TRANSCRIPTOMA

- Northern

blot

- Aporta informacin sobre la presencia de un transcrito, su abundancia y su tamao

- Electroforesis: Se realiza en condiciones desnaturalizantes, Gel: agarosa 0,8-1,4% y
formaldehdo 6%, en buffer MOPS (3-(N-morfolino)propano-sulfnico)
- Las muestras deben desnaturalizarse, buffer de carga: MOPS, formamida, formaldehdo,
colorante
- Transferencia: por capilaridad o vaco, similar a Southern
- Hibridacin: similar a Southern, buffer con ms formamida (50%)
- Para comparar diferencias en los niveles de
expresin de un gen es muy importante la
utilizacin de un control: generalmente un
gen que se exprese constitutivamente:
citoesqueleto (-actina), un gen de ARNr. Las
intensidades de la seal del gen en estudio
deben normalizarse con las del control

- RT-PCR

- PCR tiempo real

- ANLISIS

DE LA EXPRESIN DIFERENCIAL

- Obtener informacin sobre genes que se transcriben nicamente o con mayor intensidad
en una determinada condicin respecto a otra. Se busca analizar el transcriptoma completo.
- Estos mtodos se basan en la utilizacin de dos poblaciones de ADNc obtenidas a partir
del ARN de las dos condiciones a ensayar:
Mtodos clsicos:
- Hibridacin substractiva
- Differential display
- cDNA-AFLP
- ESTs
Mtodos basados en genmica:
- Microarreglos
- RNA sequencing

- ANLISIS

DE LA EXPRESIN DIFERENCIAL

- Hibridacin substractiva

-Se basa en la eliminacin de las molculas de ADNc que estn repetidas en

las dos condiciones a travs de un proceso de hibridacin; las molculas
hbridas formadas entre ADNc de las dos condiciones son entonces
eliminadas, el resto (expresadas diferencialmente) se aslan y estudian
.
- p.ej. Sistema SSH (Supression Substractive hybridization), de
Clontech

- Hibridacin substractiva

- ANLISIS

DE LA EXPRESIN DIFERENCIAL

- cDNA-AFLP

- Similar al mtodo de AFLPs pero partiendo del ADNc obtenido a partir de dos
condiciones en lugar de DNA genmico. Los patrones de bandas obtenidos
con ambas condiciones se comparan para detectar bandas presentes slo en
una condicin, indicativo la expresin diferencial de un transcrito.

- ANLISIS

DE LA EXPRESIN DIFERENCIAL

- Differential display
- Consiste en visualizar en un gel el nivel de expresin de los transcritos provenientes
de dos condiciones diferentes y detectar diferencias en la misma.
- Actualmente se utilizan mtodos basados en PCR (DD-PCR).
- Esquema:
- Para cada poblacin de RNA se ponen 3 reacciones de sntesis de ADNc,
cada una con un primer oligo-dT anclado: T12A, T12C, T12G
- Finalizada la sntesis de la hebra de ADNc, se aade el primer arbitrario
(10-12 bases) y todos los componentes para una reaccin de PCR, con 32P-dCTP
- Se cargan las muestras, previa desnaturalizacin, en un gel de acrilamida
del 6% desnaturalizante (7 M urea). Autorradiografa
- Cortar las bandas de inters (expresadas diferencialmente), eluir el ADN y
precipitar con acetato de potasio, glicgeno y etanol.
- Reamplificar por PCR usando la combinacin adecuada de primer T12M
(M= A, C o G) con arbitrario
- Correr un gel de agarosa con el producto de la PCR. Extraer el fragmento
del gel para subclonarlo, secuenciarlo, etc.

- Differential display
Para cada condicin se tiene un pool de RNA
que se utiliza para sntesis de ADNc y
amplificacin con: primer oligo-dT anclado +
primer arbitrario. Se obtiene as un patrn de
bandas amplificadas para cada condicin, las
cuales se comparan en un gel de
poliacrilamida para detectar transcritos
expresados diferencialmente.

