26/04/2016

Porcentajes de ARN en una clula

Extraccin y anlisis de ARN

ARN mensajero: 1-5%

ARN ribosomal: 80%
ARN transferencia: 10-15%
La sntesis de ARNm es una expresin dinmica del
genoma de un organismo y es esencial para el flujo de
informacin en una clula

Para que investigar un ARNm?

Gentica Molecular - 2016

Universidad de Morn

Aislamiento de ARN

- Tamao: para examinar presencia de intrones y splicing

diferencial
- Secuencia: predecir el producto proteico
- Abundancia: medicin de niveles de expresin
- Dinmica de la expresin: en el tiempo, momento de
desarrollo, tipo de tejido

Aislamiento de ARN
- ARN total a partir de una muestra biolgica:
1 - con solventes orgnicos
2 - cromatografa de afinidad (kit)
- ARN mensajero: a partir de una muestra biolgica o
de ARN total
3 - cromatografa de afinidad (kit)

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1 Extraccin con solventes

2 Extraccin de ARN total con kit

Ventajas:
- Verstil: compatible con una gran variedad de
tipos de muestras
- Escalable; se pueden procesar pequeos o
grandes volmenes de muestra
- Tecnologa establecida
- Econmico
Desventajas:
- Uso de solventes orgnicos (riesgo de salud,
descarte complicado)
- No adecuado para muestras mltiples
- Contaminacin de ARN con ADN genmico

2 Extraccin de ARN total con kit

Ventajas :
- Elimina el uso de solventes organicos
- Compatible con diferentes tipos de muestras
- El tratamiento con ADNasa elimina la
contaminacin con ADN genmico
- Alta pureza e integridad
- Sencillo y rpido, pueden procesarse muchas
muestras en paralelo
Desventajas:
- Ms caro que extraccin con solventes

3 Aislamiento de ARNm
- Las molculas de ARNm tienen una colita poliA en su
extremo 3
- Se pueden usar oligonucleotidos oligo (dT) unidos a una
matriz: el ARNm hibridiza con el oligo (dT) y queda retenido
- Se eluye el ARNm de la matriz usando agua o un buffer de
baja fuerza inica
- Aislamiento de ARNm a partir de una muestra de ARN total:
permite el procesamiento de muestras mayores, puede
haber mayor rendimiento, pero lleva mas tiempo
- Aislamiento de ARNm a partir de una muestra biolgica: mas
rpido pero hay una limitacin del tamao de muestra

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3 Aislamiento de ARNm

Estimacin de la calidad del ARN en

espectrofotmetro
Se mide la absorbancia de la muestra de ARN en un
espectrofotometro a 260, 280 y 230 nm
- 260 nm: cidos nucleicos (ADN, ARN, nucleotidos)
- 280 nm: protenas
- 230 nm: guanidina
Para ARN: 1 unidad OD260 = 40 g/ml de ARN de cadena simple
Concentracin de la muestra: A260 x dilucion x 40 (g/ml)
A260/A280: debe estar entre 1,8 y 2 (si es menor: contaminacin
con proteinas
A280/A230: debe estar entre 1,8 y 2 (si es menor: contaminacin
con guanidina

Integridad del ARN

La medicin espectrofotomtrica no garantiza integridad del ARN
hay que analizar la muestra por electroforesis en gel de agarosa
(se usa formaldehido, para prevenir la formacin de estructuras
secundarias, y buffers libres de ARNasas)

Tcnicas de anlisis de ARN:

Northern blot: tcnica para analizar la abundancia y
tamao de un ARN por hibridizacin con una sonda
especifica

La integridad puede analizarse por las

bandas de 28S y 18S ARNr (relacin
aproximada debe ser 2:1). El ARNm
se observa como un bandeado de
distintos tamaos

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Northern blot (continuacin)

Northern blot (continuacin)

RT-PCR (continuacin)

Tcnicas de anlisis de ARN

RT-PCR: transcripcin reversa reaccin en cadena de la
polimerasa

- Amplificacin de una molcula especifica de ARN a muchas

copias de ADNc (ADN copia)

- Aplicaciones potenciales:
- Determinar la presencia o ausencia de un transcripto
- Estimar los niveles de expresin de ARNm
- Convertir ARNm a ADNc para clonado y secuenciacin
- Por comparacin entre el tamao del producto de RT-PCR a
partir de ARNm y el producto de PCR a partir de ADN
genmico, evaluar la presencia de intrones en un gen

6
3

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RT-PCR (continuacin)

Tcnicas de anlisis de ARN

qRT-PCR: Permite la cuantificacin de los transcriptos

Ejemplo

Ejemplo

Tcnicas de anlisis de ARN

Microarreglos

Microarreglos
- Permiten examinar los niveles de expresin de miles de genes
en un experimento nico
- Se depositan sobre un portaobjetos o chip hasta 50.000
secuencias de ADN nicas
- cada una representa una secuencia de un gen conocido
(normalmente oligonucleotidos especficos)

- Se aisla ARN de dos celulas o tejidos diferentes

por ej. Tejido sano vs tejido canceroso
- Se genera ADNc marcado fluorescentemente
- cada una de las dos muestras se marca con un fluorforo
diferente

- Se comparan los niveles de expresin de acuerdo los niveles de

hibridacin con las secuencias depositadas en el portabojetos

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Microarreglos

Microarreglos

Microarreglos

Microarreglos

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Microarreglos vs qRT-PCR
- Los datos de microarreglos se verifican muchas veces con qRTPCR
- Microarreglos: especialmente tiles para analizar muchos
genes de inters
- qRT-PCR: especialmente til para analizar el efecto de muchos
tratamientos diferentes en unos pocos genes
- Ejemplo:
- Analizar las diferencias de expresin de 10.000 genes en
una muestra de un tumor vs un tejido normal:
Microarreglos
- Analizar el efecto del tratamiento con 10 drogas diferentes
en la expresin de uno o dos genes: qRT-PCR