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Introduo

A propagao de plantas in vitro baseia-se nas tcnicas de cutivo de tecidos vegetais.


Pequenos fragmentos de tecido vivo (explante), ou mesmo clulas isoladas, so cultivados em
ambiente artificial, com meio nutritivo e reguladores de crescimento, onde cada fragmento,
ainda que extremamente pequeno (por vezes microscpico), encontra condies favorveis
para a regenerao de plantas idnticas que lhe deu origem.
A propagao de plantas in vitro tem sido estudada desde o incio do cculo passado. No
entanto, foi nas ltimas dcadas que teve seu maior desenvolvimento.
Alm dos trabalhos voltados para a gerao de plantas com identidade gentica,
sanidade e em grande escala, a propagao de plantas em ambiente artificial, atravs do cultivo
de clulas, tecidos ou rgos vegetais, tem possibilitado o avano nos estudos de biotecnologia,
biologia molecular, engenharia gentica, etc.
A nvel comercial, a propagao de plantas por cultivo de tecidos vegetais tem sido
responsvel pelo sucesso de culturas hortcolas, principalmente por viabilizar a utilizao de
mudas de excelente qualidade e em nmero satisfatrio, seja qual for a escala de produo. No
Brasil, os exemplos mais claros da sua importncia so, a produo de mudas em grande escala
de espcies frutferas, como a banana e a framboesa, olercolas, como o alho e o morango,
silvcolas, como algumas variedades de eucalipto e pinus, alm das ornamentais, principalemnte
as flores de corte.
Contudo, a propagao in vitro exige elevado investimento inicial, conhecimento tcnico
e, principalmente, mo-de-obra especializada.
Esta apostila rene informaes importantes de pesquisadores e tcnicos da rea, as
quais so fundamentais para o aprendiz da propagao de plantas pela cultura de tecidos
vegetais. Da mesma forma, pode subsidiar aqueles que desejam maior conhecimento da tcnica,
principalmente visando possibilidade de abreviar algumas etapas, o que pode representar o
sucesso do trabalho, tanto na pesquisa como na produo.

Sumrio
Introduo

Sumrio

Captulo 1

Histrico da cultura de tecidos vegetais


1.1 INTRODUO
1.2. HISTRICO
Captulo 2
Crescimento vegetal
2.1. EMBRIOGNESE
2.2. O EMBRIO
2.3. DIFERENCIAO CELULAR
2.4. PADRES DE CRESCIMENTO E DESENVOLVIMENTO
2.5. INICIAO E REGULAO DE ROTAS DE DESENVOLVIMENTO
2.6. FITOCROMO E O CONTROLE DO DESENVOLVIMENTO DAS PLANTAS PELA LUZ
2.7. DIVISO CELULAR E DESENVOLVIMENTO VEGETAL
2.8. HORMNIOS VEGETAIS
Captulo 3
Estabelecimento de um laboratrio de cultura de tecidos vegetais
3.1. INTRODUO
3.2. DISPOSIO DAS INSTALAES
3.3. ESTRUTURA DO LABORATRIO
Captulo 4
Meios de cultivo
4.1. INTRODUO
4.2. COMPONENTES DE MEIOS NUTRITIVOS
4.3. pH
4.4. PRINCIPAIS MEIOS UTILIZADOS
4.5. ESCOLHA DO MEIO DE CULTIVO
4.6. PREPARO DE SOLUES ESTOQUE
4.7. PREPARO DOS MEIOS DE CULTIVO
Captulo 5
Fitorreguladores
5.1. INTRODUO
5.2. EFEITOS BIOLGICOS
5.3. AUXINAS
5.4. CITOCININAS
5.5. INTERAO ENTRE CITOCININAS E AUXINAS
5.6. GIBERELINAS
5.7. CIDO ABSCSICO
5.8. ETILENO
Captulo 6
Desinfestao dos tecidos vegetais, estabelecimento dos explantes e condies de incubao.
6.1. INTRODUO
6.2. ESTRATGIAS DE DESINFESTAO
6.3. ISOLAMENTO E ESTABELECIMENTO DOS EXPLANTES
6.4. FATORES QUE INFLUENCIAM NO DESENVOLVIMENTO DO EXPLANTE
Captulo 7
Limpeza clonal
7.1. INTRODUO

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7.2. VRUS
Captulo 8
Multiplicao
8.1. INTRODUO
8.2. TCNICAS DA MULTIPLICAO
Captulo 9
Enraizamento
9.1. INTRODUO
9.2. FATORES LIGADOS PLANTA MATRIZ
9.3. FATORES RELACIONADOS AOS EXPLANTES
9.4. MEIO NUTRITIVO NA FASE DE MULTIPLICAO
Captulo 10
Aclimatizao ex vitro
10.1. INTRODUO
10.2. ASPECTOS FISIOLGICOS
10.3. PREPARAO DAS PLANTAS PARA A FASE DE ACLIMATIZAO
10.4. AMBIENTE EX VITRO
Captulo 11
Cultivo de embries e semeadura in vitro
11.1. INTRODUO
11.2. PREPARO DAS SEMENTES PARA CULTIVO DE EMBRIES
11.3. EXTRAO DOS EMBRIES
11.4. CONDIES DE CULTIVO
11.5. CULTURA DE EMBRIES EM VULO
11.6. ACLIMATIZAO DOS SEEDLINGS
11.7. APLICAES DA CULTURA DE EMBRIES
Captulo 12
Problemas do cultivo vegetal in vitro
12.1. CONTAMINAO
12.2. OXIDAO
12.3. VARIAO SOMACLONAL
12.4. HIPERHIDRATAO
12.4. DECLNIO NO VIGOR DAS BROTAES
Captulo 13
Embriognese somtica
13.1. INTRODUO
13.2. TIPOS DE EMBRIOGNENSE
13.3. FATORES QUE AFETAM A EMBRIOGNESE SOMTICA
13.4. ESTDIOS E MODULAO DA EMBRIOGNENSE SOMTICA
13.5. APLICAES
Captulo 14
Biorreatores
14.1. INTRODUO
14.2. ORIGEM DOS BIORREATORES
14.3. ADAPTAES PARA USO EM CULTIVO DE CLULAS
14.4. FATORES QUE PODEM SER CONTROLADOS ATRAVS DO USO DE BIORREATORES
14.5. CONSTITUIO DOS BIORREATORES
Captulo 15
Termos utilizados em cultura de tecidos
BIBLIOGRAFIA

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Captulo 1
Histrico da cultura de tecidos vegetais
1.1 INTRODUO
Com o avano da explorao da natureza pelo homem, um grande nmero de espcies e
genes destas espcies so perdidos anualmente. Da, a necessidade de preservao de gentipos
que possam ser utilizados posteriormente em tcnicas de melhoramento gentico. Para tanto,
utilizam-se os bancos de germoplasma. A preservao de um grande nmero de espcies de
propagao sexuada em bancos de sementes e de propagao assexuada em colees de
campo (ambas formas de bancos de germoplasma), est longe de satisfazer as necessidades
atuais e futuras, devido ao custo de manuteno desses bancos, alm do elevado risco de
destruio a que est sujeito o material, principalmente pela ao de pragas, doenas ou
condies adversas do ambiente.
A preservao de material gentico in vitro uma tcnica promissora de manuteno de
genes que podero estar disponveis facilmente. Mantendo-se plantas ou segmentos das
mesmas de diferentes procedncias e gentipos em condies de crescimento mnimo ou
mesmo de criopreservao, pode-se dispor destes materiais para uso no melhoramento
gentico, bem como pode-se utiliz-lo para intercmbio entre instituies, dentro do pas ou
com o exterior, sem os riscos de estarem levando pragas ou doenas para outras regies.
O desenvolvimento das novas tcnicas de biotecnologia tem apresentado vrias alternativas
promissoras para auxiliar os programas de melhoramento vegetal, seja na multiplicao de
gentipos superiores, limpeza clonal, introduo de genes exgenos (produo de plantas
transgnicas), como tambm na eficincia de induo de mutao, produo de sementes
artificiais, conservao de germoplasma, clonagem de genes, etc.
A tecnologia de cultura de clulas, protoplastos e tecidos de plantas constitui uma das reas
de maior xito da biotecnologia. Aps meio sculo de progresso, conquistou destacada posio
na propagao comercial e industrial de plantas.
A micropropagao, indiscutivelmente, tem sido a tcnica mais utilizada, pois oferece
vantagens de manuteno de gentipos e fentipos de hbridos, mutaes genticas
selecionadas, e excelente estado fitossanitrio das plantas obtidas.
Atualmente, concentra-se na limpeza clonal e multiplicao de espcies frutferas (banana,
abacaxi, morango), ornamentais, florestais (conferas), olercolas (alho, morango) e medicinais,
pois possibilita a multiplicao rpida em perodo de tempo e espao fsico reduzido.
1.2. HISTRICO
Em 1838, Schleiden e Schwann levantaram a hiptese de que toda clula tinha a capacidade
de gerar um indivduo, fenmeno que mais tarde seria denominado de totipotencialidade.
Em 1892, Sachs definiu que as plantas sintetizam substncias capazes de formar rgos e
que apresentam distribuio de forma polar.
Em 1902, Haberlandt tentou demonstrar a totipotencialidade das clulas das plantas a
partir de ensaios com material muito maduro (tecido palidico de folhas) e obteve pouca
expanso, porm no obteve diviso celular. O desconhecimento dos reguladores de
crescimento contribuiu para este insucesso.

Em 1904, Hanning foi o primeiro a cultivar embries imaturos de crucferas in vitro com
sucesso.
Em 1922, Robins e Kotte mantiveram, com sucesso, razes de gramneas em meio de
cultivo.
Em 1925, Laibach aplicou o cultivo de embries a cruzamentos interespecficos de Linum.
Posteriormente em 1929, o mesmo autor utilizou esta tcnica para viabilizar cruzamentos
incompatveis dentro do gnero Linum.
Em 1934, White trabalhou com razes de tomateiro e observou crescimento contnuo em
meio com extrato de levedura e sacarose. Tambm em 1934, Kogh e colaboradores
identificaram o primeiro fito-hormnio, a auxina (cido indolactico), o que possibilitou o
estabelecimento e a manuteno indefinida de culturas de calos. Ainda em 1934, Gautheret
observou que razes de Salix e Populus cresciam em meios de cultura.
Em 1937, White substituiu as leveduras por um complexo de vitamina B.
Em 1939, Gautheret obteve um crescimento contnuo de clulas de cenoura in vitro.
No perodo de 1939 a 1950, Street identificou a auxina como fator importante na induo
do sistema radicular e estabeleceu as primeiras relaes copa/raiz.
Em 1941, Van Overbeek e colaboradores promoveram a diferenciao e o crescimento de
calo a partir de embries de Datura stramonium pela incluso de leite de coco no meio de
cultivo.
Em 1944, Skoog observou que quando se trabalhava com medula de fumo em meio com
adenina e fosfato, havia formao de calos e gemas adventcias. A adio de AIA ocasionava
inibio das gemas. A diviso celular s ocorria na medula.
Em 1946, Ball regenerou plantas de Lupinus e Tropaeolum a partir de pices caulinares.
Em 1948, Skoog e Tsui demonstraram a regulao qumica da formao da parte area e
raiz em calo de fumo.
Em 1949, Nitsch obteve o crescimento de ovrios de tomate in vitro, com posterior
formao de frutos.
Em 1952, Sussex e Steve, trabalhando com primrdios foliares, observaram que estes
originavam plantas. Naquele mesmo ano, Steward e Caplin obtiveram formao de calo em
diversas espcies de plantas em meio de cultivo com auxina e leite de coco. Tambm em 1952
Morel e Martin recuperaram plantas de Dalia livres do Vrus de Mosaico pela cultura de pices
caulinares. Tambm em 1952, Morel e Martin fizeram a primeira microenxertia.
Em 1953, Tulecke obteve calo haplide a partir do cultivo de plen de Gingko biloba.
No perodo de 1953-1954, Muir observou que clulas vegetais isoladas, colocadas em meio
de cultivo, continuavam se multiplicando.
Em 1954, Muir e colaboradores obtiveram a primeira planta a partir de uma clula isolada.
Em 1955, Miller descobriu a cinetina e observou que a mesma causava diviso celular em
clulas maduras. O mesmo autor mostrou que a diferenciao da parte area, raiz ou ambos, em
calo de fumo, era regulada pelo balano hormonal auxina/citocinina. A partir desta descoberta
houve grandes avanos no estudo da cultura de tecidos vegetais.
Em 1957, Skoog e Miller demonstraram a razo auxina/citocinina e sua importncia na
emisso de razes ou brotaes.
Em 1958, Wickson e Thimann observaram que, quando se aplicava cinetina a uma gema
terminal ou lateral dormente esta saa da dormncia. Tambm em 1958, Reinert e Steward e
colaboradores obtiveram formao de embries somticos a partir de calo de cenoura. Ainda
neste ano, Maheswari e Rangaswamy estudaram a cultura de nucelos e a regenerao de
embries somticos em Citrus.

Em 1959 Melchers e Bergmann observaram que havia uma variao na ploidia com o
avano do tempo em que o explante permanecia no meio de cultivo.
Em 1960, Cocking fez o primeiro isolamento de protoplastos a partir de material in vitro.
Ainda em 1960, Morel iniciou estudos com cultura de meristemas de orqudeas, trabalhando
com pice caulinar (meristemas + primrdio foliar + poro inferior ao primrdio foliar).
Em 1962, Murashige e Skoog elaboraram o meio de cultivo MS. Tambm em 1962, Kanta
e colaboradores obtiveram sucesso na polinizao in vitro de Papaver somninferum.
Em 1965, Anghion-prat induziu a florao in vitro em tecido de fumo.
Em 1964, Guha e Maheswari obtiveram plantas haplides com o cultivo de anteras.
Em 1970, Smith obteve a cultura de meristemas propriamente dita. Em 1971, Takebe, e
colaboradores obtiveram as primeiras plantas resultantes da fuso de protoplastos.
Em 1973, a engenharia gentica iniciou-se com a expresso da insulina humana em
Escherichia coli, Neste curto perodo, esta tecnologia evoluiu rapidamente, possibilitando o
isolamento, a clonagem , a transferncia e a expresso de genes entre espcies incompatveis, e
a produo de plantas com novas caractersticas de interesse agrcola.
A partir de ento, o cultivo in vitro tornou-se uma ferramenta indispensvel para a execuo
de tcnicas de manipulao gentica por pesquisadores de todo o planeta.
No Brasil, os trabalhos pioneiros com cultura de tecidos foram desenvolvidos no Instituto
Biolgico de So Paulo, na dcada de 1950. A primeira equipe de cultura de tecidos foi
estabelecida em 1971, na ESALQ, em Piracicaba, SP.

Captulo 2
Crescimento vegetal
O crescimento o aumento de tamanho. Na medida em que crescem, os organismos
multicelulares, a partir do zigoto, no s aumentam em volume como tambm em peso,
nmero de clulas, quantidade de protoplasma e complexidade. Dentre as maneiras de
quantificar o crescimento de uma planta pode-se utilizar a pesagem, logo aps o corte para
evitar a perda de gua, de onde ser obtida a massa fresca, ou seja, todos os componentes
orgnicos e minerais, incluindo a quantidade de gua contida no organismo naquele momento.
Contudo, a determinao da massa fresca da mesma parte vegetal poder ser diferente em
funo das condies de umidade do solo e do ar atmosfrico. Para tanto, utiliza-se a
determinao da massa seca, a qual obtida mediante a secagem em estufa a 60 ou 70 C at
massa constante (24 a 48h).
Em alguns casos, a determinao da massa seca pode no representar
proporcionalmente o crescimento. o caso de uma semente germinando em condies de total
escurido, absorvendo somente gua. A plntula se desenvolve com as reservas da semente e ao
invs de aumentar a massa seca, ela diminui devido perda de CO2 pela respirao.
Como critrio fundamental, o crescimento caracterizado pelo aumento de tamanho.
2.1. EMBRIOGNESE
A embriognese zigtica inicia o desenvolvimento da planta. Diferentemente dos
animais, um processo contnuo que estabelece o plano bsico do corpo dos vegetais e forma
os meristemas que geram os rgos adicionais do adulto.
O incio da embriognese acontece com a unio dos gametas na oosfera, formando o
zigoto. Alm da formao do zigoto, nesse momento, nas angiospermas, trs outros processos
so desencadeados: a formao do endosperma, semente e fruto.
A dupla fecundao uma caracterstica nica das plantas com flores: a formao do
zigoto acompanhada pela unio de um segundo gameta aos dois ncleos polares para formar
um ncleo triplide (Figura 2.1) que dar origem ao endosperma (tecido de nutrio do
embrio em desenvolvimento).
A embriognese e o desenvolvimento do endosperma ocorrem em paralelo ao
desenvolvimento da semente, sendo o embrio parte da semente. O endosperma pode,
tambm, ser parte da semente madura, porm em algumas espcies ele desaparece antes de ser
completado o desenvolvimento da semente.
Quando completados, a semente e o embrio de muitas espcies tornam-se dormentes e
capazes de sobreviver por longos perodos desfavorveis de crescimento.
A embriognese vegetal difere da maioria dos animais por no gerar diretamente os
tecidos e rgos do adulto. Nas angiospermas, por exemplo, forma um corpo vegetal
rudimentar tipicamente constitudo por um eixo embrionrio e cotildone (s). Apesar disso,
estabelece os padres bsicos de desenvolvimento que persistem e podem ser facilmente
identificados na planta adulta:
- O padro apical basal e desenvolvimento axial;
- O padro radial de tecidos encontrados nas partes areas e razes.

Figura 2.1: Ciclo reprodutivo do milho (Imagem: Taiz e Zeiger, 2004).


A maioria das estruturas que constituem a planta adulta gerada aps a embriognese,
por meio da organognese a partir dos meristemas primrios. Embora estes meristemas tenham
sido formados durante a embriognese, apenas aps a germinao tornam-se ativos e iniciam a
formao dos rgos e dos tecidos do adulto.
2.2. O EMBRIO
Logo aps a fecundao, o zigoto torna-se polarizado e alonga-se antes de sofrer sua
primeira diviso, que ocorre de forma assimtrica, em ngulo reto ao eixo longitudinal. Essa
diviso origina uma clula apical e outra basal, cujos destinos so muito diferentes. A menor (a
apical) formar a maior parte das estruturas do embrio. Duas divises verticais e uma
horizontal originam o embrio globular de oito clulas.
A clula basal tambm se divide, porm todas as suas divises so horizontais, em
ngulo reto ao eixo longitudinal. O resultado um filamento composto por seis a nove clulas
conhecido como suspensor, o qual conecta o embrio ao sistema vascular da planta em que ele
est se desenvolvendo. Apenas uma das derivadas da clula basal contribui para a formao do
embrio a mais prxima dele, a qual conhecida como hipfise e forma a columela, ou
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parte central da coifa, e uma parte essencial do meristema apical da raiz conhecida como centro
quiescente.
Alguns estdios de desenvolvimento do embrio apresentam maior importncia:
Estdio globular: aps a primeira diviso zigtica, a clula apical passa a dividir-se de
forma altamente ordenada, gerando um embrio globular de oito clulas, 30 horas aps a
fecundao (para Arabidopsis). Divises celulares adicionais aumentam o nmero de clulas do
embrio (Figura 2.2 A, B, e C).
Estdio de corao: formado quando ocorrem rpidas divises celulares em duas
regies opostas transversalmente, junto ao futuro pice da parte area. Essas duas projees
mais tarde originaro os cotildones e a simetria bilateral do embrio (Figura 2.2 D e E).
Estdio de torpedo: Esse estdio forma-se como resultado do alongamento celular ao
longo do eixo do embrio e desenvolvimento posterior dos cotildones (Figura 2.2 F, G e 2.3).
Estdio de maturao: Ao final da embriognese, o embrio e a semente perdem gua
e tornam-se metabolicamente quiescentes ao entrarem em dormncia.
Os cotildones so rgos de armazenamento de nutrientes para muitas espcies e,
durante a fase de crescimento do cotildone, protenas, amido e lipdios so sintetizados e
depositados nos cotildones para serem utilizados pela planta durante o crescimento
heterotrfico, que ocorre logo aps a germinao.

Figura 2.2: Detalhes das diferentes fases do embrio.


Padro axial: Quase todas as plantas apresentam uma polaridade axial, na qual os
tecidos e rgos so ordenados de forma precisa ao longo de um eixo linear ou polarizado. O
meristema apical da parte area est localizado em uma das extremidades do eixo, enquanto o
apical da raiz est em outra. Qualquer segmento individual, tanto de raiz como da parte area,
tambm tem extremidades apical e basal. Por exemplo, razes adventcias desenvolvem-se na
extremidade basal de um caule seccionado, enquanto que gemas desenvolvem-se na
extremidade apical, mesmo que eles estejam invertidos.
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Padro radial: Os diferentes tecidos so organizados em um padro preciso no interior


dos rgos vegetais. Por exemplo: se examinar uma raiz em seco transversal pode se ver trs
anis concntricos de tecidos ordenados ao longo do eixo radial: uma camada mais externa de
clulas epidrmicas (a epiderme) recobre um cilindro de tecido cortical (o crtex), o qual, por
sua vez, cobre um cilindro vascular (a endoderme, periciclo, floema e xilema).

Figura 2.3: Fases da formao do embrio (Imagem: Taiz e Zeiger, 2004).


Em monocotiledneas, as reservas so armazenadas em especial no endosperma,
enquanto que em muitas dicotiledneas, este se desenvolve rapidamente no incio da
embriognese, porm reabsorvido e o tecido do endosperma no est presente na semente
madura.
2.3. DIFERENCIAO CELULAR
o processo de expresso diferencial de genes que leva a clula a adquir propriedades
metablicas, estruturais e funcionais distintas. Em plantas, ao contrrio de animais, a
diferenciao celular reversvel, particularmente quando clulas diferenciadas so removidas
da planta e colocadas in vitro. Assim, se forem fornecidos os nutrientes e hormnios
apropriados, podem originar calos, tecidos e at regenerar uma planta completa por
embriognese ou organognese. Essa capacidade denominada totipotncia. A exceo a esta
regra so as clulas cujo material gentico sofreu dano, como a perda do ncleo de clulas que
formam o sistema vascular.

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2.4. PADRES DE CRESCIMENTO E DESENVOLVIMENTO


Em plantas, o crescimento ocorre em determinadas zonas que tm clulas produzidas
recentemente por diviso celular em um meristema. No entanto, somente a diviso celular no
causa aumento em tamanho. As pontas de razes e pices caulinares tm meristemas. Outras
zonas meristemticas se encontram no cmbio vascular e imediatamente acima dos ns das
monocotiledneas, ou nas bases das folhas herbceas.
Meristemas so populaes de clulas pequenas e isodiamtricas (de iguais dimenses
em todos os lados) com caractersticas embrionrias. Os meristemas vegetativos se
autoperpetuam. Eles produzem os tecidos que formaro o corpo da raiz ou caule e os
regeneram continuamente, podendo reter sua caracterstica embrionria indefinidamente
(clulas-tronco). Quando uma clula-tronco se divide, geralmente uma das clulas filhas
mantm a identidade original e a outra obrigada a seguir uma rota particular de
desenvolvimento.
O meristema apical vegetativo da parte area origina o caule assim como os rgos
laterais (folhas e gemas). Normalmente ele formado por centenas a milhares de clulas e est
localizado na extremidade do eixo, porm rodeado e coberto por folhas imaturas, as quais so
produzidas por diviso e diferenciao das clulas do meristema.
Em muitas plantas, a parte area, como um todo, apresenta uma atividade sazonal. Ou
seja, o meristema apical pode crescer rapidamente em um perodo de condies ambiental
favorveis, como uma primavera regular, e entrar em um perodo de menor crescimento em
condies ambientais desfavorveis.
Os meristemas apicais de razes e talos se formam durante o desenvolvimento
embrionrio, enquanto se origina a semente, e se chamam meristemas primrios. Aps a
germinao, as atividades desses meristemas gera os tecidos e rgos primrios que constituem
o corpo primrio da planta. A maioria das plantas desenvolve uma variedade de meristemas
secundrios durante o desenvolvimento ps-embrionrio. Os meristemas secundrios podem
ser estruturas semelhantes aos primrios, porm alguns meristemas secundrios tm uma
estrutura totalmente distinta. Neles so includos os meristemas axilares, meristemas de
inflorescncias, meristemas florais, meristemas intercalares e meristemas laterais (o cmbio
vascular e o cmbio cortical) (Figura 2.4).
Os meristemas axilares so formados nas axilas de folhas e derivados
do meristema apical da parte area. So eles que produzem as
ramificaes do eixo principal da planta.
Meristemas intercalares so encontrados no interior de rgos, em
geral prximos de suas bases. Os meristemas intercalares de folhas e
caules de gramneas permitem continuar seu crescimento apesar do
corte e do pastoreio pelo gado.
Os meristemas da raiz lateral tm a estrutura do meristema da raiz
primria, porm so formados a partir de clulas do periciclo em
regies maduras da raiz. As razes adventcias tambm podem ser
produzidas a partir de meristemas de razes laterais que se
desenvolvem a partir de caules, bem como quando caules cortados so
enraizados em propagao por estaquia.

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Figura 2.4: Corte de um caule [PE: periderme, X: xilema, F: floema, C: cmbio vascular.
(Imagem: Appezzato-da-Gloria & Guerreiro, 2003)]
2.5. INICIAO E REGULAO DE ROTAS DE DESENVOLVIMENTO
- A expresso de genes que codificam fatores de transcrio determina a identidade da
clula, tecido ou rgo;
- O destino de uma clula determinado por sua posio, e no sua histria clonal
(origem);
- As rotas de desenvolvimento so controladas por uma rede de interao de genes;
- O desenvolvimento regulado por sinalizao de clula a clula.
Quando mutaes ocorrem em clulas do meristema apical, todas as clulas derivadas
so mutantes. Uma planta nessa situao uma quimera, apresentando tecidos com uma
constituio gentica diferente.
Exemplo de quimera so as plantas de Hedera helix, que possui clulas mutantes que
afetam a capacidade de diferenciao dos cloroplastos. A presena de setores albinos indica que
os mesmos foram derivados de clulas tronco portadoras de mutao (Figura 2.5). Em
determinada camada de clulas meristemticas de hera, as clulas apresentam uma mutao
determinante do albinismo, enquanto que camadas adjacentes apresentam clulas sem mutao.
Com isso, as folhas apresentam manchas originadas por diferentes camadas de clulas do
meristema.

