CONTROL MICROBIOLGICO DE

MEDICAMENTOS Y COSMTICOS

Mara Cristina Fernndez

Curso 2010

CONTROL HIGIENICO DE PRODUCTOS NO OBLIGATORIAMENTE

ESTERILES

El Control Higinico Sanitario de los productos

farmacuticos no obligatoriamente estriles contribuyen
a la seguridad e inocuidad de los mismos debido a que
evidencia el cumplimiento de las Buenas Prcticas de
Fabricacin.
Estos productos pueden llegar a ser vehculo de
microorganismos patgenos, de alteracin de productos o
de indicadores de calidad higinica deficiente.
Es necesario fijar lmites de aceptabilidad para el Control
Higinico
de
productos
farmacuticos
no
obligatoriamente estriles con el fin de garantizar su
inocuidad y estabilidad desde el punto de vista
microbiolgico.

El contenido de microorganismos en un producto

farmacutico no estril, provee un ndice general del
grado de contaminacin y brinda informacin acerca del
proceso de manufactura del elaborador.

Uno de los objetivos del control higinico de los

productos farmacuticos no obligatoriamente estriles es
garantizar su inocuidad y estabilidad desde el punto de
vista microbiolgico.

NORMATIVA VIGENTE

Mtodos de anlisis
Farmacopea Nacional Argentina 7 ed.
Cp.90 Control Higinico de productos no
obligatoriamente estriles

NORMATIVA VIGENTE
Disposicin

2476/2003: Soluciones
Fisiolgicas para Nebulizar

Art. 2 Las Soluciones Fisiolgicas para Nebulizar

(SFPN) debern ser comercializadas en envases
monodosis con un contenido neto de hasta 20 ml. Las
SFPN debern poseer cierre hermtico con el fin de
mantener su integridad y calidad microbiolgica de
ausencia de grmenes revivificables en un mililitro
hasta el momento del uso.

DISPOSICIN 7352/99

Lmites microbiolgicos de aceptabilidad para el Control Higinico para productos farmacuticos no obligatoriamente estriles, de acuerdo con
la va de administracin.
CATEGORIA 1
Categora 1.1.
Productos para ser aplicados sobre escaras, ulceraciones o quemaduras graves.
Ausencia de grmenes revivificables.
Categora 1.2.
Productos para ser administrados por va inhalatoria.
Recuento de aerobios viables totales: no ms de 10 por gramo o mililitro.
Ausencia de Enterobacteriaceae en un gramo o mililitro.
Ausencia de Pseudomonas aeruginosa en un gramo o mililitro.
Ausencia de Staphylococcus aureus en un gramo o mililitro.
CATEGORIA 2
Productos para ser administrados por va nasal, tica, rectal, tpica y vaginal.
Recuento de aerobios viables totales: no ms de 102 por gramo o mililitro.
Ausencia de Enterobacteriaceae en un gramo o mililitro.
Ausencia de Pseudomonas aeruginosa en un gramo o mililitro.
Ausencia de Staphylococcus aureus en un gramo o mililitro.
CATEGORIA 3
Productos para ser administrados por va oral.
Recuento de bacterias aerobios viables: no ms de 103 por gramo o mililitro.
Recuento de hongos y levaduras: no ms de 102 por gramo o mililitro.
Recuento de Enterobacteriaceae: no ms de 102 en un gramo o mililitro.
Ausencia de Pseudomonas aeruginosa (solamente en forma farmacutica oral lquida) en un mililitro.
Ausencia de Staphylococcus aureus en un gramo o mililitro.
Ausencia de Escherichia coli en un gramo o mililitro.
Ausencia de Salmonella en un gramo o mililitro.
PARA PRODUCTOS FARMACEUTICOS CUYAS MATERIAS PRIMAS SE CONSIDEREN FUENTES DE CONTAMINACION: Ausencia de
anaerobios sulfitorreductores en un gramo o mililitro.

El control microbiolgico
de los productos
farmacuticos no estriles, involucra la realizacin
de dos tipos de ensayos:
Recuentos microbianos, referidos al recuento total de
bacterias aerobias mesfilas y/o recuento de hongos y
levaduras, recuento de Enterobacteriaceae.
Investigacin de microorganismos indicadores especficos,
como Escherichia coli, Salmonella, Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus, Enterobacteriaceae.

ENTEROBACTERIACEAE
Constituye una familia de bacterias Gram negativas, anaerobios facultativos, mviles
inmviles que fermentan la glucosa y lactosa.
E. coli indicador de contaminacin fecal.
Habitat: agua, tierra, plantas, tracto gastrointestinal del hombre y animales.

Escherichia coli

Bacilo gram negativo, anaerobio facultativo, miembro de la familia

Enterobacteriaceae
Hbitat: tracto gastrointestinal del hombre y animales.
Indicador de contaminacin fecal.
Esta contaminacin puede provenir de una higiene pobre de los
operadores, falta de entrenamiento del personal en buenas prcticas de
manufactura, por el agua contaminada con heces humanas o animales
utilizada en la elaboracin de productos farmacuticos.

