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MAPA/SDA/CGAL

Cdigo: MET POA/SLAV/39/02/01


Laboratrio Nacional Agropecurio - LANAGRO/RS
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Laboratrio de Produtos de Origem Animal/SLAV
Emisso: 24/07/2014
Mtodo de Ensaio - MET

Determinao de protena bruta em produtos de origem animal por acidimetria


1 Escopo
Este mtodo tem por objetivo determinar o teor de protena bruta de produtos de origem animal.
Aplica-se a amostras nitrogenadas de origem orgnica e inorgnica, com exceo de nitratos e
nitritos.

2 Fundamentos
O mtodo se baseia na digesto das protenas e outros compostos nitrogenados com cido
sulfrico concentrado a quente, em presena de catalisador, liberando o carbono como gs
carbnico, o hidrognio como gua e transformando o nitrognio em amnia (NH3), que fixado
na forma de sulfato de amnio. O sulfato de amnio resultante, na presena da soluo
concentrada de hidrxido de sdio, libera amnia, que recebida na soluo de cido brico e
titulada com cido sulfrico de ttulo conhecido. Os resultados so expressos como protena bruta,
multiplicando-se a porcentagem do nitrognio total por fatores especficos.

3 Reagentes, padres e materiais


Todos os reagentes so de grau analtico (p.a.), exceto quando especificado. Toda a gua
utilizada nos procedimentos destilada/deionizada, exceto quando especificada.

3.1 Reagentes

cido brico (H3BO3);

cido clordrico (HCl);

cido sulfrico (H2SO4);

Etanol (CH3CH2OH);

Hidrxido de sdio (NaOH);

Sulfato de amnio ((NH4)2SO4);

Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4.5H2O);

Sulfato de sdio anidro (Na2SO4) ou sulfato de potssio anidro (K2SO4);

Verde de bromocresol (C21H14Br4O5S);

Vermelho de metila (C15H15N3O2).

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3.2 Padres

Carbonato de sdio (Na2CO3), material de referncia.

3.3 Materiais

Bales volumtricos (1000 mL);

Bureta graduada ou titulador automtico;

Erlenmeyers de 125 ou 250 mL;

Gral de porcelana com pistilo;

Papel de pesagem (papel vegetal livre de nitrognio);

Provetas de 50, 100 e 250 mL;

Tubos de vidro compatveis com sistemas micro e macro-Kjeldahl.

4 Equipamentos

Balana analtica, com preciso mnima de quatro casas decimais;

Bloco digestor;

Destilador micro ou macro-Kjeldahl;

Forno-mufla.

5 Precaues analticas
Este mtodo emprega substncias qumicas nocivas e procedimentos que podem representar
risco ao operador. Todos os procedimentos devem ser realizados com uso de equipamentos de
proteo individual e uniforme apropriado. O preparo das solues reagentes deve ser feito em
capela de exausto.
Amostras de alimentos em geral devem ser consideradas como de risco biolgico, evitando-se o
contato direto com pele e mucosas.

6 Procedimentos

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Determinao de protena bruta em produtos de origem animal por acidimetria


As operaes devero ser registradas no formulrio Dados brutos, Anexo A do POP
POA/SLAV/15 Procedimentos de rotina na anlise fsico-qumica de produtos de origem animal.
Realizar o ensaio em duplicata.
6.1 Preparo de solues e reagentes

6.1.1 Mtodo micro-Kjeldahl

6.1.1.1 Mistura cataltica


Juntar dez partes de sulfato de sdio (ou potssio) anidro e uma parte de sulfato de cobre
pentahidratado. Triturar em gral, homogeneizar e armazenar em frasco identificado.

6.1.1.2 Soluo de hidrxido de sdio 50% (m/v)


Em um bquer, sobre banho de gelo, dissolver lenta e cuidadosamente 500 g de hidrxido de
sdio em aproximadamente 800 mL de gua. Esperar esfriar. Transferir para balo volumtrico
de 1 L e completar volume com gua.

6.1.1.3 Indicador misto


Pesar 0,132 g de vermelho de metila e 0,06 g de verde de bromocresol. Dissolver em 200 mL de
lcool etlico 70% (v/v). Filtrar se necessrio e guardar em frasco mbar.

