Analtica V

Aula 11: 05-03-13

Cromatografia Lquida
PRXIMA AULA TERICA (Eletroforese Capilar):
12-03-13, s 08:15h, como Prof. Marcone

Prof. Rafael Sousa

Departamento de Qumica - ICE
rafael.arromba@ufjf.edu.br

Notas de aula: www.ufjf.br/baccan

CROMATOGRAFIA LQUIDA (CL)

em Ingls

Interao diferenciada dos componentes da amostra entre

FASE ESTACIONRIA e uma FASE MVEL
slido
ou
lquido

lquido

Crom.
lquida (CL)

Uma das diferenas entre a CG e a CL so as

configuraes experimentais:

Slido
FASE
ESTACIONRIA

lquido sobre
um slido

CONFIGURAO
EXPERIMENTAL

PLANAR
COLUNA

Ex de interao analito - FE

Equilbrio FE FM (partio na crom. Lquido-lquido)

Polaridade

Diferente para as substncias diferentes

Tamanho

Cromatografia planar

Suporte da FE: papel especial OU

slido finamente dividido
FM (capilaridade)
separao

Fcil realizao

Anlises quali e
quantitativas

Baixo custo

Baixas
- Resoluo e
- Repetibilidade
- Reprodutibilidade

Cromatografia em coluna
Convencional
(Clssica)

Lquida de alta eficincia - CLAE

(HPLC)

Solvente
Fase estacionria
Suporte inerte

- Colunas verticais (FM - gravidade)

- Anlises quali e quantitativas
- Baixo custo
- Baixa frequncia
- Desempenho regular

- Colunas e FM altas presses

- Anlises quali e quantitativas
- Desempenho analtico satisfatrio
- Rapidez analtica, automao
- Custo elevado ...

Cromatografia lquida de alta

eficincia (CLAE)
- Amplamente utilizada
- Dentre as modalidade mais importantes da cromatografia
- Vem se desenvolvendo desde a dcada de 70

NO UMA TCNICA DE ANLISE ABSOLUTA

 Necessidade de calibrao
RESULTADO : Amostras x Padres
(cromatograma)

Subdivises da CLAE
Tipo de FE e o MECANISMO de separao
Cromatografia lquido-slido: CLS

FE um slido  mecanismo de adsoro

Cromatografia lquido-lquido: CLL

FE um lquido que recobre um slido
 mecanismo de partio

Cromatografia lquida de fase ligada: CLFL

FE um lquido ligado quimicamente a um suporte slido
 mecanismo de partio

Cromatografia por excluso: CE

FE um gel que recobre um slido com
porosidade controlada
Aplicao importante: anlise de polmeros
(GPC)

Cromatografia de troca inica: CTI

FE slida contm grupos NR3+ (para troca
aninica) ou grupos SO3- (para troca catinica)
Determinao de compostos de carter
inico (aminocidos, nions inorgnicos,
ons metlicos, etc)
Mesmo mecanismo estudado da Prtica 10 !

Cromatografia por afinidade: CA

FE possui substncias como enzimas e antgenos: interao seletiva
com protenas e anticorpos

Cromatografia quiral: CQ

FE possui compostos com carbonos assimtricos (C*) para interagir
seletivamente com compostos quirais

Separao e Sinal analtico

FM

FM

FM

FM

FM + componente separado

Sinal

FM

Tempo de reteno

Cromatograma

Entendendo o cromatograma

benzaldedo

aspartame

Informaes
quali e
quantitativas

sacarina

Resposta do detector

Diferentes espcies
SAEM DA COLUNA em tempos diferentes: tr

(tr= tempo de reteno  medida em funo do tempo)

Tempo de reteno
Pouca interao

Muita interao

Anlise quantitativa
Quantidades iguais de substncias diferentes geram picos
cromatogrficos com reas diferentes

Resposta do detector

 Necessidade de calibrao:

Equao de reta

Concentrao do padro, no tr especfico

Relaciona-se as reas dos picos com as concentraes

 Anlise de PADRES e AMOSTRAS nas MESMAS CONDIES

Configurao instrumental
Componentes bsicos de um cromatgrafo lquido de alta
eficincia:
Coluna
cromatogrfica

Processador-Registrador

Detector
Reservatrio
de FM

Vlvula de
amostragem
Sistema de bombeamento

 Cada componente: funo no processo analtico

Reservatrio
de FM

frasco de
plstico
ou
vidro

Sistema de
bombeamento

Vlvula de
amostragem

+
gua

Solvente(s)
orgnico(s)

Coluna
cromatogrfica

Detector

Ciclohexano
Tetracloreto de carbono
Tolueno
Etanol
Acetato de etila
Metanol
Acetonitrila
gua

Registrador

Ordem crescente
de polaridade

(VERIFICAR TABELAS)

CUIDADOS
eliminao de
partculas maiores
que 5 m
retirada de gases
Dissolvidos
Ultrasom
ou
Borbulhamento gases inertes