Aunque la mayora de las E. coli no son considerados agentes patgenos,

pueden ser patgenos oportunistas que causan infecciones en huspedes
inmunocomprometidos.
Tambin hay E. coli causantes de enfermedades gastrointestinales

Salmonella spp
bacilos gram negativos, anaerobios facultativos, miembro de la familia
Enterobacteriaceae
Hbitat: tracto gastrointestinal del hombre o animales dependiendo de la
serovariedad.
Innumerables serotipos de Salmonella son patgenos. Salmonella enterica
serovariedad Typhi y Salmonella enterica serovariedad Parathyphi
producen fiebre tifoidea y paratifoidea. Ambas enfermedades se caracterizan
por fiebre continua, cefalea intensa, malestar general, anorexia.
Otras serovariedades de Salmonella enterica de origen animal son patgenas
para los seres humanos y producen salmonelosis, enfermedad que se
manifiesta por enterocolitis aguda, de comienzo repentino, con dolor
abdominal, diarrea, nusea.

Staphylococcus aureus
bacteria gram positiva.
Su presencia en los productos farmaceuticos no estriles indica que la
contaminacin est asociada con el operador.
En las personas, el principal reservorio de Staphylococcus aureus es la
cavidad nasal, garganta y piel.
Por contacto Staphylococcus aureus produce infecciones cutneas por ello es
importante su investigacin en productos destinados a ser administrados por
va tpica, nasal u tica.
Puede multiplicarse en productos farmacuticos que van a ser
administrados por via oral y producir varias enterotoxinas.
Los sntomas predominantes de la intoxicacin estafilococica son nuseas,
vmito, clicos y postracin, a menudo se acompaa de diarrea. El modo de
transmisin es por la ingestin de un producto que contenga enterotoxina
estafilocccica.

Pseudomonas aeruginosa

bacilo gram negativo, monoflagelar, aerobio, no esporulado

Se encuentra ampliamente distribuido en suelo, agua, plantas y animales.
La contaminacin con Pseudomonas aeruginosa en un producto
farmacutico est usualmente asociada con la contaminacin del agua
utilizada para la fabricacin de dichos productos.
Por sus caractersticas nutricionales su investigacin es de importancia en
productos farmacuticos con alto contenido de oxgeno y con alto contenido
acuoso.
Es resistente a antibiticos y a otros agentes antimicrobianos como a
conservadores que forman parte de formulaciones de productos
farmacuticos.
Es considerada patgeno oportunista. Produce infecciones tanto de heridas
o quemaduras, como de piel (dermatitis). Adems produce infecciones
oculares, de odo (otitis), de vas urinarias, de vas respiratorias y
pulmonares.

TRATAMIENTO DE LOS DIFERENTES

TIPOS DE MUESTRAS SEGN:
Solubilidad de la Muestra y caractersticas de sus
componentes.
Propiedades antimicrobianas.
Grado de contaminacin esperado.

Ensayos preliminares(FNA 7ed. Cap. 90-Control higienico de

productos no obligatoriamente estriles)

Objetivo: demostrar que las muestras sometidas a las

condiciones del ensayo no inhiben la multiplicacin de los
microorganismos que pudieran estar presentes.
Efectividad

de los medios de cultivo y validez del mtodo de

recuento
Propiedades

nutritivas y selectivas de los medios y validez

del ensayo para los microorganismos especificados

Efectividad de los medios de cultivo y validez del mtodo de

recuento (FNA 7ed. Cap. 90 Control higienico de productos no
obligatoriamente estriles)
Diluir, de acuerdo a la tcnica a validar, la muestra en Solucin
reguladora de fosfato pH 7,2.
Agregar separadamente diluciones de cultivos de 24 horas de
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y
Salmonella de modo que, en las placas de recuento, siguiendo el mtodo
en estudio, el nmero de ufc hallado sea entre 30 y 300.
Controlar el mtodo de recuento, siguiendo el procedimiento
correspondiente, en presencia y ausencia de la muestra a ensayar.
El recuento de los microorganismos ensayados con la muestra no debe
diferir en ms de un factor de 5 con respecto al valor obtenido en
ausencia de la misma.

Propiedades nutritivas y selectivas de los medios y validez

del ensayo para los microorganismos especificados (FNA 7ed.
Cap. 90 Control higienico de productos no obligatoriamente estriles)
Inocular separadamente las muestras diluidas del producto a ensayar
con cultivos viables de Staphylococcus aureus, Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa y Salmonella.
Agregar 1 ml de una dilucin no menor de 10-3 de un cultivo de 24
horas del microorganismo en Solucin reguladora de fosfato pH 7,2,
Caldo Digerido de Casena-Soja o Caldo Lactosado, a la primera
dilucin del producto a ensayar y seguir el procedimiento seleccionado.