6.1.1.4 Soluo de cido brico 4% (m/v)


Dissolver 40,00 g de cido brico em 800 mL de gua quente. Homogeneizar. Deixar esfriar,
transferir para um balo de 1000 mL, adicionar 8 mL de indicador misto e avolumar.

6.1.1.5 Soluo de cido sulfrico 0,05 M (mol/L)


Na capela de exausto, transferir cuidadosamente 2,70 mL de cido sulfrico para balo
volumtrico de 1000 mL, contendo aproximadamente 400 mL de gua. Deixar esfriar e completar
o volume.

6.1.1.6 Soluo hidro-alcolica de vermelho de metila 0,1% (m/v)

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Em um balo volumtrico de 100 mL, dissolver 0,1 g de vermelho de metila em 40 mL de etanol.
Completar o volume com gua. Homogeneizar e armazenar em frasco mbar identificado.

6.1.1.7 Soluo de cido clordrico (HCl) 0,1 M (mol/L)


Na capela de exausto, adicionar com cuidado e lentamente pelas paredes de um balo de 1000
mL contendo 10 mL de gua deionizada, 8,35 mL de cido clordrico, com auxlio de uma pipeta.
Completar o volume com gua deionizada e transferir a soluo preparada para frasco de vidro e
rotular. Essa soluo poder ser armazenada temperatura ambiente.

6.1.2 Mtodo macro-Kjeldahl

6.1.2.1 Mistura cataltica


Conforme item 6.1.1.1.

6.1.2.2 Soluo de hidrxido de sdio (NaOH) 32% (m/v)


Em um bquer, sobre banho de gelo, dissolver cuidadosamente 320 g de hidrxido de sdio em
cerca de 800 mL de gua. Esfriar. Transferir para balo volumtrico de 1 L e completar volume.

6.1.2.3 Soluo de cido brico (H3BO3) 2% (m/v)


Dissolver 20,00 g de cido brico em 700 mL de gua quente. Homogeneizar. Deixar esfriar,
transferir para um balo de 1000 mL e avolumar.

6.1.2.4 Soluo de cido sulfrico (H2SO4) 0,05 M


Conforme item 6.1.1.5.

6.1.2.5 Soluo de cido clordrico (HCl) 0,1 M


Conforme item 6.1.1.7.

6.2 Digesto
6.2.1 Mtodo micro-Kjeldahl

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Pesar, em balana analtica, cerca de 0,25 g de amostra em papel de pesagem e transferir para o
tubo. Adicionar aproximadamente 2,5 g de mistura cataltica e 7 mL de cido sulfrico. Aquecer
em bloco digestor, realizando uma rampa conforme tabela 1, at o lquido se tornar lmpido e
transparente, de tonalidade azul-esverdeada. Deixar esfriar. Adicionar um pouco de gua apenas
para limpar as paredes do tubo.
Tabela 1. Rampa de aquecimento para digesto de amostras para determinao de protena
bruta (mtodo micro-Kjeldahl).
ETAPA
TEMPERATURA
TEMPO
1
50C
30 minutos
2
100C
20 minutos
3
150C
20 minutos
4
200C
20 minutos
5
250C
20 minutos
6
300C
20 minutos
7
350/420C*
At clarear
* Para produtos lcteos manter a 350C; outros produtos: 420C.

6.2.2 Mtodo macro-Kjeldahl


Pesar aproximadamente entre 0,5 g e 1 g de amostra homogeneizada e transferir para tubo
macro-Kjeldahl identificado. Adicionar aproximadamente 5 g de mistura cataltica e 20 mL de
cido sulfrico concentrado.

Se a amostra for muito gordurosa, adicionar 30 mL de cido

sulfrico. Aquecer a 420C at que o contedo dos tubos clareie por completo. Se necessrio,
fazer rampa de aquecimento (tabela 2). Se, aps digesto, as amostras no forem imediatamente
destiladas, adicionar 20 mL de gua.

