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PRCTICA 09

DETERMINACIN DEL PUNTO ISOELCTRICO DE LA CASEINA


I.

OBJETIVO
Determinar el punto isoelctrico de la casena

II.

INTRODUCCIN
Las protenas contiene una secuencia de aminocidos y
las cadenas laterales libres pueden existir en tres formas
dependiendo del pH del medio: catinicos, neutros y aninicos.
Cualquier protena tendra una carga neta positiva si se encuentra
en un medio lo suficientemente cido debido a que los grupos
COOH de los aminocidos asprtico y glutmico estaran en su
forma neutra pero los grupos amino de Arginina y Lisina estaran
protonados (-NH3+). De igual forma si la protena se encuentra en
un medio con un pH muy alto estara cargado negativamente ya
que en este caso los grupos carboxilo estaran desprotonados
(COO-) y los grupos amino estaran en su forma neutra (NH2). De lo
anterior se deduce que las protenas tienen un pH caracterstico al
cual su carga neta es cero.
A este pH se le denomina punto isoelctrico (pI). En el punto
isoelctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y
negativas por lo que la protena presenta su mxima posibilidad
para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su
agregacin.
La casena est formada por alfa (s1), alfa (s2)-casena,
beta-casena, y kappa-casena formando micelas. Ni la alfa ni la
beta casena son solubles en la leche, solas o combinadas. Si se
aade la kappa casena a las dos anteriores o a cada una de ellas
por separado se forma un complejo de casena que es solubilizado
en forma de micela. Esta micela est estabilizada por la kappa
casena mientras que las alfa y beta son fosfoprotenas que
precipitan en presencia de iones calcio.
La propiedad caracterstica de la casena es su baja
solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6 aproximadamente,
estando a ese pH la casena cargada negativamente y solubilizada
como sal clcica. Si se aade cido a la leche, la carga negativa
de la superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se
protonan) y la protena neutra precipita.
Las protenas que aparecern en el sobrenadante cuando
precipitemos la casena en medio cido son protenas globulares,
hidrofilicas y fcilmente solubles en agua as como susceptibles de

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desnaturalizacin por calor. Las principales son beta lactoglobulina,


alfa lactoalbumina, albmina de suero de bovino (BSA), e
inmunoglobulinas (Ig).
La conformacin de la casena es similar a las protenas
desnaturalizadas globulares. El alto nmero de residuos de Prolina
en la casena causa un especial plegamiento en la cadena de
protena e inhibe la formacin de una fuerte y ordenada
estructura secundaria.
III.

MATERIALES Y REACTIVOS
Tubos de prueba. 2 pipetas de 1 mL y de 5 mL, bombilla
succionadora
Gradilla
Sol. de acetato y de cido actico
pH metro, Cintas de pH
Matraz aforado,
Calculadora,
Casena

PROCEDIMIENTO

Preparar una gradilla de 9 tubos de ensayo de acuerdo a la siguiente


tabla
1

Tubos
mL de casena 5%

mL de agua destilada

8.4

7.8

8.8

8.5

8.0

7.0

5.0

1.0

7.4

mL de cido actico
1.0 N

1
.
6
0
.
2

mL de cido actico
0.1 N
mL de cido actico
0.01 N

0.
6

1.2

pH terico
pH experimental

Observa la precipitacin
de la casena a los 15
minutos (X)

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0
.
5

1
.
0

2
.
0

4
.
0

8
.
0

Reactivos

Tubo de Ensayo 1

Tubo de Ensayo 2

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Tubo de Ensayo 3

Tubo de Ensayo 4

Tubo de Ensayo 5

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Tubo de Ensayo 7

Tubo de Ensayo 9

Tubo de
Ensayo 8

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Se

agita
suaveme
nte los
tubos
con la

IV.

CUESTIONARIO
1. Cul es el punto isoelctrico de la glutelinas y , lactoalbumina,
2. Determine el punto isoelctrico del glutamato y de la arginina
3. Qu utilidad tiene conocer el punto isoelctrico de las
protenas?

