Sesion Teorico-04

Tcnicas de microscopa
aplicadas a las Ciencias Forenses
Prof. Nicols Ubero Pascal

Dpto. de Zoologa y Antropologa Fsica
Curso 2008-2009
Sesin Terico-Prctica 4
Fundamentos de microscopa electrnica1
PARTE TERICA2
4.1. Fundamentos tcnicos de la microscopa electrnica.
4.2. Microscopa electrnica de barrido (SEM) vs microscopa electrnica de transmisin (TEM)
4.3. Otros tipos de microscopa electrnica.
4.4. La microscopa electrnica y las ciencias forenses.
Fundamentos tcnicos de la microscopa electrnica

La microscopa electrnica ha revolucionado el conocimiento de ciencias como la
biologa o la medicina, aunque su campo de aplicacin se ha extendido a la mayora de
disciplinas cientficas, incluidas las de materiales. La principal ventaja de este tipo de
microscopa es alcanzar una extraordinaria amplificacin de la imagen de la muestra
manteniendo un poder de resolucin casi mil veces mayor que el ptico. Estas magnficas
propiedades se deben a que la fuente de iluminacin usada es un haz de electrones. El
funcionamiento de la microscopa electrnica, sobre todo la de transmisin, es anlogo al
funcionamiento de un microscopio ptico. Por tanto una vez entendido los fundamentos
tcnicos de la microscopa ptica sern tambin fciles de entender los de la microscopa
electrnica y, para su descripcin, nos vamos a basar inicialmente en el microscopio
electrnico de transmisin.
Imagen: En el caso del microscopio electrnico la formacin de la imagen se produce
por la dispersin de los electrones, mientras que en el ptico la imagen se produce por
absorcin de los fotones. Es decir la imagen que se observa en un microscopio ptico
(MO) se debe a la diferente absorcin de la luz por las distintas estructuras de la
muestra, mientras que en el microscopio electrnico la formacin de la imagen est en
funcin de la dispersin y, por consiguiente, perdida de los electrones (figura 1). Est
capacidad de dispersin va a depender de las distintas estructuras atmicas de la
muestra.
1
2
Este documento est sujeto a una licencia Creative Commons

La procedencia y autora de las imgenes y esquemas utilizados se encuentra al final del texto

Curso 2008-2009
Figura 1. Efectos bsicos de los electrones al chocar con la materia. El electrn

retrodispersado es aquel que cambia su trayectoria al atravesar un tomo,
mientras que el electrn secundario es aquel que surge del tomo al colisionar
con l un electrn primario, que a su vez es retrodispersado. Estos fenmenos
explican la imagen que se produce principalmente en un microscopio electrnico
de transmisin y en uno de barrido.
Aumentos: las lentes del microscopio electrnico son electromagnticas y actan

como las de un ptico (lamina 1A), es decir, desviando la trayectorias seguidas por los
electrones en el vaco. En microscopa ptica los vidrios de superficies curvas (lentes)
pueden desviar el haz luminoso haciendo que la imagen de un objeto parezca ms
grande, en microscopa electrnica este mismo efecto se consigue con campos
magnticos. Los aumentos en este tipo de lentes se obtienen modificando la intensidad
de la corriente que se hace pasar por las bobinas que conforman las lentes,
provocando un aumento del campo de fuerza y, por tanto, un desvo mayor o menor del
haz de electrones. Mientras las lentes de un MO tienen una distancia focal fija, las
lentes electromagnticas del ME tienen una distancia focal variable, por lo que para
incrementar los aumentos no es necesario cambiar de lente sino simplemente
aumentar
el
campo
de
fuerza
de
la
lente
electromagntica.
Las
lentes
electromagnticas producen desviaciones no proporcionales del haz de electrones que

se manifiesta como una aberracin denominada astigmatismo, pero que se pueden
corregir mecnicamente.