Tabela 2. Exemplo de rampa de aquecimento para digesto de amostras de leite e derivados para
determinao de protena bruta (mtodo macro-Kjeldahl).
ETAPA
TEMPERATURA
TEMPO
1
150C
15 a 20 minutos
2
300C
15 a 20 minutos
3
400C
20 minutos
4
420C
At clarear

6.3 Destilao e titulao


6.3.1 Mtodo micro-Kjeldahl

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Levar ao destilador de nitrognio um erlenmeyer contendo 50 mL de soluo de cido brico 4%
com indicador misto. Acoplar o tubo de micro-Kjeldahl ao destilador.

Adicionar a soluo de hidrxido de sdio 50% (aproximadamente 20 mL) at obter uma soluo
de cor negra, que indicativa da neutralizao da reao.
Proceder destilao. Recolher o volume necessrio para a completa destilao da amnia.
Pode-se testar o ponto final da destilao com papel indicador de pH at que no ocorra mais
reao alcalina. A soluo coletora deve ser mantida fria durante a destilao.
A titulao poder ser realizada com soluo fatorada de cido sulfrico 0,05 M ou de cido
clordrico 0,1 M.
Digerir, destilar e titular uma prova em branco, com todos os reagentes exceto com a amostra.
Amostras com alto teor de gordura ou que formem espuma durante a digesto ou destilao
podem ser adicionadas de algumas gotas de anti-espumante.

6.3.2 Mtodo macro-Kjeldahl


Levar os tubos ao conjunto de destilao/titulao, operando-o conforme instruo de uso.

Recolher o destilado em cido brico 2% (m/v) e titular. A titulao poder ser realizada com
soluo fatorada de cido sulfrico 0,05 M ou de cido clordrico 0,1 M, at indicao da viragem
pelo equipamento.
Digerir, destilar e titular uma prova em branco, com todos os reagentes exceto com a amostra.
Amostras com alto teor de gordura ou que formem espuma durante a digesto ou destilao
podem ser adicionadas de algumas gotas de anti-espumante.

6.4 Padronizao da soluo titulante


A padronizao da soluo titulante dever ser registrada no formulrio Padronizao da soluo
titulante, Anexo D do POP POA/SLAV/09 Controle de reagentes, preparo de solues, curvas de
calibrao e padronizao de solues titulantes.

6.4.1 Soluo de cido sulfrico 0,05 M


Realizar a padronizao em triplicata.

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Colocar cerca de 5 g de Na2CO3 em cadinho de porcelana de 50 mL.
Comprimir a substncia contra as paredes do cadinho, com uma esptula.
Aquecer a 300C, durante duas horas utilizando um forno mufla. Transferir o Na2CO3 para um
dessecador e deixar esfriar.
Pesar adequadamente (com ajuda de papis de seda), em um erlenmeyer de 250 mL, cerca de
0,130 g de Na2CO3. Adicionar cerca de 75 mL de gua deionizada e trs gotas de soluo de
vermelho de metila 0,1% (m/v). Titular com soluo de cido sulfrico 0,05 M. Calcular o fator de
correo (f) utilizando a seguinte frmula:

Onde:
m = massa (g) de carbonato de sdio;
V = volume (mL) da soluo de cido sulfrico gasto na titulao;
M = concentrao (molaridade) da soluo de acido sulfrico utilizada.

6.4.2 Soluo de cido clordrico 0,1M


Realizar a padronizao em triplicata.
O procedimento de tratamento do sal (Na2CO3) e o clculo do fator de correo (f) devero ser
realizados conforme o item 6.4.1.
Pesar adequadamente (com ajuda de papis de seda), em um erlenmeyer de 250 mL, cerca de
0,132 g de Na2CO3. Adicionar cerca de 75 mL de gua deionizada e uma gota de soluo de
vermelho de metila 0,1% (m/v). Titular com soluo de cido clordrico 0,1 M.

