molde de la muestra de ADN. La Taq
polimerasa promueve la sntesis de ADN apenas en la regin
de doble cadena.
La sntesis ocurre a una tasa de aproximadamente 20
nucletidos por segundo, y en un minuto es sintetizada una
nueva copia del fragmento que se quiere analizar.
Cmo se prepara?
VENTAJAS
Tcnica especfica, sino tambin muy sensible, pues en principio
para practicarla bastara una sola molcula, por ejemplo, del
genoma humano ~6 picogramos.
Puede usar como substrato para la reaccin al ADN, sin tener que
purificarlo de su fuente natural, y es comn emplear productos
biolgicos diversos. Muchas veces basta una simple ebullicin de la
muestra para lisar, liberar y de paso desnaturalizar el ADN,
dejndolo listo para la reaccin.
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DESVENTAJAS
APLICACIONES
PREDIAGNSTICO DE ENFERMEDADES
DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES
AMPLIFICACIN DE REGIONES HIPERVARIABLES
INVESTIGACIONES FORENSES
APLICACIONES EN ESTUDIOS EVOLUTIVOS
DIAGNOSTICO DE ENFERMEDADES
INVESTIGACIONES
FORENSES
APLICACIONES
EN
ESTUDIOS EVOLUTIVOS
Mediante
HUELLA DIGITAL
Test de Paternidad
Amplificando por PCR fragmentos polimrficos de
DNA de la madre, del nio y de l o los presuntos
padres, y separndolo mediante electroforesis, se
puede visualizar una serie de segmentos que tiene el
nio, que debe compartir con la madre y padre
biolgicos.
Deteccin de Enfermedades
Hereditarias
Cada gen en estudio puede ser amplificado fcilmente
por PCR, con los partidores adecuados, y luego ser
secuenciado, para as determinar si un individuo
porta alguna mutacin que explica la presencia de
una enfermedad o su aparicin en el futuro, la que
puede ser heredada a sus hijos.
COMPARACION DE LA EXPRESION
GENICA
*Imgenes editadas
digitalmente
Clonamiento de Genes
La PCR es habitualmente usada para amplificar un
determinado gen o un mRNA (representado por un cDNA),
que puede introducirse en un vector y luego en un organismo,
que al duplicarse tambin duplicar el gen que nos interesa.
As podemos tener una cantidad suficiente de un gen o cDNA,
por ejemplo, para secuenciarlo o producir a gran escala la
protena que este gen codifica.
Mutagnesis
Con variaciones en la secuencia de los partidores, se
puede producir un segmento de DNA que presente
diferencia en una o mas bases respecto al DNA
original. As se puede alterar una protena para
estudiar o anular su funcin. Esta mutacin puede ser
en un sitio determinado de un gen (sitio dirigida) o en
un lugar al azar de un gen o genoma.
Genotipificacion de polimorfismos
Mediante el uso de la PCR se puede determinar el genotipo de
un individuo para un polimorfismo dado, como un
microsatlite o un SNP (single nucleotide polymorphism).
En este ltimo caso necesitamos dos partidores para un mismo
extremo del segmento, los cuales varan en slo una base en el
extremo 3', lo que generar una amplificacin alelo-especfica,
de acuerdo al alelo del SNP que tenga el individuo en estudio.
Estos polimorfismos son muy tiles para estudios
poblacionales y para relacionar un gen o una regin
cromosmica con una enfermedad, ya sea mediante estudios
de asociacin o ligamiento.