Curso 2008-2009
A
Lmina 1. Microscopio electrnico de transmisin. A.Esquema comparado de un microscopio ptico, un

electrnico de transmisin (TEM) y uno de barrido
(SEM), como se puede observar la estructura del SEM
es un poco diferente. B.- Partes de un TEM del ao
1969: (1) cable de alta tensin, (2) emisor de
electrones, (3) motor para centrar el haz del emisor de
electrones, (4) condensador, (5) control de apertura del
diafragma, (6) portamuestras, (7) objetivo (lente
condensador), (8) proyector (lente condensador), (9)
binocular ptico de observacin, (10) pantalla
fluorescente, (11) bomba de vaco, (12) gonimetro, (13)
control de vaco y de aumentos, (14) control de
enfoque. C.- Aspecto de un TEM actual con sistema de
captura de imgenes
Iluminacin: El haz de electrones se obtiene por la excitacin de un filamento metlico

(ctodo) y es atrado por la diferencia de potencial producida en el nodo (50.000100.000 voltios). Este fenmeno se produce cuando ctodo y nodo se encuentra en
vaco (lamina 1B). Como el haz de electrones es divergente, se usa una lente
3

Curso 2008-2009
condensadora para dirigir el haz hacia la muestra, que debe ser un corte muy fino y
preparado de manera especial. Los electrones que no son totalmente dispersados son
reconducidos por la lente objetivo producindose el aumento de la imagen que es
proyectada por la lente objetivo o proyector. Como los electrones no son visibles estos
se observan en una pantalla o en un negativo impresionado (lamina 1B y C). Las partes
de la imagen donde los electrones han sido muy desviados no resultan muy intensas,
dando una tonalidad clara en el negativo, que se rebelar oscuro cuando se positiva.
Por tanto, aquellas reas de la muestra que tienen un mayor indice de dispersin, son
ms densas a los electrones, aparecern oscuras en la imagen final; justo al contrario
que aquellas reas donde no exista prcticamente dispersin. El contraste se puede
mejorar con un pequeo diafragma que limita solamente a los electrones ms
perifricos. La profundidad de campo es ms o menos constante, dada las
peculiaridades tcnicas del microscopio, pero sta (aproximadamente 1m) es
suficiente para que est enfocada toda el grosor de la muestra, que es inferior a 0,5m.
Poder de resolucin: en la microscopa ptica el poder de resolucin est limitado por
la longitud de onda de los fotones, pero en el microscopio electrnico se juega con la
ventaja de una pequesima longitud de onda en la propagacin de los electrones, por
lo que el poder de resolucin es muy elevado. Esto permite, que imagen pueda ser
aumentada posteriormente en una copia fotogrfica muchas veces, para observar
todos los detalles. El poder de resolucin de esta microscopa es de 5 a 10 (0,5
milimicras) (lmina 2).

Curso 2008-2009
A
Lmina 2. Ejemplos de microscopa ptica comparada con electrnica de barrido y de transmisin usando huevos de
un efemerptero. A.- Preparacin in toto observada a 100 aumentos con contraste de fases en un microscopio
ptico; B.- Huevo completo observado a 550 aumentos en un SEM; C.- Detalle estructura de fijacin de huevo
observada a 16.000 aumentos en un SEM; D.- Corte semifino de ovario teido con azul de toluidina observada a 100x
con microscopio ptico; E.- Corte ultrafino de ovario teido con acetato de uranilo observada a 1000 aumentos con un
TEM; F.- Corte ultrafino de ovario teido con acetato de uranilo observado a 10.000 aumentos con un TEM

Curso 2008-2009
Microscopa electrnica de barrido (SEM) vs microscopa electrnica de

