TOXICIDAD DRMICA SUBCRNICA: ENSAYO DE 90 DAS EN

ROEDORES
1. INFORMACIN PRELIMINAR

Requisitos previos

- Sustancias de ensayo slidas o lquidas

- Identificacin qumica de la sustancia problema
- pureza (impurezas) de sustancia de ensayo
- caractersticas de solubilidad
- PH (en su caso)
- La estabilidad, incluida la estabilidad en el vehculo cuando se aplica as
- Punto de fusin / punto de ebullicin
2. METODO
2.1 Aplicacin y lmites de la prueba
En la valoracin y evaluacin de las caractersticas txicas de una sustancia qumica para
determinar la toxicidad drmica subcrnica puede llevarse a cabo despus de la
informacin relativa a la toxicidad se ha obtenido mediante el estudio agudo.
Proporciona informacin sobre posibles peligros para la salud que puedan derivarse de
la exposicin repetida por va cutnea durante un perodo de tiempo limitado.

Definiciones

Toxicidad drmica subcrnica: es los efectos adversos que se producen como resultado
de la aplicacin drmica diaria repetida de un producto qumico a animales
experimentales para la parte (no superior a 10 por ciento) de un perodo de vida.
Dosis en una prueba cutnea: es la cantidad de sustancia de ensayo que se aplica a la piel
(se aplica a diario en las pruebas subcrnica). La dosis se expresa como el peso (g, mg),
en peso de la sustancia de ensayo por unidad de peso del animal (por ejemplo, mg / kg).
Nivel sin efecto Nivel Bajo / no-txico-efecto / sin efecto adverso: es la dosis mxima
utilizada en una prueba que no produce efectos adversos. Un nivel de efecto se expresa
en trminos del peso de una sustancia dada a diario por unidad de peso del animal (mg
/ kg).
Toxicidad acumulativa: son los efectos adversos de dosis repetidas que se producen como
resultado de una accin prolongada en, o aumento de la concentracin de la sustancia
administrada o sus metabolitos en, tejido susceptible.

Principio del mtodo

Se aplican a diario dosis crecientes de la sustancia estudiada en la piel de animales de

experimentacin integrados en varios grupos, a razn de una dosis por grupo durante un
perodo de 90 das. Durante el perodo de aplicacin se observa diariamente a los
animales en busca de signos de toxicidad. Los animales que mueran durante la prueba
se someten a autopsia, que se practica tambin a los supervivientes al concluir el estudio.
2.2 Descripcin del mtodo

Preparativos
Se mantiene a los animales en las condiciones de alojamiento y alimentacin
experimentales durante al menos 5 das previos a la prueba. Antes de comenzarla, se
distribuye al azar a los animales, que sern jvenes y sanos, para formar grupos de
tratamiento y de control. Antes de proceder a la aplicacin, se elimina el pelo de la regin
dorsal del tronco de los animales. Puede emplearse afeitado, pero deber practicarse
aproximadamente 24 horas antes de la prueba. Suelen ser necesarios cortes o afeitados
reiterados del pelo, ms o menos a intervalos semanales. Al practicarlos, hay que cuidar
de no lesionar la piel. Deber dejarse despejada, para la aplicacin de la sustancia en
estudio, una superficie no inferior al 10% de la corporal. Para decidir la zona que debe
despejarse y las dimensiones de la superficie a tratar, se tendr en cuenta el peso del
animal. Cuando se prueben slidos, que pueden pulverizarse si se considera oportuno,
se humedecer lo suficiente la sustancia estudiada con agua o, en caso necesario, un
vehculo apropiado para garantizar un buen contacto con la piel. Las sustancias lquidas
se emplean por lo general sin diluir. Se practican aplicaciones diarias 5 7 das a la
semana.

Animales de experimentacin

Seleccin de especie
Pueden emplearse ratas, conejos o cobayas adultos. Es posible emplear otras especies,
pero su uso exigira justificacin. Al principio de la prueba, los pesos no diferirn en un
porcentaje superior al 20% del peso medio en ratas, de 200 a 300 g; conejos, 2,0 a 3,0
kg; cobayas, 350 a 450 g. Cuando se realice una prueba drmica subcrnica como
preliminar a una de ndole crnica, se utilizar en ambas las misma especie y cepa.
Nmero y sexo
Se utilizarn al menos 20 animales (10 hembras y 10 machos) con piel sana para cada
dosis. Las hembras sern nulparas y no estarn preadas. Si est previsto el sacrificio
de algunos animales durante la prueba, debe aumentarse su nmero en una cantidad
igual a la de los que vayan a sacrificarse antes de terminar el estudio. Adems, puede
tratarse a un grupo satlite de 20 animales (10 de cada sexo) con la dosis ms alta durante
90 das para observar en ellos la reversibilidad, la persistencia o la aparicin tarda de
efectos txicos durante 28 das tras el tratamiento.
Alojamiento y alimentacin
Los animales deben ser alojados en jaulas individuales. La temperatura en el cuarto de
experimentacin debe ser de 22 C ( 3 ) para los roedores o 20 C ( 3 ) para los
conejos y la humedad relativa del 30-70 por ciento. Cuando la iluminacin es artificial,
la secuencia debe ser de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Para la alimentacin,
las dietas de laboratorio convencionales se pueden usar con un suministro ilimitado de
agua potable.