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Figura 2.5: Folhas de Hedera helix. A presena de setores albinos indica que os mesmos
foram derivados de clulas portadoras de mutao (Imagem: Taiz e Zeiger, 2004)
2.5.1. Como as clulas sabem sua posio?
Clulas vizinhas, bem como tecidos e rgos distantes proporcionam informaes
quanto posio. A coordenao da atividade celular depende da comunicao clula a clula.
Nesse caso, alguns genes no precisam ser expressos em uma determinada clula para afetar o
destino dela. Isso acontece em funo de mecanismos como sinalizao induzida (protenas
que transmitem informaes ao se ligarem a determinada clula), sinalizao hormonal
(auxinas, etileno, giberelinas, cido abscsico, citocininas e brassinosterides) e sinalizao
pelo trfego de protenas reguladoras (sinais trocados atravs dos plasmodesmos).
2.5.2. Senescncia e morte celular programada
No outono, a mudana de cor em folhas de algumas espcies, provocada pelo efeito
ambiental sobre o processo de desenvolvimento, levando senescncia e morte foliar. A
senescncia diferente de necrose, embora ambas levem morte. A necrose a morte por
danos fsicos, veneno ou outra leso externa. A senescncia uma processo de
desenvolvimento normal controlada pelo prprio programa gentico da planta. As folhas so
geneticamente programadas para morrer.
Durante a senescncia, enzimas hidrolticas decompem muitas protenas, carbohidratos
e cidos nuclicos. Os produtos resultantes so transportados de volta para a planta via floema,
onde sero reutilizados em processos de sntese. Isso acontece tambm com muitos minerais
contidos nos rgos senescentes.
A senescncia de rgos muitas vezes est associada absciso, processo pelo qual
clulas especficas no pecolo se diferenciam formando uma camada de absciso, a qual separa o
rgo da planta.

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2.6. FITOCROMO E O CONTROLE DO DESENVOLVIMENTO DAS PLANTAS PELA


LUZ
Plantas crescendo no escuro possuem aparncia plida, so altas e afiladas (estioladas).
Na ausncia de luz a planta utiliza as reservas estocadas em rgos para o seu crescimento.
Imediatamente aps o contato com a luz, inicia a transformao do estado estiolado para o
verde, mesmo que essa quantidade de luz no seja suficiente para a produo de energia pela
fotossntese. O completo desestiolamento requer alguma fotossntese, porm as mudanas
rpidas iniciais so induzidas por uma resposta luz, chamada de fotomorfognese.
Os pigmentos que promovem as respostas fotomorfognicas so, principalmente os
fitocromos, os quais esto envolvidos na maioria dos fenmenos. Estudos indicam que os
fitocromos esto concentrados na regio meristemtica. Eles regulam a transcrio ou a
represso de muitos genes.
Uma funo importante do fitocromo que ele possibilita s plantas reagirem ao
sombreamento. A elongao do caule em resposta ao sombreamento, est associada maior
proporo de ondas na faixa do vermelho-distante. Isso no acontece com as chamadas plantas
de sombra, s quais apresentam uma relao sistemtica entre o crescimento controlado pelo
fitocromo e o hbito da espcie.
O fitocromo tambm participa do controle da germinao de algumas espcies. De
forma geral, espcies com sementes grandes, que apresentam amplas reservas, capazes de
sustentar prolongados perodos de desenvolvimento de plntulas no escuro, no necessitam de
luz para a germinao. No entanto, muitas espcies herbceas e gramneas permanecem
dormentes, mesmo quando hidratadas, se esto em local fora do alcance da luz. Estudos com
sementes de alface que dependem da luz para a germinao, tm mostrado que quando h
induo germinao, tambm ocorre aumento no nvel de giberelina na forma biologicamente
ativa. Assim, o fitocromo pode promover a germinao de sementes atravs de seus efeitos na
biossntese de giberelina.
Outro efeito prtico da ao dos fitocromos a abertura e fechamento de fololos de
espcies de alguns gneros, como Mimosa, Albizia e Samanea, bem como membros da famlia
Oxalidaceae. Nestas, a alterao no ngulo das folhas ou fololos so causadas por mudanas
rtmicas de turgor nas clulas do pulvino, uma estrutura especializada localizada na base do
pecolo (Figura 2.6) . Uma vez iniciado, o fechamento persiste, tanto em folhas intactas como
em fololos isolados. No entanto, quando em contato com a luz azul, so estimulados a
abrirem, ao contrrio da luz vermelha.

Figura 2.6 : Os fluxos de ons entre as clulas motoras dorsais e ventrais dos pulvinos de
Albizia regulam a abertura e o fechamento dos fololos. (Imagem: Taiz e Zeiger, 2004).
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2.7. DIVISO CELULAR E DESENVOLVIMENTO VEGETAL


As clulas vegetais formam-se a partir de divises celulares em um meristema primrio
ou secundrio. As clulas vegetais recm formadas normalmente expandem-se e diferenciam-se,
mas, uma vez que assumam uma funo transporte, fotossntese, sustentao,
armazenamento ou proteo em geral, no se dividem novamente durante a sua vida. Nesse
aspecto, parecem se assemelhar s clulas animais, que so consideradas terminalmente
diferenciadas.
Contudo, a semelhana com o comportamento animal apenas superficial. Quase todos
os tipos de clulas vegetais que conservam o ncleo na maturidade apresentam a capacidade de
se dividirem. Tal propriedade entra em funcionamento durante certos processos, como a
cicatrizao de leses e a absciso foliar.
2.7.1. As clulas vegetais diferenciadas podem retomar a diviso
Sob certas circunstncias, clulas maduras e diferenciadas de tecidos intactos podem
retomar a diviso celular. Em muitas espcies, clulas maduras do crtex e/ou do floema
retomam a diviso para formarem meristemas secundrios, como o cmbio vascular ou o
felognio. A zona de absciso da base do pecolo da folha a regio onde as clulas maduras do
parnquima podem se dividir novamente aps um perodo de inativao mittica, formando
uma camada de clulas com paredes relativamente frgeis, onde pode ocorrer a absciso.
A leso de tecidos vegetais induz a diviso celular no local lesionado. Mesmo clulas
altamente especializadas, como as fibras do floema e as clulas-guarda, podem ser estimuladas
pela leso a se dividirem.
A atividade mittica induzida por leso normalmente autolimitante; aps poucas
divises, as clulas derivadas param de se dividir e se rediferenciam. Entretanto, quando a
bactria do solo Agrobacterium tumefaciens invade uma leso, ela pode causar neoplasia (formao
de tumor), doena conhecida como galha da coroa. Esse fenmeno uma evidncia natural do
potencial mittico das clulas vegetais maduras.
Sem a infeco da Agrobacterium, a diviso celular induzida pela leso cessaria em poucos
dias e algumas das novas clulas se diferenciariam em um tecido vascular ou em uma camada
protetora do felema. No entanto, a Agrobacterium altera as caractersticas das clulas que se
dividem em resposta leso, tornando-as semelhantes a um tumor. Elas continuam sua diviso
ao longo da vida do vegetal produzindo uma massa desorganizada semelhante a um tecido
tumoral denominado galha.
Estas consideraes sugerem que as clulas vegetais maduras param de se dividir em
decorrncia do no recebimento de um determinado sinal. A idia de que a diviso celular pode
ser iniciada por um fator difusvel foi proposta pelo fisiologista vegetal austraco G. Haberlandt
que, por volta de 1913, demonstrou que o tecido vascular possui uma substncia, ou
substncias, solvel em gua, que estimula a diviso celular em tecidos lesionados de tubrculos
de batata. O esforo para a determinao da natureza deste fator levou descoberta das
citocininas, em 1950.
A possibilidade de crescerem clulas, tecidos e rgos em um simples meio de cultivo
com nutrientes, vem, h muito, despertando o interesse de bilogos. Na dcada de 1930, Philip
White demonstrou que razes de tomateiro poderiam crescer indefinidamente em um simples
meio nutritivo, contendo apenas sacarose, sais minerais e algumas poucas vitaminas, sem a
adio de hormnios.
Ao contrrio das razes, os tecidos caulinares isolados exibem muito pouco crescimento
em meio de cultivo sem a adio de hormnios. Mesmo se a auxina for adicionada, o
crescimento limitado e, em geral, no se mantm. Com freqncia, esse crescimento induzido
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pela auxina deve-se apenas ao alongamento celular. As partes areas da maioria dos vegetais
no podem crescer em meios simples sem hormnios, mesmo quando se cultivam tecidos
caulinares contendo os meristemas apical ou lateral, at que se formem razes adventcias. Uma
vez que o tecido caulinar tenha enraizado, o crescimento da parte area retomado, mas agora
como uma planta completa.
Tais observaes indicam que existe uma diferena na regulao da diviso celular nos
meristemas da raiz e da parte area. Sugerem tambm que algum (ns) fator (es) derivado (s) da
raiz pode (m) regular o crescimento da parte area.
Em todas as plantas, as razes parecem ser os principais locais de biossntese natural de
citocinina, mas a produo tambm pode ocorrer em outros tecidos em diviso celular ativa,
tais como o cmbio do caule. O pice da raiz, e particularmente as clulas do seu centro
inativo so os locais mais importantes de sntese.
A citocinina sintetizada nas razes parece se mover pelo xilema at a parte area,
juntamente com a gua e os sais minerais absorvidos pelas razes.
2.8. HORMNIOS VEGETAIS
2.8.1. Citocininas
Embora tenham sido descobertas como fatores da diviso celular, as citocininas podem
estimular ou inibir uma variedade de processos fisiolgicos, bioqumicos e de desenvolvimento
quando aplicadas s plantas superiores, sendo cada vez mais evidente que as citocininas
endgenas exercem importante funo na regulao destes eventos.
As citocininas so, em geral, necessrias para a diviso das clulas vegetais.
A grande parte das divises celulares em uma planta adulta ocorre nos meristemas. A
expresso local do gene ipt de Agrobacterium, em sees somticas de folhas de tabaco, promove
a formao de meristemas ectpicos (de localizao anormal), indicando que o aumento dos
nveis de citocinina suficiente para iniciar as divises celulares nestas folhas.
As citocininas regulam a diviso celular, modulando o ingresso da clula no processo de
diviso celular. Ocorre um pico na concentrao de zeatina nas culturas de clulas de tabaco
sincronizadas, no final da fase S, na mitose e na fase G1.
As citocininas foram descobertas quanto a sua capacidade para estimular a diviso
celular em tecidos suplementados com nveis adequados de auxinas. Evidncias sugerem que
citocininas e auxinas participam na regulao do ciclo celular pelo controle da atividade das
quinases dependentes de ciclina. As protenas quinases dependentes de ciclina, em combinao
com suas subunidades reguladoras, as ciclinas, so as enzimas que regulam o ciclo celular em
eucariontes.
Um dos principais determinantes da forma do vegetal o grau de dominncia apical. As
plantas com forte dominncia apical, como o milho, apresentam um nico eixo de crescimento,
com poucas ramificaes laterais. Por outro lado, em plantas arbustivas, ocorre o crescimento
de muitas gemas laterais.
Embora a dominncia apical possa ser determinada inicialmente pela auxina, os estudos
de fisiologia indicam que as citocininas desempenham um papel no crescimento inicial das
gemas laterais. Por exemplo, aplicaes diretas de citocininas em gemas axilares de muitas
espcies estimulam a diviso celular e o crescimento dessas gemas.
Os meristemas dos pices das razes so as regies de maior sntese de citocinina livre. O
movimento at a parte area acontece via xilema, juntamente com a gua e os sais minerais
absorvidos pelas razes. Embries jovens de algumas espcies tambm produzem citocininas,

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assim como as folhas jovens em desenvolvimento, os frutos jovens e, possivelmente, outros


tecidos.
2.8.2. Auxinas
As auxinas so capazes de iniciar a diviso celular e esto envolvidas na origem de
meristemas, promovendo crescimento tanto ao tecido desorganizado como para rgos
definidos. A auxina natural cido indolactico (AIA) foi o primeiro hormnio vegetal
identificado, em 1928.
As auxinas so muito usadas em micropropagao e so incorporadas ao meio de cultivo
para promover a formao e crescimento de calo e de suspenso de clulas ou rgos, bem
como para regular a morfognese, especialmente associadas com citocininas. O tipo e a
concentrao de auxina a ser acrescida ao meio de cultivo iro depender de: tipo de crescimento
ou desenvolvimento requerido; nveis naturais de auxina endgena do explante quando este
preparado; capacidade dos tecidos cultivados de sintetizar auxina naturalmente; interao, se
houver, entre a auxina sinttica aplicada e a(as) substncia(s) endgena(s) natural(ais).
Em tecidos organizados, as auxinas so responsveis pela manuteno da dominncia
apical.
Os nveis de ocorrncia natural de auxina dependem do tecido do qual o explnte
removido e das condies ambientais em que este tecido vegeta.
As clulas meristemticas so locais ativos para a biossntese e/ou para a liberao de
fatores naturais de crescimento, favorecendo o crescimento da clula. A biossntese do AIA
ocorre no citoplasma e, em menor intensidade, nos cloroplastos. A degradao do AIA
realizada pela AIA-oxidase, cuja atividade estimulada por monofenis.
O transporte das auxinas na planta basal (do pice do rgo para a sua base) e polar
(manifesta polaridade em relao ao tecido). Seu deslocamento ocorre na forma livre, atravs
do floema, cmbio vascular e xilema. A velocidade de transporte da auxina na planta varia de 1
a 24 cm.h-1.
As auxinas promovem o crescimento dos tecidos da planta de duas maneiras: induzindo
a liberao de ons hidrognio dentro e atravs da parede da clula. A ao da auxina leva
quebra de lipdios e acidificao da parede, aumentando a sua extenso. ons de potssio so
colocados na clula para neutralizar o pH, o que reduz o potencial hdrico da clula, de modo
que a gua entra e a clula se expande.
Por um efeito do metabolismo do RNA (sntese protica), possivelmente induzindo a
transcrio das molculas do RNA (mRNA). Os mRNAs so capazes de decodificar protenas,
as quais so requisitadas para o crescimento.
As auxinas parecem provocar a alterao da fisiologia dos tecidos de modo a modificar
o que j estava geneticamente programado. As clulas que respondem auxina revertem-se a
um estado diferenciado e comeam a se dividir. O modo como a auxina traz tona essa
reprogramao no totalmente compreendido.
A ao da auxina dependente da disponibilidade livre do boro. Em plantas deficientes
em boro, tanto a translocao do AIA quanto a sntese de RNA nuclear em resposta ao
tratamento com auxina podem ser inibidas. Dessa forma, a deficincia de boro pode reduzir o
efeito das auxinas exgenas, por exemplo, para formao de razes. A regulao do nvel de
AIA resultante da variao na taxa de biossntese e do seu grau de desativao.
Em plantas sombreadas, a auxina transportada lateralmente para o lado escuro,
fazendo com que estas clulas se desenvolvam em maior proporo, provocando a curvatura da
planta.

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Alm do citado, as auxinas participam tambm da dominncia apical, da iniciao das


razes laterais, da absciso foliar, da diferenciao vascular, da formao de gemas florais e do
desenvolvimento do fruto.
A fruta do morangueiro na realidade um receptculo intumescido, no qual o
crescimento regulado pela auxina produzida nos aqunios (frutos verdadeiros) (Figura 2.7).

Figura 2.7: Desenvolvimento do morango sem a presena dos aqunios e sobre


aplicao de auxina. (Imagem: Taiz e Zeiger, 2004).
As auxinas sintticas vem sendo utilizadas comercialmente na agricultura h mais de 50
anos. Os primeiros usos comerciais incluram a preveno da absciso de frutos e folhas, a
promoo do florescimento em abacaxi, a induo de frutos partenocrpicos, o raleio de frutos
e o enraizamento de estacas para propagao vegetal. A induo do enraizamento ocorre
porque h induo da formao de razes adventcias na extremidade cortada.
Alm dessas aplicaes as auxinas tambm podem ser utilizadas como herbicidas.
O etileno tambm est envolvido no desenvolvimento de frutos e alguns efeitos da
auxina na frutificao podem ser resultado da promoo da sntese de etileno.
2.8.3. A razo auxina:citocinina regula a morfognese de tecidos em cultura
Logo aps a descoberta da cinetina, foi observado que a diferenciao de calos, obtidos
a partir de segmentos de medula de tabaco, em razes ou em partes areas, depende da razo de
auxina:citocinina no meio de cultivo. Enquanto uma alta razo estimula a formao de razes,
uma baixa razo leva a formao de parte area. Em nveis intermedirios, o tecido cresce como
um calo indiferenciado.
O efeito da razo auxina:citocinina na morfognese tambm pode ser observado nos
tumores da galha da coroa obtida pela mutao do T-DNA do plasmdio Ti da Agrobacterium. A
mutao do gene ipt do plasmdio Ti bloqueia a biossntese de zeatina nas clulas infectadas. A
alta razo auxina:citocinina resultante nas clulas do tumor causa a proliferao de razes em
vez de calos indiferenciados. Por outro lado, a mutao em qualquer um dos genes para a
biossntese da auxina promove uma diminuio da razo auxina:citocinina, estimulando a
proliferao da parte area.

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2.8.4. Giberelinas
As giberelinas foram descobertas pelos cientistas japoneses antes dos anos 1950. Os
agricultores da sia, plantadores de arroz, conheciam uma doena que fazia com que as plantas
de arroz crescessem excepcionalmente, mas que suprimia a produo de sementes. Ao
examinarem, fitopatologistas descobriram que os sintomas da doena era provocado por uma
substncia secretada por um fungo que infectava as plantas. Esse composto foi isolado a partir
de filtrados das culturas de fungos do gnero Gibberella. Outros pesquisadores isolaram
substncias semelhantes de fungos, o que sugeriu a existncia de giberelinas diferentes, embora
o cido giberlico fosse sempre o principal componente.
Logo aps a descoberta dos efeitos do cido giberlico sobre o crescimento das plantas,
giberelinas foram isoladas de vrias espcies vegetais. Em funo dos inmeros tipos de
giberelinas descritas, a partir de 1968, passou-se a numer-las de acordo com a ordem de
descrio, assim, passaram a ser identificadas como GA1, GA2, ...GAn.
Alm do elongamento de entrens (Figura 2.8 A), as giberelinas atuam na germinao de
sementes, incluindo a quebra de dormncia e a mobilizao das reservas. No desenvolvimento
reprodutivo, as giberelinas podem afetar a transio do estado juvenil para o maduro, bem
como a induo da florao, a determinao do sexo e o estabelecimento do fruto.
As aplicaes de giberelinas podem causar o estabelecimento do fruto aps a
polinizao e o crescimento de alguns frutos, no caso em que a auxina no apresente efeito. Por
exemplo, o estmulo do estabelecimento do fruto por giberelina em ma.
Os principais usos comerciais das giberelinas (o GA3, principalmente), aplicadas por
asperso ou imerso, incluem o controle da qualidade de frutas, a maltagem da cevada e o
aumento da produo de acar em cana. Em algumas plantas cultivadas, a reduo na altura
desejvel, o que pode ser obtido pelo uso de inibidores da sntese de giberelinas.
Na produo de frutos, o principal uso para aumentar o comprimento do pednculo
de uvas sem sementes (Figura 2.8 B).
A

Figura 2.8: Efeito da aplicao de giberelinas


em plantas de repolho (A) e no aumento do
pednculo de uvas sem sementes (B)
(Imagem: Taiz e Zeiger, 2004).

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O uso de algumas giberelinas associadas a auxinas pode causar alongamento dos frutos
de ma e, sob certas condies, utilizada utilizado para melhorar a forma dos frutos.
Em frutos ctricos, as giberelinas retardam a senescncia, possibilitando a permanncia
na planta, prolongando o perodo de comercializao.

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Captulo 3
Estabelecimento de um laboratrio de cultura de tecidos vegetais
3.1. INTRODUO
A montagem e organizao de um laboratrio dependem dos objetivos a que se
prope. Assim, um laboratrio com finalidade comercial, destinado exclusivamente a
micropropagao com base em protocolos estabelecidos, tende a ser maior, porm, mais
simples em instalaes e equipamentos que um laboratrio destinado pesquisa, que pode ser
pequeno, porm, mais diversificado quanto aos equipamentos. Um laboratrio de pesquisa
pode tambm ter finalidade didtica e, neste caso, pode-se reservar reas para ensino e
demonstrao.
O laboratrio de cultura de tecidos vegetais (LCTV) deve dispor de uma rea
destinada ao estabelecimento, crescimento e multiplicao das plantas produzidas. Os
laboratrios que se dedicam produo e distribuio de materiais com certificado de sanidade,
por exemplo, devem incluir facilidades para a quarentena e avaliao fitossanitria.
As dependncias do laboratrio devem estar num mesmo nvel, de fcil acesso, uma
vez que as atividades tpicas de cultura de tecidos requerem movimentao frequente entre as
diferentes reas. Dessa forma, a distribuio das dependncias deve ser funcional, facilitando o
deslocamento de pessoal e materiais.
As salas de preparo de meio, transferncia e de crescimento, bem como cmaras frias
devem ser isoladas com circulao controlada. A localizao de salas e o espao disponvel
dependero da natureza do trabalho e preferncia pessoal.
H que se dispor de fonte de gua de boa qualidade, embora a gua possa ser
purificada em diferentes graus no laboratrio. Deve existir um eficiente sistema de drenagem da
gua utilizada, que usada em grande quantidade especialmente na lavagem de vidraria.
3.2. DISPOSIO DAS INSTALAES
Quando se vai produzir pequeno nmero de propgulos, as vrias operaes
necessrias podem ser condensadas num ambiente que ao mesmo tempo escritrio, depsito,
laboratrio e casa de vegetao. Entretanto, se a escala de produo aumenta, recomendvel
uma disposio adequada. Em empresas comerciais, visando principalmente a funcionalidade,
facilidade de acesso e maior controle de contaminaes, projetam-se salas de isolamento de
explante, transferncias e crescimento das culturas separadas das demais atividades.
Torres (1998), salienta que a capacidade de produo de um laboratrio de cultura de
tecidos determinada pelo tamanho da sala de cultura ou de incubao. Portanto, durante o
planejamento do laboratrio, deve-se dimensionar primeiramente a sala de cultura, em funo
da produo diria, mensal ou anual desejada.
3.3. ESTRUTURA DO LABORATRIO
As atividades podem ser agrupadas na seguinte ordem: lavagem e esterilizao, preparo
de material e meios de cultura, manipulao assptica e incubao das culturas. Para efeito de
planejamento, descrevem-se as caractersticas desejveis de cada uma das salas componentes do
laboratrio:
Sala de lavagem e esterilizao: esta rea fundamentalmente destinada esterilizao
do meio de cultivo e outros materiais, lavagem de vidraria e desinfestao dos propgulos
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destinados retirada de explantes. Esta sala deve ser contgua de preparo do meio, pois o
meio imediatamente esterilizado e, da mesma forma, a vidraria lavada retorna para sala de
preparo. A sala de lavagem e esterilizao deve ter uma porta de acesso para o corredor
evitando a passagem pela sala de preparo de meio. Deve dispor de um exaustor para eliminar
vapores desprendidos pela autoclave. Dotada de bancadas para trabalhos em p, armrios e
prateleiras para estocagem temporria da vidraria a ser lavada, pia com pelo menos uma
torneira de gua quente, autoclave, destilador, deionizador, lavador de pipetas, aparelho de
banho-maria, escorredores para vidraria, instalao de gua, esgoto e eletricidade 110 e 220
volts, com tomadas diferenciadas. As pias devem ser fundas com distncia de 80cm entre seu
fundo e o bico da torneira.
Sala de preparo de meio de cultivo: destinado ao preparo de meios e de solues
diversas. a rea de maior circulao de pessoal e onde se efetuam as principais atividades do
laboratrio. Pisos e paredes devem ser lisos para evitar acmulo de poeira e facilitar a limpeza.
Janelas devem ser mantidas fechadas. O nmero de portas deve ser o mnimo necessrio e,
preferencialmente no permitir o acesso direto ao exterior do laboratrio e sim a uma rea
comum interna. Algumas conexes internas podem dispensar o uso de portas, a exemplo do
acesso sala de lavagem e esterilizao. Deve haver boa ventilao com intuito de manter a
temperatura agradvel no ambiente, uma vez que o calor gerado por lmpadas, freezer,
geladeira, chapa aquecedora, meio quente, etc, eleva a temperatura ambiente. A iluminao
tambm deve ser abundante.
Uma fonte de gua destilada se faz necessria tanto para preparo de meios como para
enxaguar a vidraria aps a lavagem em gua de torneira. Para o preparo de meio, a gua deve
ser de alta pureza e qualidade, preferencialmente deionizada e bidestilada. A deionizao
remove a maioria dos ons e a destilao remove molculas orgnicas grandes, microorganismos
e patgenos. gua da torneira imprpria porque contm ctions (amnio, clcio, ferro,
magnsio, sdio, etc.), nions (bicarbonatos, cloretos, fosfatos, fluoretos, etc.),
microorganismos (algas, fungos, bactrias), gases (oxignio, dixido de carbono, nitrognio) e
outras impurezas (silte, leos, matria orgnica, etc.).
Outros equipamentos que so mantidos na sala de preparo de meio: balana analtica
de preciso, potencimetro (medidor de pH), agitador magntico, forno de microondas e
dispensador de meio. Produtos qumicos devem ser mantidos em uma sala isolada, com sistema
de exausto e controle de temperatura e, principalmente, acesso restrito. Esta sala deve conter
bancadas de concreto revestidas com material impermevel e de fcil limpeza. Nelas sero
preparados os meios e mantidos os equipamentos, estantes, armrios para armazenamento de
vidraria, instrumentos, etc.
Sala de isolamento e transferncia: onde se manipula o material vegetal antes do
estabelecimento in vitro ou durante as repicagens e transferncias. Estas atividades devem ser
efetuadas em superfcie estril e dentro de um ambiente sem risco de reinfestaes de
contaminantes. O mtodo mais efetivo para evitar contaminaes o uso de cmaras de fluxo
de ar laminar estril. H cmaras com fluxo de ar horizontal na direo do operador ou vertical
e de diferentes tamanhos. Para trabalhos de cultura de tecidos, deve se preferir a horizontal. Os
microscpios tambm podem ser mantidos na sala de isolamento e transferncia, como
tambm em sala separada.
Sala de crescimento: rea onde sero mantidas as culturas durante o perodo de
desenvolvimento in vitro. As culturas so mantidas sobre estantes desmontveis de madeira ou
ao, com prateleiras distantes entre si, aproximadamente, 40-50 cm. Em cada prateleira, h uma
ou duas lmpadas fluorescentes; alguns laboratrios incluem tambm lmpadas incandescentes