- ANLISIS

DE LA EXPRESIN DIFERENCIAL

- SAGE: Serial analysis of gene expression

- Se basa en tres principios

- Una secuencia corta, tag (etiqueta), de 10-14 nucletidos, contiene suficiente
informacin para identificar de forma nica un transcrito.
- Una vez aislados, estos tags pueden unirse para formar largas series de
molculas de ADN que pueden clonarse y secuenciarse.
- La cuantificacin del nmero de veces que un determinado tag est presente en
una condicin indica el nivel de expresin del gen correspondiente en esa
condicin

- SAGE
- Se cortan con las enzimas NlaIII y
BsmFI las secuencias tag de cada
transcrito de una condicin determinada
- Se ligan las secuencias aisladas
formando largas cadenas de ADN que
se secuencian
- La secuencia nos indica el nmero de
veces que un tag particular est
presente, lo que refleja la abundancia de
ese transcrito en una determinada
condicin, permitiendo hacer
comparaciones cuantitativas entre dos o
ms condiciones
- Finalmente se identifican los genes a
que corresponden los tags mediante
comparacin de la secuencia del tag con
una base de datos que contenga todos
los genes caracterizados de la especie
en cuestin

- SAGE
Obtencin de los tags: Se corta con NlaIII, se aaden adaptadores (linkers) para
BsmFI y se corta con esta enzima. BsmFI es del tipo IIs, corta a una distancia de unos
15 pares de bases del sitio de reconocimiento (en el linker), generando fragmentos con
una secuencia de 15 pb (SAGE tag), que se ligan para formar concatmeros.

- ANLISIS

DE LA EXPRESIN DIFERENCIAL

- ESTs: Expressed Sequence Tags

- Ms que un mtodo de differential display es una tcnica que permite identificar cientos de
transcritos que se estn expresando en una clula en un momento y condiciones
determinados: transcriptoma
- Consiste en la obtencin de ADNc de la muestra o muestras en estudio, y en la realizacin
de una nica reaccin de secuencia que permita identificar mediante bsquedas en bases
de datos los genes a que corresponden cada uno de los clones secuenciados. Se obtiene
as una representacin del transcriptoma que puede compararse entre dos condiciones
distintas.

- MICROARREGLOS
- Un arreglo de ADN es una coleccin de molculas de ADN (ADNC u oligonucletidos)
dispuestas sobre un soporte slido como una matriz de filas y columnas
- Macroarreglos: puntos sobre una membrana de nylon o nitrocelulosa, pequeo
nmero. Las sondas (ADNc que proviene de dos condiciones) se marcan por
radiactividad. Se detecta la intensidad de la seal en cada punto y se compara la misma
entre las dos condiciones.
- Microarreglos: Habitualmente oligonucletidos (20-80 nucletidos), cada uno de ellos
es una secuencia identificativa de un gen. Contienen hasta 40.000-60.000 puntos. El
marcaje de las sondas de ADNc se realiza con fluorescencia: rojo (Cy5) para la
condicin problema y verde (Cy3) para la condicin de referencia. El detector compara la
intensidad de la fluorescencia e integra el resultado en cada punto, observndose el
resultado final como un punto rojo (genes sobreexpresados en la condicin problema),
verde (genes con menor expresin en la condicin problema) o amarillo-naranja (genes
con expresin similar en las condiciones problema y de referencia)

Confeccin del microarreglo

1. Colecciones de Expressed
Sequences Tags (EST)
2. Bibliotecas de ADNc
3. Secuencias genmicas

Procedencia de la informacin de
secuencia para la elaboracin de
los oligonucletidos o fragmentos
de ADN que se fijarn al arreglo.

Confeccin de arreglos
MICROARREGLOS
Siembra 0,25-1 nL/punto
generando puntos de 100150 m de dimetro.

Confeccin de microarreglos

Hibridacin en microarreglos

El experimento tipo consiste en la comparacin de los niveles de expresin de

todos los genes de un organismo en dos estados celulares (condiciones).
Proceso
1. Aislar ARNm a partir de una muestra biolgica.
2. Convertir el ARNm en ADNc, utilizando una transcriptasa reversa.
3. Marcar el ADNc con nucletidos fluorescentes (Cy5 y Cy3)
4. Hibridar el ADNc marcado en el microarreglo.
5. Detectar y cuantificar la fluorescencia utilizando un laser scanner confocal.
6. Analizar los resultados.

