Progesterona

Elisa

Cdigo: 6001009

Ensayo inmunoenzimtico para la determinacin cuantitativa de niveles de

Progesterona en Suero
Para uso de Diagnstico In Vitro
MATERIALES
PROVISTOS

USO DE LA PRUEBA
Para la determinacin cuantitativa de concentraciones de Progesterona
en suero plasma humano.

INTRODUCCIN
La progesterona es un estereroide C21, que es sintetizada a partir de
los tejidos y colesterol circulante. El colesterol es transformado en
pregnenolona por medio de la deshidrogenasa e isomerasa en
progesterona. Los sitios principales de produccin son las glndulas
suprarrenales, los ovarios y la placenta durante el embarazo. La
mayora de los esteroides son metabolizados en el hgado para
pregnaneidol y conjugado como un glucornido antes de la excrecin
por los riones. La progesterona exhibe una gran variedad sobre los
rganos. El rol primario de la progesterona se presenta en los rganos
reproductores. En los hombres, la progesterona es un intermediario
necesario para la produccin de corticosteroides y andrgenos. En
mujeres la progesterona permanece a niveles relativamente constantes
en la fase folicular del ciclo menstrual. La concentracin incrementa
rpidamente durante la ovulacin y permanece elevada por 4 6 das
y decrece a los niveles iniciales 24 horas antes del inicio de la
menstruacin. En el embarazo, la produccin de progesterona por
medio de la placenta incrementa los niveles de 10 a 20 veces de
aquellos del pico de la fase ltea. La determinacin de progesterona es
efectuada para determinar la ovulacin as como para caracterizar los
defectos de la fase ltea. El monitoreo de la terapia con progesterona y
las evaluaciones del embarazo temprano comprenden el resto de los
ensayos de progesterona. El equipo de Progesterona por sistema Elisa
est diseado para la evaluacin cuantitativa de la progesterona Total
en suero plasma humano.

1.
2.
3.
4.
5.
6.

ALMACENAMIENTO
Los equipos debern permanecer a temperatura de entre 2 -8C y el
microplato deber mantenerse en su bolsa cerrada con desecantes
para minimizar su exposicin con el aire. Los equipos ya abiertos
permanecern estables hasta su fecha de expiracin manteniendo
cuidado con su almacenaje.

2.
3.
4.
5.
6.
7.

Micropozos recubiertos con Progesterona Mab

Estndares de Progesterona (listo para su uso)
Enzima conjugada (20X)
Diluyente de la muestra
SustratoTMB (listo para su uso)
Solucin de Frenado (listo para su uso)
Buffer de Lavado(20 X)

1.

2.
3.

4.
5.

NO

Potencial de los materiales de riesgo biolgico: Los

calibradores contienen componentes de origen humano, que se
han sido probados y encontrados no reactivos para el antgeno
de superficie de hepatitis B y anticuerpos contra el VIH
Aprobado por la FDA. Sin embargo no hay mtodo de prueba
que puede ofrecer completa seguridad de que el virus VIH,
Hepatitis B u otros agentes infecciosos estn presentes. Estos
reactivos deben ser manejados segn el Nivel de Bioseguridad
2, como se recomienda en los Centros para el Control de
Enfermedades / Institutos Nacionales de Salud manuales.
"Bioseguridad en laboratorios microbiolgicos y biomdicos
1984
No pipetee con la boca. No fume, coma , o beba en el rea
donde maneje este equipo
Los componentes en este equipo son para uso como una
unidad integral. Los componentes de diferentes lotes no se
deben mezclar
Es recomendable que los estndares, controles y muestras de
suero se corran por duplicado
Para obtener ptimos resultados, debe apegarse estrictamente
al protocolo. Pipeteado exacto y preciso, as como despus de
la hora exacta y requerimientos de temperatura prescritos son
esenciales. Cualquier desviacin de este pueden dar datos no
vlidos

RECOLECCIN DE LA MUESTRA
1.

2.
3.
4.