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para aumentar o espectro de luz, principalmente a faixa do vermelho. Os reatores podem ser
instalados no exterior da sala, evitando assim o aquecimento demasiado.
Mesas agitadoras tambm so mantidas neste ambiente, para culturas sob agitao.
Deve-se prever o espao para culturas no escuro, necessrias am alguns casos.
Em rea prxima a sala de crescimento deve-se reservar um espao para estufas tipo
B.O.D. ou incubadoras.
A intensidade luminosa deve ser entre 1000 a 5000 lux medida na base de cada
prateleira. Uma irradincia de 12 mol m-2.s-1, equivalente a, aproximadamente, 1000 lux,
suficiente para o estabelecimento e crescimento inicial de culturas de gemas e meristemas de
muitas plantas. Porm, brotaes ou culturas em estdios mais avanados geralmente
necessitam de 3000. O fotoperodo regulado por temporizadores, em mdia de 16 horas
dirias.
Aparelhos de ar condicionado so necessrios para a manuteno de temperatura em
torno de 27 2 C. Algumas culturas crescem melhor com temperaturas noturnas inferiores s
diurnas, enquanto outras crescem bem a temperatura constante.
A umidade relativa do ar na sala de crescimento pouco influencia as culturas, pois o
microclima do frasco no afetado. Contudo, em funo das lmpadas ligadas durante a maior
parte do dia, a umidade se mantm em torno de 50%.
Cmara fria: um ambiente destinado a trabalhos envolvendo dormncia,
armazenamento de culturas para usos posteriores e manuteno de plantas matrizes, etc. A
temperatura indicada de 2 a 4oC para plantas de clima temperado e 15oC para plantas de clima
tropical.
rea de observao: quando o laboratrio destina-se produo de plantas livres de
viroses, por exemplo, necessita-se de uma rea livre de insetos. Alm disso, deve ser equipado
com sistema de nebulizao permitindo a aclimatizao das plntulas micropropagadas.
rea de administrao: espao para escritrio (secretaria, arquivos, biblioteca, copacozinha, etc.), toaletes, chuveiros, lavatrios, etc.
3.3.1. Instalaes de Apoio
Cmara de nebulizao: importante para abrigo das plantas recm-sadas dos frascos
de cultura, podendo ser construda sob um telado ou dentro da casa de vegetao. Algumas
instalaes utilizam atomizadores, que so muito eficientes na manuteno de um teor
permanente de umidade elevada.
Casa de Vegetao: estrutura metlica coberta com poliestireno de baixa densidade
(PEDB) a fim de elevar a temperatura em seu interior. Normalmente dotada de sistema de
nebulizao intermitente e pode ser recoberta com sombrite para reduo da temperatura
interior. utilizada para aclimatizao das plantas sadas do laboratrio.
Telado: destinado manuteno das plantas em vasos, provenientes da cmara de
nebulizao, assim que termine a fase de aclimatizao. Pode ser construdo em madeira, metal
ou canos plsticos envolvidos por tela de nilon de cor cinza ou preta para reduzir a incidncia
de luz de 25 a 50%. O piso deve ser coberto com uma camada de 15 a 20cm de areia grossa ou
brita a fim de evitar encharcamento.
rea de Quarentena e Controle Fitossanitrio: quando a funo do laboratrio a
produo de materiais de sanidade certificada.
Almoxarifado: para estocar e guardar materiais de reposio e principalmente os
produtos qumicos. Deve ficar prximo rea de preparao ou dentro dela.

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3.3.2. Equipamentos
Autoclave: Utilizada para esterilizao de meios de cultivo, gua e outros materiais.
Tem funcionamento semelhante ao de uma panela de presso em que a temperatura elevada a
partir de uma resistncia eltrica. Deve funcionar com presso de aproximadamente 1,05 Kg
cm-2 e temperatura de 120 a 125 C. Pode ser do tipo horizontal ou vertical. A autoclave pode
perfeitamente ser substituda por panela de presso com capacidade para 15 L de volume, com
a vantagem de aquecer e resfriar mais rapidamente.
Deionizador: um aparelho dotado de um sistema de coluna de resina que retm sais,
permitindo a passagem somente da gua. encontrado em casas especializadas, a custo
relativamente baixo. Periodicamente, a coluna de resina deve ser substituda, devido a sua
saturao.
Destilador: eliminao de sais minerais da gua. Para obter maior pureza da gua
recomendada sua utilizao juntamente com o deionizador.
Estufa de secagem: um forno eltrico comum que produz calor seco, eficiente para
secagem rpida de vidraria e outros materiais. Pode tambm servir para esterilizao de alguns
materiais no lquidos, desde que atinja temperatura mnima de 160 C.
Lavador de pipetas: dispensvel em pequenos laboratrios.
Refrigerador Domstico: armazenamento de solues estoques, reagentes e
reguladores de crescimento.
Congelador: armazenamento de reagentes que exigem temperaturas abaixo de 0 C.
Balana (capacidade entre 0,1 e 5000g): pesagem de reagentes no preparo de solues
e dos meios de cultura.
Balana de preciso (capacidade entre 0,0001 e 500g): pesagens precisas de solutos
utilizados em pequenas quantidades.
Potencimetro ou pHmetro: determinao do pH de solues e de meios de cultura.
Agitador magntico: auxiliar na dissoluo de reagentes.
Dessecador: para a manuteno de frascos de certos reagentes higroscpicos, em p,
depois de abertos.
Cmara de fluxo laminar: Esse equipamento fora a passagem de ar por meio de um
filtro bacteriolgico, de modo a criar um ambiente estril com presso positiva, que evita a
entrada de ar externo contaminado por esporos. Algumas cmaras vm equipadas com uma
lmpada ultravioleta que tem ao germicida, e que deve ser ligada cerca de 30 minutos antes do
incio dos trabalhos. Alguns laboratrios utilizam este sistema de luz germicida incidindo sobre
toda a sala onde se localiza a cmara, porm neste caso muito importante que se tenha um
dispositivo de alarme para evitar que, em caso de distrao, se trabalhe com a lmpada
germicida ligada. Laboratrios caseiros confeccionam pequenas capelas formadas de metal no
oxidvel ou acrlico e vidro transparente. um equipamento que, se bem manipulado, pode
substituir a cmara de fluxo, porm importante lembrar que os desinfestaes e manuseios
devem ser cuidadosos, alm do limitado espao interno.
Bico de bunsen: esterilizao dos instrumentos cirrgicos (pinas e bisturis) e
flambagem da boca de frascos, por meio de chama produzida pela queima de gs de cozinha.
Pode ser substitudo por lamparina a lcool.
Microscpio estereoscpico: utilizado em laboratrios para separao de estruturas
pequenas (meristemas, etc).
Carrinho de laboratrio: transportar material, culturas e meios.
Estufa incubadora tipo B.O.D.: para trabalhos com variao de temperaturas e/ou
fotoperodos.

25

Chapa aquecedora ou forno microondas: para dissoluo de agar, descongelamento


e/ou aquecimento de solues.
Mesa agitadora: agitao orbital de frascos com meios lquidos.
Aparelhos de ar condicionado: manter a temperatura dos ambientes do laboratrio.
Temporizadores: controle de fotoperodo (aparelhos acoplados ao sistema de
iluminao), controle de tempos de operaes diversas (tipo despertadores).
Equipamento para filtragem a frio: esterilizao de produtos termossensveis, como
alguns fitorreguladores, antibiticos, etc.
Dispensador de meio: bomba aspirante que auxilia na distribuio dos meios de
cultura para tubos ou frascos no volume desejado. Muito til quando se trabalha com grandes
quantidades de meio de cultivo.
Esterilizador de ar: reduz a populao de microorganismos nos ambientes.
3.3.3. Utenslios
Instrumentos: os instrumentos utilizados em laboratrio de cultura de tecidos
dependem da finalidade e do tamanho do laboratrio. Porm, de modo geral, os instrumentos
de maior importncia so: pinas, bisturis, estiletes, lminas para bisturi, tesouras, bandejas,
suportes para tubos de ensaio, suportes para placas de petri, esptulas, lamparinas,
micropipetadores,
Vidrarias: assim como citado para os instrumentos, a vidraria e sua quantidade variam
conforme o laboratrio, sendo as principais: copo becker, balo volumtrico, erlenmeyer, placade-petri, tubo-de-ensaio, frascos de cultivo (normalmente com volume entre 150 a 300 mL),
proveta, pipeta, e funil de vidro, basto de vidro, etc.
Termmetros: Para monitorar a temperatura da sala de crescimento so utilizados
termmetros de mxima e mnima; para outras determinaes so empregados termmetros
comuns de laboratrio.
Frascos para Reagentes: So frascos de 250 a 1000 ml, com boca estreita e tampa de
presso ou rosca, de vidro ou material plstico. So utilizados para armazenar solues estoque.
Quando destinados a reagentes sensveis a ao da luz, devem ser de cor escura. Frascos
comuns adquiridos com reagentes podem ser utilizados satisfatoriamente.
3.3.4. Outros materiais
So ainda necessrios ao laboratrio outros materiais, tais como: tampas plsticas
autoclavveis para tubos de ensaio e frascos, algodo hidrfilico, gase, fita crepe, detergentes,
desinfetantes, escovas para lavagem da vidraria, mscaras, luvas, plsticos para vedao dos
tubos (PVC esticvel), papel-filtro, lmpadas incandescentes, fluorescentes e ultra-violeta,
recipientes para gua destilada, papel-toalha, folha de alumnio, etiquetas adesivas, canetas,
termmetros, pissetas, entre outros.

26

Captulo 4
Meios de cultivo
4.1. INTRODUO
Os meios nutritivos utilizados para cultura de clulas, tecidos e rgos de plantas se
baseiam nas exigncias das mesmas quanto aos nutrientes minerais e substncias essenciais,
com algumas modificaes, para atender as necessidades especficas de crescimento e
desenvolvimento in vitro, pois apesar das mesmas vias bioqumicas e metablicas bsicas que
funcionam nas plantas serem conservadas nas clulas cultivadas, alguns processos como
fotossntese podem ser inativados pelas condies de cultivo e pelo estado de diferenciao das
clulas.
Vrios compostos orgnicos so adicionados ao meio para suprirem as necessidades
metablicas, energticas e estruturais da clula para complementar as substncias
biossintetizadas. O meio de cultivo fornece no s macro e micronutrientes, mas tambm um
carboidrato (normalmente a sacarose) para substituir o carbono que a planta normalmente fixa
da atmosfera pela fotossntese. Para proporcionar um crescimento maior, normalmente
incluem-se certos componentes orgnicos como vitaminas, aminocidos e reguladores de
crescimento. A importncia de haver uma homogeneidade quanto composio do meio faz
com que materiais que possam vari-lo sejam evitados, mesmo que proporcionem resultados
positivos.
Passos importantes no desenvolvimento de formulaes nutritivas foram dados nos
estudos de nutrio mineral de plantas que culminaram na definio da soluo nutritiva de
Knop. Vrios autores se basearam nessa soluo para formular os macronutrientes para suas
solues. Uma composio diferente de macronutrientes com base na soluo nutritiva de
Uspenski e Uspenkaia foi desenvolvida ao longo de uma srie de estudos com culturas de razes
de trigo e tomate por White.
Alguns dos primeiros meios apresentavam, entre os micronutrientes, metais exticos
como nquel, titnio e berlio alm dos mais comuns (mangans, zinco, cobre e boro). A lista
dos minerais includos na maioria dos meios utilizados at hoje foi definida por White em 1945.
O meio de White continha ainda vitaminas e sacarose como suplementos orgnicos. Dos
hormnios vegetais, ou reguladores de crescimento, apenas a auxina cido 3-indolactico era
conhecida nas dcadas de trinta e quarenta.
Nota-se que a nfase desses primeiros trabalhos era a identificao dos compostos
essenciais para o crescimento de clulas ou rgos isolados das demais partes da planta.
Durante anos o meio de White foi utilizado como meio bsico para a cultura de uma grande
variedade de tecidos de diferentes espcies. A mudana de padro de meio seguiu as tentativas
de otimizar o crescimento de calo in vitro. Essas modificaes posteriores envolveram,
principalmente, o aumento de concentraes de sais em geral, uma diminuio na concentrao
de sdio e o acrscimo de nitrognio na forma de amnio para complementar o nitrato.
O meio MS de Murashige e Skoog foi desenvolvido a partir de testes de suplementao
do meio de White com extrato de folhas de fumo. Foi demonstrada que a frao do extrato que
mais estimulou o crescimento era aquela dos componentes inorgnicos. O meio MS,
juntamente com o B5 usado na cultura de tecidos da grande maioria das espcies.
Quando se encontra na literatura uma citao do meio MS, por exemplo, normalmente
se refere composio dos sais minerais do meio de Murashige e Skoog (1962), que pode ser
identificado como um meio bsico. Se as combinaes de vitaminas no forem mencionadas no
trabalho, supe-se que foram utilizadas, tambm, as vitaminas do meio MS. A concentrao de
27

sacarose ou de outro carboidrato, bem como dos reguladores de crescimento, geralmente


especificada em cada trabalho. Casos especficos de alteraes de meio bsico so encontrados
em estudos particulares que tratam de cultura de anteras, cultura de embries e cultura de
protoplastos.

4.2. COMPONENTES DE MEIOS NUTRITIVOS


Para que se torne possvel a reproduo dos resultados de trabalhos em qualquer poca
ou lugar, desde o princpio do desenvolvimento de meios nutritivos procurou-se composies
conhecidas e possveis de controle. Para evitar a contaminao dos meios por impurezas
minerais, todos os sais utilizados na sua preparao devem ser de qualidade analtica (p.a.).
4.2.1. gua
o componente de maior quantidade no meio de cultivo. Por ser uma fonte potencial
de impurezas que podem afetar o crescimento dos explantes, conveniente que sejam tomados
cuidados quanto origem da gua a ser utilizada. A gua destilada e deionizada, ou bi-destilada,
normalmente suficientemente pura para uso nos meios. No entanto, dependendo da fonte, a
gua pode apresentar contaminantes orgnicos volteis, que permanecem aps a destilao e
inibem o crescimento das culturas.
Uma opo a purificao com um sistema de filtrao, por filtros de carvo ativado,
colunas de troca inica e filtros de acetato de celulose que confere um alto grau de pureza
gua, porm com custo elevado.
4.2.2. Macronutrientes
Os elementos minerais exigidos em maiores quantidades para o crescimento de plantas
so includos na forma de sais inorgnicos, podendo o nitrognio e o enxofre ser adicionados,
tambm, como componentes de suplementos orgnicos (como aminocidos, por exemplo). Os
sais usados para fornecer macronutrientes tambm podem fornecer ons dos elementos sdio e
cloro, mas como clulas vegetais podem tolerar altas concentraes de Na+ e Cl-, pouca
importncia dada a estes ons. A absoro de nutrientes pelo explante influenciada pela
concentrao de outros elementos, como pH, temperatura e condio bioqumica e fisiolgica
dos tecidos.
Nitrognio: nas plantas, o nitrognio encontrado predominantemente na forma
orgnica NH3+ (amnia) ou NH4+ (amnio) constituindo principalmente aminocidos e
protenas. Alm desses, constitui bases nitrogenadas, vitaminas, coenzimas e pigmentos ou atua
como poder redutor (NADPH, NADH) em vrias reaes enzimticas.
O nitrognio difere dos demais elementos pelo fato de apresentar-se na forma de ction
(amnio) e nion (nitrito e nitrato). Essas diferentes formas inorgnicas proporcionam um
efeito marcante no que diz respeito ao crescimento e desenvolvimento de culturas de tecidos: o
nitrato, como nica fonte de nitrognio, sustenta uma boa taxa de crescimento em muitas
espcies, sendo tambm, a melhor forma de nitrognio para algumas culturas como cenoura,
fumo, roseira entre outras.
Praticamente todos os meios de cultura fornecem N na forma de ons nitrato. No
entanto, uma vez dentro da clula, o nitrato tem que ser reduzido para amnio antes de ser
biossintetizado. O NH4+, quando fornecido sozinho ao meio, causa problemas de toxicidade.

28

A resposta de culturas aos ons nitrato e amnio depende em grande parte das enzimas
envolvidas no processo e do aumento ou reduo de suas atividades pela presena dos ons.
Estes fatores variam de acordo com o grau de diferenciao do tecido, sua idade fisiolgica e
seu gentipo.
Quando o nitrognio fornecido somente na forma de sais inorgnicos de amnio, as
clulas in vitro apresentam sintomas de toxidez. Uma combinao das duas formas de
nitrognio, amnio e nitrato, estimula o crescimento de muitas espcies de plantas in vitro de
modo que a toxidez do amnio no absoluta. A mesma concentrao de amnio, que
inibitria quando a concentrao de nitrato baixa, permite um bom crescimento quando se
aumenta a concentrao do nitrato.
A razo entre as concentraes parece ser o fator determinante do crescimento, sendo
que a de amnio deve ser, no mximo, um tero do nitrognio total.
H alta proporo de N na forma NH4+ no meio MS (NO3-:NH4+ = 66:34) e a
quantidade total de N muito maior do que na maioria dos outros meios, tornando-se
demasiada para algumas culturas.
A relao entre os dois ons precisa ser ajustada para cada espcie de planta e tipo de
explante, bem como a quantidade total de N, de forma a se otimizar o crescimento e a
morfognese.
Uma outra forma de nitrognio inorgnico que foi testada o nitrito. Embora este on
tenha sido testado com poucas culturas, acredita-se que seja txico de modo geral,
considerando que as concentraes de nitrato e de amnio no meio de Murashige & Skoog
(1962), por exemplo, so de 40mM e 20 mM, respectivamente, portanto muito mais elevadas
do que a concentrao de 10mM de nitrito que mostrou inibio em alguns estudos.
Fsforo: O fsforo absorvido rapidamente incorporado em compostos orgnicos. Ao
contrrio do que ocorre no solo, a redistribuio interna muito rpida. Nos vegetais, o fsforo
constituinte de carboidratos fosfatados, fosfolipdios, nucleotdeos (cido fosfrico) e
molculas energticas como ATP, ADP, AMP e NADPH. As principais funes do fsforo
so:
O fsforo absorvido pelas plantas na forma do on H2PO4-. Nos meios de cultura, o
fsforo fornecido como fosfato de sdio solvel ou fosfato de potssio mono e dihidrogenado. O H2PO4- monovalente predomina em valores de pH abaixo de 7, caracterstico
da maioria dos meios de cultura e este on que mais prontamente absorvido pelas plantas. A
converso de H2PO4- em HPO42- inicia quando as solues se tornam mais alcalinas.
Altas concentraes de fosfato dissolvido podem diminuir o crescimento do explante,
possivelmente porque o clcio e alguns microelementos so precipitados da soluo ou sua
absoro reduzida. Embora as concentraes de fosfato em meios de culturas atingem at
19,8 mM, o nvel mdio 1,7 mM e a maioria dos meios contm em torno de 1,3 mM.
Potssio: O potssio se encontra no solo na forma de K+ em soluo ou fixado.
absorvido ativamente pelas razes como K+. transportado atravs do xilema e apresenta alta
capacidade de redistribuio (75 % do potssio est na forma solvel).
Os ons potssio so transportados rapidamente atravs das membranas das clulas e
duas de suas principais funes so regular o pH e o equilbrio osmtico dentro das clulas.
Estes ons tm um papel similar em tecidos cultivados in vitro, porm, os mecanismos usuais de
transporte podem no ocorrer. A deficincia de potssio no meio de cultivo conduz, segundo
alguns autores, a hiperidricidade (ou vitrificao) e decrscimo na taxa de absoro de fosfato.
Magnsio: O magnsio um componente essencial da molcula de clorofila e atua como
ativador enzimtico em vrias reaes. Meios de cultura invariavelmente contm baixas
concentraes de Mg (5-6 mM, em mdia). Freqentemente, o MgSO4 (sulfato de magnsio)
29

usado como nica fonte, tanto de magnsio como de ons sulfato, o que fornece tambm o
enxofre.
Pode ocorrer um certo antagonismo entre clcio e magnsio, desta forma deve-se ter
cuidado nas combinaes de concentraes desses elementos.
Enxofre: O enxofre pode apresentar funes metablicas ou estruturais em
conseqncia dos elementos dos quais faz parte. Estruturalmente pode estar ligado a
polissacardeos constituintes da membrana celular.
O enxofre utilizado pelas plantas absorvido principalmente como SO42-, que a fonte
usual do elemento em meios de cultura. Sua absoro relacionada assimilao do nitrognio
e, independentemente do pH.
Quando o suprimento, por exemplo, de enxofre (S) no meio for elevado, grande
quantidade de nitrognio solvel foi acumulada nas clulas. Na forma de sulfato, o enxofre
entra como on acompanhante dos micronutrientes zinco e mangans e, na forma orgnica, que
pode tambm ser assimilada, nos aminocidos cistena e metionina, quando estes so utilizados
no meio.
Clcio: O clcio constituinte da parede celular ou pode ser encontrado dissolvido no
vacolo. Nas clulas, 60% do total do clcio est presente nos cloroplastos. Este elemento
participa da ativao de substncias como a calmodulina a qual induz a sntese de ATPases,
enzimas que atuam relaxando a parede celular permitindo troca de substncias entre clulas ou
diviso celular. Atua tambm na germinao do tubo polnico.
O on Ca2+ est envolvido na morfognese in vitro e requerido para muitas das
respostas induzidas por substncias do crescimento em plantas, particularmente auxinas e
citocininas.
O clcio apresenta limitaes na sua translocao na planta intacta, que s vezes, so
observadas tambm in vitro. Como o clcio depende da transpirao da planta para seu
transporte no xilema, as condies de alta umidade do ar que se estabelecem in vitro podem
induzir deficincia de clcio em partes areas em micropropagao.
Com a concentrao normal de clcio no meio MS (3,0 mM), a necrose limitada a 10%
das partes areas regeneradas in vitro. Se a tampa do recipiente de cultura de parafilme, ou
outro material que diminui a evaporao da gua e aumenta a umidade dentro do recipiente, os
sintomas se intensificam. Quando se encontra uma cultivar com maior exigncia de clcio, a
concentrao desse on no meio pode ser aumentada e/ou ser utilizada uma tampa que permita
uma maior troca de gases entre o ambiente e o interior do recipiente de cultura ou ainda
diminuindo-se a temperatura.
Ferro: O ferro exigido em concentraes menores que as do macronutrientes, mas
superiores as dos micronutrientes. O ferro constituinte de vrias enzimas (ex: peroxidases) e
compostos (ex: ferredoxina), alm de participar na sntese de algumas protenas e da clorofila.
o nico elemento mineral essencial que no absorvido como on livre do meio. Atualmente a
forma mais utilizada nos meios nutritivos a de quelato de ferro com EDTA (etinodiamino
tetra-acetato).
Alguns compostos orgnicos tm a capacidade de formar complexos com ctions
metais, chamados quelatos. Os metais podem ser atrados por um agente quelante e deixado na
soluo sob condies onde ons livres reagiriam com nions para formar compostos
insolveis. Alguns complexos podem ser mais quimicamente reativos do que os prprios
metais.
Sem o EDTA, o ferro provavelmente formaria quelatos com substncias orgnicas,
liberadas pelo explante para o meio. Este quelato absorvido com facilidade pelas clulas,
substituindo o citrato de ferro ou mesmo o cloreto e sulfato de ferro que foram utilizados nos
30

primeiros meios nutritivos. cido ctrico e tartrico podem agir como agentes quelantes, porm
no so eficientes em manter o Fe em soluo, tornando-os sujeitos precipitao como
fosfato de ferro. O Fe pode, ento, no estar disponvel s clulas da planta, a no ser em pH
muito baixo.
4.2.3. Micronutrientes
Os microelementos do meio MS incluem todos aqueles elementos minerais aceitos
atualmente como essenciais para plantas clorofiladas (mangans, zinco, boro, cobre, cloro e
molibdnio), alm do cobalto e do iodo.
O crescimento de clulas e a morfognese de algumas espcies podem ser promovidos
pelo aumento do nvel de micronutrientes, alm do recomendado pelo meio MS. A induo e
manuteno de calos e crescimento de clulas em suspenso de espcies florestais apresentaram
melhor comportamento com micronutrientes em cinco vezes a concentrao do meio MS. Em
soja, houve maior induo de brotaes adventcias a partir de calos em meio adicionado de
micronutrientes quatro vezes a concentrao do meio.
Mangans: O mangans um dos mais importantes microelementos e tem sido includo
na maioria dos meios de cultura de tecidos. geralmente adicionado em concentraes entre
25-150 mM.
Em cultura de tecidos, a omisso de ons Mn reduziu o nmero de gemas iniciadas
sobre cotildones de alface. Nveis de auxina natural so reduzidos na presena do Mn2+
porque a atividade da AIA-oxidase aumentada por este nutriente. A produo de brotaes
axilares de videira foi aumentada quando o nvel do Mn2+ no meio MS foi reduzido de 100 mM
para 5 mM.
Zinco: H uma estreita relao entre o teor de Zn da planta e seu contedo de auxina.
Sugere-se que o Zn um componente de uma enzima relacionada com a sntese do precursor
do AIA (cido indol actico), o triptofano. A concentrao de Zn adicionada aos meios de
cultivo varia amplamente, desde 0,1 at 70 mM.
Boro: Na planta, o boro atua na formao da parede celular, diviso celular (em plantas
deficientes h diminuio da sntese protica), aumento das clulas (forma complexos com
carboidratos enrijecendo a parede rapidamente) e transporte de carboidratos.
O B encontrado no solo sob a forma de cido brico e este o composto usado como
fonte do elemento em cultura de tecidos. O B usado no meio de cultivo em concentraes
variveis, sendo mais usual de 50 a 100 mM (o meio MS contm 100mM).
Plantas com deficincia de B tm sistema radicular reduzido. A deficincia de B resulta
tambm em reduo na sntese de citocinina.
Cobre: O cobre absorvido na forma de Cu2+. Nas plantas atua como um importante
ativador enzimtico, co-fator da sntese de enzimas, de DNA e RNA; atua no metabolismo dos
carboidratos e na fixao biolgica de nitrognio.
A maioria dos meios de culturas inclui 0,1 - 1,0 mM de Cu2+,o qual adicionado na
forma de sulfato de cobre, embora ocasionalmente seja empregado cloreto de cobre ou nitrato
de cobre.
Molibdnio: O molibdnio faz parte da enzima redutase de nitrato. A ausncia deste
elemento gera acmulo de NO3- nas plantas. constituinte tambm da nitrogenase que atua no
processo de nodulao.
O molibdnio adicionado ao meio de cultivo como molibdato de sdio em
concentraes superiores a 1 mM.