II.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Calixto C. Mara R. Gua de prcticas de Qumica Integrada.
UNMSM-Fac Medicina .Lima, Per 2008 p.30
2. Da Zagoya. Bioqumica. 1 edicin, Editorial Mc Graw Hill. 2007.
India, p. 490
3. Coultate T.P Qumica y Bioqumica de los alimentos. 3 edicin
Edit Acribia Zaragoza-Espaa.200.

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PRCTICA 10

CROMATOGRAFIA DE METABOLITOS SECUNDARIOS DE


VEGETALES

I.

Objetivo: Separar e identificar los metablicos de bajo peso


molecular un mezcla de matriz de alimentos
II. Introduccin
La tcnica de separacin de TLC consta de un sistema de dos fases,
una solida (fase estacionaria) que se aplica en forma de capa
delgada, absorbente, usualmente de entre 0.1 a 0.25 mm de grueso
para fines analticos, pero el grosos puede variar. Esta capa puede
es fijada a una placa o lmina firme de vidrio, aluminio o plstico
que acta como soporte. A travs de la fase estacionaria transita un
liquido o solvente (fase mvil o eluente)
La fase estacionaria
La fase estacionaria es un slido fijo al soporte. El sorbente debe ser
inerte, poroso e insoluble en los solventes usados como fase mvil.
Existen diferentes materiales inertes, pero los ms comunes son la de
silica gel y el oxido de aluminio. La utilizacin de soportes hidrfobos
facilita la separacin de compuestos no polares (lpidos, por
ejemplo).

El silica gel tambin es llamada como cido silico o kieselgel, es un


polvo blanco, poroso y amorfo, y una que se elimina el agua da
luigar a la formacin de un gel. El control de la temperatura y el pH
durante esta etapa es crucial para la calidad del gel formado. Las
partculas coloidales una vez formadas, con la consiguiente
condensacin y encogimiento
forma una red
tridimensional
descrita como un hidrogel. Despus de lavado y calentamiento un
gel poroso y duro es formado, llamado silica gel, el q se usa para la
TLC.
La eficiencia de la silica gel en la separacin est ligada al tamao
de la partcula. El tamao de partcula en TLC tpicamente est
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entre 5 a 40 um, y entre ms pequeo sea su valor, es mejor la


resolucin. El tamao de poro tambin incide en la buena
separacin, tpicamente se emplean silica gel que desarrolla un
tamao de poro de 40- 150 A
VOLUMEN DE MUESTRA APLICAR
Para el desarrollo de la cromatografa, las muestras, en un disolvente
adecuado, se aplican puntualmente con la ayuda de jeringas,
micropipetas o capilares en un extremo de la placa. El volumen de
muestra a aplicar es crtico, ya que va a afectar a la resolucin
(separacin de los componentes de una mezcla compleja), y
depende de la concentracin del compuesto o compuestos de
inters en la muestra. Para soluciones concentradas bastar una
cantidad muy pequea (rango de l) para aplicar suficiente
cantidad de los solutos a separar sin llegar a saturar la capacidad
de resolucin de la placa cromatogrfica. Para soluciones muy
diluidas, deber aplicarse un volumen suficiente (de hasta varios ml)
para asegurar una cantidad detectable de soluto o solutos de
inters. En este caso conviene hacer la aplicacin en pequeos
volmenes fraccionarios, no procedindose a una nueva adicin
hasta haberse secado totalmente la precedente (de lo contrario la
superficie de aplicacin se hara muy grande, distando mucho de la
situacin ideal de concentracin de la muestra en un solo punto de
aplicacin). Una vez aplicada y seca la muestra, la placa se
introduce en un recipiente cerrado (cmara cromatogrfico)
CAMARA CROMATOGRAFICA
La cmara cromatografa consiste en un recipiente con tapa de
cierre hermtico, a este recipiente se le aade la fase mvil. Que
contiene,
butanol, cido actico y agua. La cantidad que se
agrega depende de la ubicacin del origen en la placa
cromatografa. El origen est colocado a una altura de o.5 cm, por
lo tanto, si el nivel del solvente no debe llegar hasta el origen, se
agregar hasta un nivel de 0.3-0.4 cm de altura. Se tapa y se deja
que el vapor del solvente sature la atmsfera interna del recipiente
antes de introducir la palca cromatografa.