Condiciones del ensayo

Los niveles de dosis

Se utilizarn al menos tres niveles posolgicos y un control, o un control para el vehculo
si se emplea ste. El perodo de exposicin no ser inferior a 6 horas diarias. La aplicacin
de la sustancia de prueba debe hacerse a las mismas horas todos los das, y la cantidad
de producto se ajustar a intervalos (semanales o quincenales) de forma que se mantenga
una dosis constante en relacin con el peso del animal. Salvo por la omisin de la

sustancia estudiada, los animales del grupo de control deben recibir un trato idntico al
de los integrantes del grupo de prueba. Cuando se utilice un vehculo para facilitar la
administracin, el grupo de control lo recibir de igual modo que los grupos tratados, y
en cantidad igual a la administrada al grupo con dosis ms alta. La dosis ms alta debe
originar efectos txicos, pero producir pocos fallecimientos, o ninguno. La dosis ms baja
no debe originar signo alguno de toxicidad. Cuando se disponga de una estimacin vlida
de la exposicin humana, la dosis mnima ser superior a ese valor. Lo ideal sera que la
dosis media produjera el efecto txico mnimo observable. Si se emplea ms de una dosis
intermedia, la diferencia entre dosis ser suficiente para que los efectos txicos
resultantes sean escalonados. En los grupos con dosis bajas e intermedias, as como en
los controles, la mortalidad debe ser baja, a fin de permitir una evaluacin significativa
de los resultados.
Si la aplicacin de la sustancia probada provoca una irritacin cutnea grave, se
reducirn las concentraciones, lo que quiz origine una reduccin, o la ausencia, de otros
efectos txicos con la dosis alta. Si la piel ha sufrido lesiones importantes, quiz sea
necesario dar por concluido el estudio y emprender uno nuevo a concentraciones
menores.
Ensayo lmite
Si un ensayo con una sola dosis de al menos 1000 mg kg de peso corporal / (en funcin
de la exposicin humana esperada puede indicar la necesidad de utilizar una dosis alta),
utilizando los procedimientos descritos en este estudio, no produce ningn efecto txico
observable y si la toxicidad no lo hara esperarse sobre la base de datos de compuestos
estructuralmente relacionados, realizar un estudio completo con tres dosis puede no ser
considerada necesaria.
Perodo de observacin
Un cuidadoso examen clnico debe hacerse por lo menos una vez al da.
Las observaciones se deben hacer todos los das de manera que se minimizar la prdida
de los animales para el estudio, por ejemplo, autopsia o refrigeracin de los animales
muertos, as como aislamiento o sacrificio de los animales dbiles o moribundos.
Es preciso observar a diario a los animales de experimentacin en busca de signos de
toxicidad. Hay que tomar nota del momento del fallecimiento y de los de aparicin y
desaparicin de signos de toxicidad.

Procedimiento

Los animales se alojarn en jaulas individuales. El rgimen ideal comprende la

administracin, a los animales, de la sustancia ensayada por 7 das de la semana durante
un perodo de 90 das. Sin embargo, basado principalmente en la prctica, la aplicacin
sobre una base 5 das por semana se considera que es aceptable. Los animales de grupos
satlites destinados a observaciones complementarias deben observarse 28 das ms sin
tratamiento para apreciar la recuperacin de los efectos txicos, o su persistencia. El
perodo de exposicin diario ser de 6 horas. La sustancia estudiada se aplicar
uniformemente sobre una zona que corresponda aproximadamente al 10% de la
superficie corporal total. En caso de sustancias muy txicas, la zona tratada puede ser
inferior, pero se cubrir con una capa lo ms uniforme y delgada posible.
Durante la exposicin, la sustancia estudiada se mantiene en contacto con la piel con
ayuda de un apsito de gasa poroso y esparadrapo no irritante. Adems, la zona tratada