6.5 Teste de recuperao de nitrognio

6.5.1 Mtodo micro-Kjeldahl


Triturar o sulfato de amnio em gral e secar em estufa a 102C por quatro horas. Em um tubo de
destilao, pesar 0,15 g de sulfato de amnio. Adicionar ao tubo 2,5 g de mistura cataltica e
cerca de 7 mL de cido sulfrico. Levar o tubo para a digesto junto com as amostras realizando
o mesmo procedimento. Aps a digesto, levar ao destilador de nitrognio realizando o mesmo

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procedimento de uma amostra. Aps a destilao, titular o recuperado e calcular o percentual de
nitrognio recolhido (% Nr) atravs da seguinte frmula:

Onde:
% Nr = percentual de nitrognio recolhido;
V = volume gasto de soluo titulante (mL);
B = volume do branco (mL);
m = massa de sulfato de amnio (g);
CT = concentrao terica (molaridade) da soluo titulante;
FC = fator de correo da soluo titulante

6.5.2 Mtodo macro-Kjeldahl


Triturar o sulfato de amnio em gral e secar em estufa a 102C por quatro horas. Em um tubo de
destilao, pesar 0,25 g de sulfato de amnio. Adicionar 5 g de mistura cataltica e 20 mL de cido
sulfrico. Proceder digesto. Destilar e titular conforme programao do equipamento (com
adio automtica de gua e de hidrxido de sdio). Calcular o percentual de nitrognio recolhido
(% Nr) conforme item 6.4.1.

6.5.3 Recuperao em funo da pureza do sulfato de amnio


O resultado da recuperao (% Nrec) deve ser maior que 99,5%, calculado pela seguinte frmula:

Onde:
% Nr = percentual de nitrognio recolhido;
% N = percentual de nitrognio de acordo com o grau de pureza do sulfato de amnio (tabela 3).

Tabela 3. Percentual de nitrognio de acordo com o grau de pureza do sulfato de amnio, para
avaliao da recuperao na determinao de protena bruta (mtodos macro e micro-Kjeldahl).
GRAU DE PUREZA
PERCENTUAL DE NITROGNIO
99,5%
21,09%
99,6%
21,12%

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99,7%
99,8%
99,9%

21,14%
21,16%
21,18%

7 Resultados
Em casos de funcionamento inadequado do equipamento, quebra de tubos ou perda de amostra
durante a realizao do ensaio, os resultados so desconsiderados e o ensaio repetido.
Os resultados so aceitos se observadas todas as precaues analticas e se realizados todos os
procedimentos em conformidade com este mtodo.

7.1 Clculos e expresso dos resultados


O resultado a ser expresso a mdia das duplicatas, em g.100g-1 de protena bruta deve ser
calculado de acordo com as frmulas abaixo:

7.1.1 Clculo do nitrognio total:

Onde:
V = volume de soluo titulante (mL) gasto na titulao;
B = volume gasto (mL) na titulao da prova em branco;
CT = concentrao terica (molaridade) da soluo titulante;
FC = fator de correo da soluo titulante;
m = massa de amostra (g).
7.1.2 Clculo da protena bruta (g.100g-1):

Onde:
PB = protena bruta (g.100 g-1);
% N = nitrognio total;
FE = fator emprico (Tabela 4).
Tabela 4. Fatores empricos de transformao do nitrognio em protena, para clculo da protena
bruta de amostras de alimentos pelos mtodos macro e micro-Kjeldahl.

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ALIMENTO
FATOR EMPRICO
Leite e derivados
6,38
Trigo e derivados
5,83
Outros alimentos
6,25
Os clculos so realizados atravs da planilha Clculos - Determinao de protena bruta
(Anexo A).

7.1.3 Relao umidade/protena (U/P):

Onde:
Um = Umidade mdia (g.100g-1), determinada conforme MET POA/SLAV/27;
PBm = protena bruta mdia (g.100g-1).

7.2 Validao da planilha


A planilha Clculos Determinao de protena bruta deve ser validada conforme descrito no
POP POA/SLAV/15, atravs de clculos manuais os quais devem ser registrados no formulrio
Validao de planilhas eletrnicas, Anexo M do POP POA/SLAV/15.

8 Arquivamento dos registros


A planilha de clculo deve se mantida protegida na pasta eletrnica Resultados. O formulrio de
validao da planilha de clculos deve ser arquivado conforme descrito no POP POA/SLAV/15 e o
formulrio de padronizao da soluo titulante conforme POP POA/SLAV/09.