MTODOS PARA LA NEUTRALIZACIN DE AGENTES

INHIBIDORES DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

La ausencia de crecimiento de alguno de los microorganismos ensayados en

el medio correspondiente indica una inhibicin del desarrollo por parte del
producto y requiere una modificacin en el procedimiento a travs de:

Un aumento en el volumen del diluyente mantenindose la misma cantidad

del material a ensayar;
Incorporacin de una cantidad suficiente de un agente inactivante apropiado
en el diluyente, como por ej., lecitina de soja al 0,5 % y/o Polisorbato 20 al
4,0%;
Una combinacin de las modificaciones anteriores a fin de favorecer el
desarrollo del inculo.
Alternativamente, se puede emplear Caldo Digerido de Casena-SojaPolisorbato 20 para neutralizar conservantes u otros agentes antimicrobianos
presentes en el producto a ensayar.
Mtodo de filtracin por membrana

Si aun no fuera posible recuperar los cultivos viables se

podr asumir que la falla en no aislar los microorganismos
inoculados es atribuible a las propiedades inhibitorias del
producto. En estos casos se debe continuar efectuando
ensayos con el fin de establecer el espectro de inhibicin y
la actividad bactericida del producto.

Proceder a la determinacin en condiciones destinadas a

evitar la contaminacin microbiana extrnseca del producto
a ser examinado.
Las precauciones adoptadas para evitar la contaminacin
deben ser tales que no afecten a ningn tipo de
microorganismo que se revele en la prueba.

TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS A

ENSAYAR
Segn

Que

sus caractersticas fsicas.

no altere el nmero y tipo

microorganismos originalmente presentes.

de

TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS A

ENSAYAR
Slidos que no se disuelven por completo, reducir la muestra a polvo
moderadamente fino. Suspender en el vehculo especificado.

Productos solubles en agua : Disolver en solucin diluyente. Si contiene

conservadores, disolver en solucin diluyente con neutralizante.
Productos oleosos, como ungentos, cremas y ceras, disolver en
solucin diluyente con una cantidad mnima de un agente emulsionante
apropiado (polisorbato 20 u 80), calentar a una temperatura menor o
igual a 45C, y homogeneizar hasta obtener una emulsin.
Productos no oleosos insolubles en agua: Disolver en solucin diluyente
con un agente emulsionante apropiado (por ej., polisorbato 20 u 80 )
tambien puede ser necesaria la homogenizacin mecnica para facilitar
la suspensin.

Si el producto a ser examinado presenta

actividad antimicrobiana, esta debe ser
neutralizada.
Si se utilizan agentes inactivantes para este fin, se
debe demostrar su eficacia y la ausencia de
toxicidad para los microorganismos.

AGENTES NEUTRALIZANTES

DE COMPUESTOS CON ACCIN

INHIBITORIA DEL DESARROLLO MICROBIANO

Conservador

Neutralizante Recomendado

Compuesto de amonio cuaternario

Lecitina 0.1% + Tween 80 al 0.7%

Clorhexidina

Lecitina 0.1% + Tween 80 al 0.7%

Halgenos: hipocloritos
cloraminas
yodo-povidona

Tiosulfato de sodio 0.05%

Agentes quelantes EDTA

Dilucin 1/10 a 35C

Aldehdos

Dilucin
Bisulfito de sodio 6%.
Suero 0.5%

Fenoles

Dilucin 1/50
Tween 20 u 80 hasta 10%

Compuestos mercuriales

Tioglicolato de sodio 0.05 al 0.1%

Caldo Tioglicolato

Alcoholes

Dilucin 1/30 -1/50- 1/100

Acidos y steres orgnicos

Dilucin 1/50
Tween 20 u 80 al 5%

CATEGORA 1.1: DETERMINACIN DE GRMENES

REVIVIFICABLES

Categora 1.2 y 2

CATEGORA 3

MUESTREO

Tratamiento de la Muestra

Se toman 10 g o 10 ml de la muestra y se realiza una dilucin 1/10 con

la solucin diluyente con el agregado del neutralizante correspondiente.

Homogeneizar la muestra

Las diluciones as preparadas no deben dejarse ms de 1 hora antes de

proseguir con el ensayo.

Proceder segn tcnica para la categora a la cual corresponde el

producto a analizar

Recuento de aerobios viables

Procedimiento en placa - Transferir 1 ml de la dilucin inicial a cada

una de dos placas de Petri estriles. Agregar rpidamente a cada placa
entre 15 y 20 ml del Agar Digerido de Casena-Soja previamente
fundido y enfriado a 45 C. Tapar las placas de Petri, homogeneizar la
muestra con el agar por rotacin de las placas y dejar solidificar a
temperatura ambiente. Invertir las placas de Petri e incubar durante 48
a 72 horas.
Luego de la incubacin, examinar las placas para ver si hubo
desarrollo. Contar el nmero de colonias y expresar el promedio para
las dos placas en trminos del nmero de unidades formadoras de
colonias por g (ufc/g) o por ml de muestra (ufc/ml).