se cubrir de forma que se mantengan colocados el apsito y la sustancia y se impida a

los animales la ingestin de sta. Cabe utilizar dispositivos de sujecin para evitar la
ingestin de la sustancia objeto de estudio, pero no se recomienda la inmovilizacin
completa.
Al final del perodo de exposicin, se eliminar la sustancia restante, siempre que sea
posible, por medio de agua o algn otro mtodo apropiado de limpieza de la piel. Es
preciso observar a diario a todos los animales y registrar los signos de toxicidad, incluidos
el momento de comienzo, el grado y la duracin. Entre las observaciones que deben
practicarse sobre los animales enjaulados destacan las de modificaciones de la piel y el
pelo, los ojos y las membranas mucosas, as como de los sistemas respiratorio,
circulatorio, autonmico y nervioso central, la actividad somatomotriz y el
comportamiento. Cada semana, se determinarn el consumo de alimento y el peso de los
animales. Son necesarias observaciones peridicas de los animales para evitar en lo
posible la prdida de alguno por causa de canibalismo, autlisis de tejidos o
enjaulamiento errneo. Al final del perodo de prueba, se realiza la autopsia a todos los
supervivientes de los grupos de tratamiento no satlites. Los animales moribundos se
retirarn y sometern a autopsia.
En todos los animales, incluidos los controles, se practican habitualmente
los exmenes clnicos siguientes:
a) Exploracin oftalmolgica con un oftalmoscopio o equipo apropiado equivalente,
antes de administrar la sustancia estudiada y al final del estudio, preferiblemente en
todos los animales, pero por lo menos en los grupos con dosis altas y de control. Si se
apreciaran alteraciones oculares, se examinar a todos los animales.
b) Pruebas hematolgicas al final del perodo de estudio: hematocrito, concentracin de
hemoglobina, recuento eritrocitario, recuento y frmula leucocitarios, y determinacin
de la coagulacin por pruebas como tiempo de coagulacin, tiempo de protrombina,
tiempo de tromboplastina o recuento de plaquetas.
c) Determinaciones bioqumicas clnicas en la sangre al final del perodo de prueba. Se
consideran aspectos de inters en todos los estudios el balance electroltico, el
metabolismo de hidratos de carbono y las funciones hepticas y renal. En la seleccin de
las pruebas concretas influirn las observaciones sobre el modo de accin de la sustancia.
Se sugiere la determinacin de los parmetros siguientes: calcio, fsforo, cloruro, sodio,
potasio, glucosa en ayunas (con perodo de ayuno apropiado a cada especie),
transaminasas glutamicopirvica (Conocida actualmente como alaninaminotransferasa
srica) y glutamicooxaloactica (Conocida actualmente como aspartatoaminotransferasa
srica) s ricas, ornitindescarboxilasa, gammaglutamiltranspeptidasa, nitrgeno ureico,
albmina, creatinina plasmtica, bilirrubina total y protenas sricas totales. Entre otras
determinaciones que pueden ser necesarias para una evaluacin toxicolgica adecuada
figuran los anlisis de lpidos, hormonas, equilibrio acidobsico, metahemoglobina y
actividad de colinesterasa. Siempre que sea preciso, se emplearn otras pruebas
bioqumicas clnicas para ampliar la investigacin de los efectos observados.
d) El anlisis de orina no es necesario de forma sistemtica, sino slo en caso de efectos
txicos probables o manifiestos. Si los datos de referencia previos son insuficientes,
habr que considerar la posible determinacin de los parmetros hematolgicos y de
bioqumica clnica antes de iniciar la administracin.

