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Los Pases Bajos; 2Instituto de Ciencias Molecular Vegetal, laboratorios Gorlaeus, Leiden University,
nivel de resistencia frente a un amplio espectro de
P.O. Box 9502, 2300 RA Leiden, Pases Bajos
agentes patgenos. La forma clsica de obtener
aceptaron el 23 de abril de 1999.
La colonizacin radicular de Arabidopsis thaliana no
patgenas, por la rizosfera-colonizar, biocontrol
bacteria Pseudomonas fluorescens WCS417R se ha
mostrado para obtener la resistencia sistmica
inducida
(ISR)
contra Pseudomonas
syringae pv. Tomate (PST). La respuesta de ISR
difiere del patgeno-inducible de la resistencia
sistmica adquirida (SAR) en respuesta que el ISR es
independiente del cido saliclico y no asociados con
protenas relacionadas con la patognesis. Varios de
etileno-respuesta mutantes fueron probados y
demostraron esencialmente normales los sntomas de
infeccin de PST. ISR qued abolida en el etilenomutante insensible etr1-1, mientras que el SAR no fue
afectado. Se obtuvieron resultados similares con el
etileno-insensible mutantes ein2 por ein7, indicando
que la expresin de ISR requiere la va de
transduccin de seal completa de etileno conocida
hasta el momento. La induccin de ISR por WCS417r
no fue acompaada por un aumento de la produccin
de etileno en races u hojas, ni por los aumentos en la
expresin de los genes que codifican para las enzimas
de biosntesis de etileno 1-aminocyclopropane1carboxlico sintasa (CAC) y la ACC-oxidasa.
La EIR1 mutante, mostrando insensibilidad de
etileno en las races slo, no expresan el ISR, previa
solicitud de la CMC417r a las races, pero no exhiben
ISR cuando las bacterias que provocan se infiltraron
en las hojas. Estos resultados demuestran que, para la
induccin de ISR, el etileno se requiere flexibilidad en
el lugar de la aplicacin de inducir rhizobacteria.
Palabras clave adicionales: la mancha
enfermedad, respuesta de etileno mutantes.
bacteriana
Mutant
Fenotipo
Etr1-1
El etileno insensible, dominante
Ein2-1
El etileno insensible recesivos
Ein3-1
El etileno insensible recesivos
Ein4-1
El etileno insensible, dominante
Ein5-1
El etileno insensible recesivos
Ein6
El etileno insensible recesivos
Ein7
El etileno insensible, semidominant
Eto1-1
El etileno overproducer recesivos
Eir1-1
El etileno insensible recesivos raz
Axr1-12
Etileno y auxina insensible recesivos raz
Ctr1-1
Triple respuesta constitutiva recesivos
Tabla 1. Mutantes de etileno utilizado en bioensayos
Ecotipo
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Ler
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
Col-0
porcentajes de las hojas enfermas por planta en controles de Coloh, eir1-1, y etr1-1: 57,4, 59,9 y 64,4%, respectivamente. Letras
diferentes indican diferencias estadsticamente significativas entre
los tratamientos con la mnima diferencia significativa de Fisher
Test ( = 0,05). Los experimentos se realizaron dos veces con
resultados similares.
Fig. 3. Anlisis de la expresin gnica de Hel en hojas de col-0, eir1-1, ein2-1, y eto1-1 de plantas. Hel se analiz la expresin gnica 2 das despus
del tratamiento con 0,01% Silwet L-77 (0), o de 0,5, 1 y 2,5 mM ACC (1-aminocyclopropane-1-cido carboxlico) + 0,01% Silwet L-77. Para
comprobar la igualdad de las cargas, Blot fue desnudado y se hibridaron con un proble para - tubulina (hidromasaje ).
WCS417r. Resultados de un
Experimento tpico se muestran en la Tabla 2. Durante el
perodo de 3 semanas entre el trasplante de las plntulas
en el suelo bacterized y desafo de inoculacin, cuando
las bacterias estn presentes en las races en niveles
desencadenando ISR, una diferencia estadsticamente
significativa en los niveles de etileno de races de control
y WCS417rtreated plantas nunca fue encontrado. Las
hojas fueron analizados de manera similar pero,
igualmente, no existen diferencias estadsticamente
1
2
20
ab
184 15 3 75 9 de 66 7 e 144 10 c 155 16 a.c.
overproducing eto1-1 constitutivamente muestra niveles
( Pieterse et al. 1998).
altos de etileno, pero no expresan una mayor resistencia.