Se recomienda recoger muestras de suero con equipamientos

disponibles en el mercado. Las muestras de suero debe ser
totalmente incoloro incluso el color rojo muestra ligera
contaminacin de la sangre
Las muestras pueden ser refrigeradas de (2-8C) por 1 da.
Muestras congeladas (-20C) no mas de un mes
Evitar mltiples ciclos de congelacin-descongelacin
Muestras congeladas, deben descongelarse totalmente y mezclase

PREPARACIN DE REACTIVO
1. REACTIVO DE TRABAJO A Solucin de conjugado
progesterona Diluir la enzima conjugada 1:21 con diluyente
de muestra en un recipiente adecuado. Por ejemplo, diluir
100l del conjugado con 2 ml de diluyente de la muestra( este
reactivo de trabajo es suficiente para 10 micropozos)

2.
12x8x1
0.25 ml
1.2 ml
24 ml
12 ml
12 ml
25 ml

PERO

CUIDADOS Y PRECAUCIONES

REACTIVOS Y MATERIAL SUMINISTRADO

1.

REQUERIDOS

Pipetas de precisin.
Agua destilada
Puntas de pipetas desechables
Papel absorbente o toalla de papel
Un lector de ELISA a 450nm de longitud de onda
Papel cuadriculado.

PRINCIPIO DEL ENSAYO

La Progesterona es una fase competitiva de ELISA. Las muestras y la
enzima conjugada de Progesterona son agregadas a los pozos
recubiertos con anticuerpos anti-Progesterona monoclonales. La
progesterona presente en la muestra del paciente competir con la
Progesterona marcada enzimticamente por la unin con el anticuerpo
anti-Progesterona inmovilizado en la superficie del micropozo. La
muestra y el conjugado no unidos se eliminan por lavado, se agregan
los reactivos de desarrollo de color. Al reaccionar con la enzima unida
se lleva a cabo un cambio de color el cual ser inversamente
proporcional a la concentracin de la progesterona en la muestra del
paciente. Una curva estndar es obtenida graficando la concentracin
de los estndares contra la absorbancia de la muestra.

ADICIONALES

BUFFER DE LAVADO Prepare una solucin de lavado a

1X, adicionando el contenido de la botella (25 ml.20 X) a
475 ml de agua destilada o desionizada.
Conserve a temperatura ambiente

PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO

Antes de proceder, todos los reactivos debern ser llevados a
temperatura ambiente. Mezclar suavemente todos los reactivos antes de
su uso

1.
2.
3.
4.

Coloque el numero de pozos que vaya a utilizar

Pipette 10 l de estndares, muestras y controles a sus
respectivos micropozos.
Dispense 200 l de Reactivo Conjugado de Progesterona en
cada micropozo.
Incube 60 minutos a temperatura ambiente (18-26C)

5.
6.
7.
8.
9.

Remueva el lquido de los pozos .Lave en tres tiempos con 300

de solucin Buffer 1X.
Agregue 100 ll de sustrato TMB a cada pozo.
Incube 15 minutos a temperatura ambiente
Agregue 50 l de solucin stop a cada pozo. Mezclar suavemente
los pozos.
Lea la absorbancia a 450nm con microlector de ELISA durante
los siguientes 15 minutos.

EL PUNTO DE LAVADO DE MICROPOZOS ES CRITICO YA QUE UN

POBRE LAVADO DARA COMO RESULTADO IMPRECISION
LECTURA ELEVADA FALSA DE LA PRUEBA.
CALCULO DE RESULTADOS
LA CURVA ESTANDAR SE CONSTRUYE DE LA SIGUIENTE
MANERA:
1.
2.

3.

Calcule el valor de la media de la absorbancia (a450) para cada

grupo de Estndares de referencia, Controles y muestras.
Construya una curva estndar graficando la media de la
absorbancia obtenida para cada estndar de referencia contra su
concentracin en ng/ml en un papel graficador lineal lineal. Con
valores de absorbancia en el eje vertical y la concentracin en el
eje horizontal.
Utilice los valores de la media de la absorbancia para cada
muestra para determinar la correspondiente concentracin de
Progesterona en ng/ml de la curva estndar.

EJEMPLO DE CURVA ESTANDAR

Un resultado de una tpica corrida estndar con lecturas de densidad
ptica a 450nm muestra en el eje Y contra concentraciones de
Progesterona mostradas en el eje de las X. Nota. Esta curva estndar
es nicamente con fines ilustrativos y no deber utilizarse para clculo
de desconocidos. Cada laboratorio debe proveer su propia informacin
y curva estndar en cada experimento.
Progesterona (mIU/ml)

Absorbancia (450nm)

Standard 1 ( 0 ng/m )

2.719

Standard 2 (2.5 ng/ml)

1.937

Standard 3 ( 5 ng/m l)

1.391

Standard 4 (10 ng/ml)

0.828

Standard 5 (20 ng/m )

0.528

Standard 6 (40 ng/ml)

0.291

ng/ml
<50

CARACTERISTICAS DE COMPORTAMIENTO
1.