transmisin (TEM)
El microscopio electrnico de barrido (SEM) es un instrumento que permite la
observacin y caracterizacin superficial de materiales inorgnicos y orgnicos, entregando
informacin morfolgica del material analizado (lmina 2A). A partir de l se producen
distintos tipos de seal que se generan desde la muestra y se utilizan para examinar muchas
de sus caractersticas. Con l se pueden realizar estudios de los aspectos morfolgicos de
zonas microscpicas de los distintos materiales con los que trabajan los investigadores de la
comunidad cientfica y las empresas privadas, adems del procesamiento y anlisis de las
imgenes obtenidas. Las principales utilidades del SEM son la alta resolucin (~100), la
gran profundidad de campo que resuelve una imagen tridimensional de la muestra y la
relativa sencillez de preparacin de las muestras.
El microscopio electrnico de barrido puede estar equipado con diversos detectores
(lmina 2 B y C), entre los que se pueden mencionar: un detector de electrones secundarios
para obtener imgenes de alta resolucin (SEI), un detector de electrones retrodispersado
que permite la obtencin de imgenes de composicin y topografa de la superficie (BEI) y
un detector de energa dispersiva (EDS) que permite detectar los rayos X generados por la
muestra y realizar anlisis de distribucin de elementos en superficie.
El microscopio electrnico de transmisin (TEM) tiene un modo de operar similar al del
microscopio ptico, ya que est basado en el hecho de que la manera de actuar un campo
electromagntico sobre un haz de electrones es anlogo a la accin de una lente de cristal
sobre el haz de fotones. La imagen, sin embargo, se forma sobre una pantalla fluorescente
como lo hara en una pantalla de televisor. El microscopio electrnico de barrido no tiene la
resolucin que se alcanza con el microscopio electrnico de transmisin, pero su ventaja es
una excelente impresin tridimensional, derivada de la amplificacin de seales que se
generan al irradiar la superficie de las muestras con un haz muy estrecho de electrones.
A

Curso 2008-2009
Lamina 3. Microscopio Electrnico de Barrido. A.- Aspecto externo de un SEM moderno; B.- Esquema general de un
SEM indicando el detector de electrones secundarios (SEI) y la sonda de rayos X; C.- Esquema de la deteccin de los
electrones secundarios mediante, en la imagen de la izquierda el detector no tiene polaridad y son captados los
electrones retrodispersados mediante un detector BEI, mientras que el de la derecha s, atrayendo as los electrones
secundariosal detector SEI. D.- Ejemplo de imgenes de la misma estructura obtenidos mediante un detector SEI y un
detector BEI.

Curso 2008-2009
Figura 2. Esquema general del efecto del haz de electrones sobre una muestra que dan lugar a los tipos de
microscopa electrnica ms importantes, as como las posibilidades tcnicas de cada una
Figura 3. Esquema bsico de la obtencin de la imagen en un TEM y un SEM

Curso 2008-2009
Otros tipos de microscopa electrnica

Microscopio Electrnico de Barrido Ambiental (ESEM) de ltima generacin que
admite el anlisis de muestras en estado natural o bajo condiciones ambientales naturales,
sin necesidad de usar tcnicas convencionales de preparacin de muestras. Adems, es
posible utilizar rgimen de alto vaco de forma similar a los microscopios SEM
convencionales.
Microscopio Electrnico de Barrido de Congelacin (Cryo-SEM): Es un tipo de
microscopio electrnico que basa su funcionamiento sobre muestras congeladas. La
congelacin de la muestra se realiza una vez puesta sobre el pedestal introducindola en
nitrgeno lquido. El pedestal se acopla a una varilla que es introducida en un compartimento
cilndrico con nitrgeno lquido, estructura que se acopla a una la unidad de alto vaco del
SEM que mantiene la congelacin. Esta crio-cmara presenta una serie de utensilios para
manejar la muestra congelada (por ejemplo para fracturarla) y en ella se lleva a cabo la
sublimacin de la muestra y su cubrimiento metlico (mtodo de sputtering). Una vez
metalizada la muestra se introduce en la cmara de alto vaco de observacin, mediante un
sistema mecnico interno, pudiendo analizar la muestra como un SEM normal.
Microscopio Electrnico de Barrido para Transmisin (STEM): Es un tipo de
microscopio electrnico de transmisin que permite capturar los electrones que atraviesan la
muestras como ocurre en un TEM normalmente, pero tiene asociado un detector de
electrones secundarios (aquellos que se desprenden de la muestra cuando el choca con ella:
fundamento tcnico del SEM) permitiendo obtener una imagen de barrido de un punto de
terminado de la muestra. Obviamente, las muestras dirigidas a este tipo de microscopio
deben ser lminas finas, con el fin de que los electrones puedan atravesarla. En realidad, la
utilizacin ms cercana con el SEM es que lleva asociado una sonda de rayos X, lo que
permite analizar qumicamente puntos determinados de la muestra.
A

Curso 2008-2009
Lmina 4. A.- Microscopio Electrnico de Barrido Ambiental (ESEM); B.- Microscopio electrnico de Barrido que puede
trabajar sin metalizacin previa de las muestras; C.- Microscopio Electrnico de Barrido para Transmisin (STEM); D.Microscopio Electrnico de Barrido preparado para analizar muestras congeladas (Crio-SEM); E.- Detalle de la crio-cmara
adosada a la cmara de visualizacin propia del SEM.
10