9 Referncias
BRASIL. Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento. Mtodos analticos fsicoqumicos para controle de produtos crneos e seus ingredientes, sal e salmoura. Instruo
Normativa n. 20, de 21de julho de 1999. Braslia: Dirio Oficial da Unio, Seo 1, de 27 de julho
de 1999.
BRASIL. Ministrio da Agricultura e Abastecimento. Secretaria de Defesa Agropecuria. Instruo
Normativa n 68 de 12 de dezembro de 2006. Mtodos analticos fsico-qumicos para
controle de leite e produtos lcteos. Braslia: Dirio Oficial da Unio, 14/12/2006.

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10 Anexos
Anexo A MET/POA/SLAV/37/01 Planilha Clculos Determinao de protena bruta.

11 Alteraes
Substituda concentrao do cido sulfrico de 0,1 N por 0,05 M;
Item 1: excludo no Laboratrio de Produtos de Origem Animal POA/SLAV;
Item 3.1: includo cido clordrico (HCl);
Item 6: excludo Dados brutos Determinao de protena bruta (Anexo A)., includo Dados
brutos, Anexo A do POP POA/SLAV/15 - Procedimentos de rotina na anlise fsico-qumica de
produtos de origem animal;
Item 6.1.1.5: includo Na capela de exausto;
Itens 6.3.1 e 6.3.2: includo cido clordrico 0,1 M;
Item 6.4: includo A padronizao da soluo titulante dever ser registrada no formulrio
Padronizao da soluo titulante, Anexo D do POP POA/SLAV/09 - Controle de reagentes,
preparo de solues, curvas de calibrao e padronizao de solues titulantes;
Itens 6.4.1 e 6.4.2: includos;
Item 7.1: excludo O clculo realizado atravs das planilhas eletrnicas Clculos
Determinao de protena bruta (Anexo B) disponvel no computador da unidade. Includo O
resultado a ser expresso a mdia das duplicatas, em g.100g-1 de protena bruta e deve ser
calculado de acordo com as frmulas abaixo;
Item 7.2: excludo quinzenalmente, atravs de clculos manuais que devem ser registrados no
formulrio Validao da planilha de clculos - Determinao de protena bruta (Anexo C).
Includo validada conforme descrito no POP POA/SLAV/15, atravs de clculos manuais os
quais devem ser registrados no formulrio Validao de planilhas eletrnicas, Anexo M do POP
POA/SLAV15;
Item 8: excludos O formulrio Dados Brutos Determinao de protena bruta deve ser
arquivado na pasta Dados Brutos e O formulrio de Validao da Planilha de Clculos
Determinao de protena bruta deve ser arquivado na pasta Validao de Planilha de Clculos
da unidade. Includo O formulrio de validao da planilha de clculos deve ser arquivado

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conforme descrito no POP POA/SLAV/15 e o formulrio de padronizao da soluo titulante
conforme POP POA/SLAV/09;
Item 10: excludos Anexo A MET/POA/SLAV/37/01 Formulrio Dados Brutos Determinao de
protena bruta e Anexo C MET/POA/SLAV/37/01 Formulrio Validao da planilha de clculos Determinao de protena bruta. Substitudo Anexo B por Anexo A;
Anexo A: Formulrio Dados Brutos Determinao de protena bruta substitudo pela planilha
Clculos Determinao de protena bruta;
Anexo B: agora Anexo A. Excludos campos: referente a recuperao do nitrognio e a data;
Anexo C: Formulrio Validao da planilha de clculos - Determinao de protena bruta,
excludo.

No h necessidade de complemento de relatrio de confirmao de desempenho em


funo das alteraes realizadas.

12 Responsabilidades
O Responsvel pelo POA/SLAV deve garantir a elaborao, aprovao, emisso, distribuio de
cpias, implementao, capacitao do pessoal para execuo, gerenciamento de no
conformidades, anlise crtica e reviso deste MET.
A UGQ responsvel pela verificao deste MET.

Elaborao/Reviso:

Aprovao:

Verificao:

Ana Paula Pereira de Melo POA/SLAV

Cristhiane Cattani POA/SLAV

Rosane Carlessi UGQ

Data: 21/07/2014

Data: 21/07/2014

Data: 24/07/2014