Si no se detectan colonias en las placas que representan la dilucin

inicial (1:10) de la muestra, expresar los resultados como menos de 10
ufc por g o por ml de muestra.
El Resultado se expresa como:

Ufc/ g ml de muestra:
Nmero de colonias ( promedio de 2 placas) X 1/dilucin x 1 / Volumen

RECUENTO DE AEROBIOS
VIABLES PROCEDIMIENTO EN TUBOTABLA DE NMERO MS PROBABLE
Procedimiento en tubo - Agregar a cada uno de catorce tubos de ensayo de
tamao similar, 9,0 ml de Caldo Digerido de Casena-Soja estril.
Distribuir doce de los tubos en cuatro grupos de tres tubos cada uno. El
grupo de los tres tubos restantes servir de control. Transferir 1 ml de la
solucin o suspensin de la muestra a cada uno de los tres tubos de un
grupo ("100") y a un cuarto tubo (A) y mezclar. Transferir 1 ml del
contenido del tubo A, al tubo restante (B) no incluido en ningn grupo y
mezclar. Estos dos tubos contienen 100 mg ( 100 ml) y 10 mg ( 10 ml) de
la muestra, respectivamente. Transferir 1 ml del contenido del tubo a cada
uno de los tres tubos del segundo grupo ("10") y 1 ml del contenido del
tubo B a cada uno de los tubos del tercer grupo ("1"). Descartar el
contenido remanente de los tubos A y B. Tapar bien e incubar todos los
tubos. Luego del perodo de incubacin, examinar los tubos para detectar
desarrollo bacteriano: los tres tubos controles deben permanecer
transparentes y los tubos que contienen la nuestra deben compararse con
la Tabla de nmero ms probable.

RECUENTO DE AEROBIOS VIABLES

Ensayo para Staphylococcus aureus

A un volumen de la dilucin inicial, equivalente a 1 g o 1 ml de
producto, agregar Caldo Digerido de Casena-Soja para obtener 100 ml,
mezclar e incubar.
Luego de la incubacin inocular realizar aislamiento en Agar VogelJohnson o Agar Baird-Parker o Agar Manitol-Sal. Tapar, invertir las
placas e incubar.

AISLAMIENTO STAPHYLOCOCCUS AUREUS

AGAR VOGEL JOHNSON
Agentes selectivos:
Telurito
Litio cloruro
Glicina en elevada concentracin
Agente diferencial: Manitol

AGAR MANITOL SAL

Agentes selectivos:
Cloruro de sodio
Agente diferencial: Manitol

AGAR BAIRD PARKER

Agentes selectivos:
Telurito
Litio cloruro
Piruvato
Glicina
emulsin de Yema de huevo

colonias negras por la

reduccin del telurito a
teluro metlico con halo
amarillo por la
degradacin del manitol
con formacin de cido y
viraje al amarillo del
indicador Rojo de Fenol

colonias amarillas
rodeadas por un halo
amarillo

Colonias negras por la

reduccin del telurito a
teluro metlico, con borde
incoloro, convexas,
rodeadas de una zona
opaca, con una zona clara
externa.

Criterio de aceptacin

La muestra cumple con los requisitos del ensayo

para ausencia de Staphylococcus aureus por gramo
o mililitro si no se observa el desarrollo de colonias
con las caractersticas descriptas para
Staphylococcus aureus.
Confirmar la presencia de Staphylococcus aureus
en cualquier colonia sospechosa que se haya
desarrollado en los medios, por pruebas
bioqumicas convencionales o Kits de identificacin
comerciales.

IDENTIFICACIN STAPHYLOCOCCUS AUREUS

Gram
Catalasa +

Cocos gram Positivos en pares,

ttradas o cadenas cortas

Formacin inmediata de
burbujas a partir de H2O2

Coagulasa +

Plasma de conejo.
Formacin de cogulo entre 3
y 24 hs a 37C

Dnasa +

Las colonias formadoras de

Dnasa hidrolizan al DNA del
medio de cultivo. Al agregar el
HCl, precipita el DNA
(turbidez), en tanto que las
colonias Dnasa- positivas
presentan a su alrededor halos
de aclaramiento.

Ensayo para Pseudomonas aeruginosa

A un volumen de la dilucin inicial, equivalente a 1

g o 1 ml de producto, agregar Caldo Digerido de
Casena-Soja para obtener 100 ml, mezclar e
incubar.
Luego de la incubacin, realizar un aislamiento en
Agar Cetrimida. Tapar, invertir las placas e
incubar.