31

Cobalto: O cobalto essencial para as bactrias fixadoras de N, assim quando elas


estabelecem uma relao simbitica com uma planta leguminosa, o cobalto se torna essencial
para o crescimento s custas do N atmosfrico. Em outras condies, mesmo pra a as plantas
leguminosas que crescem com nitrato ou amnio como fonte de N, o cobalto no essencial.
No meio nutritivo que contm N fixado em forma de nitrato e amnio, no h necessidade de
colocar cobalto.
O meio MS mantm o cobalto para simplificar as citaes e facilitar a comparao dos
resultados com os de outros pesquisadores.
O Cobalto includo na metade dos meios da cultura publicados e a concentrao mais
comum 0,1 mM. No h uma clara evidncia da necessidade do Co para morfognese ou
crescimento.
Iodo: Em alguns casos, o iodo estimula o crescimento de explantes in vitro de maneira
bastante significativa. No se conhecem casos na literatura que mostrem um efeito negativo
desse elemento na concentrao usada no meio MS.
O iodo pode ser um elemento essencial, porm, alternativamente, esse on pode agir
como agente redutor. O iodeto de potssio foi includo no meio Y3 (Eeuwens 1976) para evitar
o escurecimento de culturas de palmeiras. Em culturas de meristemas de Prunus, a presena de
iodeto de potssio a 0,06 mM aumentou a sobrevivncia e o crescimento dos explantes.
Silcio, Alumnio e Nquel: O silcio no normalmente adicionado aos meios de cultura,
embora provavelmente esteja presente em baixas concentraes. Sua adio pode, no entanto,
aumentar o crescimento de algumas plantas.
Quanto ao alumnio e ao nquel, efeitos benficos da adio desses metais no parecem
ter sido adequadamente demonstrados.
Sdio e Cloro: O sdio pode entrar na composio de meios nutritivos, em
concentraes muito variveis como on acompanhante de algum elemento essencial. A
concentrao mdia de sdio em meios de cultura de 1,9 mM.
Esses dois ons tambm entram em concentraes variadas durante o ajuste de pH do
meio com HCl ou NaOH.
4.2.4. Suplementos orgnicos
4.2.4.1. Vitaminas
Os primeiros estudos com cultura de razes definiram a mistura bsica de vitaminas
utilizada at hoje. Esta mistura consiste de tiamina (vitamina B1), cido nicotnico (niacina),
piridoxina (vitamina B6) e mio-inositol, as quais fazem parte do meio MS e so adicionadas em
diferentes concentraes. As necessidades de vitaminas variam com a espcie e tipo de cultura e
devem ser definidas experimentalmente. Em vrios experimentos, tm-se concludo que uma
ou at mesmo todas as vitaminas so dispensveis para algumas culturas.
Embora tenha sido verificado que essas vitaminas desempenham funes essenciais na
planta, outras vitaminas tambm exercem papel importante. Portanto, o efeito benfico da
incluso de determinada vitamina no meio nutritivo depender em grande parte, da capacidade
de biossntese de cada um dos tecidos ou rgos cultivados. Para algumas espcies cultivadas in
vitro, h necessidade de aumentar a concentrao das vitaminas, sendo, s vezes, preciso outras
serem acrescentadas mistura padro.
H outras vitaminas utilizadas em cultura de tecidos vegetais. O cido pantotnico
desempenha importante papel no crescimento de alguns tecidos. A vitamina C (cido
ascrbico) muito usada para evitar a oxidao. Algumas vitaminas do grupo D, como D2 e
32

D3, podem ter efeito de regular o crescimento de algumas culturas. A vitamina E (-tocoferol)
tambm tem efeito anti-oxidante. O cido flico eventualmente mostra algum efeito sobre a
proliferao de tecidos.
Em resumo, os resultados com diferentes vitaminas parecem ser muito particulares para
cada espcie e talvez para diferentes cultivares da mesma espcie, dependendo do tipo de
explante.
4.2.4.2. Aminocidos
Os aminocidos podem ser adicionados ao meio para satisfazer a necessidade de
culturas quando o nitrognio reduzido. Porm, por serem caros, s devem ser usados se
realmente produzirem resultados positivos. Para a maioria das culturas, a adio de aminocidos
pode ser desnecessria, desde que a quantidade de N e a proporo de ons nitrato e amnio
sejam corretas.
Tem sido demonstrado ser possvel cultivar plantas em meios cuja nica fonte de N
sejam os aminocidos, que suprem clulas de plantas com uma fonte imediatamente disponvel
de N e a incorporao pode ser muito mais rpida do que a de nitrognio inorgnico no mesmo
meio.
Os aminocidos podem tambm fornecer nitrognio reduzido ao meio em lugar do
+
NH4 e como um suplemento a NO3-. No entanto, eles so geralmente empregados como
adies menores ao meio contendo tanto NH4+ e NO3-. A adio do aminocido causa
decrscimo no pH do meio, de forma similar ao que ocorre quando os ons NH4+ so
absorvidos. A glicina um aminocido usado em muitos meios de cultura, em pequenas
quantidades. Apesar disso, h dificuldade em se encontrar evidncias de que seja realmente
necessrio. Possivelmente, a glicina ajuda a proteger as membranas da clula do estresse
osmtico e de temperatura.
Protenas hidrolisadas por cidos ou enzimas e desdobradas em molculas menores so
mais baratas do que os aminocidos. Embora protenas hidrolisadas sejam fonte de substncias
que podem promover o crescimento, elas so de natureza relativamente indefinida. Os
hidrolisados mais comumente usados em meios da cultura so as protenas do leite, casena,
lactoalbumina, peptonas e triptona. A casena hidrolisada pode ser fonte de clcio, fsforo,
alguns microelementos, vitaminas e principalmente, uma mistura de mais de 18 aminocidos. A
glutamina o aminocido mais comum da casena hidrolisada. A taxa de crescimento de clulas
em suspenso , em geral, aumentada pela adio de casena hidrolisada ou um ou mais
aminocidos (particularmente glutamina) ao meio contendo ons nitrato e amnio.
Tem-se observado que, para muitas culturas, os aminocidos no so essenciais, mas,
sua adio como compostos puros e identificados ou, de forma mais barata, atravs de
hidrolisados de casena, pode ser um caminho fcil de se prevenir deficincia no meio ou de
fornecer uma fonte de nitrognio que imediatamente disponvel s clulas e tecidos em
cultura.
4.2.4.3. Elementos indefinidos
Muitos suplementos indefinidos foram anteriormente usados em culturas de tecidos,
porm, sua utilizao tem diminudo muito, porque o balano entre sais inorgnicos tem sido
melhorado e porque o efeito de aminocidos e reguladores de crescimento tem se tornado mais
bem entendido. Adies aos meios de cultura tm sido feitas com extrato de malte e de
levedura; sucos, polpas e extratos de vrios frutos (ex.: banana, tomate e abacaxi); leite ou gua
33

de coco; extratos de plntulas, razes, embries zigticos imaturos ou folhas; extrato de batata e
milho; etc. Estes suplementos podem ser fontes de aminocidos, peptdios, vitaminas e
reguladores de crescimento.
O extrato de levedura era muito utilizado como fonte de aminocidos e vitaminas e em
geral adicionado ao meio nas concentraes de 0,1 a 1 g L-1. Ocasionalmente, tem sido usado
a 5, 10 ou 20 g L-1. O leite de coco tem proporcionado inmeros resultados positivos nas
concentraes de 10 a 20 % em substituio gua.
cidos orgnicos em culturas de tecidos podem agir como agentes quelantes,
aumentando a disponibilidade de alguns micronutrientes, como tampo contra variaes do pH
e podem agir como nutrientes. So exemplos os cidos mlico, ctrico, fumrico e piruvato de
sdio.
4.2.4.4. Acares
Praticamente todas as clulas, tecidos e rgos cultivados in vitro so heterotrficos e
dependem de uma fonte externa de energia. Portanto, torna-se necessrio incorporar ao meio
de cultivo uma fonte de carbono. Os carboidratos fornecem energia e esqueletos de carbono,
que so utilizados para a biossntese de polissacardeos, aminocidos e protenas.
As clulas, tecidos e plntulas cultivadas in vitro no encontram condies adequadas de
iluminao e concentrao de CO2 e, s vezes, no apresentam teores de clorofila suficientes
para realizar fotossntese que sustentem o crescimento. Portanto, as clulas possuem o
potencial para a fotossntese in vitro, mas o crescimento da maioria das culturas sustentado
pela fonte de carboidratos adicionados ao meio.
A fonte mais comumente utilizada a sacarose, que pode ser total ou parcialmente
hidrolisada em glicose e frutose. Outras fontes tambm tm sido utilizadas, tais como a
maltose, rafinose, frutose, manose, galactose e lactose, porm com resultados menos
expressivos, salvo raras excees. Alguns outros monossacardeos (arabinose e xilose),
dissacardeos (celobiose e maltose) e alguns polissacardeos, sujeitos a se desdobrarem em
glicose e frutose podem eventualmente substituir a sacarose. A sacarose o carboidrato mais
comumente utilizado devido a certas caractersticas: alta solubilidade, rpida metabolizao e
por ser o acar mais transportado e armazenado pela maioria das clulas vegetais. Os produtos
da hidrlise da sacarose (glicose e frutose), uma vez dentro da clula, podem entrar na via
glicoltica ou na rota das pentoses-fosfato ou ainda serem armazenadas nos vacolos como
amido.
A hidrlise parcial da sacarose pode ocorrer durante a autoclavagem do meio e h uma
relao inversa com o pH - quanto menor o pH, maior a inverso da sacarose, a qual
praticamente nula em pH 6,0. Esta inverso tambm pode ocorrer por ao da enzima
invertase, localizada na parede das clulas. A metabolizao da sacarose fornece ATP e
precursores intermedirios para os processos metablicos da clula.
A concentrao tima de sacarose para induzir a morfognese ou o crescimento difere
entre gentipos, porm normalmente utilizada a 2-4 %. Estes nveis de sacarose normalmente
so inibitrios sntese de clorofila, cujo grau de inibio varia com a espcie. Observou-se um
aumento na taxa de fotossntese quando, em subculturas sucessivas, a concentrao de sacarose
foi reduzida de 20 ou 40 g L-1 para 10 g L-1. Em cultura de embries, nos estdios iniciais de
crescimento, so necessrias elevadas concentraes de sacarose, em torno de 12 a 18%. A
concentrao de sacarose afeta a assimilao de nutrientes e o efeito de reguladores de
crescimento. Alm disso, a concentrao de sacarose afeta a produo de metablitos

34

secundrios, de grande importncia nos processos metablicos e na composio da parede


celular.
O amido produzido a partir da sacarose incorporada ao meio pode ser um pr-requisito
para a morfognese, pois tem se verificado o acmulo de amido em locais de formao de
primrdios foliares. Presume-se que o amido funciona como uma reserva de energia requerida
para a morfognese, uma vez que desaparece rapidamente quando os meristemides ou os
primrdios foliares so formados.
4.2.4.5. Mio-Inositol
Esta substncia, um hexitol ou composto cclico com grupos OH em todos os seus seis
carbonos, outro componente testado desde o incio dos estudos com a cultura de tecidos de
plantas. Sabe-se hoje que o inositol incorporado s molculas de fosfolipdeos que compem
a estrutura da membrana plasmtica, e talvez de outras membranas celulares. Outra funo
significativa para a cultura de tecidos a sua ao na conjugao de auxinas: uma reao
enzimtica forma o composto auxina-inositol, que inativo como regulador de crescimento.
Quando a auxina novamente liberada volta a exercer os seus efeitos sobre o crescimento e
desenvolvimento das clulas.
Parte dos efeitos do leite de cco sobre o crescimento devido ao seu contedo de mioinositol. O inositol um constituinte do extrato de levedura e pequenas quantidades podem
tambm estar contidas no gar comercial. O efeito estimulante do mio-inositol origina-se de sua
capacidade em induzir a formao de pectina e hemicelulose, necessrias nas paredes das
celulares, e pode ter um papel importante na absoro e utilizao de ons. Tecidos vegetais
cultivados variam em sua capacidade para biossntese de mio-inositol. Brotos intactos
usualmente produzem suas prprias necessidades, porm em muitos tecidos desorganizados, a
adio de mio-inositol estimula a diviso celular.

4.2.5. Agentes Gelificantes e Suportes


Os meios nutritivos podem ser lquidos ou gelificados, sendo que a cultura em meio
lquido normalmente exige algum tipo de suporte ou agitao para fornecer o oxignio
necessrio para a respirao do explante. Quando o explante precisa ser mantido superfcie do
meio, normalmente se utilizam meios gelificados, portanto, faz-se necessrio o uso de agentes
que proporcionem essa condio fsica. Os meios lquidos possuem a vantagem de preparo
mais rpido (e mais barato). H tambm maior homogeneidade, pois gradientes de nutrientes se
estabelecem com o crescimento de tecidos sobre um meio gelificado, o que no acontece em
meios lquidos.
Pode-se afirmar que a concentrao adequada de sais em meio lquido menor que a de
meios gelificados. possvel que as concentraes timas de sais, num meio gelificado, sejam
mais elevadas do que as concentraes timas para o crescimento em meio lquido, em virtude
das restries de difuso de nutrientes que o meio gelificado impe. Com relao aos meios
gelificados, mesmo que o seu preparo seja mais demorado e maior custo, estes so preferidos,
devido facilidade de manejo do explante.
Explantes pequenos como meristemas sobrevivem em meios lquidos que incluem
suportes como pontes de papel de filtro (pontes de Heller). Mais recentemente, esto sendo
comercializados suportes prprios de fibras de celulose envoltas numa camada de celofane,

35

como um filtro de cigarro. Esse mtodo assegura excelente aerao dos tecidos, porm o tempo
necessrio para preparo e insero faz com que seja utilizado apenas em situaes especiais.
Os meios gelificados, tradicionalmente so gelificados com gar, um polissacardeo
extrado de algas marinhas. O gar dissolvido em gua fervente para sua completa dissoluo
e adio soluo de sais e outros componentes do meio de cultivo. Depois gelificado na
presena de ctions em temperatura abaixo de 40C. Mantm-se estvel nas temperaturas de
cultura e no digerido por enzimas dos explantes.
Embora o gar seja o agente gelificante de uso mais comum, outros produtos tm sido
testados e/ou utilizados, tais como o amido, a gelatina, a goma carragena, a agarose, entre
outros. O amido progressivamente degradado por enzimas do explante, tornando o meio
mais lquido ao longo do tempo de cultura. A gelatina, de origem animal, txica para a maioria
dos tecidos vegetais. Gomas produzidas por bactrias tm dado bons resultados. So exemplos
deste tipo de geleificante o Gelrite e o Gel-Gro, os quais so utilizados em menores
concentraes do que o gar e deixam o meio mais transparente.
A preferncia por um ou outro agente depende da espcie da planta e talvez das
condies de cultivo. Uma das diferenas entre os agentes gelificantes est nas impurezas de
cada um, especialmente de micronutrientes, tais como boro, clcio, magnsio, sdio e potssio,
dependendo da marca e do grau de pureza. Algumas impurezas podem ser removidas do gar
por lavagem em gua bidestilada por pelo menos 24 horas, lavando-o posteriormente em etanol
e secando-o a 60 oC durante 24 horas.
4.2.6. Componentes utilizados em casos especficos
4.2.6.1. Carvo Ativado
O carvo ativado finamente modo freqentemente adicionado no meio em diferentes
estgios da cultura de tecidos. O carvo ativado no um regulador de crescimento, mas
modifica a composio do meio e, por isso, em algumas circunstncias, melhora ou regula o
crescimento da planta in vitro.
Muitos dos efeitos benficos do carvo dependem de sua habilidade em adsorver uma
grande diversidade de compostos. De modo geral, quatro vantagens do carvo ativado so
relatadas na literatura:
a) adsorver compostos exsudados dos tecidos cultivados ou presentes no gar que, de
alguma maneira inibiria o crescimento;
b) evitar o excesso de crescimento de calo;
c) promover a morfognese, particularmente a embriognese;
d) promover a formao de razes, provavelmente devido sua alta habilidade em
excluir a luz do meio de cultivo;
O carvo ativado possui fortes propriedades adsorventes e usado como adsorvente de
produtos qumicos, gases e slidos dissolvidos. Se por um lado ele adsorve produtos
indesejveis no meio, por outro pode adsorver reguladores de crescimento e ons, prejudicando
o crescimento da cultura.
O carvo pode ajudar na adsoro de substncias txicas que podem estar presentes nos
ingredientes, produzidos durante a autoclavagem ou exsudados pelos tecidos cultivados, tais
como o hidroximetil-furfural (HMF), resultante da hidrlise da sacarose e diversos fenis
oxidados.
O uso de carvo ativado pode diminuir a disponibilidade de reguladores de crescimento,
tais como citocininas e cido abscsico, como tambm de algumas auxinas.
36

Vrios autores tm relatado que o carvo ativado causa aumento no pH do meio de


cultivo. J foi observado um aumento de 0,75 unidades no pH em meio MS na presena de 0,5
% de carvo ativado, a mudana do pH ocorreu, em parte durante a autoclavagem e em parte,
nos primeiros 14 dias subseqentes em meio armazenado.
4.2.6.2. Antibiticos e Fungicidas
Antibiticos e fungicidas esto sendo cada vez mais usados em meios nutritivos para o
controle da contaminao microbiana, proveniente, muitas vezes, de infeces sistmicas das
plantas matrizes. Estas substncias no podem ser usadas como substitutas das tcnicas de
desinfestao do explante no momento do estabelecimento in vitro.
necessrio, antes de escolher um produto, verificar se o mesmo no apresenta efeitos
fitotxicos ao explante. Benomyl, Cloranfenicol e Rifampicina so os antibiticos de uso mais
freqente em cultura de tecidos.
4.3. pH
O pH do meio responsvel pela manuteno da solubilidade dos sais, influencia a
absoro de nutrientes e reguladores de crescimento e afeta a eficincia do gar. Isto significa
que a amplitude efetiva do pH para os meios muito restrita. O pH do meio altera-se durante a
cultura, mas um pH inicial deve ser selecionado de forma a assegurar a disponibilidade de
nutrientes e a taxa mais rpida de crescimento.
A absoro de nions favorecida em pH cido e a de ctions, em pH mais elevado. Por
sua vez, a absoro de ctions e nions altera o pH do meio.
O amnio, como fonte de N, absorvido de forma deficiente em pH baixo. Por outro
lado, o nitrato no prontamente absorvido em pH neutro ou alcalino. A absoro de nitrato
pelas clulas leva alcalinizao do meio e a de NH4+, acidificao. Em um meio com pH 5-6,
a absoro preferencial de NH4+ leva reduo do pH no incio do crescimento, o que resulta
num aumento na utilizao de NO3- e uma gradual elevao do pH. O pH final do meio
depender da proporo NO3-:NH4+ que fornecida. Estas alteraes de pH dependem do
tipo de cultura.
A diferenciao e a morfognese so freqentemente dependentes do pH. H citaes
na literatura mostrando que o pH do meio pode influenciar a formao de razes de algumas
plantas in vitro. Um pH levemente cido parece ser preferido para a maioria das espcies e uma
explicao de que a acidez necessria para ao das auxinas.
A maioria das clulas e tecidos in vitro toleram pH de 4,0 a 7,2. Aqueles explantes
inoculados em meio com pH ajustado para 2,5 - 3,0 ou 8,0, provavelmente morrem. Os
melhores resultados so usualmente obtidos em condies levemente cidas. Normalmente
utiliza-se um pH em torno de 5,6, apesar de que so encontrados ajustes desde 3,5 at 7,1.
O pH do meio ajustado antes da autoclavagem. Em meio sem acar, a alterao
usualmente pequena, a menos que a concentrao de fosfato seja baixa, quando ocorrem
variaes mais significativas. O meio autoclavado com acar tem geralmente um pH
levemente mais baixo do que aquele autoclavado sem acar.
Tem sido demonstrado que o pH do meio lquido com sais de MS e 3-3,4% de sacarose,
inicialmente ajustado para 5,7, cai para 5,17, 5,5 ou 4,6 durante a autoclavagem. A queda varia
com o pH em que o meio foi ajustado inicialmente. Exemplos: pH ajustado em 5,0 caiu para
4,2; ajustado em 6,4 caiu para 5,1 e pH ajustado em 8,5 caiu para 8,1.

37

O pH de meio autoclavado tende a cair se for armazenado. Por exemplo, meio MS


lquido com pH inicial de 5,7 caiu para 4,6 aps a autoclavagem e para 4,1 aps 6 meses de
armazenamento; quando gelificado o pH 5,7 tambm caiu para 4,6 aps autoclavagem e para
4,4 aps 6 meses. Para minimizar as variaes no pH, sugere-se que o meio seja mantido no
escuro.
Meio com gar pode no gelificar satisfatoriamente quando o pH inicial ajustado para
4,0-4,5. A reduo no pH que ocorre durante a autoclavagem pode tambm causar uma
insatisfatria geleificao do gar. Parte da sacarose adicionada ao meio ajustado em pH 5,5
tambm hidrolisada durante a autoclavagem e esta proporo aumenta em pHs mais baixos.
Plantas que crescem bem em solos cidos, normalmente se adaptam melhor em meios
com pH inicial baixo.

4.4. PRINCIPAIS MEIOS UTILIZADOS


Meio de Murashige e Skoog (1962) (MS)
Trabalhos de formulaes e meios melhorados no laboratrio do Prof. Skoog culminou
em 1962 na publicao de Murashige e Skoog sobre sais inorgnicos necessrios para culturas
de tecidos de tabaco. Este meio denominado MS continha 40 mM de NO3- e 20 mM de
NH4+. O melhor crescimento de clulas e tecidos de plantas em meio MS , sem dvida, em
grande parte devido alta concentrao de amnia e nitrato. Alm do nitrognio, o potssio no
meio MS encontra-se tambm em dosagens altas, assim como outros macronutrientes, porm
em dosagens menos elevadas. O aumento na concentrao dos sais encontrados no meio MS
proporcionou ganhos significativos no crescimento de tecidos e clulas em diversas espcies de
plantas, tornando-se o meio de cultivo mais utilizado em trabalhos de cultura de tecidos
vegetais. A nica crtica feita ao meio MS refere-se ao baixo nvel de fosfato que, para muitos
pesquisadores, insuficiente para o sustentar crescimento de muitas culturas. Porm, o baixo
teor de fosfato tem sido utilizado com o objetivo de evitar a formao de precipitados no meio
o que reduziria a disponibilidade do elemento para as plantas.
Meio de Gamborg et al. (1968) (B5)
O meio B5 foi desenvolvido por Gamborg et al. (1968) para a cultura de suspenses de
clulas de soja. Contudo, posteriormente passou a ser utilizado em diversos estudos de cultura
de tecidos. Este meio apresenta nveis elevados de NO3- e K+ e baixos de NH4+, em
concentraes superiores a 2 mM de NH4+. Posteriormente, novas formulaes surgiram a
partir de adaptaes do meio B5 como do meio de Greef e Jacobs (1979), que utilizaram outras
fontes de macronutrientes, e Savage et al. (1979) que aumentou os nveis de ferro no meio.
Meio de Schenk e Hildebrandt (1972) (SH)
Foi introduzido para induo e cultura de calos de mono e dicotiledneas. De maneira
diferente, Schenk e Hildebrandt alcanaram concentraes inicas finais semelhantes s de
Gamborg et al. (1968), porm com nveis mais altos de Ca2+, Mg 2+ e H2PO4-. Contudo, o meio
SH no propicia um meio satisfatrio e, por isto, tem sido pouco utilizado em trabalhos de
cultura de tecidos restringindo-se basicamente cultura de leguminosas.

38

Tabela 4.1: Alguns meios utilizados em cultura de tecidos vegetais.


Componentes
B5
H
LS
MS
White
(mg L-1) (mg L-1) (mg L-1) (mg L-1) (mg L-1)
Macronutrientes
CaCl2
166
CaCl2. 2H2O
150
440
440
Ca(NO3)2. 4H2O
300
KCl
65
KH2PO4
68
170
170
KNO3
2.500
950
1900
1900
80
K2SO4
MgSO4. 7H2O
250
185
370
370
720
NaH2PO4 . H2O
150
19
Na2SO4
200
NH4NO3
720
1650
1650
NH4H2PO4
(NH4)2SO4
134
Micronutrientes
CoCl2.6H2O
0,025
0,025
0,025
CuSO4.
CuSO4.5H2O
0,025
0,025
0,025
0,025
0,001
F(SO4)3
2,5
H3BO3
3
10
6,2
6,2
1,5
KI
0,75
0,83
0,83
0,75
MnSO4 H2O
10
MnSO4 4H2O
25
22,3
22,3
7
MoO3
0,0001
Na2MoO4.2H2O
0,25
0,25
0,25
0,25
ZnSO4.7H2O
2
10
8,6
8,6
3
FeEDTA:
F(SO4).7H2O
27,8
27,8
27,8
27,8
Na2EDTA.2H2O
37,2
37,2
37,2
37,2
Componentes
Orgnicos:
cido flico
0,5
cido
Indol
0,1
Actico
cido nicotnico
1,0
5,0
0,5
0,5
Biotina
0,05
Glicina
2,0
2,0
3,0
Mio-inositol
100
100
100
100
100
Piridoxina.HCl
1,0
0,5
0,5
0,1
Tiamina.HCl
10,0
0,5
0,4
0,5
0,1
Sacarose (g/l)
20
20
30
30
30

WPM
(mg L-1)

SH
(mg L-1)

96
556
170
990
370
400
-

200
2.500

0,1
0,2

400
300
-

0,25
6,2
22,3
0,25
8,6

0,1
1

27,8
37,2

15
20

0,5
100
0,5
1,0
20

5
1000
0,5
5
30

5
1
10

Meio de Anderson (1978, 1980)


Anderson formulou um meio para a cultura de brotos de Rhododendron, no qual a
concentrao de ons de nitrato, amnia e potssio eram da concentrao do meio MS e os
nveis de PO3- eram dobrados. Este meio tem sido recomendado para espcies lenhosas, por
apresentar baixas concentraes totais de ons.