Porque hel transcripcin gnica acumulacin no aument
Hemos intentado profundizar en el camino que lleva a
en respuesta al CAC en el eto1-1 mutante, parece que la
la ISR mediante la realizacin de un anlisis ms amplio
va de sealizacin de etileno en cierto modo estaba
de la participacin de la va de transduccin de la seal de
saturado y que la aplicacin de bacterias ISRinducing no
etileno en la expresin de ISR. Varios pasos en el camino
ofrecer incentivos adicionales para la induccin de ISR.
signaltransduction etileno han sido identificados (Ecker,
1995). La respuesta de etileno mutantes etr1-1, ein2-1,
Aplicacin de ISR de inducir el WCS417r no altera la
ein3-1, ein4-1, ein51, ein6 y ein7 fueron probados para el
produccin de etileno o la expresin gnica de genes de
WCS417R-mediada de ISR de respuesta y la respuesta
biosntesis de etileno en races u hojas. Por lo tanto, no
SAR inducida por el patgeno. WCS417rmediated ISR
hay indicios de que la CMC417r inducida ISR en
qued abolida en todos los mutantes probados, mientras
Arabidopsis induciendo genes de biosntesis de etileno o
que todos los mutantes pudieron expresar SAR inducida
de produccin de etileno. Algunas Pseudomonas spp. son
por el patgeno. Estas observaciones confirman hallazgos
capaces de producir etileno (Weingart y Vlksch 1997), y
anteriores por Lawton et al. (1994, 1995) que en la
cabra pensar que no la planta, pero WCS417r en s
Arabidopsis induccin de SAR es independiente de
misma est produciendo el etileno por que la
etileno. En contraste, ISR requiere una respuesta de
transduccin de seales de etileno en la planta est
etileno intacto y, aunque las ubicaciones exactas de Ein5,
activado. No hay pruebas concluyentes sobre la
EIN6 y EIN7 en la va de transduccin de la seal de
produccin de etileno por WCS417R ha sido obtenido
etileno no son conocidos, esto indica que todos los
hasta el momento (P. A. H. M. Bakker, comunicacin
conocidos ein en el camino de los genes son necesarios
personal). Sin embargo, los genes que responden de
para la expresin de ISR.
etileno hel (Potter et al. 1993) y pdf1.2 (Penninckx et al.
1996) no son inducidas en races bacterized con
Porque la va de transduccin de la seal de etileno es
WCS417R, por lo que es improbable que la CMC417r
necesaria para la plena expresin de la respuesta de ISR,
produce cantidades biolgicamente activos de etileno
la implicacin del etileno en la induccin de la ISR fue
( Pieterse et al. 1998).
investigado ms a fondo. Bioensayos con el EIR11 mutante, mostrando insensibilidad de etileno en las
As, la induccin de ISR requiere todos los
races slo, arroja nueva luz sobre el camino por el cual
componentes conocidos de la va de sealizacin de
se induce ISR. En este mutante, aplicacin de WCS417r a
etileno en la ausencia de un aumento en la produccin de
las races no resultan en una respuesta de ISR en las
etileno. Esta situacin se asemeja a la interaccin
hojas. En contraste, la infiltracin de bacterias en las
compatible
de
arroz
con
la
piricularia
hojas dio como resultado una respuesta de ISR. La EIR1hongo Magnaporthe grisea (Hebert) Barr., en la cual JA1 hojas son normalmente sensibles a etileno, en contraste
inducible de genes son activados sin un aumento
con la ETR1-1 y ein mutantes, que muestran la completa
concomitante de JA endgena (Schweizer et al. 1997). En
insensibilidad de etileno. Esto demuestra que el etilenola JA-promovi la senescencia de desprendimiento de
dependientes se requiere la sealizacin en el lugar de la
hojas de arroz, el etileno es la hormona responsable de la
aplicacin de bacterias que provocan, ya sean races u
prdida de la clorofila. Sin embargo, niveles de etileno
hojas, para obtener una respuesta de ISR.
disminuy en lugar de aumentar, pero aparentemente JA
aument la sensibilidad al etileno (Tsai et al. 1996).