Sensitividad La concentracin mnima detectable medida con dos

desviaciones estndar de la media a un estndar Cero se estima
que es 0.3 ng/ml.

2.

Precisin.
A. INTRA-ENSAYO. La precisin fue determinada por
determinaciones de rplica por cuatro diferentes muestras de
suero en un ensayo. Las variables son las siguientes:
MUESTRAS
# replicas
Media de
Progesterona (ng/ml)
Desv. Std.
C.V. (%)

1
24

2
24

3
24

4
24

1.8
0.1
7.1

8.0
0.2
2.6

21.7
0.7
3.3

44.8
1.1
2.4

1
20

2
20

1.7 7.9
0.2 0.4
12.6 4.5

3
20

4
20

21.0
1.2
5.9

44.6
1.1
2.6

ESTUDIOS DE LINEARIDAD.
Cuatro muestras de pacientes fueron diluidas para determinar la
linearidad. La linearidad media fue 105.9%
ESTUDIOS DE RECUPERACION.
Varias muestras de suero con niveles conocidos de progesterona fueron
combinados y ensayados por duplicado. La media de la recuperacin fue
111.3%
PAR
No.

ESPERADO
Prog(ng/ml)

1
2
3
4
5
6
7

41.5
43.1
19.9
18.0
3.8
7.3
0.8

OBSERVADO RECUPERADO
Prog(ng/ml) %
43.1
45.7
19.8
19.2
4.3
8.7
0.7

103.9
106.1
99.1
106.4
115.4
118.6
80.4

ESPECIFICIDAD.
Los siguientes materiales han sido evaluados para revisar su reaccin
cruzada. El porcentaje indica reaccin cruzada al 50% comparado con
Progesterona.
La informacin de reaccin cruzada
farmacuticos se resumen en esta tabla:

para

algunos

esteroides

Reaccin cruzada (%) Conc. De Prog. Observada x 100

Concentrac. Esteroides

Progesterona
Androsterona
Corticosterona
Cortisona
Colesterol
Estradiol
Esterota
Estriol
Prednisolona
Testosterona

Cada laboratorio debe establecer sus propios rangos normales

basados en la poblacin de pacientes ha desarrollado su propia escala
de valores como sigue:

AM-PM

MUESTRAS
# replicas
Media de
Progesterona (ng/ml)
Desv. Std.
C.V. (%)

ESTEROIDES

VALORES ESPERADOS Y SENSIBILIDAD

CLASIFICACION

B. INTER-ENSAYO. La precisin entre corridas fue determinada por

las mediciones de seis diferentes muestras de suero a partir de
ensayos individual colectivamente ensayados. La variabilidad
entre ensayos se muestra como sigue:

REACCION CRUZADA
100%
0.86%
0.74%
0.11%
<0.08%
<0.01%
0.08%
<0.024%
0.075%
0.1%

APLICACIONES CLINICAS.
1. Documentacin de ovulacin.
El monitoreo de concentraciones de progesterona durante el ciclo
menstrual es til en la documentacin de la ovulacin. La concentracin
de la progesterona por arriba de 3.0ng/ml ser una evidencia presumible
de ovulacin.
2. Niveles de Progesterona Normales Vs. Anormales.
Los niveles por arriba de los rangos normales pueden indicar embarazo,
cncer adrenal, cncer ovrico, una mola la sobreproduccin hormonal
glandular. Sin embargo, los niveles de progesterona son sustancialmente
ms altos en embarazos mltiples que en embarazos simples. Niveles
por debajo de lo normal indican amenorrea problemas con ovulacin.
En mujeres embarazadas, los niveles de progesterona por debajo de
5ng/ml pueden indicar
3. Embarazos ectpicos.
La progesterona puede ser til tambin en el diagnstico de embarazos
ectpicos. Para valores <25ng/ml durante el embarazo, la viabilidad del
feto debe ser establecida por ultrasonido. Sin embargo, la progesterona
por arriba de 5 ng/ml en el primer semestre indica un embarazo no viable
independientemente de la localizacin del feto.
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Distribuido por:
Grupo Industrial MexLab S.A. de C.V.
01800-111-4343
www.grupomexlab.com
Rev. 09-2011