39

Meio de Lloyd e McCown (1980) - Meio WPM (Woody Plant Medium)


Este meio foi desenvolvido para cultura de brotaes em plantas lenhosas. Apresenta as
mesmas concentraes de NO3- e NH4+ que o meio de Anderson, alm de mais potssio e um
alto nvel de ons sulfato. Este meio amplamente utilizado para propagao de arbustos e
rvores em laboratrios comerciais.
Uma variedade muito grande de meios tem sido descrita para a cultura de plantas. O
nmero de meios a ser utilizado em um laboratrio depender do tipo de cultura e espcies de
plantas a serem cultivadas Portanto, necessrio possuir uma lista de meios que iro
proporcionar a melhor escolha.

4.5. ESCOLHA DO MEIO DE CULTIVO


A absoro de sais minerais em material vegetal cultivado varia de acordo com a relao
superfcie/volume do explante e se cultivada em meio gelificado ou lquido. rgos grandes
(cultura de brotaes em proliferao) ou grandes massas de calos com uma pequena relao
superfcie/volume e um meio gelificado absorveria nutrientes mais rapidamente em meio
relativamente concentrado do que em meio diludo. Razes com clulas especialmente
adaptadas para a absoro de nutrientes absorvem sais mais eficientemente do que outros
rgos ou tecidos desorganizados que crescem bem num meio de concentrao total baixa.
Meios diludos so tambm mais apropriados para a iniciao de razes em brotaes e para a
germinao de sementes in vitro, tornando-se necessrio adaptar a concentrao dos
macronutrientes quanto ao tipo de cultura e espcie que est sendo cultivada.
O ajuste concentrao inica torna-se necessrio quando um ou mais ons forem
inibidores de determinada espcie ou grupo de plantas. Tecidos vegetais lenhosos, por exemplo,
freqentemente crescem melhor em meio contendo concentraes reduzidas de um ou mais
ons. De forma alternativa, alguns pesquisadores utilizam concentraes reduzidas de macro
elementos do meio MS para plantas lenhosas, ao invs dos meios convencionais.
Os meios so selecionados em funo da espcie e tipo de cultura ou do estgio cultural
que est sendo efetuado. Quando no h informaes prvias deve-se usar os meios e mtodos
que deram bons resultados em casos anteriores, com a mesma espcie. Se no for possvel
encontrar registros para determinada cultivar, aqueles apropriados para outros cultivares,
espcies, gneros ou famlias podero ser bem sucedidos. Mudanas podem, ento, serem feitas
no meio original para tentar melhorar o crescimento, morfognese ou taxa de multiplicao. A
formulao mais apropriada de meio pode variar dentro de uma mesma espcie.
4.6. PREPARO DE SOLUES ESTOQUE
Quando somente uma pequena quantidade de meio necessria ou quando o meio
utilizado com pouca freqncia, recomendado pesar e dissolver diretamente os reagentes para
cada preparo. Em situaes onde so preparados meios com relativa freqncia (um ou mais
litros por semana), solues estoque so preferidas, pois agilizam os trabalhos. Desta forma, o
processo de pesagem dos elementos bsicos (principalmente macro, micronutrientes)
realizado uma nica vez, para a preparao escalonada de dezenas de litros.
4.6.1. Preparo das solues estoque do meio MS
Em geral, as solues estoque para o meio MS so preparadas de acordo com a Tabela
4.2 Os reagentes utilizados devem ser com a mxima pureza possvel. O volume e a
40

concentrao de cada soluo depender da demanda do laboratrio. Em geral, os estoques so


preparados para 100 litros de meio, contudo, em algumas situaes, quando o consumo baixo,
diminui-se a concentrao das solues estoque para que a soluo no permanea por longo
perodo armazenada. No preparo da soluo estoque que contm Fe, alguns passos devem ser
seguidos a fim de se evitar a formao de precipitados na soluo. Deve-se dissolver o
Na2EDTA.2H2O em gua deionizada a 50% do volume final da soluo, deixando agitar por 10
minutos. Posteriormente, aquecer at 50 a 70C, e acrescentar lentamente o FeSO4.7H2O,
mantendo a agitao. Aps a completa dissoluo dos cristais adicionados, completar a soluo
para o volume final preestabelecido.
Tabela 4.2: Solues estoques de sais minerais, vitaminas e aminocido do meio
Murashige e Skoog.
Soluo
A
B
C

D
E

Vitaminas
Aminocido

Componentes
NH4NO3
KNO3
H3BO3
KH2P04
KI
Na2MoO4 2H2O
CoCl2 . 6H2O
CaCl22H2O
MgSO4 . 7H2O
MnSO4 . 4H2O
ZnSO4 . 7H2O
CuSO4 . 5H2O
Na2 EDTA.2H2O
FeSO4 . 7H2O
Mio-inositol
Tiamina HCl
Piridoxina HCl
cido Nicotnico
Glicina

Sol. estoque conc. 100 X


(mg L-1)
165000
190000
620
17000
83
25
2,5
44000
37000
2230
860
2,5
3720
2780
10000
50
50
50
200

Sol. estoque conc. 10 X


(mg L-1)
16500
19000
62
1700
8,3
2,5
1,25
4400
3700
223
86
1,25
372
278
1000
2,5
5
5
20

Para melhor conservao da soluo de Fe, envolver o frasco com papel alumnio
evitando assim a entrada de luz. O mesmo deve acontecer com a soluo de vitaminas.
Logo aps a dissoluo, as solues estoque devem ser armazenadas em refrigerador
(entre 1 e 5C), retirando-as somente momentos antes da preparao do meio. Quando
preparadas e armazenadas de forma adequada, as solues podem permanecer at seis meses
sem que seja comprometida a qualidade do meio. Importante salientar que a sacarose e o agar
devem ser dissolvidos somente no momento da preparao do meio, no devendo serem
acrescentados s solues estoque.
Alguns autores defendem que os componentes: vitaminas, aminocidos e inositol no
devem ser armazenados em forma de soluo, e sim pesados no momento da preparao do
meio.

41

4.7. PREPARO DOS MEIOS DE CULTIVO


Cada laboratrio pode adotar diferentes procedimentos para preparar os meios
nutritivos. Normalmente, mantm-se solues estoques dos sais minerais na geladeira.
Alternativamente, todo o meio pode ser preparado numa concentrao 10 vezes maior que a
concentrao final. Podem ser utilizadas tambm pores conservadas no congelador j
divididas nas quantidades necessrias para preparar um litro de meio ou ainda serem utilizada
misturas previamente preparadas em laboratrios comerciais (meios pr-misturados).
O meio de Murashige e Skoog (1962) e outros meios podem ser obtidos a partir de prmisturas de fornecedores de produtos qumicos, em quantidades suficientes para preparar
vrios litros de meio. Alguns componentes do meio, como os macro e micronutrientes e as
vitaminas, so tambm vendidos separadamente.
Os meios previamente preparados possibilitam economia com mo de obra e com local
para armazenamento de reagentes e solues. No entanto, no h possibilidade de modificar a
proporo dos componentes.
Partindo-se diretamente dos sais, sem a utilizao das solues estoque, pesam-se todos
os componentes, de acordo com a receita e a quantidade de meio a ser preparada Logo em
seguida, dissolve-se em gua deionizada. Importante que seja utilizado algum recipiente com
volume preciso (como provetas ou bales volumtricos). Concluda a dissoluo de todos os
produtos qumicos e a sacarose, acrescenta-se o gar e corrige-se o pH. O ajuste do pH pode
ser feito com soluo de 0,5 M de HCl (para baixar) ou NaOH (para elevar).
Partindo-se de solues estoque, pipetam-se as alquotas de cada soluo, de acordo
com a concentrao e a quantidade de meio a ser preparado. Em seguida, completa-se para o
volume final com gua deionizada e corrige-se o pH.
O passo seguinte para ambos os mtodos mencionados acima o aquecimento para
dissoluo do agar. Para o aquecimento, pode-se utilizar chapa aquecedora ou forno de
microondas, desde que o meio atinja 90 a 95C. To logo alcance esta temperatura, distribui-se
todo o volume nos frascos de cultivo, fechando-os em seguida com tampa autoclavvel ou
papel alumnio.
4.7.1. Autoclavagem
Embora tenha sido aquecido, o meio ainda necessita ser autoclavado por 15 minutos a
121 C, o que deve ser feito to logo o meio seja distribudo nos frascos. Em casos
excepcionais, pode-se autoclavar no dia seguinte ao preparo, no entanto, isso deve ser evitado,
pois colnias de contaminao em desenvolvimento podem liberar toxinas, alm de consumir
parte dos compostos.
4.7.2. Esterilizao a frio
Ingredientes termolbeis devem ser esterilizados por ultra-filtrao ao invs de serem
autoclavados. Todavia, o processo mais lento e mais caro que a autoclavagem e tambm deve
ser utilizado apenas para ingredientes especficos.
A ultra-filtrao consiste em filtrar a soluo em uma malha com dimetro de poro
menor que 0,22m, em um recipiente esterilizado. Pequenos volumes de solues podem ser
passados atravs de uma unidade de ultra-filtrao menor, presa a uma seringa. Dessa forma, a
soluo forada a passar pelo filtro com a presso exercida no mbolo da seringa.
Grandes volumes de soluo necessitam de equipamentos especficos, alm do prprio
filtro, como por exemplo, bombas de presso ou vcuo, e funis especiais.

42

4.7.3. Armazenamento dos meios


Aps aesterilizados os meios devem ser armazenados por pouco tempo. Nesse perodo,
importante que o local de armazenamento seja mantido com temperaturas baixas, limpo e
sem luz.

43

Captulo 5
Fitorreguladores
5.1. INTRODUO
Todas as plantas possuem substncias qumicas cuja funo regular os processos
metablicos envolvidos no crescimento e desenvolvimento. Essas so conhecidas como
hormnios ou reguladores de crescimento. Por outro lado, h substncias sintticas que, uma
vez aplicadas s plantas inteiras ou a segmentos de tecidos vegetais, provocam atividades
fisiolgicas similares aos hormnios. A estas substncias d-se o nome de reguladores de
crescimento ou fitorreguladores. importante distinguir estes dois termos, pois tratam-se de
produtos distintos, embora com atividade fisiolgica semelhante e frequentemente confundidos
entre si.
Alguns hormnios so produzidos em um tecido e transportados para outro, onde
produzem respostas fisiolgicas especficas; outros atuam dentro do mesmo tecido em que so
produzidos. Essas substncias so ativas em concentraes muito baixas nos tecidos, como
exemplo, no sistema caulinar do ananaseiro (Ananas comosus) em que existem 6 microgramas de
cido indol-actico (AIA) por quilograma de material vegetal.
A palavra hormnio vem do grego horman, que significa excitar. Entretanto, hoje est
claro que alguns hormnios possuem atividade inibitria. Assim, antes de pensar nos
hormnios como estimuladores mais conveniente consider-los como reguladores qumicos,
muito embora um regulador especfico dependa no somente de sua estrutura qumica, mas
tambm de como ele percebido pelo tecido alvo, ou seja, o mesmo hormnio pode
desencadear diferentes respostas em tecidos diferentes ou em pocas distintas do
desenvolvimento de um mesmo tecido.
Uma das peculiaridades do cultivo de tecidos vegetais a possibilidade quase absoluta de
controle do crescimento e desenvolvimento das plantas. Isso no seria possvel sem a adio
dos reguladores de crescimento ao meio de cultivo, pois so estes componentes que direcionam
o metabolismo do explante in vitro para o processo desejado. Da a importncia do
conhecimento destas substncias.
Os cinco principais grupos de hormnios vegetais (e reguladores de crescimento) so:
auxinas; citocininas; giberelinas; etileno; cido abscsico.
Basicamente o balano entre as auxinas e as citocininas que determinar a regulao do
crescimento e da morfognese de tecidos e rgos. Em cada uma dessas classes, foram
descobertos reguladores sintticos com uma atividade biolgica que se iguala ou excede quela
dos hormnios. O requerimento exgeno de hormnios depende do nvel endgeno da planta.
Em numerosos casos apenas uma citocinina suficiente para iniciar a brotao.
Alm dos hormnios e reguladores de crescimento em si, h os produtos antagnicos a
eles. o caso tpico das anti-giberelinas, tal como o paclobutrazol. Seu efeito o de bloquear a
sntese de giberelina no interior da planta. Normalmente, estas substncias so reguladores de
crescimento muito eficientes. Alm disso, podem ser citados como exemplo os gases acetileno
e propileno, que imitam a atividade do etileno, embora concentraes molares
consideravelmente mais altas so necessrias para produzir a mesma atividade biolgica.
5.2. EFEITOS BIOLGICOS
Os efeitos dos reguladores de crescimento geralmente variam quanto s respostas das
clulas, tecidos e rgos in vitro, de acordo com as condies culturais, o tipo do explante e o
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gentipo da planta. O efeito destas substncias ocorre em muitas espcies. Portanto, considerase o efeito dos reguladores de crescimento como no-absolutos e no-especficos.
Mesmo que no cultivo de tecidos vegetais a presena de reguladores de crescimento
(exgenos e sintticos) no meio de cultivo seja muito importante, o crescimento e a
morfognese in vitro so regulados pela interao e balano entre os reguladores de crescimento
fornecidos no meio e os hormnios produzidos internamente. Alm de exercerem um efeito
direto sobre os mecanismos celulares, muitos reguladores sintticos podem modificar o nvel de
substncias de crescimento produzidas internamente, de um modo que muitas vezes se torna
hereditrio por vrios subcultivos. Fatores que influenciam o crescimento e a morfognese iro
tambm exercer sua influncia atravs de mudanas no nvel interno de hormnios.
O efeito produzido in vitro por um regulador de crescimento tambm depende do
ambiente no qual um rgo ou tecido est sendo cultivado. Concentraes idnticas de um
regulador de crescimento em dois meios de cultivo diferentes entre si podem dar efeitos
distintos.
5.3. AUXINAS
As substncias so chamadas auxinas se elas forem capazes de controlar vrios
processos distintos, tais como o crescimento e elongao celular. As auxinas so capazes de
iniciar a diviso celular e esto envolvidas na origem de meristemas, promovendo crescimento
tanto ao tecido desorganizado como para rgos definidos. A auxina natural (AIA) foi o
primeiro hormnio vegetal identificado, em 1928.
As auxinas so muito usadas em micropropagao e so incorporadas ao meio de cultivo
para promover a formao e crescimento de calo e de suspenso de clulas ou rgos, bem
como para regular a morfognese, especialmente associadas com citocininas. O tipo e a
concentrao de auxina a ser acrescida ao meio de cultivo iro depender: do tipo de
crescimento ou desenvolvimento requerido; dos nveis naturais de auxina no interior do
explante quando este preparado; da capacidade dos tecidos cultivados de sintetizar auxina
naturalmente; da interao, se houver, entre a auxina sinttica aplicada e a(as) substncia(s)
endgena(s) natural(ais).
5.3.1. Auxinas de Ocorrncia Natural
No tecido organizado, as auxinas so responsveis pela manuteno da dominncia
apical. A principal auxina natural o AIA (cido 3-indol actico).
Os nveis de ocorrncia natural de auxina em explantes vo depender da planta-me,
especialmente da idade e do tecido, das condies sob as quais elas crescem e as estaes do
ano nas quais os explantes foram tirados. A concentrao de AIA num tecido ou clula
resultante da taxa de inativao e da taxa de biossntese. A inativao reversvel quando ocorre
a conjugao com outros compostos de baixo peso molecular (acares, aminocidos ou
inositol) ou quando a auxina se liga parede celular. Assim, a conjugao forma uma reserva de
auxina, que libera o AIA livre (fisiologicamente ativo) quando necessrio atravs da ao de
enzimas. A degradao pode ser qumica (fotoqumica, principalmente pela absoro de luz
ultravioleta) ou enzimtica (AIA-oxidases).
As clulas meristemticas so locais ativos para a biossntese e/ou para a liberao de
fatores naturais de crescimento, favorecendo o crescimento da clula. A biossntese do AIA
ocorre no citoplasma e, em menor intensidade, nos cloroplastos.
O transporte das auxinas na planta basal (do pice do rgo para a sua base) e polar
(manifesta polaridade em relao ao tecido). Seu deslocamento ocorre na forma livre, atravs
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do floema, cmbio vascular e xilema. A velocidade de transporte da auxina na planta varia de 1


a 24 cmh-1.
5.3.2. Modo de Ao das Auxinas
a) Promoo do crescimento
As auxinas promovem o crescimento dos tecidos da planta de duas maneiras:
a.1) induzindo a liberao de ons hidrognio dentro e atravs da parede da clula: a ao
da auxina leva quebra de lipdios e acidificao da parede, aumentando a sua extenso. ons
de potssio so colocados na clula para neutralizar a exportao de ons de H+ (prtons) e isso
tem como efeito reduzir o potencial hdrico da clula, de modo que a gua entra e a clula se
expande. Esta explicao comumente aceita para elucidar o rpido efeito de simulao de
crescimento da auxina;
a.2) por um efeito do metabolismo do RNA (sntese proteica), possivelmente induzindo
a transcrio das molculas do RNA (mRNA). Os mRNAs so capazes de decodificar
protenas, as quais so requisitadas para o crescimento.
A exportao de prtons das clulas causa uma acidificao do meio externo quando os
explantes so tratados com auxina. A troca de ons pode ocorrer porque a auxina indiretamente
estimula a enzima ATP-ase, localizada nas membranas celulares, que so responsveis pelo
transporte de H+ e OH- para dentro e para fora das clulas ou porque a auxina aumenta a
permeabilidade da membrana celular a prtons e outros ons. As auxinas possuem carga
positiva e por isso, necessitam serem ligadas a um receptor.
b) Morfognese
As auxinas parecem provocar a alterao da fisiologia dos tecidos de modo a modificar
o que j estava geneticamente programado. As clulas que respondem auxina revertem-se a
um estado diferenciado e comeam a se dividir. O modo como a auxina traz tona essa
reprogramao no totalmente compreendido.
Fatores que afetam os nveis naturais de AIA e a atividade deste composto podem, desse
modo, ser importantes para controlar o crescimento e a morfognese nas culturas de tecidos de
plantas usadas para micropropagao. A ao da auxina dependente da disponibilidade livre
do boro. Em plantas deficientes em boro, tanto a translocao do AIA quanto a sntese de
RNA nuclear em resposta ao tratamento com auxina podem ser inibidas. Dessa forma, a
deficincia de boro pode reduzir o efeito das auxinas exgenas, por exemplo, para formao de
razes. A regulao do nvel de AIA resultante da variao na taxa de biossntese e do seu grau
de desativao.
Tanto o AIA quanto as auxinas sintticas reagem com compostos no interior da planta.
A adeso a pequenas molculas determinada conjugao, enquanto que o complexo com
protenas necessrio para a ao de algumas auxinas determinado interao. A conjugao
torna as auxinas temporariamente ou permanentemente indisponveis. A auxina, quando presa
em molculas conjugadas, protegida da degradao por oxidao e pode ser liberada
novamente atravs da ao de enzimas quando necessria. A intensidade e os tipos de
conjugao variam amplamente entre espcies e mesmo entre variedades.
As auxinas sintticas, aplicadas exogenamente para controlar o crescimento e a
organizao de tecidos cultivados, podem tambm inibir a AIA oxidase.
5.3.3. Uso de Auxinas no Cultivo de Tecidos
O AIA sinttico a auxina mais semelhante auxina naturalmente encontrada nas
plantas e pode ser utilizado no meio de cultivo. Porm, ela tende a ser desnaturada no meio de
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cultivo e ser rapidamente metabolizada dentro dos tecidos da planta. Entretanto, essas
propriedades podem ser teis porque, em algumas plantas, o calo induzido pelo AIA
(juntamente com as citocininas), freqentemente origina maior nmero de brotaes ou
embries. O AIA tambm pode ser utilizado para induzir a morfognese direta e para as
culturas de meristemas. Entretanto, em diversos casos, necessrio usar um dos muitos
anlogos qumicos do AIA, os quais, por possurem propriedades biolgicas similares, so
tambm chamados auxinas. As auxinas sintticas mais comumente usadas no cultivo de tecido
so: 2,4-D (cido 2,4-diclorofenoxi actico); AIB (cido indolbutrico); ANA (cido naftalenoactico). Outras auxinas menos usadas so: NOA (cido naftoxiactico); CPA (cido 4clorofenoxiactico); PCPA (cido r-clofenoxiactico); MCPA (cido [(2-metil) 4-clorofenoxi]actico); 2,4,5-T (cido tri-clorofenoxi actico); Picloram (cido-4-amino-3,5,6tricloropicolnico).
O AIA e o AIB so instveis ao calor e decompem-se parcialmente durante a
autoclavagem, mas o AIA no estvel no meio de cultivo mesmo sendo esterilizado a frio. A
taxa de reduo da atividade do AIA ainda mais rpida na luz e acelerada pela presena de
sais MS.
O efeito das auxinas difere conforme a situao. Em meio para trabalho de
micropropagao, concentraes efetivas de cada regulador de crescimento varia e por isso
precisa ser ajustado de acordo com o gentipo da planta a ser cultivada, o tipo de tecido ou
rgo, a origem do mtodo de micropropagao e o estgio do cultivo. A maioria dos
pesquisadores prefere usar apenas um ou no mximo dois componentes. Entretanto, a mistura
de mais de uma auxina pode ser particularmente efetiva para a induo de enraizamento.
5.3.4. Efeitos no Cultivo de Tecidos
a) Induo de crescimento de calo
Uma auxina geralmente requerida para ser incorporada ao meio nutritivo para a
induo de calo nos explantes. A auxina mais freqentemente empregada para iniciar cultivos
de calos o 2,4-D, embora isso possa acarretar variaes genticas. Por isso, em alguns casos,
utiliza-se ANA ou AIA, bem como induz-se a formao de calo com 2,4-D e aps, transfere-se
o explante para meio com ANA ou AIA. Para induo de calo de plantas dicotiledneas, o 2,4D geralmente usado em nveis entre 4,5-13,6 mM (1,0-3,0 mg L-1). Em monocotiledneas
uma concentrao mais alta de auxina, por exemplo 2,4-D, na escala 9,0-45,2 mM (2,0-10,0
mg.L-1) geralmente usada.
b) Morfognese
A induo de calognese, geralmente requer um ajuste nos nveis de auxinas e
citocininas. Uma relao mais alta entre auxina e citocinina geralmente requerida. Em
contraste, a rizognese geralmente segue o tratamento com a auxina sozinha ou com misturas
contendo mais auxina que citocinina. Citocininas exgenas so geralmente inibitrias na
formao de razes.
Estudos recentes com clulas de mesfilo foliar de Zinnia elegans mostraram que a
diferenciao dos elementos do xilema requerem tanto auxinas como citocininas.
Significativamente, muitas clulas isoladas diferenciam-se diretamente em traquedeos sem
sntese prvia de DNA ou citocinese, excluindo assim a necessidade de diviso celular como um
pr-requisito para a diferenciao. Estes estudos chamam a ateno para o fato de que estes
produtos raramente atuam sozinhos, isto , eles atuaram de acordo com outros fatores internos
como suprimento de acares e outros reguladores de crescimento vegetal.

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c) Cultivo de rgos
Uma auxina geralmente necessria para promover o crescimento inicial do meristema e
a extremidade do broto dos explantes. Uma baixa concentrao de auxina freqentemente
usada em combinao com altos nveis de citocinina quando a multiplicao das brotaes
requerida, mesmo que em alguns casos a citocinina sozinha seja suficiente. importante
escolher concentrao tima de auxina para promover o crescimento sem induzir a formao
de calo.
Na fase final in vitro, quando as plantas so preparadas para a fase de aclimatizao,
geralmente utilizada uma auxina associada a baixas concentraes de uma citocinina. Embora
muitas espcies enrazam sem serem submetidas a auxinas exgenas, esta prtica adotada para
que ocorre um enraizamento mais uniforme, associado a melhor desenvolvimento das mudas
(Figura 5.1).