Curso 2008-2009
La microscopa electrnica y las ciencias forenses

La aplicaciones de la microscopio electrnico son muy variadas y van desde la
industria petroqumica o la metalrgica hasta las ciencias experimentales y de la salud. En
ciencias forenses, el microscopio electrnico de barrido tiene una mayor utilidad, ya que al
proporcionar datos morfolgicos de gran precisin (tamao, textura, forma de la muestra,
composicin qumica elemental), permite el estudio de muestras de cualquier tipo y origen.
Entre los campos cientficos con inters forense en los que se aplica el SEM podemos
mencionar:
Geologa:
estudio
morfolgico
estructural
de
muestras
cristalogrficas,
mineralgicas y petrolgicas.
Estudios de los materiales: caracterizacin microestructural, valoracin de su

deterioro, presencia de defectos, tipo de degradacin (fatiga, corrosin, fragilidad,
etc.) de materiales cermicos, metlicos, semiconductores, polmeros.
Control de calidad: productos manufacturados de origen animal o vegetal (pieles,

fibras), microelectrnica y materiales informticos, etc.
Estudio de muestra botnicas, zoolgicas, mdicas, biomdicas, etc.
Peritaciones caligrficas
Fuentes de Informacin
1. Gonzlez, R. 1966. Manual de microscopa electrnica. Monografas de Ciencia Moderna. CSIC.
2. Aballe, M., J. Lpez Ruiz, J.M. Bada y P. Adeva (coordinadores). 1996. Microscopa electrnica de
barrido y microanlisis de rayos X. CSIC, Ed. Rueda.
3. Goldstein, J.I., D.E. Newbury, P. Echlin, D.C. Joy, A.D.Romig, Jr., C.E. Lyman, C. Fiori and E. Lifshin.
1992. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis: a text for biologist, materials scientists,
and geologist. 2nd. Ed. Springer Science. New York.
4. Virtual Microscopy. Imaging Technology Group. Beckman Institute for Advance Science and Technology.
University of Illinois
5. Central Microscopy of The University of Iowa
6. Material Science and Engineering Department. Iowa State University
7. Scanning Electron Microscopy. Museum of Science. Boston
8. Mtodos de Anlisis Microscpico. Departamento de Ciencias Analticas. Universidad Nacional de
Educacin a Distancia
9. Electron Microscopy. Swiss Federal Institute of Technology of Zurich
11

Curso 2008-2009
10. The Unit for Nanocharacterization of The Hebrev University of Jerusalen

