Mtodos de Histologia

maro 22, 2012

Embriologia e Histologia Histologia histologia, mtodos, Microscopia Deixe um
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Microscopia
Na aula prtica , foi constado que o microscpio possui vrios componentes e que
cada um possui uma determinada funo. Entre os componentes podemos citar: lente
ocular (10x), tubo binocular, revlver, objetiva (4x,10x,40x,100x), prendedor de lmina,
diafragma do condensador, diafragma do campo, base, regulador da intensidade
luminosa, macromtrico e micromtrico. Todos esses componentes funcionam em
conjunto com o objetivo de aumentar a imagem a ser visualizada.
Durante a prtica foi aprendido a manusear o microscpio, entre os conceitos bsicos
esto, verificar se a voltagem do aparelho condiz com a da tomada, antes de ligar
ajustar a intensidade da luz e deixar o aparelho na objetiva de 4x.
Para o ajuste do foco necessrio o manuseio do macro e micromtrico sendo que o
macro serve apenas para a primeira aproximao e micro para o ajuste final, pois seu
movimento mais sensvel.

Histologia
Na primeira aula em laboratrio de histologia foi posto em prtica conceitos visto em
sala de aula, onde revisamos passo a passo o preparo de lminas atravs do mtodo
com parafina.
O primeiro passo a colheita que pode ser realizada atravs de necropsia.
O segundo passo a fixao, que pode ser usado formaldedo, lcool, acido actico
ou acido pcrico, que tem como objetivo interromper a morte programada da clula e
manter como proporo de 30/1 em pelo menos 24 horas.
O terceiro passo a desidratao, que tem como objetivo eliminar toda gua existente
na clula. Para isso se usa o etanol 70% at chegar ao 100%.
O quarto passo a diafanizao que tem como objetivo garantir que no existe mais
gua na clula. Nesse processo usado o xileno, que torna miscvel o tecido com a
parafina.
O quinto passo a incluso, em que se utiliza a parafina quente no seu ponto de fuso
(mais ou menos 45C).
O sexto passo o corte, realizado pelo micrmetro, esse corte deve ser extremamente
fino com aproximadamente 5m.

O stimo passo o banho-maria em que a parafina derrete e cola na lmina de vidro,

que seria a montagem.
O oitavo passo a colorao. Nesse processo removido a parafina e hidratado o
tecido que seria corado e desidratado rapidamente em lcool 70% a 100%.
Para finalizar o processo realizada a montagem da lmina, e deixando a mesma em
blsamo do Canad para conservao do tecido.

Mtodos de estudos Histolgicos

maro 15, 2012
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Vrios so os mtodos de estudos dos tecidos, variando do estudo dos tecidos in

vivo at aqueles que utilizam os tecidos mortos. O mtodo mais utilizado em Histologia
opreparado histolgico permanente (lmina histolgica) estudado em microscpio
ptico. A seguir descrevemos as etapas de produo de uma lmina histolgica:
1 Etapa: Coleta da Amostra
A primeira etapa de todo o processo de preparao de uma lmina histolgica consiste
em coletar a amostra, ou seja, obt-la e isto pode ser feito, por exemplo, por
necropsia.
As peas cirrgicas grandes ou de autpsia devem ser clivadas previamente para
reduzir sua espessura permitindo a penetrao fcil do fixador. O princpio
fundamental de clivagem que o fragmento possua em torno de 4 mm de espessura.

2 Etapa: Fixao
A base de uma boa preparao histolgica a fixao que deve ser completa e
adequada. Para tanto preciso tomar algumas precaues que so obrigatrias:
a) O material coletado deve ser imerso rapidamente no fixador;

b) O volume de fixador deve ser em torno de 30 vezes maior que o volume da pea
coletada.

Os principais objetivos da fixao so:

a) Inibir ou parar a autlise tecidual;
b) Coagular ou endurecer o tecido e tornar difusveis as substncias insolveis;
c) Proteger, atravs do endurecimento, os tecidos moles no manuseio e
procedimentos tcnicos posteriores;
d) Preservar os vrios componentes celulares e tissulares;
e) Melhorar a diferenciao ptica dos tecidos;
f) Facilitar a subseqente colorao.