Porque la induccin de ISR por WCS417r es igualmente
dependa tanto de JA y etileno, pero ningn aumento en la
1 Letras
diferentes
indican
diferencias
estadsticamente
produccin de etileno es evidente, tambin puede
significativas entre los tratamientos con la mnima diferencia
preverse que ja aumenta la sensibilidad al etileno. JA
significativa de Fisher Test ( = 0,05). Los experimentos se
parece actuar antes de etileno en la va de sealizacin de
realizaron tres veces con resultados similares.
ISR (Pieterse et al. 1998). Si la aplicacin de ISR-recabar
Fig. 4. Anlisis de acs2 y aco de la expresin gnica en las races de
rhizobacteria aumenta los niveles de JA en la planta an
las plantas de col-0. En cubos de lana de roca, Col-0 races fueron
est por determinarse. Sin embargo, puede concluirse que
tratados con 10 mM MgSO4 mezclado con polvo de talco como
para expresin de ISR en Arabidopsis, etilenoportador (C), o con Pseudomonas fluorescens WCS417r aplicarse de
la misma manera (417r). Acs2 y aco se analizaron la expresin
dependientes se requiere la sealizacin en el lugar de la
gnica 1, 3 y 7 das despus del tratamiento, en comparacin con
aplicacin de inducir rhizobacteria, y que la induccin de
patrones de rRNA teidos con bromuro de etidio.
ISR no est acompaada por elevados niveles de etileno
en la planta.
725 / Plant-Microbe Interacciones moleculares
Materiales y Mtodos
Los cultivos bacterianos.
A RIFAMPICINA mutante resistente de la cepa de
biocontrol bacteriano Pseudomonas fluorescens WCS417
(WCS417R), eficaz en la induccin de la resistencia
sistmica en clavel (Van Peer et al. 1991), rbano
(Hoffland et al. 1995), y la Arabidopsis (Pieterse et al.
1996), fue utilizado como induciendo rhizobacterium.
WCS417r fue crecido en medio del rey B (KB) placas de
agar (King et al. 1954) durante 24 horas a 28C. Las
bacterias fueron recolectadas y resuspendido en 10 mM
MgSO4.
El
virulento
patgeno
foliar
bacteriano Pseudomonas
syringae pv. Tomate (PST)
(DC3000 Whalen et al. 1991) fue aumentado a 28C
durante la noche en forma lquida en KB. Las
clulas fueron colectadas por centrifugacin y
resuspendido en 10 mM MgSO4. Su avirulent derivativo
dc3000 (avrRPT2), llevando el plsmido pLAFR3 que
contenga el gen avirulence avrRPT2 (Whalen et al.
1991), fue igualmente cultivadas en KB sin lquido
MgSO4, complementado con tetraciclina (40 g/ml).
El cultivo de plantas.
Semillas de Arabidopsis thaliana ecotipos de Columbia
(Col-0) y Landsberg erecta (ler) y sus mutantes fueron
sembradas en arena. Las plntulas fueron cultivadas en
una cmara de crecimiento con un 9h luz (200 E m s-12 a 24C) y 15-h oscuro perodo (20C) a 70% de
humedad relativa. 10- a 14 das de edad fueron
trasplantados plantas individualmente en potes de 60 ml
que contenga 12:5 ( vol/vol) macetas de suelo/arena,
autoclavar dos veces durante 1 h, y se complementa con
10 mM MgSO4 o una suspensin de la CMC417R de 10
mM MgSO4, tal como se describe para el bioensayo de
ISR.
Las plantas se regaron con regularidad y suministra una
vez a la semana con la mitad de la fuerza de la solucin
Hoagland (KNO3 de 2 mM, 5 mM Ca[N3]2, 1 mM de
KH2PO4, 1 mM MgSO4 y oligoelementos, pH 7)
(Hoagland y Arnon, 1938), que contiene 10 M
Sequestreen (Fe-etilendiamina-di[o-hydroxyphenylacetic
acid]; CIBA-GEIGY, Basilea, Suiza).