AISLAMIENTO PSEUDOMONAS AERUGINOSA

AGAR CETRIMIDE
Agentes selectivos:
Cetrimide
Agentes diferenciales:

Colonias verde- azuladas

fluorescentes a la luz
UV

Si ninguna de las placas contiene colonias con las caractersticas descriptas para P.
aeruginosa, la muestra cumple con los requisitos del ensayo para ausencia de
Pseudomonas aeruginosa por gramo o mililitro.
Confirmar la presencia de Pseudomonas aeruginosa en cualquier colonia sospechosa
que se haya desarrollado en el agar Cetrimide, por pruebas bioqumicas convencionales
o Kits de identificacin comerciales.

IDENTIFICACIN DE PSEUDOMONAS
AERUGINOSA
Gram

Bacilos Gram negativos

Motilidad +
Oxidasa +

Rosa- violeta
Rvo: p-amino dimetil anilina

O/F Glucosa
+ /-

Reconocimiento de la degradacin
oxidativa y fermentativa de glucosa.
O/F +/- : Coloracin amarilla slo en los
tubos con aporte de aire: degradacin
oxidativa de la glucosa con formacin de
cido y viraje del azul de bromotimol.

Agar F +

Examinar las colonias bajo luz ultravioleta, a

260nm.
Positivo: colonias amarillo, amarillo-verdosas
debidas a fluorescena, pigmento fluorescente
difusible

Agar P + (
Piocianina)

Examinar las colonias bajo luz ultravioleta, a

260nm.
Positivo: colonias azul, azul-verdosas debidas a
piocianina, pigmento fluorescente difusible.

Crecimiento
a 41 C

Turbidez del caldo peptona de soja- peptona

de casena

Investigacin de Salmonella spp.

A un volumen de la dilucin inicial, equivalente a 1 g o 1 ml de
producto, agregar Caldo Lactosado para obtener 100 ml, mezclar e
incubar.
Luego de la incubacin, mezclar suavemente y transferir porciones de
1 ml a tubos que contengan respectivamente, 10 ml de Caldo SelenitoCistina y 10 ml Caldo Tetrationato, mezclar e incubar durante un
perodo de 12 a 24 horas.

Mediante el empleo de un ansa de inoculacin, transferir porciones de

los medios de selenito-cistina y de tetrationato, a las superficies de Agar
Verde Brillante, Agar Xilosa-Lisina- Desoxicolato y Agar Sulfito de
Bismuto. Tapar, invertir las placas e incubar.

AISLAMIENTO Salmonella
AGAR SALMONELLASHIGELLA SS
Agentes selectivos:
Verde brillante, bilis de buey,
tiosulfato, citrato en elevada
concentracin.
Agentes diferenciales: lactosa,
tiosulfato sdico e iones de hierro.

AGAR VERDE
BRILLANTE
Agentes selectivos:
Verde brillante
Agentes diferenciales: lactosa,
sacarosa

AGAR SULFITO de
BISMUTO segn WilsonBlair
Agentes selectivos:
Verde brillante, bismuto
Agentes diferenciales: lactosa,
tiosulfato sdico e iones de hierro.

Colonias incoloras
transparentes con o sin
centro negro. ( lactosa
negativos)

Colonias rosas rodeadas por

una zona roja ( lactosa y
sacarosa negativas)

Colonias con centro negro,

borde claro, precipitado
negro con brillo metlico
alrededor de las colonias (
ojo de conejo, ojo de pez)

AISLAMIENTO SALMONELLA
AGAR XILOSALISINADESOXICOLATO

Colonias del mismo color que

el medio de cultivo,
transparentes, con o sin centro
negro

La muestra cumple con los requisitos del ensayo para ausencia de Salmonella spp por gramo o
mililitro si no se observa el desarrollo de colonias con las caractersticas descriptas para
Salmonella spp..
Confirmar la presencia de Salmonella en cualquier colonia sospechosa que se haya desarrollado
en los medios, por pruebas bioqumicas convencionales o Kits de identificacin comerciales.

IDENTIFICACIN SALMONELLA
Gram

Bacilos Gram negativos

Reduccin nitrato a
nitrito +

Rojo
Rvos: alfa naftilamina 0,5 % +
cido sulfanlico 0,8 % en cido
actico 5 N

Oxidasa -

Sin desarrollo de color

Rvo: p-amino dimetil anilina

TSI Rojo / amarillo

Glucosa + / lactosa -

alcalino/ acido SH2 +/-

Indol -

Sin desarrollo de color

Rvo de Kovacs ( produccin de
Indol a partir del triptofano)

Rojo de Metilo +

Rojo
Rvo: Rojo de metilo pH < 4,2

Voges proskauer -

Sin desarrollo de color

Rvos: alfa naftol 5 % + KOH 40 %

IDENTIFICACIN SALMONELLA
Citrato +

Medio de cultivo azul

oscuro
Basado en la utilizacin de citrato
como nica fuente de carbono
(energa)
La degradacin del citrato por los
microorganismos da lugar a una
alcalinizacin del medio de cultivo, lo
que se manifiesta por un viraje a azul
oscuro del indicador de pH azul de
bromotimol.