Sntesis de ADNc

Hibridacin en microarreglos
1

Cy5

Cy5 = 633 nm

Cy3 = 532 nm

Cy3

Expresin de 1 > 2
Expresin de 1 = 2
Expresin de 1 < 2

Microarreglo de levadura

- RNA

Sequencing

- Secuenciacin del transcriptoma mediante los nuevos mtodos de secuenciacin

(Next Generation Sequencing)
- Permite la obtencin de millones de secuencias: gran precisin estadstica
- Permite la deteccin de ARNm con maduracin alternativa o transcritos no descritos,
mientras que los microarreglos slo permiten estudiar transcritos ya conocidos (lo que
se ha depositado en el microarreglo)
-Puede realizarse con especies en las cuales no existe informacin previa de su
secuencia genmica (si bien los resultados ptimos se consiguen cuando s est
secuenciado el genoma)

PROTEOMA

ESTUDIOS CON PROTENAS: SDS-PAGE

SDS-PAGE: Polyacrilamide Gel Electrophoresis. Permite separar protenas desnaturalizadas
en un gel de poliacrilmida en funcin de su tamao.
Se utiliza acrilamida/bis 37:1. La mezcla que se indica es
para un gel con un porcentaje de acrilamida del 12%, si este
porcentaje vara debe recalcularse la cantidad de
acrilamida/bis y de agua destilada a aadir.
Mezcla para gel separador:
Acrilamida/bis 40%

9 ml

Tris-HCl 1,5 M pH 8,5 7.5 ml

Agua destilada

13 ml

10% SDS

300 l

10% APS

100 l

TEMED

15 l

Mezcla para gel concentrante:

Acrilamida/bis 40%

1 ml

Tris-HCl 1M pH 6,8

1.25 ml

Agua destilada

7.6 ml

10% SDS

100 l

10% APS

35 l

TEMED

5 l

SDS-PAGE
Buffers y soluciones
Tampn de electroforesis:
25 mM Tris, 192 mM Glicina,
0.1% SDS, pH 8.3
Tampn de muestra:
0.3 M TrisHCl, pH 6.8, 5%
SDS, 50% glycerol, Azul de
bromofenol 0.01%, 2-mercaptoetanol 0,5%
Solucin de teido:
0.125% Coomassie Brilliant
Blue R-250, 50% Metanol, 10%
cido Actico
Solucin de desteido:
50% Metanol, 10% cido
Actico

SDS-PAGE
Tincin con Coomasie
Solucin de teido:
0.125% Coomassie Brilliant
Blue R-250, 50% Metanol, 10%
cido Actico

Tincin con sales de plata

1- Etanol, cido actico, H2O (30:10:60)
2- Etanol 30%
3- Nitrato de plata 0,1%
4- NaCl, CuSO4, NH4OH, tiosulfato sdico
5- cido actico 1%

PAGE
PAGE: Gel de poliacrilamida nativo, sin SDS
- Cuando se pretende extraer una protena del gel de forma que conserve su actividad, o
bien cuando se quiere ensayar una actividad enzimtica en el propio gel, las protenas
no deben desnaturalizarse. Para ello se llevan a cabo las siguientes modificaciones:
- No se aade SDS al gel, buffer de muestra ni buffer de electroforesis
- No se aade -mercaptoetanol al buffer de muestra para evitar la reduccin
de los puentes disulfuro
- Las muestras no se calientan y la electroforesis se desarrolla a 4C
- Para ver actividad en el gel: ste se incuba con el sustrato adecuado hasta
que aparezcan bandas de actividad
Debe tenerse muy en cuenta el pH del gel, ya que las protena entrarn y se movern en
el gel slo si tienen carga neta negativa, y esto depende de su punto isoelctrico.
- Si se quiere recuperar la actividad de una protena despues de un SDS-PAGE existen
protocolos para renaturalizar la protena

Western Blot
Deteccin de una protena mediante anticuerpos tras un SDS-PAGE

Western Blot
Actividad de la enzima
fosfatasa alcalina
conjugada con el anticuepo
secundario

Western Blot

Reaccin cruzada con anticuerpos policlonales

Western Blot

Cuantificacin de la protena tras un Western blot como mtodo de

determinacin de la expresin del gen

Tcnicas de Protemica
Electroforesis bidimensional: 2D SDS-PAGE

Isoelectroenfoque:
separacin de las
protenas en funcin
de su punto
isoelctrico: pH al cual
la carga neta total de la
protena es 0
SDS-PAGE:
separacin de las
protenas en funcin
de su tamao

Tcnicas de Protemica
Electroforesis bidimensional: 2D SDS-PAGE

Pueden llegar a
detectarse todas las
protenas que se estn
expresando en una
clula
Permite establecer
comparaciones entre
dos condiciones:
sistema de anlisis de
expresin diferencial