Figura 5.1: Plantas em fase de enraizamento in vitro, em meio com auxinas (A:
Schlechtendalia luzulifolia, B: Limonium brasiliense e C: Musa sp) (Imagens CSFior, JB/FZB-RS)
5.4. CITOCININAS
As citocininas abrangem uma classe de reguladores de crescimento que estimulam a
sntese protica. Por esta razo, elas podem promover a maturao de cloroplastos e atrasar a
senescncia de folhas destacadas. A aplicao de citocinina em um rgo da planta (por
exemplo, uma folha) faz com que o rgo tratado se torne um centro de convergncia de
aminocidos, que ento migram para a regio prxima. O efeito das citocininas mais notvel
em cultivos de tecidos onde elas so usadas, freqentemente junto com as auxinas para
estimular a diviso celular e controlar a morfognese. Adicionadas cultura de brotaes, estas
substncias reduzem a dominncia apical e liberam gemas laterais da dormncia. Neste caso,
elas parecem ter um efeito oposto ao da auxina endgena. Assim como no caso das auxinas, h
citocininas naturais e seus anlogos sintticos.
A primeira citocinina a ser descoberta, a cinetina, foi isolada no laboratrio por Skoog,
em 1955, em experimentos para promover o crescimento contnuo de calo em segmentos de
caule de fumo em meio de cultivo. Esta substncia foi denominada quimicamente 6-furfurilamino-purina. A cinetina no considerada uma citocinina natural, pois foi originada pelo rearranjo estrutural de outra substncia (DNA de arenque). Em 1963, foi isolada a primeira
citocinina natural, em endosperma de milho, razo pela qual ela foi denominada zeatina.
Porm, pelo menos 25 substncias de crescimento, estruturalmente relacionadas com a
cinetina, foram identificadas, tanto como substncias livres ou como glicosdeos. As citocininas
de ocorrncia natural mais utilizadas em cultivo de tecidos vegetais so: Zeatina (N6- (4-hidroxi3-metilbut-2 enil) aminopurina); 2iP (2- isopenteniladenina); Dihidrozeatina [6-(4-hidroxi-3metil-trans-2-butenil) aminopurina].
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Apesar da ocorrncia de citocininas endgenas em plantas intactas, muitos tecidos e


pequenos rgos isolados in vitro no so aptos para sintetizar o suficiente destas substncias
para sustentar o crescimento. A dependncia de algumas culturas de calos de citocinina para a
diviso celular tem sido usada como base de uma sensvel bio-anlise para as citocininas.
Provavelmente, nos tecidos que esto aptos a crescer sem citocinina sendo adicionada ao meio,
as clulas podem produzir citocinina natural suficiente para que a diviso celular prossiga.
5.4.1. Biossntese de Citocininas
As citocininas ocorrem como molculas livres nas plantas e so tambm encontradas em
RNAs (t-RNAs) transportadores do citoplasma e cloroplasto. Em todas as plantas, as razes
parecem ser os principais locais de biossntese natural de citocinina, mas a produo tambm
pode ocorrer em outros tecidos em diviso celular ativa, tais como o cmbio do caule. O pice
da raiz o local mais importante de sntese. A concentrao de citocinina nos tecidos varia
entre 0,01 a 1M.
As citocininas produzidas nas razes das plantas so normalmente transportadas atravs
do xilema para outras regies. A seiva das plantas rica em citocininas o que pode promover o
crescimento in vitro. A citocinina produzida por brotaes apenas uma pequena proporo
daquela formada pelos pices da raiz.
O transporte de citocininas nas plantas ocorre atravs do xilema e floema como
conjugados nucleotdeos.
5.4.2. Substncias Sintticas com efeito de Citocinina
a) Purinas
Embora usadas em pesquisa, as citocininas naturais 2-iP e zeatina, no so empregadas
por laboratrios comerciais rotineiramente devido ao seu alto custo. Diversos anlogos
qumicos de citocininas naturais tm sido isolados e so muito ativos como citocininas. Embora
elas sejam principalmente derivadas de 6-adeninas substitudas, h outras substncias menos
relacionadas e que tambm possuem atividade de citocinina.
As citocininas sintticas mais comumente usadas em cultivo de tecidos vegetais so:
Cinetina (6-furfurilamino-purina) e BAP ou BA (6-Benzilaminopurina = 6-Benziladenina).
Algumas substncias com atividade de citocinina ou de anti-citocinina tm propriedades
fungicidas. O fungicida benomyl, que tem uma estrutura similar citocinina de base adenina
tem sido testado em cultivo de tecidos por apresentar ao de citocinina. O benomyl pode
causar danos a culturas desenvolvidas em recipientes selados.
b) Fenilurias
Uma maneira comum de adicionar citocinina natural ao meio atravs do uso de
suplementos orgnicos tais como o extrato de levedura ou leite de coco. O leite de coco
contm vrias substncias fisiologicamente ativas, dentre as quais a citocinina zeatina com base
purina natural e 1,3-difeniluria. A ltima substncia, e muitas outras urias substitutas, tm
atividade de citocinina. Foi descoberto que algumas fenilurias so mais ativas que purinas tais
como BAP e zeatina na promoo de crescimento de calo e morfognese. Algumas das
substncias mais ativas nesta srie so: 2CI-4PU (N-(2-chloro-4-pyridyl)-N-feniluria); 2,6CI4PU (N-(2,6-dichloro-4-pyridyl)-N-feniluria); Thidiazuron (TDZ) (N-phenyl-N-1,2,3thiadiazol-5-ylurea).
Este ltimo composto foi registrado inicialmente como desfolhante na cultura do
algodo, com o nome comercial Dropp e, sua alta atividade de citocinina foi posteriormente
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demonstrada. Em algumas plantas, ele mais eficiente que as substncias de base adenina para
induzir a regenerao de brotaes adventcias.
5.4.3. Modo de Ao
O modo de ao das citocininas da planta incerto. Foi descoberto que algumas
estavam presentes nas molculas de RNA transportador, mas ainda no est muito claro
quando a incorporao dentro do t-RNA necessria antes que os efeitos tpicos da citocinina
se manifestem. Em alguns casos, foi demonstrado que as citocininas ativaram a sntese de RNA
e estimularam a sntese protica e a atividade enzimtica. A ao das citocininas dependente
da luz.
As citocininas podem ter um efeito anti-auxina. Tem sido mencionado em alguns casos
que a cinetina bloqueia a sntese de um polipeptdeo (provavelmente uma enzima -1,3glucanase) induzida pela auxina. Parte dos efeitos biolgicos produzidos pelas citocininas
poderia ser prprio da sua inibio da oxidao do AIA. A citocinina, em concentraes de
0,04 a 1 mg L-1 alterou atividade, distribuio e composio das enzimas do complexo AIAoxidase em clulas de calo de tabaco. Em outra situao, a citocinina fez com que as paredes da
clula ficassem mais rgidas de tal forma que o potencial de turgescncia das clulas fosse
aumentando. O potencial hdrico das clulas, desta maneira, se tornou mais negativo e elas se
tornaram menos sujeitas a captarem gua do meio ao redor. Este foi o efeito diretamente
oposto ao da auxina CPA.
Em geral, assume-se que os compostos de feniluria com atividade de citocinina agem
nos mesmos lugares que as citocininas de base purina. Uma hiptese alternativa que as
fenilurias podem estimular o acmulo ou biossntese de citocininas com base purina, ou alterar
o metabolismo destas substncias. As fenilurias tambm so potentes inibidoras da oxidase de
citocinina.
A absoro de citocinina dentro dos tecidos cultivados rpida. Uma enzima que ocorre
naturalmente, a citocinina-oxidase, degrada citocininas tais como a zeatina e a adenina-isopentil,
que tm uma dupla ligao, partindo a cadeia lateral. Em vrios tipos diferentes de tecido de
planta, a atividade da citocinina oxidase aumentada pela aplicao exgena de citocininas
sugerindo que tratando plantas com citocininas sintticas poderia diminuir o nvel de
substncias endgenas naturais.
Na ausncia de citocinina, a mitose consideravelmente alongada, j tendo sido
sugerido que as citocininas possam ser requisitadas para regular a sntese de protenas
envolvidas na formao e funcionamento do fuso mittico. Onde a citocinina limitada, a
diviso nuclear das clulas fica presa em um estdio do ciclo celular.
5.4.4. Efeitos das Citocininas em Cultivo de Tecidos
O efeito das citocininas em cultivos de tecido ou rgos pode variar de acordo com a
substncia utilizada, o tipo de cultivo, a variedade da planta de onde ela foi derivada e da idade
do tecido que deu origem ao explante.
a) Estmulo da diviso celular
Em cultivos de tecidos, as citocininas parecem ser necessrias para a diviso celular da
planta. Os tecidos de calo, nos quais a diviso celular ocorre sem a adio de citocinina ao meio
de cultivo, so aptos a produzir suas prprias substncias de crescimento.
b) Formao de brotaes adventcias

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Brotaes surgindo de algum local da axila da folha ou de brotaes apicais so


chamadas de brotaes adventcias. As citocininas so muito eficientes em promover a iniciao
direta ou indireta de brotaes. Como foi mencionado no item anterior, elas so usadas com
este propsito em combinao com auxinas.
c) Embriognese
Uma baixa concentrao de citocinina (tipicamente 0,5-2,5 M) pode ser adicionada ao
meio de cultivo para induo de calo embriognico, especialmente em dicotiledneas. H
algumas evidncias para sugerir que as citocininas podem inibir a embriognese em
monocotiledneas. A presena de citocinina endgena pode tambm ser responsvel pela falta
de habilidade para obter embriognese em alguns gentipos.
d) Proliferao de brotaes axilares
Citocininas podem ser utilizadas para estimular o crescimento de gemas auxiliares e
reduzir a dominncia apical no cultivo de brotaes. Este tratamento pode induzir o
crescimento de diversas pequenas brotaes de cada explante ( Figura 5.2 A e B)

Figura 5.2: Brotaes adventcias emitidas a partir de gemas axilares de Siphocampylus


betulaefolius (A) e Hippeastrum reticulatum (B) em meio com citocininina (Imagens: CSFior,
JB/FZB-RS).
. No entanto, altas taxas de citocininas podem reduzir o tamanho das brotaes e
estimular a ocorrncia de hiperidricidade e formao de folhas anormais.
A formao de brotaes adventcias, tanto diretamente dos tecidos explantados quanto
indiretamente do calo, regulada por uma interao entre auxinas e citocininas.
Altas concentraes de citocinina (0,5-10 mg.L-1) geralmente inibem ou atrasam a
formao de razes. Por esta razo, as citocininas so geralmente omitidas do meio de cultivo de
brotaes no estgio de enraizamento. Algumas vezes, mais que uma subcultura para um meio
livre de citocinina pode ser requerida at que o nvel de citocinina dentro dos tecidos tenha sido
suficientemente reduzido.
5.5. INTERAO ENTRE CITOCININAS E AUXINAS
Muitos aspectos da diferenciao celular e organognese nos cultivos de tecidos e rgos
so controlados por uma interao entre as concentraes de auxina e citocinina.
Tecidos de monocotiledneas podem freqentemente ser induzidos a formar calo pela
cultura em altos nveis de auxina isolada - as citocininas podem no ser essenciais;
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A organognese em monocotiledneas freqentemente promovida pela transferncia


da cultura para um meio sem auxina, reduzindo as concentraes de uma auxina altamente ativa
tal como o 2,4-D ou substituindo-o por outra auxina (AIA ou ANA).
5.6. GIBERELINAS
A primeira giberelina foi isolada a partir do fungo do arroz Gibberella fujikuroi. Da em
diante, mais de oitenta diferentes compostos com estrutura qumica baseada no esqueleto das
giberelinas foram identificados de fungos e plantas superiores, dando origem a diferentes
giberelinas com diferentes efeitos fisiolgicos. Nem todas as giberelinas so biologicamente
ativas em vegetais superiores. A atividade de uma giberelina depende da afinidade com um
receptor, da mobilidade de transporte e da taxa de metabolismo. Vrias giberelinas podem ser
encontradas na mesma planta. Por exemplo, em tecidos vegetativos encontrada a giberelina
GA1 e, em tecidos reprodutivos, a giberelina GA4. O cido giberlico (GA3) e uma mistura de
GA4 e GA7 so as nicas giberelinas comercialmente disponveis.
5.6.1. Atividade Fisiolgica e Biossntese de Giberelinas
A atividade de biossntese est concentrada em sementes em germinao, endosperma,
frutos imaturos e pices de caules e razes.
O transporte de giberelinas na planta se d principalmente atravs do xilema, sendo a
forma preferencial para transporte o ster glicosdico.
Em plantas intactas, as giberelinas podem influenciar o crescimento e desenvolvimento
de vrios modos, como por exemplo: aumentando o comprimento do caule, promovendo o
florescimento ou induzindo a formao de frutos. Vrios dos efeitos das giberelinas sobre as
plantas so causados pelo decrscimo seletivo na biossntese e atividade de enzimas.
5.6.2. Efeitos das Giberelinas em Cultivo de Tecidos
O crescimento in vitro de tecidos vegetais pode ser induzido sem giberelinas, embora
possam se tornar ingredientes essenciais de meios para cultivar clulas em baixas densidades.
Quando o GA3 adicionado no meio de cultivo, ele freqentemente produz efeitos de natureza
similares aos das auxinas. Altas concentraes de GA3 (maiores do que cerca de 5 M ou 1-8
mg.L-1) induz o crescimento de clulas de calos no-diferenciadas e podem promover o
crescimento de calos em combinao com auxina e baixas taxas de citocininas.
a) Morfognese
O cido giberlico, em meio de cultivo, normalmente diminui ou impede a formao de
razes, brotaes ou embries somticos. Assim, o tratamento prvio do calo ou de explantes
com GA3 ou a adio do mesmo ao meio de cultivo, junto com a auxina e citocinina em
concentraes que normalmente promoveriam a morfognese, em geral inibe a formao de
brotaes ou razes.
A inibio do enraizamento causada pelo GA3 geralmente ampliada na presena da
auxina, o que pode ser decorrente de uma concentrao excessiva de auxina total. Em alguns
trabalhos, j foi constatado que o cido giberlico foi tambm capaz de promover formao
direta de raiz em fragmentos de folha de Digitalis quando aplicado em baixos nveis de AIA,
mas foi inibidor quando a concentrao de IAA foi aumentada.
Todavia, em algumas plantas, o pr-tratamento de material vegetal com GA3 aumenta
ou intensifica a formao de razes quando as mudas so posteriormente colocadas em meio
que induz o enraizamento. Se o GA3 for aplicado na ausncia de auxina e o explante for

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posteriormente mantido no escuro, o enraizamento tende a ocorrer. O efeito do cido


giberlico sobre a formao de raiz dependente da poca de aplicao.
O GA3 pode inibir a formao de brotaes se presente na poca de formao de
meristemides, sendo mais repressivo durante a incubao no escuro do que na luz. Esta
inibio no irreversvel, mas pode persistir pelo menos durante dois subcultivos em um meio
sem GA3.
b) Embriognese e desenvolvimento de embrio
Em geral, o cido giberlico inibe a formao de embries somticos. J foi observado
que a adio de inibidores da biossntese de giberelinas aumentou o nmero de embries
somticos a partir de calos de Citrus sinensis.
c) Diferenciao celular
O cido giberlico tem pouco efeito sobre a diferenciao celular in vitro alm de mediar
a ao da auxina. Em plantas intactas, a formao do xilema pode ser estimulada pelo
tratamento com GA3 ou com auxina e GA3 combinadas.
d) Alongamento de brotaes
Um dos principais efeitos e aplicaes das giberelinas em cultivo de tecidos o
alongamento das brotaes durante a multiplicao ou antes do enraizamento. O tratamento
pode ser benfico onde o alto nvel de citocinina resultou em muitas brotaes curtas. Em
geral, so utilizadas concentraes de GA3 entre 0,1 a 2,0 mg L-1. Porm, o que pode ocorrer
como efeito do GA3 a formao de brotaes muito alongadas com folhas estreitas.
e) Tratamentos durante a aclimatizao
As plantas micropropagadas de algumas espcies lenhosas podem se tornar dormentes
aps serem transplantadas ao solo e no crescem adequadamente a menos que sejam
submetidas a um perodo de frio ou tratadas com cido giberlico. A biossntese de giberelina
promovida pelo tratamento a frio.
5.7. CIDO ABSCSICO
O cido abscsico (ABA) foi descoberto por Addicot e colaboradores em 1963, em
estudo sobre a absciso de frutos de algodo.
O cido abscsico encontrado com frequncia nas plantas e normalmente definido
como sendo um inibidor de crescimento de planta, pois pode controlar a dormncia de gemas e
sementes, porm mais especialmente porque inibe a acidificao da parede celular promovida
pela auxina e o afrouxamento que permite o alongamento de clulas. O ABA tem muitas outras
funes reguladoras nas plantas, tais como o fechamento estomtico, controle de absoro de
gua e ons pelas razes, absciso e senescncia foliar. Em cultivo de tecidos, s vezes, promove
a morfognese ou crescimento.
5.7.1. Biossntese do cido Abscsico
O cido abscsico produzido nas plantas a partir do cido mevalnico (MVA) ou do
desdobramento de pigmentos carotenides (que so tambm derivados do MVA). A
biossntese ocorre nos plastdeos, especialmente em cloroplastos, onde ocorre mais de 50 % da
produo de ABA.
A concentrao de ABA nos tecidos varia entre 3 a 20000 g.kg-1, sendo o regulador
encontrado em toda a planta. Nveis mais elevados de ABA so encontrados durante a queda
de flores e frutos, na entrada da planta em dormncia e em condies de estresse.
O transporte de ABA ocorre tanto atravs do xilema quanto atravs do floema.

53

5.7.2. Atividade Fisiolgica do cido Abscsico


Possivelmente, o ABA pode modificar a sntese ou a atividade de citocinina, como foi
observado em algumas plantas testes intactas. Em casos em que o ABA estimulou o
crescimento de plantas ou a embriognese, pode ter ocorrido uma superao do seu efeito
pelos altos nveis de citocininas naturais. O efeito sinrgico do ABA com as auxinas na
promoo de enraizamento de estacas poderia ser explicado do mesmo modo. O cido
abscsico tem efeitos opostos a substncias fenlicas e pode, por exemplo, aumentar a oxidao
do AIA que muitos fenis parecem impedir. O balano entre os teores de ABA e de giberelinas
determina a quebra de dormncia das gemas.
5.7.3. Efeitos do cido Abscsico em Cultivo de Tecidos
a) Crescimento de calos
O ABA em geral inibidor do crescimento de calo. Porm, em algumas espcies o
regulador estimulou o crescimento do calo, como por exemplo em Cryptomeria sp (1 mg L-1 de
ABA teve o mesmo efeito que 10 mg L-1 de BAP) e em Citrus sp (0,6 a 2,0 mg L-1 de ABA teve
efeito favorvel formao de calos a partir de segmentos de folhas). Esta resposta
geralmente obtida apenas com concentraes de ABA relativamente baixas. Taxas mais altas
causam decrscimo no peso de calo produzido.
b) Morfognese
- Formao de brotaes adventcias: em Begonia sp a formao de brotaes adventcias
foi intensificada quando as folhas foram tratadas com cido abscsico e inibida quando se
aplicou auxina ou giberelina.
- Embriognese: o ABA essencial para o crescimento normal de embries somticos e
somente na sua presena eles se assemelham estreitamente aos embries zigticos no seu
desenvolvimento e estrutura. A manipulao de nveis de ABA endgenos e/ou exgenos
aumenta a freqncia dos embries que alcanam a maturidade. H tambm citaes de baixas
concentraes de ABA estimulando a iniciao de embries somticos ou o crescimento do
embrio.
5.8. ETILENO
H muito tempo, sabe-se que, mesmo em concentraes muito baixas de etileno na
atmosfera (0,1 ppm por volume), as plantas podem crescer de forma anormal. Em anos mais
recentes, foi descoberto que o etileno produzido por tecidos de plantas vivas e regulam o seu
crescimento. O etileno est principalmente envolvido no amadurecimento e senescncia de
frutos e na absciso de folhas, mas tambm tem muitas outras funes.
5.8.1. Biossntese e Atividade Fisiolgica do Etileno
O etileno produzido a partir do aminocido metionina, atravs do ACC (cido 1amino ciclopropano-1-carboxlico). Este processo intensificado pelo fornecimento de
carboidratos exgenos, luz, auxinas, citocininas e dixido de carbono. A adio de ACC
exgeno nas plantas em geral resulta num aumento na produo de etileno, indicando que,
normalmente, a sntese de ACC que limita a formao de etileno. A converso do ACC a
etileno controlada por uma enzima formadora de etileno que exige oxignio e ou a presena
de um radical livre de oxignio, provavelmente o radical superxido.
O etileno atua ligando-se a um stio ativo que contm cobre, sobre o qual ele se torna
oxidvel. Isto parece resultar no estmulo dos stios ativos de enzimas especficas. Observa-se,
54

por exemplo, que mRNAs relacionados ao amadurecimento so acumulados em frutos de


tomate em resposta ao tratamento por etileno.
Vrios produtos qumicos sintticos liberam etileno. O mais utilizado o etefon (2CEPA ou cido 2-chloroetilfosfnico). Este composto absorvido em tecidos vegetais, onde
desdobrado para liberar o etileno.
5.8.2. Produo do Etileno in vitro
O etileno produzido durante a cultura de todos os tipos de clulas vegetais, tecidos ou
organismos. A taxa de biossntese elevada se as clulas forem submetidas a algum tipo de
estresse (altos nveis de cloreto de sdio, nveis txicos de ons de amnio, etc.). Alguns
produtos qumicos adicionados ao meio de cultivo podem estimular a produo de etileno, tais
como o manitol e o polietileno-glicol (PEG). A produo de etileno tambm maior durante a
senescncia do material vegetal cultivado. As auxinas geralmente aumentam a produo de
etileno.
A concentrao de etileno no espao de ar livre, em frascos de cultivo, varia conforme o
tipo de tecido que est sendo cultivado, o peso do tecido, o volume do recipiente de cultivo, a
maneira como o recipiente lacrado e o prprio meio de cultivo.
5.8.3. Efeito do Etileno em Cultivo de Tecidos
Alguns dos efeitos fisiolgicos produzidos pelo etileno so idnticos aos produzidos
pela auxina, pois j foi constatado que o tratamento com auxina aumenta a biossntese da
enzima ACC-sintetase aumentando, assim, a produo de etileno a partir da Sadenosilmetionina. Portanto, isto sugere que algumas das respostas das plantas s auxinas so,
em ltima anlise, efetuadas pelo etileno, produzido em resposta a um tratamento por auxina.
a) Isolamento de explantes
A produo de etileno por tecidos vegetais temporariamente elevada quando ocorre
um ferimento, como quando durante o isolamento do explante.
b) Iniciao e crescimento de calos
O etileno parece estimular o crescimento de calo de algumas plantas in vitro. Em cultura
de Ginkgo biloba, por exemplo, embries cultivados em meio sem reguladores originaram
plntulas quando os frascos foram fechados com algodo, mas deram origem a calos quando
selados com parafilme.
c) Morfognese
A funo do etileno na morfognese ainda no est bem esclarecida, embora sua ao de
inibir a auxina deve ser parcialmente responsvel pelos efeitos observados. Alm de influenciar
a determinao de clulas que daro origem ao calo, o etileno pode influenciar a morfognese in
vitro. Parece haver uma concentrao crtica na qual a morfognese estimulada; concentraes
abaixo e acima deste limite so ineficazes ou inibidoras. Segundo alguns autores, o etileno inibe
a formao de brotaes durante os primeiros cinco dias de iniciao, mas posteriormente
acelera a formao dos primrdios.
A formao de bulbos em brotaes de tulipa foi intensificada pelo aumento do etileno
endgeno.
Sobre o enraizamento in vitro, o etileno parece ter efeitos promotores e inibidores. J foi
demonstrado que, em condies onde o AIA promove a formao de razes adventcias em
discos de folha de tomateiro, a aplicao simultnea de gs de etileno, ou etefon, foi inibidora.
55

J em explantes de fumo, o surgimento de razes foi associado com um aumento na sntese de


etileno. Na presena de oxignio, o enraizamento de estacas de crisntemo foi aumentado pela
adio de 10 ppm de etileno na fase gasosa ou pelo ferimento do explante.
d) Embriognese
J foi observado que o etileno favorece a formao de embries, em concentraes
muito baixas (0,01-1,0 mg L-1). Nveis elevados so txicos e podem impedir a embriognese.
s vezes, o prprio tecido produz etileno em concentraes txicas devido ao fechamento
hermtico do recipiente a gases.
e) Crescimento de brotaes
O etileno geralmente inibidor para o crescimento de clulas nos meristemas de
plntulas. Portanto, seria de se esperar que concentraes de etileno encontradas dentro de
frascos de cultura impediriam o crescimento normal de brotaes. Essa inibio realmente
parece ocorrer em alguns casos, mas em outros, o etileno pode estimular o crescimento de
brotaes.
f) Dormncia de gemas
Embora a gema permanea dormente na presena de etileno externo, uma vez que a
planta ou rgo da planta seja isolada do gs, a dormncia quebrada e o crescimento do broto
geralmente estimulado. Em micropropagao, as citocininas so usadas para promover o
crescimento de gemas axilares. Citocininas e a presena anterior de alto teor de etileno podem
ter o mesmo efeito final.
Caractersticas dos principais reguladores de crescimento utilizados em cultivo de
tecidos vegetais.
Classe
Abreviatura ou
Nome qumico
Peso
nomes comuns
molecular
Auxinas
AIA
cido 3-indolilactico
175,2
ANA
cido naftalenoactico
186,2
AIB
cido indolilbutrico
203,2
CPA
cido (4-clorofenoxi) actico
208
2,4 - D
cido 2,4-diclorofenoxiactico
221
Picloram
cido 4-amino-3,5,6-tricloropicolnico
241,5
ANO
cido naftoxiactico
202,2
Citocininas Cinetina (KIN)
6-furfurilamino-purina
215,2
BAP (BA)
6-Benzilaminopurina=6-Benziladenina
225,2
2iP
Isopenteniladenina
203,2
6
Zeatina (Zea)
N -(4-hidroxi-3-metilbut-2 enil) aminopurina
219,2
PBA
(6-Benzilamino)-9-2-tetraidropiranil-9-H-purina
300
Giberelinas cido giberlico 2,4a,7-trihidroxi-1-metil-8-metilene-gib-3 ene-1,10(GA3)
cido carboxlico-1-4-lactona
364,4
Inibidores
ABA
cido Abscsico
264,3
Etileno
C2H4
28
Ethephon
cido 2-cloroetilfosfnico
144,5
Adaptado de Torres, Calda e Buso, 1998.