Fenilalanina
deaminasa -

Sin desarrollo de color

( cloruro frrico 10 %)

Lisina
decarboxilasa +

Sin cambio
( prpura de bromocresol)

( excepto Salmonella
paratyphi A)

Investigacin de Escherichia coli

A un volumen de la dilucin inicial, equivalente a 1 g o 1
ml de producto, agregar Caldo Lactosado para obtener 100
ml, mezclar e incubar.
Luego de la incubacin, realizar un aislamiento en Agar
Mac Conkey. Tapar, invertir e incubar las placas.
Si se observaran colonias con crecimiento caracteristico,
transferir individualmente las colonias sospechosas, con la
ayuda de un ansa de inoculacin, a la superficie de Agar
Levine Eosina-Azul de Metileno. Tapar, invertir e incubar

AISLAMIENTO ESCHERICHIA COLI

AGAR MAC CONKEY

Colonias rojas con halo de

Agentes selectivos: sales

biliares y cristal violeta(
inhiben bacterias gram +)
Agente diferencial: lactosa

precipitacin

AGAR EOSINA AZUL DE

METILENO LACTOSA
SACAROSA EMB- AGAR
Agentes selectivos:
Eosina y azul de metileno (
inhibicin de bacterias gram
positivas)
Agentes diferenciales:
lactosa y sacarosa

Colonias verdosas con brillo

metlico a la luz reflejada, con el
centro negroazulado a la luz
transmitida

La muestra cumple con los requisitos del ensayo para la ausencia

de Escherichia coli por gramo o mililitro, si, ninguna de las colonias
observadas en los medios de aislamiento selectivos son
caracteristicas de E. coli.

La presencia de Escherichia coli puede ser confirmada por

pruebas bioqumicas convencionales o Kits de identificacin
comerciales.

IDENTIFICACIN ESCHERICHIA COLI

Gram

Bacilo Gram Negativo

Reduccin nitrato a nitrito +

Rojo
Rvos: alfa naftilamina 0,5 % + cido sulfanlico 0,8 %
en cido actico 5 N

Oxidasa -

Sin desarrollo de color

Rvo: p-amino dimetil anilina

TSI cido/ cido gas + SH2 -

Viraje del rojo de fenol al amarillo

Indol +

Anillo rojo
Rvo: Kovacs
Produccin de Indol a partir del triptofano

Rojo de metilo +

color rojo
Rvo: Rojo de metilo
Evidenciar la presencia de productos finales cidos del metabolismo de
la Glucosa.
Positivo: color rojo.
Negativo: color amarillo.

IDENTIFICACIN ESCHERICHIA COLI

Voges Proskauer -

sin cambios

Citrato -

Sin cambio

Rvos: alfa naftol e hidrxido de potasio

evidenciar la presencia de productos finales neutros (acetil metil carbinol) del
metabolismo de la glucosa
Positivo: desarrollo de un color rojo en pocos minutos despus de una
completa agitacin del tubo.
Negativo: ausencia de color rojo.

Investigacin de anaerobios sulfitoreductores

A un volumen de la dilucin inicial, equivalente a 1 g o 1 ml de producto,
agregar Medio Tioglicolato previamente calentado durante 10 minutos en
un bao de vapor y enfriado, adicionado de azida sdica al 0,03%, hasta
obtener 100 ml. Cubrir la superficie con una mezcla estril de vaselina y
parafina. incubar entre 48 y 72 horas a 35C.
Si se observa desarrollo microbiano, transferir 1 ml a un tubo estril de
no ms de 16 mm de dimetro exterior y no menos de 200 mm de largo.
Agregar por las paredes, Agar Sulfito-Polimixina- Sulfadiacina,
previamente fundido y enfriado a 40C, hasta no ms de 1 cm del borde
superior del tubo. Cubrir con la mezcla de vaselina-parafina e incubar
entre 5 y 7 das a 35C, observando diariamente.
La muestra cumple con el ensayo de ausencia de microorganismos
anaerobios sulfito-reductores por gramo o mililitro si no se observa el
desarrollo de colonias negras.

Grmenes revivificables
Se toman 10 g o 10 ml de la muestra y se realiza una dilucin 1/10 con
la solucin diluyente con el agregado del neutralizante
correspondiente.
Homogeneizar la muestra
A un volumen de la dilucin inicial equivalente a 1 g o 1 ml de
producto, agregar Caldo Digerido de Casena-Soja para obtener 100
ml. Incubar durante 5 das entre 25 y 28 C.
A otro volumen de la dilucin inicial equivalente a 1 g o 1 ml de
producto, agregar Medio Tioglicolato hasta obtener 100 ml: Incubar
entre 48 y 72 horas a 35C.
Observar ambos medios: la muestra cumple con los requisitos del
ensayo para ausencia de grmenes revivificables en un gramo o
mililitro si no se observa desarrollo microbiano evidenciado por
turbidez de los medios.