Tcnicas de Protemica
Mtodos de identificacin de las protenas
Las protenas separadas en un 2D (o purificadas por cualquier otro mtodo) pueden
analizarse para conocer su masa molecular, huella peptdica y secuencias de pptidos
internos en sistemas de espectrometra de masas; esto permite su identificacin.
- Huella peptdica: tras digestin con tripsina se obtiene la masa molecular precisa de todos
los pptidos resultantes, la cual se compara con la masa virtual obtenida de la informacin
de los genes en la base de datos. Se lleva a cabo con un MALDI-TOF (Matrix-assisted laser
desorption ionization-time of flight)
- Para completar la identificacin puede hacerse una microsecuenciacin de pptidos
internos con un LC-MS/MS (Liquid chromatography-tandem MS). Se obtienen secuencias
de longitud corta (6-14 aminocidos) que a menudo presentan ambigedades.
- Microsecuenciacin por Degradacin de Edman : Mtodo clsico de secuenciacin de
pptidos. Requiere al menos 0,5 g de protena. Es un mtodo ms directo, pueden
obtenerse secuencias de hasta 20-25 aa, mayor fiabilidad.

Tcnicas de Protemica
Huella peptdica

Tcnicas de Protemica
Huella peptdica

Tcnicas de Protemica
Huella peptdica

SECUENCIACIN DEL ADN

Mtodo de Sanger o de los didesoxinucletidos

- Se basa en la utilizacin de terminadores: molculas de didesoxinucletidos que al
incorporarse a la cadena de ADN detienen la reaccin de polimerizacin.

- Una mezcla de los 4 desoxinucletidos con 1 didesoxinucletido concreto

ocasionar que la reaccin de polimerizacin se detenga al azar generando molculas
de diferente tamao que se separan en un gel de acrilamida

ANLISIS DE LA SECUENCIA DE
NUCLETIDOS
ddATP

ddGTP

5-A-3

3-TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5
5-AG-3

5-AGA-3
5-AGACCTGCA-3

5-AGACCTG-3
5-AGACCTGCATTTATAAG-3

5-AGACCTGCATTTA-3
5-AGACCTGCATTTATA-3
5-AGACCTGCATTTATAA-3
5-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCA-3

5-AGACCTGCATTTATAAGCCG-3
5-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCG-3

4 reacciones: ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP

5-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCAG-3

ddATP
ddCTP

ddTTP

3-TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5
5-A-3
3-TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5
3-TCTGGACGTAAATATTCGGCGGCGTCA-5
5-AGA-3
5-AGAC-3
5-AGACCT-3
5-AGACC-3
5-AGACCTGCA-3
5-AGACCTGCAT-3
5-AGACCTGC-3
5-AGACCTGCATTTA-35-AGACCTGCATT-3
5-AGACCTGCATTTATAA-3
5-AGACCTGCATTTATAAGC-3
5-AGACCTGCATTT-3
5-AGACCTGCATTTATAAGCC-3
5-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCA-3
5-AGACCTGCATTTAT-3

5-AGACCTGCATTTATAAGCCGC-3
5-AGACCTGCATTTATAAGCCGCC-3
5-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGC-3

5-AGACCTGCATTTATAAGCCGCCGCAGT-3

- Gel de acrilamida con reacciones de secuencia, se visualiza una autorradiografa

generada por la seal del istopo 35S-dATP

- En la actualidad el proceso se hace de forma automtica. Los terminadores llevan

incorporados colorantes fluorescentes de diferente longitud de onda, que permiten
hacer la reaccin en un nico tubo. Tras un proceso de electroforesis capilar un
detector lser recoge la seal de cada terminador (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP)

Secuenciacin automtica

Secuenciacin primer walking

- Tenemos un fragmento para
secuenciar clonado en un
vector plasmdico. Se lleva a
cabo la primera reaccin de
secuencia con un primer
universal. A partir de la
secuencia obtenida se disea
un segundo primer hacia el
extremo 3 de la misma para
que haga de iniciador en la
siguiente reaccin, y as
sucesivamente hasta completar
el fragmento a secuenciar
5

Secuenciacin shot-gun

Estrategias de secuenciacin en proyectos genoma

Shot-gun

Clon a clon de
una genoteca

Algunos sitios web relacionados con proyectos genoma