Patologa

Autopsia
Se practicar en todos los animales una autopsia completa que comprenda la inspeccin
de la superficie externa del cuerpo, todos sus orificios y las cavidades craneal, torcica y
abdominal y sus contenidos. Hgado, riones, suprarrenales y testculos deben pesarse
frescos lo antes posible tras la diseccin, a fin de evitar la desecacin. Se conservarn en
un medio adecuado para un posible examen histopatolgico posterior los rganos y
tejidos siguientes: todas las lesiones macroscpicas, el cerebro incluidos cortes de
bulbo/protuberancia, corteza cerebelosa y enceflica, hipfisis, tiroides/paratiroides,
tejido tmico (trquea), pulmones, corazn, aorta (glndulas salivares), hgado, bazo,
riones, suprarrenales, pncreas, gnadas, tero, rganos genitales accesorios, vescula
biliar (si existe), esfago, estmago, duodeno, yeyuno, leon, ciego, colon, recto, vejiga
urinaria, ganglio linftico representativo (glndula mamaria femenina) (musculatura del
muslo), nervio perifrico (ojos) (esternn con mdula sea) (fmur, incluida superficie
articular) (mdula espinal a tres niveles: cervical, mesotorcico y lumbar) y (glndulas
lagrimales exorbitarias). Los tejidos que aparecen entre parntesis slo se examinarn si
as lo aconsejan los signos de toxicidad o afectacin del rgano diana.
Examen histopatolgico
a) Se sometern a un examen histopatolgico completo la piel normal y la tratada, y los
rganos y tejidos de los animales de los grupos de control y los de dosis mxima.
b) Se examinarn todas las lesiones macroscpicas.
c) Se examinarn los rganos efectores de los animales de grupos con otras dosis.
d) Si se utilizan ratas, se sometern los pulmones de los animales integrantes de los
grupos con dosis mnimas e intermedias a examen histopatolgico en busca de signos de
infeccin, ya que esta medida permite una evaluacin cmoda del estado de salud de los
animales. Es posible que en los animales de estos grupos no sean necesarios por sistema
exmenes histopatolgicos complementarios, pero siempre se llevarn a cabo en los
rganos de los del grupo con dosis mxima que presenten indicios de lesiones.
e) Cuando se utilice un grupo satlite, se practicar un examen histopatolgico de los
tejidos y rganos que presenten signos de toxicidad en los grupos tratados.

3. RESULTADOS Y REPORTE

Tratamiento de datos

El informe sobre el ensayo incluir si

fuera posible:
Especie,
cepa,
origen,
condiciones
ambientales,
alimentacin

Datos de respuesta txica en

funcin del sexo y la dosis
Dosis carente de efectos, si es
posible

Condiciones de la prueba

Momento de la muerte durante

el estudio, o indicacin de que los
animales sobrevivieron a la
experiencia

Dosis (incluido el vehculo, si

procede) y concentraciones

Descripcin de los
txicos o de otro tipo

efectos

 Momento de observacin de
cada signo anmalo y evolucin
de ste
Datos sobre alimentacin y peso
Hallazgos oftalmolgicos
Pruebas
hematolgicas
practicadas y sus resultados
completos
Pruebas de bioqumica clnica
empleadas y sus resultados

completos (incluidos los del

anlisis de orina, si procede)
Hallazgos de autopsia
Descripcin detallada de los
hallazgos histopatolgicos
Tratamiento estadstico de los
resultados, si es posible
Comentario de los resultados
Interpretacin de los resultados.

Evaluacin de los resultados

Los resultados de un estudio de toxicidad drmica subcrnica deben ser evaluados en

conjunto con los hallazgos de estudios anteriores y se considera en trminos de los
efectos txicos observados y la necropsia adems de los hallazgos histopatolgicos. La
evaluacin incluir la relacin entre la dosis de la sustancia de ensayo y la presencia o
ausencia, la incidencia y la gravedad, de anormalidades, incluyendo las anomalas
clnicas y de comportamiento, las lesiones macroscpicas, objetivo identificado rganos,
cambios de peso, efectos sobre la mortalidad y cualquier otro general o especfico efectos
txicos. Una prueba subcrnica realizado correctamente debera proporcionar una
estimacin satisfactoria de un nivel sin efecto.

Informe de la prueba

El informe del ensayo debe incluir la siguiente informacin:

-

Especie / cepa utilizada;

Datos de reacciones txicas por sexo y dosis;
Momento de la muerte durante el estudio o si los animales sobrevivieron
a la experiencia;
Efectos txicos o de otro tipo;
Momento de observacin de cualquier sntoma anormal y su evolucin;
alimentos y el peso corporal de datos;
Anlisis hematolgicos practicados y resultados con los datos de
referencia pertinente;
Pruebas de bioqumica clnica empleadas y los resultados con los datos de
referencia pertinente;
hallazgos de la autopsia;
Una descripcin detallada de los hallazgos histopatolgicos; y
Tratamiento estadstico de los resultados en su caso.

4. BIBLIOGRAFIA
Subchronic Dermal Toxicity: 90-day Study; 411 OECD GUIDELINE FOR
TESTING OF CHEMICALS Adopted: 12 May 1981.
Diario Oficial de las Comunidades Europeas; Toxicidad Drmica Subcrnica:
ensayo de 90 das en roedores.
Manuel Repetto Jimnez, Guillermo Repetto Kuhn.
TOXICOLOGA
FUNDAMENTAL; Instituto Nacional de Toxicologa; Universidad de Sevilla.
Cuarta edicin.