Recuento de Enterobacteriaceae
Procedimiento en placa - Transferir 1 ml de la dilucin inicial a
cada una de dos placas de Petri estriles. Agregar rpidamente a cada
placa entre 15 y 20 ml del Agar Cristal Violeta-Rojo-Neutro-BilisGlucosa previamente fundido y enfriado a 45 C. Tapar las placas de
Petri, homogeneizar la muestra con el agar por rotacin de las placas y
dejar solidificar a temperatura ambiente. Invertir las placas de Petri e
incubar durante 48 a 72 horas.
Luego de la incubacin observar las placas para ver si hubo
crecimiento. Contar el nmero de colonias rojas con halo de
precipitacin rojizo y expresar el promedio para las dos placas en
trminos del nmero de ufc de Enterobacteriaceae por g o ml de
muestra.

Si no se observan colonias caractersticas en las placas que

representan la dilucin inicial (1:10) de la muestra, expresar los
menos
El resultados
Resultado secomo
expresa
como:de 10 ufc por g o ml de muestra.
Ufc/ g ml de muestra: Nmero de colonias ( promedio de 2 placas) X 1/dilucin x 1 /
Volumen

Recuento de Enterobacteriaceae
Procedimiento en tubo - Inocular cantidades apropiadas de Caldo
de Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias con diluciones de
la muestra que contengan respectivamente 1,0; 0,1 y 0,01 g o 1,0, 0,1 y
0,01 ml. Incubar. A partir de cada cultivo positivo subcultivar sobre
Agar Cristal Violeta-Rojo Neutro-Bilis-Glucosa. Incubar entre 18 y 24
horas. La presencia de colonias rojas con halo de precipitacin rojizo
de bacilos Gram negativos constituye un resultado positivo. A partir de
la Tabla de nmero ms probable de Enterobacterias, determinar el
nmero ms probable de Enterobacteriaceae por g o ml de muestra.

RECUENTO DE
ENTEROBACTERIACEAE
PROCEDIMIENTO EN TUBO-TABLA DE
NMERO MS PROBABLE

INVESTIGACIN DE
ENTEROBACTERIACEAE

Disolver o suspender 10,0 g de muestra, si fuera slida, o 10,0 ml,

exactamente medidos, si fuera un lquido, en Caldo Lactosado hasta
obtener 100 ml. Incubar entre 2 y 5 horas.
Homogeneizar y transferir 10 ml de la muestra incubada a 90 ml de
Caldo de Mossel para Enriquecimiento de Enterobacterias. Incubar
entre 18 y 24 horas.
Subcultivar sobre Agar Cristal Violeta- RojoNeutro-Bilis-Glucosa e
incubar.

AISLAMIENTO ENTEROBACTERIAS
AGAR CRISTAL
VIOLETA ROJO
NEUTRO BILIS
GLUCOSA
Agentes selectivos: cristal
violeta y sales biliares
Agente diferencial: glucosa

Colonias: rojas con halo

de precipitacin rojizo.

La muestra cumple con el ensayo para ausencia de Enterobacteriaceae por gramo o

mililitro si no se observa desarrollo de colonias rojas con halo de precipitacin rojizo de
bacilos Gram negativos, o si los ensayos bioqumicos son negativos.

IDENTIFICACIN ENTEROBACTERIAS
Gram

Bacilos Gram negativos

O/F Glucosa +/+

Reconocimiento de la degradacin oxidativa y

fermentativa de glucosa.
O/F +/+ : Coloracin amarilla en los tubos sin
aire ( recubiertos con parafina) y en los tubos
con aporte de aire ( no recubiertos con
parafina): degradacin fermentativa de la
glucosa con formacin de cido y viraje del
azul de bromotimol.

Catalasa +

Formacin inmediata de burbujas a partir de

H2O2

Oxidasa -

Sin desarrollo de color

Rvo: p-amino dimetil anilina

Reduccin de nitrato a
nitrito +

Rojo
Rvos: alfa naftilamina 0,5 % + cido sulfanlico
0,8 % en cido actico 5 N

Recuento de hongos y levaduras

Transferir 1 ml de la dilucin inicial a cada una de dos placas de Petri estriles.
Agregar rpidamente a cada placa entre 15 y 20 ml del Agar DextrosaSabouraud, Agar Papa-Dextrosa o Agar DRBC, previamente fundido y enfriado
a 45 C. Tapar las placas de Petri, homogeneizar la muestra con el agar por
rotacin de las placas y dejar solidificar a temperatura ambiente. incubar las
placas de Petri durante un perodo de 5 a 7 das, a una temperatura entre 20 y
25 C.
Luego de la incubacin, examinar las placas para ver si hubo desarrollo.
Contar el nmero de colonias y expresar el promedio para las dos placas en
trminos del nmero de unidades formadoras de colonias por g (ufc/g) o por ml
de muestra (ufc/ml).