ISR y SAR la induccin.
Plantas para el ISR y SAR los bioensayos fueron
aleatorizados. Para cada tratamiento, 20 plantas fueron
utilizados. Para la induccin de la ISR a travs de la
colonizacin de las races, plantas germinadas en la arena
fueron trasplantados en las macetas de suelo/arena
complementado con 50 ml de 10 mM MgSO4, que
contena 109 UFC ml-1 WCS417r por kg de suelo, o una
cantidad equivalente de 10 mM MgSO4 como
tratamiento de control. Para la induccin de la ISR a
travs de la infiltracin de hoja, 5 semanas de edad se
utilizaron plantas. Un da antes del tratamiento, las
plantas fueron puestas al 100% de humedad relativa. Tres
hojas por planta inferior se haban infiltrado con una
solucin que contenga 107 UFC ml-1 de WCS417R,
usando una jeringa sin aguja (Swanson et al. 1988). Para
la induccin de la SAR el procedimiento utilizado para la
Una vez supuesto experimento para analizar ISRrelacionados y acs aco la expresin gnica en races de
plntulas se realiza colocando 2 semanas de edad, Col-0
plntulas horizontalmente en cubos de lana de roca
empapada en la mitad de la fuerza de la solucin
Hoagland (Pieterse et al. 1996). Una suspensin de 5
108 UFC ml-1 WCS417R de 10 mM MgSO4 o 10 mM
MgSO4 solos, fue mezclado 1:1 (vol/wt) con polvos de
talco y aplicado a las races, que luego fueron cubiertos
con cubos de lana de roca. A las 1, 3 y 7 das despus del
tratamiento, las races fueron cosechadas y talco mix fue
quitado lavando las races en el agua. Despus del secado,
las races fueron congelados en nitrgeno lquido y se
almacena a -80C para el aislamiento de ARN.
Se aisl el ARN como se describe anteriormente
(Linthorst et al. 1993). RNA total (20 g) se separan en
un gel de agarosa al 1% en 15 mM fosfato de sodio de pH
6.5, y trasladado a Hybond N+ filtros (Amersham, 'sHertogenbosch, Pases Bajos). La hibridacin se realiz a
los 65C en 250 mM fosfato de sodio pH 7,0, 1 mM de
EDTA, 7% de dodecil sulfato de sodio, 1% de albmina
srica
bovina,
con
sondas
marcadas
con
aleatoriamente de acs1, -2, -4, y -5 (Liang
et
al.
1992), Aco (GmezLim et al. 1993), y hel. La plantilla
del hel sonda fue preparado por reaccin en cadena de la
polimerasa con cebadores basados en la secuencia de
adnc publicada (Potter et al. 1993).
Agradecimientos
Agradecemos al Centro de Recursos Biolgicos de Arabidopsis
(Columbus, OH) para el suministro de semillas de los mutantes de
etileno. A. Theologis es reconocida por brindar la
Arabidopsis acs1, -2, -4, y -5 Adnc y M. A. Gmez-Lim para
el aco clon. Estamos ms endeudados a Hans van Pelt para
asistencia tcnica de expertos. Esta investigacin fue apoyada por la
Fundacin Ciencias de la vida (SLW), que est subvencionado por
la Organizacin Neerlandesa para la Investigacin Cientfica
(NWO).
Literatura Citada
Bakker, P. A. H. M., Van Peer, R. y Schippers, B. 1991. Supresin
de patgenos transmitidos por el suelo de la planta por
fluorescente pseudomonadas: Mecanismos y perspectivas.
Pginas 217-230: interacciones biticas y soilborne las
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A. B. Schippers Ruissen, y A. Tempel, eds., Elsevier, Amsterdam.
Dobladas, A. F., Innes, R. W., Ecker, J. R., y Staskawicz, B. J. 1992.
El desarrollo de la
enfermedad en el etilenoinsensitive Arabidopsis thaliana infectados con avirulent
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Respuesta de etileno Arabidopsis ETR Gen1: Similitud de
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Chao, Q., Rothenberg, M., Solano, R. Romano, G., Terzaghi, W. y
Ecker, J. R. 1997. La activacin de la va de respuesta al gas
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