USO
(preparao diria)

Reservatrio
de FM

Sistema de
bombeamento

Vlvula de
amostragem

Coluna
cromatogrfica

Detector

Registrador

 Impulsionar a FM para dentro da coluna com vazo constante e reprodutvel

 BOMBAS DE ALTA PRESSO
Composio constante
eluio ISOCRTICA

Composio varivel
Eluio por GRADIENTE ou
Eluio por programao de solvente
Amostras complexas
Compostos de polaridade
muito diferente

Bomba de seringa
Bomba recproca
Bomba pneumtica
Proporo do
Solvente mais polar

Reservatrio
de FM

Sistema de
bombeamento

Vlvula de
amostragem

Coluna
cromatogrfica

Detector

Registrador

Ex: Bomba recproca (uma das mais usadas)

Para coluna

Vantagem:

Desvantagens:

Mudana da fase mvel

Vazo pulsada
amortecedor

Cavitao (bolhas) devido compresso

Reservatrio
de FM

Sistema de
bombeamento

Vlvula de
amostragem

Coluna
cromatogrfica

Detector

Registrador

Dispositivo de ao inoxidvel com uma ala de amostragem

que permite introduzir volumes exatos e precisos na coluna

ALA TROCVEL  Volumes de 2 a 1000 L

Reservatrio
de FM

Sistema de
bombeamento

Vlvula de
amostragem

Coluna
cromatogrfica

Detector

Registrador

Coluna  tubo de ao inoxidvel
separao

Capacidade:
dimenses

i= 1 20 mm
L= 3 25 cm
(limitado pela P trabalho)

FE

+
FM

Partculas com na faixa de m

Uso de partculas pequenas

melhor separao (aumenta N)

DUAS
COMBINAES

Fase reversa FE apolar (baixa polaridade)

FM polar
Fase normal

FE polar
FM apolar (baixa polaridade)

EFICINCIA DA COLUNA

 REPRESENTADADA POR N
Nmero de pratos tericos

N = 16

tr
W

Sinal do detector

- Determina a resoluo do cromatograma

- Relacionada ao no de etapas de equilbrio entre o soluto na
FE e o soluto na FM

Tempo de reteno

Quanto maior o nmero de etapas, mais eficiente a separao

 No implica em rapidez !
Esta dada pela Altura do prato (H): H= L / N,
em que valores pequenos referem-se a colunas rpidas

Reservatrio
de FM

Sistema de
bombeamento

Vlvula de
amostragem

Coluna
cromatogrfica

Detector

Registrador

Deteco dos componentes
conforme saem da coluna

Deve-se obter UM PICO no cromatograma para CADA SUBSTNCIA

 Diferentes tipos de detectores podem ser usados

(no existem detectores universais para CLAE)
a) Detectores que respondem concentrao

SINAL proporcional CONCENTRAO
Ex: Absoro no UV-Vis, infravermelho e de fluorescncia
MAIS GERAIS PORM MENOS SENSVEIS
b) Detectores que respondem massa

SINAL proporcional a um FLUXO DE MASSA por unidade de tempo
Ex: Detectores eletroqumicos e de condutividade eltrica
MAIS SENSVEIS MAS NO PERMITEM ELUIO COM GRADIENTE

Consideraes prticas

Vrias configuraes instrumentais podem ser empregadas
determinao de vrios tipos de substncias
(mesmo em amostras complexas)
sistema alta presso: checar vazamentos
As condies instrumentais e de preparo de amostra influenciam
no resultado
para minimizar os erros experimentais pode-se utilizar padres
internos
(substncia com caractersticas fsico-qumicas semelhantes s do
analito e que adicionada em quantidade fixa e conhecida)

Questes
1- Descreva os componentes bsicos de um equipamento para cromatografia lquida
de alta eficincia (CLAE) e explique, brevemente, a funo de cada um deles.
2- Os cromatogramas X, Y e Z referem-se a uma mistura de compostos presentes em
analgsicos e foram obtidos em uma mesma coluna, mas utilizando fases mveis
diferentes e em modo isocrtico (X: 70% MeOH/ 30% gua; Y: 60% MeOH/ 40%
gua; Z: 40% MeOH/ 60% gua). Considerando essas informaes, responda qual
o composto mais polar e qual das fases mveis voc utilizaria para fazer essa
mesma separao.

Referncias
Skoog, D. A., Holler, F. J.; Nieman, T. A.
Principles of Instrumental Analysis
5th ed., Saunders College Publishing: Philadelphia, 1998
Harris, D. C.
Anlise Qumica Quantitativa
7a ed., LTC Livros Tcnicos e Cientficos Editora, 2008
Collins, C. H., Braga, G. L., Bonato, P. S.
Fundamentos de Cromatografia
1a ed., Editora UNICAMP: Campinas, 2006