56

Captulo 6
Desinfestao dos tecidos vegetais, estabelecimento dos explantes e condies
de incubao.
6.1. INTRODUO
Plantas em desenvolvimento esto em contato com inmeros microorganismos. A
maioria deles se desenvolve na superfcie de ramos, folhas e demais tecidos sem lhes causar
qualquer alterao. Contudo, ao instalarmos um tecido vegetal in vitro, as condies ambientais
de elevada umidade, nutrientes disponveis e alta concentrao de acar propicia o
crescimento destes microorganismos superando e, na maioria das vezes, impedindo a
regenerao e desenvolvimento do explante. Por essa razo, o cultivo de tecidos vegetais in vitro
deve ser feito em condies de mxima assepsia possvel.
6.2. ESTRATGIAS DE DESINFESTAO
Para reduzir os problemas de contaminao, necessrio realizar a desinfestao de
forma intensa e cuidadosa. De modo geral, quanto maior o explante, maior o risco de
contaminao. A desinfestao apenas permite a limpeza superficial do explante, sem eliminar
patgenos que estejam localizados internamente aos tecidos. Da a importncia de cultivar a
planta matriz sob excelentes condies fitossanitrias, para que os explantes fornecidos
contenham o mnimo de propgulos de microorganismos.
A dificuldade maior nesta etapa reside em se obter tecido descontaminado sem conduzilo morte quando isolado. So determinantes os pr-tratamentos aplicados na planta matriz
para o sucesso dessa etapa do trabalho, principalmente no que se refere aos microrganismos
endgenos.
Logo aps a coleta, os ramos de onde sero retirados os explantes devem permanecer
sob gua corrente durante algumas horas para promover lavagem superficial. Aps, procede-se
a retirada de parte das folhas e caule no aproveitveis, reduzindo assim a quantidade de
inculos. A limpeza do ambiente e dos materiais muito importante para viabilizar uma
desinfestao mais eficiente.
Vrias substncias com ao germicida so utilizadas para fazer a desinfestao dos
explantes. Os mais comuns so o etanol e os compostos a base de cloro, tais como o
hipoclorito de sdio e de clcio. Outros agentes desinfestantes usados incluem o clreto de
mercrio, o cido clordrico, o cloreto de benzacnio e o perxido de hidrognio. Tambm so
citados cidos ou bases concentradas, o mertiolate, outros tipos de lcool como o isopropanol e
algumas substncias do grupo das bases quaternrias, como os triquaternrios de amnio.
Alguns produtos oferecem resultados superiores para finalidades especficas.
Em geral, utilizam-se concentraes bastante elevadas das substncias para
desinfestao, o que implica em curto tempo de tratamento. Pode-se, entretanto, trabalhar com
concentraes mais baixas, devendo-se, por isso, aumentar o perodo de exposio. Alm disso,
considerando a sensibilidade do tecido a ser desinfestado, manipula-se a concentrao da
soluo e tempo de exposio de maneira inversamente proporcional. Alm da ao germicida,
o etanol surfactante, e, aplicado inicialmente, facilita ao dos outros produtos. O tempo de
exposio dos tecidos ao etanol , em geral, de algumas dezenas de segundos, mas, conforme a
sensibilidade destes tecidos, pode chegar a alguns minutos. Graduaes de etanol superiores a
80% podem desidratar os tecidos com facilidade. O tempo de exposio dos tecidos ao etanol
tambm depender da sensibilidade dos mesmos. Tecidos tenros, que oxidam facilmente, so
57

mergulhados em etanol 50 a 70% por alguns segundos. Em mdia, para a maioria dos tecidos,
este tempo pode variar de um a dois minutos. Excepcionalmente, em se tratando de sementes,
cujo tegumento ser removido aps a desinfestao, pode-se manter em etanol 80% por mais
tempo (5 a 10 minutos).
Para desinfestar segmentos nodais de Citrus sinsensis coletados no campo, Giladi et al.
(1979) aumentaram o tempo de imerso em etanol 80% de 0,5 para 5 minutos, elevando assim
a taxa de recuperao de culturas de 42% para 65%. No houve diferena em utilizar o etanol
antes ou depois da soluo de hipoclorito de clcio.
Juntamente com o etanol, o cloro o princpio ativo mais utilizado, em geral na forma
de hipoclorito de sdio, sendo facilmente encontrado em formulaes comerciais de gua
sanitria. O hipoclorito de clcio apresenta a vantagem de ser menos txico para os tecidos que
o sdio. As concentraes mais comuns variam de 0,5 a 2,0% de cloro ativo e o tratamento
dura at 50 minutos, no caso de tecido lignificado.
Quando o explante est protegido por outras camadas de tecido, concentraes e
tempos de exposies maiores podem ser utilizados. Como exemplo cita-se 5% de hipoclorito
de sdio, durante 60 minutos, tem sido utilizado para a desinfestao de frutos intactos de
tangerina Sunkai, visando extrao de sementes (Torres, Caldas & Buso, 1998).
Como procedimento padro na maioria dos laboratrios, aps o tratamento com etanol,
os tecidos vegetais so mergulhados em soluo de hipoclorito de sdio ou clcio com 1 a 2,5%
de cloro ativo. Os alvejantes comercializados para uso domstico possuem, em geral, 2 a 2,5%
de cloro ativo. Alguns produtos comerciais oferecem concentraes de at 12%, o que pode ser
vantajoso, uma vez que possibilita maior diluio, sem que a eficincia seja prejudicada.
Explantes cobertos de tricomas ou estruturas equivalentes requerem tratamentos mais
intensivos. Tecidos muito tenros e explantes de pequeno tamanho devem ser desinfestados
com maior cuidado.
Para aumentar o contato da soluo desinfestante com o material, utilizam-se misturamse soluo de hipoclorito algumas gotas de detergente concentrado, com isso, diminui-se a
tenso superficial do tecido, o que aumenta a penetrao do cloro e, conseqentemente a
eliminao de propgulos de microorganismos. O mais utilizado o Tween 20, sendo
necessrias apenas 4 a 10 goras por litro de soluo.
Tabela 6.1: Desinfestantes comumente usados em cultivo de tecidos de plantas
(Adaptado do catlogo da Sigma, 1990).
Desinfestante
Concentrao (%)
Tempo de exposio
(minutos)
Hipoclorito de clcio
9-10
5-30
Hipoclorito de sdio
0,5-5
5-30
gua oxigenada
3-12
5-15
lcool etlico
70-95
5-15
Nitrato de Prata
1
5-30
Cloreto de mercrio
0,1-1
2-10
Os cloretos de mercrio e benzacnio so outras possibilidades. O cloreto de mercrio
bastante txico e utilizado em concentraes inferiores aos hipocloritos. Gupta et al (1981)
desinfestaram gemas de Eucalyptus citriodora com cloreto de mercrio 0,05 % durante 15
minutos. O cloreto de benzacnio pouco txico aos tecidos e pode ser utilizado em
concentraes e tempos semelhantes aos hipocloritos. A Tabela 6.1 apresenta alguns

58

desinfestantes e suas respectivas concentraes e tempos de exposio, usados em cultivo de


tecidos.
Grigoletto et al. (1999) visando erradicar os contaminantes que surgiram na
micropropagao de mama-cadela (Brosimum gauchichaudii Trec.) retirou a polpa dos frutos e o
tegumento externo das sementes e tratou-as com etanol (70% v/v) e hipoclorito de sdio. Ele
observou que a contaminao das sementes aps inoculao em meios de cultivo variou de
acordo com o ano e o lote. No primeiro ano houve pouca contaminao, mas no segundo ano
de coleta, apareceram leveduras. Numa terceira coleta foi retirado o tegumento interno aps a
imerso em soluo de 0,25% de hipoclorito de sdio. Os mesmos autores observaram que nas
sementes deste tratamento inoculadas em meio MS (Murashige & Skoog, 1962) com 2% de
sacarose, no houve contaminao por fungos. Entretanto, 92% das sementes apresentaram
contaminao por trs tipos de bactrias. De acordo com os resultados obtidos, as sementes
desinfestadas com etanol (70% v/v) e hipoclorito de sdio, foram imersas em soluo aquosa
contendo tobramicina e kanamicina por 20 minutos e depois inoculadas em meio MS com 2%
de sacarose, contendo os dois antibiticos na concentrao de 30 mg L-1. Grigoletto et al. (1999)
observaram que aps 45 dias, uma das bactrias, para a qual os antibiticos tinham ao
bacteriosttica, contaminava 37% das sementes. Estes mesmos autores chegaram concluso
que o crescimento das plntulas que estavam em meio de cultivo contendo antibiticos foi mais
lento que no meio de cultivo sem antibiticos.
Posteriormente Grigoletto et al. (1999) inocularam explantes apicais e segmentos nodais
retirados de sementes contaminadas por leveduras em meio Knops a 50% contendo os
fungicidas Nistatina (1 ou 10 ml. L-1) ou Benlate (50 ou 100 mg L-1). Conclusivamente eles
observaram que as culturas tratadas com os fungicidas mostraram porcentagens de
sobrevivncia pouco superiores ao controle.
Aps o tratamento com o desinfestante, lavam-se os tecidos em gua autoclavada, por 3
a 5 vezes, sob condies asspticas. Desta forma, elimina-se a maior parte do resduo do cloro,
pois a manuteno do mesmo junto ao explante pode impedir a regenerao.
Com todos esses cuidados, ainda podem permanecer propgulos de microorganismos
viveis, o que ser percebido com alguns dias de incubao. Em geral, a contaminao por
fungos manifesta-se nos primeiros dias aps o estabelecimento. Contaminaes bacterianas,
entretanto, surgem mais tardiamente, em cerca de 1 a 3 semanas aps. Contudo, em alguns
casos, principalmente em tecidos de plantas lenhosas, colnias bacterianas surgem aps 30 a 40
dias desde a inoculao.
Problemas crnicos de contaminao podem ser amenizados adicionando-se fungicidas
e/ou bactericidas ao meio de cultivo. Porm, esta prtica nem sempre d bons resultados,
principalmente quando no so adotados critrios tcnicos para a escolha dos antibiticos, em
funo do tipo de organismo a ser controlado. Manejos adequados durante o tratamento da
planta matriz oferecem melhores resultados e diminuem o risco ao manipulador.
6.2.1. Reaes de hipersensibilidade
As reaes de hipersensibilidade (ou oxidao por compostos fenlicos) so provocadas
assim que os explantes so preparados. A injria dos tecidos estimula o metabolismo de
compostos fenlicos, produzindo substncias txicas ao explante, as quais difundem-se no
meio de cultivo. Este problema mais grave em isolamentos de explantes de espcies lenhosas,
pois esses tecidos so mais ricos em compostos fenlicos, muitos deles substncias precursoras
da sntese de lignina.
Para reduzir os problemas causados pela oxidao, algumas tcnicas so adotadas:
tratamento da planta matriz, alterao no meio de cultivo, adio de produtos antioxidades,
59

manejo do tecido desde a coleta at a incubao, controle de luminosidade e/ou oxigenao


dos tecidos, alm de outros.
6.3. ISOLAMENTO E ESTABELECIMENTO DOS EXPLANTES
O isolamento dos explantes deve ser realizado com a mxima higiene e desinfestao,
tanto do ambiente, como dos tecidos. Esta operao realizada em cmara de fluxo de ar
laminar estril. A forma como o explante manipulado determina o sucesso da regenerao do
tecido. Especialmente quando se trabalha com meristemas ou outros explantes de pequeno
tamanho.
Alm da desinfestao prvia, os utenslios utilizados para a manipulao e corte dos
tecidos devem ser mergulhados em etanol 96% e flambados periodicamente durante o
processamento do material. Esta operao impede que a contaminao presente em uma
poro do tecido seja disseminada para os demais explantes isolados. Aps cada flambagem,
deve-se aguardar o resfriamento dos instrumentos para que a alta temperatura no prejudique
os explantes. Esse processo pode ser otimizado utilizando-se utenslios sobressalentes, ou seja,
enquanto alguns instrumentos recm flambados resfriam, outros so utilizados, e vice versa.
Os cortes nos tecidos devero ser executados com bisturis novos e bem afiados. Assim,
o isolamento do explante ocorre sem injrias excessivas.
Explantes muito pequenos, como pices caulinares, embries, etc, so isolados com o
auxlio de microscpio estereoscpio. A manipulao desse equipamento dever ser feita no
interior da cmara de fluxo estril, o qual dever passar por uma prvia desinfestao, visandose com isso evitar a introduo de inculos e, conseqentemente a contaminao dos explantes.
Como forma de auxiliar na manuteno da assepsia do laboratrio, algumas regras
devem ser respeitadas. A principal delas a restrita utilizao dos equipamentos e utenslios do
laboratrio, ou seja, todo material utilizado para os trabalhos com cultivo de tecidos, no deve
ser manipulado para outras finalidades. Outra prtica que favorece a manuteno da assepsia
o uso obrigatrio de aventais limpos, os quais no devem ser retirados do laboratrio. Em
algumas situaes, em que a casa de vegetao prxima ao laboratrio, recomenda-se o uso de
aventais especficos para cada ambiente.
Durante dias chuvosos ou com elevada umidade relativa no ar, os riscos de introduo
de microorganismos no laboratrio so potencializados. Uma forma de evit-los restringir ao
mximo a circulao de pessoas no laboratrio durante esses perodos, principalmente naqueles
laboratrios abertos visitao.
6.4. FATORES QUE INFLUENCIAM NO DESENVOLVIMENTO DO EXPLANTE
Aps a inoculao do explante em frascos contendo meio de cultivo, devem-se manter
condies adequadas de iluminao, temperatura e umidade, visando otimizao das respostas
aos estmulos termo e fotoperidicos.
Dependendo da espcie, o explante do tecido original pode ser obtido do pice caulinar,
gema lateral, caule, ou tecido radicular, sem que a planta matriz seja destruda.
6.4.1 Gentipo
O crescimento de tecidos de rgos cultivados e a morfognese in vitro so mais
influenciados pelo gentipo que por qualquer outro fator.
Embora metodologias gerais possam ser estabelecidas para cultivo de tecidos vegetais
em geral, mesmo variedades extremamente relacionadas podem diferir em suas exigncias.
60

Em alguns gneros, a taxa de sobrevivncia dos explantes em cultura pode depender de


diferenas aparentemente secundrias no gentipo das plantas matrizes. Observam-se
diferenas na capacidade de explantes crescerem in vitro entre espcies de plantas bastante
aparentadas e at mesmo entre plantas de uma mesma espcie. A micropropagao de espcies
lenhosas altamente dificultada por fatores genticos.
As plantas variam consideravelmente na sua habilidade em produzir brotos adventcios
diretamente em tecidos seccionados. Em geral, o sucesso in vitro est estreitamente relacionado
com a facilidade com que os brotos adventcios podem ser regenerados naturalmente, apesar de
que, sob condies controladas e condies livre de doenas, o potencial morfognico das
espcies ampliado e os brotos so produzidos mais livremente do que seriam por outros
modos. Espcies que produzem bulbos parecem ser universalmente capazes de produzir brotos
adventcios da parte basal de bulbos explantados.
6.4.2. Efeito do Ambiente
6.4.2.1. Tenso de oxignio
Trocas de gs entre o exterior e o interior do frasco de cultivo e destes para os
explantes, so devidos, principalmente a flutuaes na temperatura e presso atmosfrica na
sala de crescimento. A maior parte da troca de oxignio e outros gases devida difuso. O
oxignio disponvel dentro dos tecidos cultivados , portanto, influenciado pela concentrao
de gases na atmosfera do ambiente, pela sua taxa de difuso para dentro do frasco de cultura e
pela sua taxa de difuso para dentro das clulas ou tecidos cultivados.
A concentrao ser mais prxima daquela da atmosfera ambiente quando o tecido ficar
livre do meio e estiver envolvido por um filme mnimo de umidade ou meio. Tecidos ou rgos
submersos em um meio esttico so muito pouco arejados.
A forma mais simples de influenciar o suprimento de oxignio cultura de tecidos
alterar a concentrao na atmosfera externa. Se o ar esterilizado, ou uma mistura de gases,
introduzido diretamente no recipiente de cultura, os problemas de difuso de gs no ocorrem.
Todavia, com culturas no ventiladas que crescem em recipientes lacrados, a concentrao do
oxignio ao nvel do meio ou dos tecidos pode ser muito menor do que a encontrada
externamente. Isto se d porque o uso de oxignio pela cultura cria um dficit que no pode ser
imediatamente compensado por causa do impedimento difuso criado pela vedao,
especialmente se esta for forte e impermevel. O formato do recipiente de cultivo influencia a
difuso gasosa.
As folhas de brotaes podem absorver oxignio da atmosfera circundante como fariam
in vivo. Extremidades apicais sobre papel filtro mantido acima de um meio lquido so
provavelmente melhor arejadas do que se fossem colocados em um meio slido. O oxignio
apenas moderadamente solvel em gua. Assim, o aumento da temperatura da cultura de 21C
para 25oC diminuir a quantidade mxima de oxignio em um meio em aproximadamente 9%.
H evidncias de que o nvel timo ou os menores nveis tolerveis podem variar de
acordo com a espcie de planta e o tipo de cultivo. O crescimento e desenvolvimento so
dependentes da respirao. Isto pode ocorrer por vrias rotas bioqumicas. A mais comum a
via do Ciclo de Krebs, que ocorre tanto na luz como no escuro, embora seja normalmente
chamada respirao no escuro para distingu-la da fotorrespirao. A respirao do Ciclo de
Krebs exige oxignio: sua taxa em geral diminui imediatamente medida que a concentrao do
oxignio cai abaixo da concentrao do ar atmosfrico. Por outro lado, a respirao de alguns
tecidos de plantas pode mesmo aumentar medida que o nvel de oxignio aumentado acima
da concentrao atmosfrica normal.
61

A taxa de crescimento de plantas pode ser diminuda ao limitar-se o suprimento de


oxignio (hipoxia). Em um ambiente natural, as razes frequentemente tm de crescer em baixas
tenses de oxignio. Assim, cultivos de raiz parecem tolerar nveis relativamente baixos de
disponibilidade de oxignio.
A taxa de absoro de sacarose, nitrato e outros ons pelas razes ou tecidos
desorganizados reduzida em condies de hipoxia, embora o suprimento de nitrognio no
limite o crescimento. As clulas morrem quando o nvel de oxignio cai abaixo de um nvel
crtico, criando-se um quadro de anoxia.
Trocas gasosas adequadas so essenciais para assegurar uma rpida taxa de multiplicao
na maioria das culturas, porm a taxa satisfatria de crescimento pode ser obtida quando a
concentrao de oxignio dissolvido est abaixo do ponto de saturao aerbica. Existem
vrios trabalhos que indicam que a reduo na presso parcial de oxignio pode ser usada para
regular o crescimento e desenvolvimento em cultivo de tecidos.
A natureza de diferenciao de clulas em cultivo tambm pode ser regulada pela
concentrao de oxignio disponvel.
A tenso de oxignio do meio pode ser um fator que determina a organognese e o
posterior crescimento de brotaes. possvel que haja uma concentrao de oxignio tima
para a formao de primrdios de brotos mltiplos em meristemas cultivados.
6.4.2.2. Dixido de Carbono
Todos os tecidos cultivados produzem dixido de carbono (CO2) durante a respirao,
da qual dependem seu metabolismo e crescimento. O gs somente incorporado em
quantidades significativas por clulas ou tecidos fotossinteticamente ativos. O substrato
primrio para a obteno do C da maioria dos tecidos in vitro o carboidrato (normalmente
sacarose) adicionado ao meio.
Conforme a dependncia da fonte de energia, os tecidos podem distinguir-se em:
Heterotrficos - tecidos que so completamente dependentes de fonte de energia;
Mixotrficas - aqueles que necessitam parcialmente de sacarose no meio e compostos
produzidos atravs da fotossntese;
Autotrficas - aquelas que podem se sustentar totalmente atravs da fotossntese.
A quantidade de fotossntese realizada pela cultura determina se mixotrfica ou
autotrfica.
A concentrao de CO2 no ar de cerca de 0,035%; j dentro da sala de crescimento
normalmente de 0,04 a 0,08%. O nvel dentro do frasco de cultivo no ser necessariamente o
mesmo que o da atmosfera externa devido difuso do CO2 e outros gases fisiologicamente
ativos. Dentro e fora dos tecidos cultivados, o teor de CO2 ser dependente dos mesmos
fatores que controlam a disponibilidade de oxignio. A respirao de tecidos no
fotossinteticamente ativos pode causar aumento dos nveis de CO2.
Desde que recebam dixido de carbono e luz suficiente, os brotos ou as plantas in vitro
so capazes de assimilar carbono suficiente para permanecer autotrficos. Taxas inadequadas
de fotossntese in vitro ou a presena de acar fazem com que os tecidos ou rgos verdes
tornem-se mixotrficos.
O crescimento heterotrfico comum em cultivos convencionais de brotos. As folhas
tornam-se modificadas e podem no ser fotossintticamente competentes quando transferidas
para um ambiente sem acar ou transferidas para a aclimatizao.
6.4.2.3. Tamanho do recipiente
62

O crescimento e a morfognese in vitro podem ser influenciados pelo volume do


recipiente usado. Estes efeitos so, provavelmente, devido a diferentes concentraes de
oxignio, dixido de carbono, etileno e outros compostos. Diferentes tamanhos de recipientes
em geral diferem nas relaes explante-meio, explante-ar e meio-ar. O formato do recipiente
pode tambm influenciar a taxa de crescimento das culturas modificando a taxa de difuso de
gases.
Foi demonstrado que impossvel recomendar tamanhos de vasos para um tipo particular de
procedimento de micropropagao sem experimentao prvia. O melhor tamanho e formato
do recipiente varia de uma espcie para outra e depende de fatores como material do qual o
recipiente feito (vidro ou material plstico permevel a gs), o tipo de tampa, o volume de
meio ou a densidade do inculo.
6.4.2.4. Temperatura
A temperatura mdia das salas de crescimento de 25oC. As plantas tropicais e
subtropicais tendem a ser cultivadas em temperaturas levemente mais altas do que espcies
temperadas (mdia de 27,7oC). Quando uma variao diurna-noturna desejada, normalmente
se adota o seguinte: 25C durante o dia, 20C noite, ou 28C/24C.
A organognese geralmente mxima em uma faixa estreita de temperatura, a qual varia
conforme a espcie. A morfognese frequentemente influenciada pela temperatura na qual a
planta me foi mantida anteriormente. A formao de razes adventcias em brotos tambm
dependente da temperatura. Em muitas plantas, a induo de razes em microestacas de brotos
produzidos in vitro parece requerer uma temperatura ligeiramente menor que a necessria para a
multiplicao e crescimento de brotos. Em plantas de batata, ao menos dez vezes mais
tubrculos so formados in vitro a uma temperatura constante de 20C que a 28C ou a
temperaturas diurnas de 27C e noites mais frias. Em espcies bulbosas, temperatura pode
causar a paralisao do crescimento de brotos, um tipo de dormncia que exige um tratamento
a frio para revert-la.

6.4.2.5. Luz
A luz uma fonte de radiao eletromagntica essencial para o crescimento e
desenvolvimento das plantas. O espectro eletromagntico estende-se dos comprimentos de
onda muito curtos correspondentes aos raios csmicos at comprimentos de onda longos,
como as ondas de rdio. A luz visvel a poro da radiao eletromagntica perceptvel pelo
olho humano, com comprimento de onda entre 380 a 760 nm.
A luz geralmente medida por instrumentos (radimetros, fotmetros e
espectrorradimetro). Vrias unidades tm sido usadas para comparar a qualidade da
iluminao emitida por uma fonte de luz. O radimetro mede a quantidasde de energia radiante
que incide na superfcie do detector. As doses de luz so expressas em termos de energia por
unidade de rea, por exemplo, no sistema SI o joule (J) por m-2. A intensidade de luz ou
irradincia, que corresponde densidade do fluxo de energia pode ser expressa como energia
por unidade de rea por unidade de tempo, ou seja, J.m-2.S-1, ou como potncia por unidade de
rea, isto W por m-2, onde 1 W (watt) corresponde a 1 J.S-1. Essa unidade empregada
quando se trabalha com o balano de energia da planta, da folha da planta ou de uma casa de
vegetao.