3 Etapa: Desidratao
Antes que um material de incluso, tal como a parafina, possa penetrar no tecido seu
contedo em gua deve ser removido. A desidratao levada a efeito imergindo o
bloco de tecido em concentraes crescentes de lcool etlico. O lcool o agente
mais comumente utilizado neste processo, sendo empregado numa srie crescente
(70% 80% 90% 100%) para se evitar a retrao pronunciada do tecido
ocasionando leses estruturais da clula de carter irreversvel. O lcool tem a
vantagem de endurecer mais o tecido. O volume de lcool dever ser 10 a 20 vezes
maior que o volume da pea.
Vrias so as substncias utilizadas como agentes de desidratao: lcoois etlico,
butlico, metlico e isoproplico, a acetona, o ter, o clorofrmio e o xido propileno. O
lcool etlico o mais utilizado em tcnica de rotina.
4 Etapa: Diafanizao (Clarificao)
A impregnao do tecido com meio de incluso impossvel nesse estgio porque as
substncias semelhantes parafina usadas para a incluso no se misturam com o
lcool. O tecido deve, portanto, ser imerso em um produto qumico e que o lcool e a
parafina sejam solveis. Assim a diafanizao consiste na infiltrao do tecido por um
solvente da parafina que seja ao mesmo tempo desalcolizante. A parafina no se
mistura com gua e nem com lcool. Ambos devem ser completamente removidos
para que a parafina possa penetrar eficientemente no tecido. O xilol comumente
utilizado. Tal produto qumico muitas vezes chamado de agente clarificador porque
torna o tecido semi-translcido, quase transparente. Entre os reagentes mais utilizados

na fase de diafanizao podemos citar ainda: toluol, clorofrmio, leo de cedro, benzol
e salicilato de metila.
A quantidade de xilol (substncia mais empregada) utilizada deve ser 10 a 20 vezes o
volume da pea. A durao da clarificao varia com as dimenses, a constituio do
material e a temperatura.
5 etapa: Incluso (Impregnao)
A finalidade da impregnao eliminar completamente o xilol contido no material e a
total penetrao da parafina nos vazios deixados pela gua e gordura, antes
existentes no tecido. Este processo serve tambm para preparar o material para os
cortes, removendo o clarificante e endurecendo-o suficientemente e dando-lhe a
consistncia adequada para que possa ser cortado.
O tecido passado em duas trocas de parafina para assegurar a substituio de todo
o agente clarificador pela parafina. Emprega-se a parafina a uma temperatura em
torno de 45 C (parafina fundida). O bloco de tecido permanecer imerso na parafina
fundida (em estufa) durante o tempo necessrio para a completa impregnao.
Posteriormente sero retirados da estufa e deixados temperatura ambiente at que a
parafina endurea, aps isto o bloco de parafina com o tecido ser retirado da frma e
conduzido ao corte. Pode-se citar ainda como agentes de impregnao: celoidina,
goma arbica, parafina plstica, polietileno glicol e parafina esterificada.
6 etapa: Microtomia (corte)
Para se obter cortes de material includo em parafina ou por congelao necessrio
um instrumento especial: o micrtomo. Os micrtomos variam de acordo com os
fabricantes e tem como fundamento duas peas principais: o suporte ou mandril (onde
fixada a pea a cortar) e a navalha. O suporte sempre encaixado a um parafuso
micromtrico ou a uma espiral metlica que o faz adiantar segundo seu eixo, em
medida conhecida e que pode ser regulada vontade. Esta medida tem como unidade
o micrmetro que corresponde milsima parte do milmetro. Normalmente um
micrtomo faz cortes cuja espessura varia de 1 a 50 micrmetros, mas a espessura
mais utilizada em microscopia ptica de 4 a 6 micrmetros. H vrios tipos de
micrtomos: rotativo, tipo Minot, de congelao e o destinado a trabalhos de
microscopia eletrnica.
7 etapa: Colagem do Corte Lmina
As fitas de cortes de parafina so estiradas cuidadosamente e os cortes individuais
so separados por um bisturi. Na superfcie de uma lmina de vidro feito um ponto
de aderncia (normalmente com albumina de ovo) e o corte de parafina colocado
embanho-maria (gua morna) de forma que as dobras provocadas pelo corte no
tecido desapaream. Aps o que o corte pescado com a lmina, preparada com
albumina, na qual se adere.
8 etapa: Colorao