11. Virtual Classroom Biology de la Faculty of Science, Mathematics and Computing Science de la
Radbound University Nijmegen
Crditos de las figuras
El logo del encabezamiento proceden de la pgina web http://ocw.um.es/
La figura 1 ha sido adaptada de la imgenes de Dake y han sido obtenidas de la pgina Wikimedia Commons. la
imagen se encuentra en la direccin: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Sem_electrons_photons.svg.
La figura A de la lmina 1 han sido obtenidas de la pgina web de Central Microscopy de la Universidad of Iowa.
Las fotografas se encuentran en la direccin: http://www.uiowa.edu/~cemrf/methodology/tem/index.htm.
Las figuras B y C de la lmina 1 son de Ricce y de FEI respectivamente y han sido obtenidas de la pgina
Wikimedia Commons. Las fotografas se encuentran en las direcciones:
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Simens_numeri.jpg y
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:FEITecnaispirit05.jpg.
Todas las imgenes de la lmina 2 son del autor del texto, Nicols Ubero Pascal
La figura A de la lmina 3 es de D. Schwen y han sido obtenidas de la pgina Wikimedia Commons. la imagen se
encuentra en la direccin: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Goe_SEM_students_working1.jpg.
La figura B de la lmina 3 procede de la pgina web Programa de Biologa Celular desarrollada por el Grupo de
Neurobiologa del Departamento de Nutricin y Bioqumica de la Pontificea Universidad Javeriana de Colombia. La
fotografa se encuentra en la direccin:
http://javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/microelectrans.htm.
La figura C de la lmina 3 ha sido adaptada de las imgenes de Steff obtenidas de la pgina Wikimedia
Commons. Las fotografas se encuentran en las direcciones: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:EVT%2B.PNG
y http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/f/f1/EVT-.PNG.
La figura D de la lmina 3 es del autor del texto, Nicols Ubero Pascal
La figura 2 procede de la pgina web Crista Mine desarrollada por el Departamento de Ciencias Analticas de la
UNED y el Departamento de Ingeniera Geolgica de la ETSI de Minas de Madrid (UPM). La fotografa se
encuentra en la direccin: http://www.uned.es/cristamine/mineral/metodos/micr_electr.htm#tipos.
La figura 3 procede de la pgina web Programa de Biologa Celular desarrollada por el Grupo de Neurobiologa del
Departamento de Nutricin y Bioqumica de la Pontificea Universidad Javeriana de Colombia. La fotografa se
encuentra en la direccin:
http://javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/microelectrans.htm.
La figura A de la lmina 4 procede de la pgina web The Unit for Nanocharacterization de The Hebrev University of
Jerusalen. La fotografa se encuentra en la direccin: http://nanoscience.huji.ac.il/unc/esem_main.htm
Las figuras B y C de la lmina 4 proceden de la pgina web Direct Industry. Las fotografas se encuentran en la
direccin: http://www.directindustry.es/prod/hitachi-high-technologies-europe-gmbh/microscopio-electronico-debarrido-sem-30506-199337.html#prod_199337
La figura D de la lmina 4 procede de la pgina web Quorun Technology. La imagen se encuentra en la direccin:
http://www.sputtercoating.com/Applications/Case_studies/Universidad-Politecnica-de-Cartagena.htm
La figura E de la lmina 4 procede de la pgina web Virtual Classroom Biology de la Faculty of Science,
Mathematics and Computing Science de la Radbound University Nijmegen. La imagen se encuentra en la
direccin: http://www.vcbio.science.ru.nl/en/fesem/info/cryosem/
12

Sesion Teorico-04

Enviado por

Dados do documento

Título original

Direitos autorais

Formatos disponíveis

Compartilhar este documento

Compartilhar ou incorporar documento

Opções de compartilhamento

Você considera este documento útil?

Este conteúdo é inapropriado?

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Sesion Teorico-04

Enviado por

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Tcnicas de microscopa

aplicadas a las Ciencias Forenses

Prof. Nicols Ubero Pascal

Fundamentos tcnicos de la microscopa electrnica

Este documento est sujeto a una licencia Creative Commons

Prof. Nicols Ubero Pascal

Figura 1. Efectos bsicos de los electrones al chocar con la materia. El electrn

Aumentos: las lentes del microscopio electrnico son electromagnticas y actan

electromagnticas producen desviaciones no proporcionales del haz de electrones que

Prof. Nicols Ubero Pascal

Lmina 1. Microscopio electrnico de transmisin. A.Esquema comparado de un microscopio ptico, un

Iluminacin: El haz de electrones se obtiene por la excitacin de un filamento metlico

Prof. Nicols Ubero Pascal

Prof. Nicols Ubero Pascal

Prof. Nicols Ubero Pascal

Microscopa electrnica de barrido (SEM) vs microscopa electrnica de

Prof. Nicols Ubero Pascal

Prof. Nicols Ubero Pascal

Figura 3. Esquema bsico de la obtencin de la imagen en un TEM y un SEM

Prof. Nicols Ubero Pascal

Otros tipos de microscopa electrnica

Prof. Nicols Ubero Pascal

Prof. Nicols Ubero Pascal

La microscopa electrnica y las ciencias forenses

Estudios de los materiales: caracterizacin microestructural, valoracin de su

Control de calidad: productos manufacturados de origen animal o vegetal (pieles,

Estudio de muestra botnicas, zoolgicas, mdicas, biomdicas, etc.

Prof. Nicols Ubero Pascal

10. The Unit for Nanocharacterization of The Hebrev University of Jerusalen

Crditos de las figuras

El logo del encabezamiento proceden de la pgina web http://ocw.um.es/

La figura D de la lmina 3 es del autor del texto, Nicols Ubero Pascal

Você também pode gostar