III.

MATERIALES Y EQUIPOS.
Etanol absoluto.
Butanol.cido actico glacial. Agua destilada.
Solucin de FeCl3, 5 %,

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EQUIPOS Y MATERIALES.
Estufa regulada a 50 C.
Cmara de cromatografa.
Pulverizador.
Secadora de mano.
Tubos de prueba de 13 x100mm.
Pera de decantacin.
Palitos de fosforo, soporte universal, anillo de filtracin, Baguetas,
pipetas de 5 ml, 4 capilares
Placas cromatografas de HPTLC
Guantes, tapa boca, cuatro capilar de hematocrito, frascos de
tapa boca, fsforos o encendedor, frascos de plsticos de anlisis
con tapa
(h= 8 a 10 cm)
secador de cabello. Embudo de
separacin, soporte universal, pulverizador.
, butanol-cido actico- agua destilada (4-1-5 v/v) estndares de
aminocidos,
alimentos que probablemente contengan
aminocidos, etanol, ninhidrina la 5 %, acetona.
IV. PROCEDIMIENTO
a. Preparacin de la cmara cromatogrfica:
En una pera de decantacin se mezclan: butanol: cido
actico: agua, en la proporcin de 4: 1: 5 se agita suavemente
por rotacin y luego se deposita en una pera de decantacin,
dejarlo por una hora hasta q se separe, usar la fase orgnica, la
micro-cmara, se tapa y se deja en reposo por 15 minutos, o
hasta saturacin de la cmara.
b. Preparacin del soporte.
Se prepara una cromatoplaca de 8 x 2.5 cm, a unos cm del borde
se traza con lpiz una lnea recta. Sobre esta lnea se marcan
puntos, a distancia de 0.5 cm, donde se depositar la muestra
problema y los standard.

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c.
Preparacin del Cromatograma
Utilizando un capilar se van depositando en uno y otro de
los puntos marcados , la mezcla de 3 estndares, as como
una muestra de material biolgico. Tras cada aplicacin se
seca la mancha.

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d.

Desarrollo del Cromatograma.

El Cromatograma as preparado se introduce en la cmara


previamente saturada, cuidando que el solvente impregne el
silica gel, pero no cubra las gotas de muestras aplicadas.
Cuando el solvente ha ascendido hasta la parte superior de
la placa, se saca sta de la cmara, y se seca bien con un
secador.

e.

R
e
v
e
l
a
d
o
d
e
l
C
r
o
m
atograma

A continuacin la cromatoplaca se pulveriza con la solucin


de cloruro de fierro y la solucin de tricloruro de aluminio, y se
seca en estufa a 60 C. A los pocos minutos aparecern las
manchas de que se pueden identificar por su Rf (distancia
origen- mancha / distancia origen - frente del disolvente).
V.

RESULTADOS.
Una vez que se revela el Cromatograma, se procede a
determinar el Rf de cada mancha correspondiente al estndar.
El Rf permite determinar que aminocido se muestra en la
muestra problema.

VI.

CUESTIONARIO.

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a. Describa como realizara la separacin de los aa. TLC y


HPTLC.
b. Cmo investigara la presencia de azucares libres en
harina de maz.
c. Describa los metabolitos secundarios en los vegetales
d. Que otros solventes podemos usar?
VII.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1. Calixto C. Mara R. Gua de prcticas de Qumica Integrada.
UNMSM-Fac. Medicina .Lima, Per 2008 p.30
2. Da Zagoya. Bioqumica. 1 edicin, Editorial Mc Graw Hill. 2007.
India, p. 490
3. Coultate T.P Qumica y Bioqumica de los alimentos. 3 edicin
Edit Acribia Zaragoza-Espaa.200.

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