Si no se detectan colonias en las placas que representan la dilucin inicial (1:10)

de la muestra, expresar los resultados como menos de 10 ufc por g o por ml de
muestra.
El Resultado se expresa como:
Ufc/ g ml de muestra: Nmero de colonias ( promedio de 2 placas) X 1/dilucin x 1 /

ARMONIZACIN
Con el Mtodo armonizado debemos informar ausencia de los
siguientes microorganismos especificados:
-

Grmenes revivificables

Bacterias gram-negativas tolerantes a la bilis

Escherichia coli

Salmonella spp.

Pseudomonas aeruginosa

Staphylococcus aureus

Clostridium spp

Candida albicans (Nuevo)

ARMONIZACIN
INVESTIGACIN DE BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
RESISTENTES A LA BILIS
Mtodo

FNA

Armonizacin

Preparacin de la
muestra

Dilucin 1/10 en Caldo

Lactosado

Dilucin 1/10 en Caldo

digerido de casena- soja

Incubacin

30 - 35C, 2 a 5 hs.

20-25C, 2-5 hs

Transferir la cantidad
equivalente a 1 g ml
de producto a

Caldo de enriquecimiento Caldo de enriquecimiento

de Enterobacteriaceae
para Enterobacteriaceae
seg. Mossel
seg. Mossel

Incubacin

30 - 35C, 18 a 24 hs.

30-35 C 24 a 48 hs.

Aislamiento

Agar VRBD

Agar VRBG

Incubacin

30 - 35C, 24 a 48 hs.

30-35C, 18-24 hs

Criterio de aceptacin

Crecimiento de colonias
tpicas

Crecimiento de colonias
tpicas

Confirmacin

Pruebas bioqumicas

Se utilizan los mtodos armonizados segn el

documento ICH Q4B Anexo 4C publicados en
Farmacopea Europea ( edicin 6.3), Farmacopea
Japonesa ( edicin 15) y Farmacopea de los
Estados Unidos ( Edicin 30)

INVESTIGACIN DE CLOSTRIDIOS
Mtodo
Preparacin de la muestra
Tratamiento de calor

Armonizacin
Dilucin 1/10
Dividir la muestra en 2 porciones de al menos 10
ml. Calentar 1 porcin a 80 C durante 10
minutos y enfriar rpidamente. No calentar la otra
parte.

Transferir 10 ml (de las dos

partes) la cantidad
equivalente a 1 g ml de
producto a

Medio para Clostridios

Incubacin anaerbica

30-35 C durante 48 hs.

Aislamiento (de las dos

porciones)

Agar Columbia

Incubacin anaerbica

30-35 C durante 48-72 hs

Criterio de aceptacin

crecimiento anaerobio de bacilos Gram positivos

(con o sin endosporas), reaccin de catalasa
(negativa)

Confirmacin

pruebas bioquimicas

Candida albicans

Es un hongo diploide asexual (forma de levadura),

saprfito de la familia de los Sacaromicetos.
Normalmente se encuentra en la cavidad oral, en el tracto
gastrointestinal y en la vagina.
Candida albicans puede asumir patogeneidad provocando
la candidiasis; en ese caso se presenta como una afeccin
vaginal (vaginitis), de la cavidad oral (muguet), del tracto
gastointestinal, o de la piel.
En la Armonizacin se incorpor la investigacin de
Candida albicans en productos farmaceuticos cuya va de
administracin es vaginal.

INVESTIGACIN DE CANDIDA ALBICANS

Mtodo

Armonizacin ( Nuevo)

Preparacin de la muestra

Dilucin 1/10

Transferir la cantidad
equivalente a 1 g ml de
producto a

100 ml de Caldo Sabouraud dextrosa

Incubacin

30-35 C, 3 a 5 das

Aislamiento

Agar Sabouraud - dextrosa

Incubacin

30-35 C durante 24 a 48 hs.

Criterio de aceptacin

Crecimiento de colonias blancas

Confirmacin

Pruebas de identificacin

El producto cumple con el anlisis si estas colonias no estn presentes o si las pruebas de identificacin son
negativas.

BIBLIOGRAFIA
Farmacopea Nacional Argentina 7 ed. Cp..90 Control
Higinico de productos no obligatoriamente estriles
Disposicin 7352/99. Productos farmacuticos no
obligatoriamente estriles.
Disposicin 2476/2003: Soluciones Fisiolgicas para
Nebulizar.
Farmacopea Europea, edicin 6.3

GRACIAS