 a tcnica tintorial empregada para facilitar o estudo dos tecidos sob microscopia. A
colorao de importncia fundamental em histologia, pois os tecidos no tratados
tm pouca diferenciao ptica. As coloraes de um modo geral se efetuam por
processos fsico-qumicos ou puramente fsicos e podem ser consideradas, segundo a
modalidade, a ao, o carter, o grau de ao, o tempo, o nmero de corantes e a
cromatizao.
Quanto cromatizao, ou seja, de acordo com o nmero de cores conferidas s
estruturas pelas coloraes simples ou combinadas, estas tomam a denominao de
coloraes monocrmicas (uma cor), bicrmicas (duas cores), tricrmicas (trs
cores) e policrmicas (mais de trs cores).
Para se corar convenientemente a clula, deve-se recorrer a um mtodo de colorao
sucessiva do ncleo e do citoplasma.
A combinao mais comum de corantes usada em Histologia e Histopatologia
aHematoxilina e Eosina (HE). A hematoxilina um corante natural obtido da casca
de pau campeche. Ela no realmente um corante e deve ser oxidada em hematena
a fim de tornar-se um corante. Ademais, o corante que resulta (hematoxilinahematena) no tem afinidade para os tecidos. Deve ser usado um mordente, como o
alumnio ou o ferro, juntamente com a mistura de hematoxilina antes que ela possa
corar os tecidos. A mistura cora em azul-prpura. A eosina um corante sinttico e
produz uma coloraovermelha.
Nas clulas coradas com HE os cidos nuclicos presentes no ncleo so corados
pela hematoxilina, dando ao ncleo um tom azul-prpura. A eosina atrada pelos
elementos bsicos da protena do citoplasma da clula, corando-o de rseo a
vermelho. Os componentes dos tecidos que se coram prontamente com os corantes
bsicos so chamados basfilos; os que tm afinidade pelos corantes cidos so
chamadosacidfilos. A hematoxilina comporta-se como um corante bsico e,
portanto, cora o ncleo de modo basfilo. A eosina um corante cido e cora os
elementos bsicos da protena do citoplasma de maneira acidfila.
Antes que o corte seja corado, a parafina em que ele foi includo deve ser removida. O
corte, que j foi aderido lmina de vidro (pescagem em banho-maria), banhado no
xilol para dissolver a parafina. Devido ao fato de muitos corantes serem solveis em
gua, torna-se necessrio remover o xilol do tecido e substitu-lo por gua
(hidratao). O corte imerso em uma srie de concentraes decrescentes de lcool
etlico at que esteja hidratado. Depois que o corte estiver hidratado procede-se
colorao propriamente dita. No caso da HE, o tecido imerso primeiramente em
hematoxilina, lavado com gua para retirada de excedente, depois imerso em eosina
e, aps isto tambm se faz lavagem do tecido.
9 etapa: Montagem

Depois que o corte tiver sido corado com a soluo apropriada, ele passado atravs
de concentraes crescentes de lcool para remover, de novo, a gua (desidratao).
Objetiva-se com esta desidratao aumentar a sobrevida do preparado histolgico.
Finalmente, o corte banhado em xilol antes de ser montado em um meio solvel em
xilol, que o meio de montagem (para os cortes de parafina usado o Blsamo de
Canad). Uma gota do meio de montagem colocada sobre o corte e a lamnula
posicionada sobre o corte de forma
delicada, de uma forma tal que o meio de montagem cubra completamente o corte.
Depois a lamnula comprimida com firmeza sobre o corte e o meio de montagem se
espalha formando uma delgada pelcula entre a lmina e a lamnula que
posteriormente vo estar firmemente aderidas uma outra pela estabilizao do meio
de montagem.