63

O fotmetro mede a iluminao de uma superfcie por luz branca em unidades de lux ou
lumens. Nesse caso a qualidade da luz definida de maneira equivalente da medida de
irradincia no sistema padro de energia.
A influncia da luz no cultivo in vitro pode ser direta, atravs da ao sobre o tecido que
j est crescendo in vitro, ou indireta, atravs da influncia da luz sobre a planta matriz.
As plantas podem seguir duas estratgias de desenvolvimento, dependendo se estiverem
crescendo na presena ou ausncia de luz. No escuro, as plantas investem no alongamento
rpido do caule ficando estioladas, no h expanso foliar e nenhum aparato fotossinttico
funcional formado; a exposio luz induz uma rpida mudana na expresso gnica, levando
a um padro normal de desenvolvimento.
6.4.2.5.1 Qualidade da luz
A qualidade do espectro da lmpada utilizada de suma importncia na morfognese in
vitro. Em geral, para induo de parte area a regio do azul do espectro crtica e a luz
vermelha no apresenta efeito. Entretanto, outros autores, salientam a importncia da luz
vermelha na formao de brotaes adventcias em cultivo de tecidos.
Em plantas lenhosas ornamentais, a utilizao de lmpadas de vapor de sdio promoveu
formao de maior nmero de brotaes em cultivo de pices caulinares. Entretanto, as
lmpadas recomendadas para illuminao das culturas in vitro so do tipo fluorescentes brancas
fria, plantilux ou com emisses balanceadas nas regies do azul (430 nm) e vermelho (660 nm).
Assim, em cultivo de tecidos, quando se objetiva a multiplicao de plantas, as lmpadas
devem conter emisses nessas regies.
Lmpadas fluorescentes so utilizadas quase universalmente para fornecer luz para as
culturas. Elas tm a vantagem de proporcionar iluminao sem gerar muito calor. Lmpadas
incandescentes so s vezes utilizadas para complementar a luz fluorescente no espectro do
vermelho, mas isso nem sempre desejvel. As salas de crescimento para micropropagao so
equipadas com lmpadas de luz branca fria.
6.4.2.5.2. Intensidade luminosa
As condies de incubao podem variar muito. Escuro total ou intensidades de luz
reduzidas so teis nos primeiros dias aps o isolamento para reduzir a oxidao fenlica. O
incio da cultura no escuro tambm indicado para evitar estresse em alguns explantes, como
meristemas de rizomas, bulbos e razes.
Estudo realizados por Murashige (1977) mostraram que a fase inicial de
desenvolvimento do explante in vitro (estdio I) requer baixa intensidade luminosa (at 1000
lux), emitidas por lmpadas Gro-lux. Na fase de multiplicao de parte area (estdio II) as
exigncias foram de 1000 a 3000 lux e no estgio III (pr-transplante, aclimatizao),
recomendou-se de 3000 a 10000 lux.
Em Grbera a intensidade luminosa tima para iniciao de parte area foi de
aproximadamente, 1000 lux. Intensidade luminosa de 300 lux inadequada, muito embora
algumas brotaes podem ser produzidas no escuro.
A luz de baixa irradiao na cultura de tecidos vegetais utilizada pelas seguintes razes:
a) o fornecimento de altos nveis de luz artificial caro e gera calor no desejado; b) as culturas
em ambientes lacrados tornam-se superaquecidas em altas irradiaes devido ao efeito estufa, e
c) a tecnologia de cultivo de tecidos vegetais evoluiu usando tecidos no autotrficos supridos
com carboidrato.
64

6.4.2.5.3. Perodo de exposio diria a luz - Fotoperodo


O fotoperodo influencia as plantas de duas maneiras: pela regulao da quantidade de
energia radiante captada e atravs de um mecanismo controlador, pelo qual as plantas so
capazes de reconhecer mudanas no ambiente, e pela durao do dia, que pode influenciar
nveis de reguladores do crescimento naturais dentro de tecidos de plantas cultivadas.
Geralmente, constata-se que plantas cultivadas em fotoperodo longo mostram um teor de
auxina mais alto do que aquelas cultivadas em dias curtos, independente da exigncia
fotoperidica da planta para florescer. Pode ocorrer tambm interao do fotoperodo com a
temperatura.
Para timo crescimento e desenvolvimento dos explantes in vitro as exigncias em
fotoperodo das culturas devem ser satisfeitas. O incio de determinado processo
morfogentico s se manifesta quando as culturas esto expostas a um adequado comprimento
do dia. Em geral, 16 horas de fotoperodo tem-se mostrado satisfatrio para vrias espcies de
plantas, utilizando-se lmpadas fluorescentes banco fria ou Grolux, com intensidade luminosa
de 1000 lux. A manuteno das culturas sob iluminao constante no recomendada.
6.4.2.5.4. Quantidade total de energia
Vrios estudos tm mostrado que essa varivel parece estar associada com o fotoperodo
dentre outros fatores. Em cultivo de tecidos de Brssica, o fotoperodo timo foi de 9 horas
associado com 4000 lux de intensidade luminosa (Margara, 1969). Esses resultados sugerem que
perodos de exposio curtos podem ser suficientes quando alta intensidade luminosa for
empregada. Ao contrrio, perodo de exposio longo, pode ser usado com baixa intensidade
luminosa.
As lmpadas fluorescentes podem ser instaladas de duas maneiras: montadas na parte
superior das prateleiras, acima das culturas ou lateralmente s culturas com as lmpadas
instaladas em suporte vertical.
6.4.2.6. Umidade relativa
Ela expressa a relao entre o vapor de gua que um determinado volume de ar pode
conter e o que este poderia conter quando saturado, em uma dada temperatura. Em cultivo de
tecido, essa varivel nem sempre considerada. A umidade relativa da mistura gasosa (ar) acima
do meio, em um frasco de cultivo, depende da sua temperatura e da temperatura do meio.
Quando a temperatura do ar iguala a do meio e o frasco esta vedado, a umidade relativa pode
estar na faixa de 98 99,5%. O ar torna-se mais saturado se a temperatura do meio exceder a
do ar. Entretanto, a umidade relativa decrescer se ocorrer troca do vapor de gua do frasco de
cultivo com a sala de crescimento.
Portanto pouco se sabe a respeito da umidade da sala crescimento. Baixa umidade
relativa da sala pode influenciar a perda gua dos recipientes usados para cultivo, enquanto que
alta umidade pode aumentar a contaminao.
6.4.2.7. Trocas gasosas
Uma boa aerao parece ser necessria para cultivo in vitro. As plantas produzem
oxignio, gs carbnico, etileno, audedo e outros compostos volteis. Na natureza, estes
compostos so dissipados na atmosfera. Em cultivo de tecidos, esses gases podem ficar retidos
no frasco, alterando o desenvolvimento das plantas. A acumulao de CO2 em altas
65

concentraes conduz anaerobiose, fermentao e produo de lcoois. Em alguns casos,


altas concentraes de gs carbnico induzem distrbios no crescimento e desenvolvimento da
planta in vitro.
6.4.3. Efeitos do explante
6.4.3.1. Planta matriz
As plantas usadas como fonte de explantes primrios para cultivo de tecidos so
normalmente denominadas plantas matrizes (ou, erroneamente, plantas-mes). Os resultados
obtidos in vitro podem ser influenciados pela forma que as plantas matrizes so tratadas e pelo
ambiente em que elas cresceram. Sabe-se que o melhor explante proveniente de plantas sadias
e vigorosas que so mantidas em estado ativo de crescimento, sem estresse. As plantas que
crescem no campo esto sujeitas a altas taxas de contaminao e a um ambiente varivel. Para
obter-se material uniforme para explantes h claras e frequentes vantagens em desenvolver-se
plantas em salas de crescimento sob condies controladas. Se isto no for possvel, ento uma
casa de vegetao usualmente uma alternativa satisfatria. Espcies herbceas so facilmente
tratadas desta forma, mas tm sido experimentadas dificuldades com muitas espcies lenhosas.
Em alguns casos, a forte de contaminao de um tipo de explante pode justificar a busca de
outra tcnica de micropropagao usando outro tipo de explante que seja menos contaminado
ou mais facilmente desinfestvel.
H vrios aspectos relacionados com a planta matriz, sendo os principais:
- Nutrio mineral: adequada nutrio mineral da planta matriz, o que deve ser feito de
acordo com a exigncia de cada espcie e estdio vegetativo;
- Estado fitossanitrio: a presena de pragas ou doenas so razes para rejeitar as
plantas matrizes, pois os patgenos que as infectam so capazes de causar a morte da cultura in
vitro. Em geral, a infeco da planta matriz reduz o nmero e tamanho das brotaes.
Semelhantemente, a produo de brotaes axilares e o nmero de plantas finalmente
estabelecidas tendem a ser menores em cultivos infectados. Algumas associaes patgenohospedeiro no apresentam sintomas em casa de vegetao ou no campo, mas podem resultar
em pobre crescimento in vitro.
- poca de coleta: sabe-se que poca de coleta causa efeito sobre o estabelecimento e
crescimento dos explantes. Alteraes na temperatura, comprimento do dia, qualidade da luz e
estresse hdrico ao longo do ano resultaro em plantas com nveis alterados de carboidratos,
protenas e reguladores de crescimento endgenos. A idade relativa dos tecidos e rgos alterase medida que avanam as estaes de crescimento e o nvel de contaminao encontrado em
explantes, especialmente aqueles coletados de plantas crescendo no campo. Portanto, de se
esperar que os resultados da cultura de tecidos variem de acordo com a poca do ano em que
explantes so excisados, ou de acordo com as condies artificiais sob as quais as plantas
matrizes so desenvolvidas.
Geralmente, os cultivos so estabelecidos mais facilmente a partir de explantes coletados
no incio ou durante o crescimento ativo da planta matriz, mas a melhor poca do ano para
coleta pode depender do tipo de cultivo a ser produzida, do gentipo em particular a ser
utilizado e da quantidade relativa de contaminao e oxidao dos explantes que ocorrem em
cada estao. A melhor poca para coleta usualmente quando as plantas matrizes esto
produzindo novas e vigorosas brotaes (ou seja, em regies de clima temperado, na primavera
e incio do vero), mas muitas excees tm sido observadas. Algumas vezes, o efeito da poca
do ano em que os explantes so colhidos pode persistir por algum tempo durante o cultivo in
vitro.
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Figura 6.1: Brotao juvenil emitida aps poda drstica em Rubus idaeus cultivado em
casa de vegetao (Imagem: CSFior, JB/FZB-RS).
Cortes drsticos das plantas matrizes induzem o crescimento de brotaes juvenis
(Figura 6.1). Quando for iniciado o cultivo de brotaes, pode ser tambm vantajoso podar as
plantas para obter uma boa quantidade de novas brotaes contendo gemas jovens, menores e
menos contaminadas.
O crescimento a 22oC e 12 horas de alta irradiao foi observado como sendo o mais
eficiente tratamento da planta me para obter o crescimento e formao de brotaes em
segmentos nodais de Eucalyptus. Plantas matrizes de tomateiro desenvolvidas sob intensidade
de luz reduzida deram as mais elevadas produes de protoplastos. Os efeitos indutivos do
comprimento do dia podem ser transmitidos da planta matriz para dentro do cultivo, mas
usualmente a ao direta do comprimento do dia mais importante. Em alguns gneros, o
enraizamento ocorre mais facilmente em brotaes colhidas de plantas mantidas sob dias
longos ou, como ocorre em Acer rubrum, quando as plantas matrizes so mantidas sob
iluminao. Estacas de outros gneros enrazam mais facilmente quando as plantas matrizes das
quais elas so obtidas so mantidas sob dias curtos.
Reguladores de crescimento aplicados a plantas matrizes intactas antes da retirada dos
explantes, a exemplo de giberelinas e citocininas com frequncia induzem algum grau de
rejuvenescimento em plantas lenhosas, facilitando a cultura in vitro e induzindo, com frequncia,
a quebra de dormncia de gemas axilares e aumentando o nmero de brotos dos quais os
explantes podem ser tirados. O tratamento de plantas matrizes com citocininas pode aumentar
o nmero de gemas, propiciando mais brotos para retirada de explantes. Folhas de petnia
mergulhadas em soluo de BAP (por exemplo, 3 segundos em 400 mg L-1l) originaram brotos
adventcios quando os segmentos das folhas foram, mais tarde, cultivados em meio livre de
citocinina. Os resultados foram semelhantes aos obtidos quando a citocinina foi incorporada ao
meio. O pr-tratamento de plantas de trigo com pulverizao de 2,4-D e vrios outros
herbicidas durante a primeira semana de desenvolvimento do embrio causou a formao
mltipla de brotos dos embries num estgio posterior. Isto pode ocorrer atravs da formao
in vitro de embries adventcios.

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- Capacidade regenerativa do explante: Em geral, os explantes tirados de rgos


recentemente originados so mais capazes de originarem o crescimento e a organognese in
vitro.
Embora em algumas espcies os explantes de muitos rgos sejam capazes de produzir
brotos adventcios, em geral, constata-se que estes variam na capacidade morfogentica. A
posio do explante exerce influncia sobre suas respostas morfogenticas. Gemas semelhantes
do pice e da base de uma planta comportam-se diferentemente in vitro, como, por exemplo, em
Topophysis. Explantes de diferentes origens reagem a reguladores de crescimento de maneiras
distintas. O tempo para mostrar resposta pode tambm variar. A dosagem tima de reguladores
de crescimento para induzir morfognese frequentemente varia de acordo com o tamanho e o
tipo de explante de uma nica planta.
Em geral, h um tamanho timo de explantes para iniciar uma cultura de tecidos.
Explantes muito pequenos, sejam extremidades de brotos, meristemas, fragmentos de tecidos
de plantas inteiras ou pedaos de calos, no sobrevivem bem em cultura, porm explantes
grandes podem ser difceis de descontaminar ou serem menos facilmente manipulados. A
morfognese direta e indireta em explantes tambm frequentemente depende do tamanho do
explante.
Mtodo de cultivo: h uma densidade de inoculao mnima para induzir o crescimento
de clulas ou tecidos in vitro e esta densidade afeta a diferenciao de clulas na morfognese ou
proliferao de brotos. Quanto menor o tamanho de um explante ou o nmero de explantes
em uma determinada quantidade de meio, maior deve ser a disponibilidade de nutrientes aos
tecidos cultivados; porm um alto volume de meio por explante pode no necessariamente
resultar na melhor taxa de propagao.
O crescimento ou morfognese de explantes pode ser influenciado pela maneira que o
explante colocado dentro ou sobre o meio. Os efeitos notados podem s vezes ser devido
polaridade, e em outras ocasies podem ser atribudos ao efeito do posicionamento sobre a
disponibilidade de nutrientes e reguladores de crescimento quelas partes do explantes que so
competentes.
Ferimento: os ferimentos em plantas estimulam a formao de calos e/ou morfognese.
Todos os explantes transferidos para cultivo esto sujeitos a ferimentos durante seu isolamento.
Quanto menor o explante, maior a proporo de superfcie ferida. Em muitos casos, as leses
causam a liberao de substncias inibidoras, porm tambm induz a produo natural de gs
etileno que frequentemente propicia estmulos formao de tecidos no-organizados ou
brotos e razes adventcias.

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Captulo 7
Limpeza clonal
7.1. INTRODUO
Uma vez caracterizada a importncia de uma planta, seja pela produtividade ou pelo
vigor, interessante que essa caracterstica possa ser reproduzida por cruzamentos ou ento
mantida por tcnicas de propagao vegetativa, submetendo-a a testes clonais e em seguida a
plantios comerciais.
A contaminao dos propgulos por patgenos pode apresentar-se como um problema
para a propagao vegetativa. Provavelmente todas as espcies propagadas vegetativamente
esto infectadas com um ou mais patgenos. Esses patgenos so transmitidos e acumulados
com propagaes sucessivas e podem manifestar-se na planta infectada como reduo do vigor
e da produtividade.
As doenas de plantas so causadas principalmente por fungos, nematides, bactrias e
vrus. Entre estes patgenos os vrus latentes so os mais abundantes, principalmente por serem
de difcil constatao e por no apresentarem sintomas visuais. Medidas efetivas de controle
qumico so aplicadas para a maioria das doenas, exceto para aquelas causadas por algumas
bactrias e pelos vrus.
Geralmente os vrus no so transmitidos para a semente, mas tendem a se acumular em
plantas que so propagadas vegetativamente.
Na falta de um produto qumico capaz de erradicar vrus de plantas infectadas, tcnicas
de cultura de pices caulinares vm sendo utilizadas desde 1952 para eliminao desses
patgenos, a fim de obter material de multiplicao com alta qualidade fitossanitria.
7.2. VRUS
Os vrus so organismos microscpicos de organizao simples e dependentes de seres
vivos para se multiplicarem. So constitudos de e um genoma muito pequeno, apenas um tipo
de cido nuclico (DNA ou RNA), envolto em uma capa de protena.
Ao penetrar na clula hospedeira faz com que os processos metablicos celulares
vegetais sejam realizados para a sntese de seus cidos nuclicos protenas.
As doenas virais so na sua maioria transmitidas de uma planta a outra principalmente
por insetos e nematides. Insetos sugadores, como afdeos ou cigarrinhas, transmitem
regularmente os vrus de uma planta a outra, medida que eles se alimentam, sugando a seiva
do floema e mudando de uma planta para outra.
As necroses e os mosaicos so os sintomas causados por vrus mais conhecidos.
Caracterizam-se por reas verde-claras ou amarelas, podendo variar em tamanho desde
pequenas manchas at amplas faixas, tanto em folhas como em outras reas verdes. s vezes
toda a planta infectada pode apresentar-se de colorao verde mais clara que o normal.
As doenas virais reduzem intensamente a produtividade de muitas das diversas culturas
em todo o mundo e grande esforo tem sido feito para descobrir maneiras eficientes de
control-las.
Os sintomas de degenerescncia nos cultivares de plantas propagadas, causados por
infeco viral so: a)Reduo do porte, b) Reduo da espessura e largura da folha, c) Queda de
produtividade e, d) Plantas mais susceptveis s adversidades do meio.
O controle das viroses em plantas pode ser realizado em hospedeiros, vetores e na
prpria planta, isoladamente ou em conjunto.
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A produo de plantas livres de vrus atravs de cultura de pices caulinares um dos


mtodos altamente eficazes no controle das infeces virais.
7.2.1. Transmisso de vrus em plantas
Ainda que os vrus de plantas no possuem meios para penetrar na clula hospedeira,
diversas maneiras podem transmiti-los de plantas infectadas para as sadias: a) Enxertia; b)
Transmisso mecnica: poda, capina, desbrotas, etc...; c) Insetos e caros: principais vetores de viroses
de plantas (pulges, cigarrinhas, moscas brancas); d) Nematides: os principais pertencem ao
gnero Longidorus e Xyshinema, que transmitem o vrus da folha em leque da videira (Grapevine
Fanleaf Virus ou GFLV) e o Trichodorus; e) Fungos; f) Plen e vulo: transmisso atravs de
gametas masculinos ou femininos. Os vrus so transmitidos prxima gerao por sementes.
A transmisso por semente rara, ocorrendo com poucos vrus e em baixa intensidade.
7.2.2. Preveno da transmisso
O controle de viroses em plantas deve ser efetuado em hospedeiros, vetores e na
prpria planta, isoladamente ou em conjunto.
A. Hospedeiros
A eliminao de plantas hospedeiras reduz drasticamente o aparecimento de viroses.
Outra medida importante o uso de sementes ou material propagativo (estacas, borbulhas)
isentas de vrus. Desta maneira, o material propagativo deve ser proveniente de plantas matrizes
cuja sanidade seja comprovada atravs de testes de indexao.
B. Vetores
No caso de insetos voadores, o uso de isolamento geogrfico, barreiras fsicas (telados),
controle qumico ou biolgico pode reduzir significativamente a incidncia das viroses. A
cobertura do solo com materiais como tiras de alumnio, casca de arroz, repelem certos insetos
vetores, que deixam de infestar a cultura. O homem pode atuar como veto disseminando
viroses atravs de prticas como enxertia, poda, capina, amarrio e uso de ferramentas
contaminadas.
C. Espcie vegetal de importncia
A soluo eficiente utilizar plantas que sejam imunes ou resistentes ao vrus. Outro
mtodo que tem produzido resultados satisfatrios a pr-imunizao ou o uso do princpio da
proteo cruzada. Uma planta infectada por uma estirpe de um vrus dificilmente infectada
por outra estirpe. Assim, a pr-imunizao consiste em infectar uma planta com uma estirpe
fraca de um vrus, evitando que estirpes mais severas a infectem. Essa tcnica tem sido usada
desde a dcada de 1960 com grande sucesso em citros para controle do vrus da tristeza.
A utilizao de clones nucelares em citricultura contribuiu significativamente para a
eliminao de viroses, porque a propagao atravs de sementes impede a transmisso das
mesmas. Porm, plantas nucelares apresentam caractersticas de juvenilidade, e no so
possveis em variedades monoembrinicas ou sem sementes.
7.2.3. Limpeza de material vegetal infectado
Talvez esta seja a aplicao mais amplamente utilizada da cultura de tecidos em plantas,
principalmente daquelas que se propagam vegetativamente, as quais, a cada gerao vo
apresentando disseminao e agravamento das viroses, culminando com acentuada reduo na
produtividade e qualidade dos produtos.

70

Para tanto, podem ser utilizadas vrias tcnicas de limpeza de viroses, tais como: cultura
de meristemas, microenxertia e termoterapia, cuja eficincia deve ser testada atravs da
indexao.
7.2.3.1. Cultura de pices caulinares ou meristemas apicais
A cultura de pices caulinares (tambm chamados de meristemas) uma estratgia para
o estabelecimento de estoques de plantas matrizes livres de vrus. Esse mtodo baseia-se na
premissa de que a concentrao desse patgeno distribui-se no uniformemente na planta
infectada. A estratgia consiste em reproduzir in vitro plantas a partir de tecidos supostamente
livres de vrus.
Considera-se meristema apical o tecido que se encontra distal ao mais novo primrdio
foliar, tendo o aspecto de uma cpula proeminente ou plataforma achatada, estando algumas
vezes, sobre uma depresso. Seu tamanho no excede 0,1mm. As clulas desse tecido tm a
propriedade de permanecerem na condio embrionria e, por meio de atividades
morfogenticas complexas, dar origem ao eixo vascular, folhas, gemas, rgos de reproduo e
outras estruturas laterais (Clark, 1997).
A regio meristemtica a nica parte da planta no infectada por vrus. Assim sendo, a
cultura do meristema propriamente dito, acompanhado de dois ou trs primrdios foliares,
permite a regenerao de plantas isentas de viroses.
Quanto maior o nmero de primrdios foliares, tanto mais facilmente se obter uma
planta, porm, tanto mais dificilmente esta planta ser isenta de viroses e vice-versa.
Ao se iniciar a cultura a partir de um meristema, h maior probabilidade de se manter o
gentipo original sem variao, ao mesmo tempo em que se efetua a limpeza clonal,
eliminando-se vrus e outros organismos sistmicos.
Esta tcnica foi utilizada pela primeira vez por Ball (1946), para regenerar plantas de
Tropaelum majus e Lupinus albus a partir da cultura do pice caulinar com 2 ou 3 primrdios
foliares.
Existem vrias hipteses que procuram explicar o fato de que um meristema origina
uma planta livre de vrus, dentre elas:
A. A ausncia de tecidos vasculares no meristema evitaria que o mesmo fosse atingido
pelo vrus;
B. No meristema, a competio entre a produo de partculas de vrus e a intensa
produo de clulas dificultaria a proliferao dos mesmos. Durante a diviso celular, a
capacidade para sntese de cidos nuclicos estaria sendo utilizada para a produo de clulas,
em detrimento da multiplicao de vrus.
Os exemplos mais notveis do uso da cultura de meristemas no Brasil se verificam com
o morango. O morango cultivado na regio de Pelotas/RS, apresenta uma produtividade mdia
de 3t/ha; alguns produtores que passaram a utilizar mudas obtidas por cultura de meristemas,
registraram uma produtividade mdia elevada para 12 t/ha e casos extremos at 22 t/ha.
Em inmeras outras espcies, a exemplo da macieira, pereira e videira, tem sido possvel
contornar o srio problema apresentado pelas viroses, atravs da regenerao de plantas, tanto
porta-enxertos como copas, por cultura de meristemas. A cultura de meristemas em bananeira
tem sido utilizada para a obteno e intercmbio de material propagativo livre de doenas.
7.2.3.1.1. Vantagens da cultura de meristemas
A. Manter um Banco de Germoplasma: como os meristemas mantm alta estabilidade
gentica, podem, consequentemente, ser usados como fonte de germoplasma;
71

B. Possibilidade de produzir clones de espcies que so lentas ou difceis de se


propagarem vegetativamente;
C. Capacidade de produzir plantas durante o ano inteiro, independentemente de
restries climticas;
D. Multiplicao rpida de plantas;
E. Obteno de plantas livres de viroses;
F. O material produzido pode ser armazenado por longo perodo de tempo; etc.
7.2.3.1.2. Desvantagens da cultura de meristemas
A. Maior treinamento tcnico, principalmente devido ao processo de reconhecimento e
extrao do pice caulinar (Figura 7.1);
B. Laboratrio especializado (aparelhagem cara);
C. Mtodos especficos para um melhor sucesso de cada espcie;
D. As plntulas no incio so pequenas;
E. Perodo de aclimatizao;
F. Possibilidade de se obter plantas aberrantes geneticamente; etc.

1 mm
Figura 7.1: Processo de extrao do pice caulinar de Philodendron renauxii (Imagem:
CSFior, JB/FZB-RS).
7.2.3.2. Tratamento com elevadas temperaturas (termoterapia)
A cultura de meristemas pode ser associada termoterapia, permitindo que se use um
meristema acompanhado de maior nmero de primrdios foliares, facilitando, desta forma, a
72

regenerao de plantas, principalmente naqueles casos em que difcil a cultura de meristemas.


Consiste no tratamento do material infectado por vrus durante determinado tempo, sob
temperatura elevada.
A temperatura (geralmente acima de 30C), e o tempo de tratamento (mnimo de 20 dias
, mas de preferncia, acima de 40 dias), devem permitir apenas a sobrevivncia da planta ou
broto durante a inativao. Por exemplo, vrus de videira so inativados atravs do tratamento
de brotos in vitro, por 21 dias a 35C. J para vrus em mandioca, por exemplo, utiliza-se 40C
durante o dia e 35C noite ao longo de 3 a 4 semanas. Este tratamento pode ser efetuado em
plantas inteiras.
A termoterapia recomendada como uma tcnica complementar da cultura de
meristemas e da microenxertia, especialmente quando a cultura de meristemas difcil.
H vrias hipteses sobre os efeitos da termoterapia sobre a inativao do vrus.
Alguns acreditam que a multiplicao do vrus inibida neste processo, outros apostam na
ocorrncia de uma reduo da movimentao das partculas virais na planta infectada. Mas
atualmente h um grande consenso de que na verdade a termoterapia no inativa o vrus, mas
impede que ele infecte as brotaes desenvolvidas durante o tratamento.
A termoterapia in vitro pode ser realizada em salas de crescimento ou em estufas
incubadoras, com controle de temperatura e do fotoperodo.
Aps a termoterapia e o cultivo de pices caulinares, para a cultura da mandioca, tmse obtido aumentos de rendimento em alguns casos de mais de 100%.
A reinfestao ocorrer com maior ou menor rapidez segundo a enfermidade, por
exemplo, vrus transmitidos por insetos causam uma reinfestao mais rpida que aqueles
transmitidos mecanicamente.
7.2.3.3. Microenxertia
Essa tcnica particularmente adequada em espcies lenhosas: quando h absoluta
exigncia da manuteno de caractersticas adultas no propgulo vegetativo (como
florescimento), quando o explante de meristema no regenera uma planta, quando as partes
areas regeneradas no enraizam-se adequadamente in vitro.
A microenxertia foi descrita pela primeira vez por Murashige et al. (1972), recuperando
plantas de Citrus com manuteno das caractersticas adultas, indispensveis do ponto de vista
comercial. Posteriormente foi aperfeioada, tornando-se eficiente na obteno de plantas
ctricas livres de vrus e tem sido utilizada, com sucesso, para outras espcies lenhosas tais como
macieira, videira e pessegueiro.
A tcnica de microenxertia para Citrus, consiste, fundamentalmente na obteno de um
porta-enxerto in vitro, a partir de sementes, sobre o qual enxertado um meristema da cultivar
copa infectada por vrus.
A termoterapia pode ser usada como uma tcnica complementar microenxertia,
permitindo que se use um meristema acompanhado de um maior nmero de primrdios
foliares e, desta forma, facilitando sensivelmente a operao da microenxertia.
7.2.3.3.1. Obteno do Porta-Enxerto
O porta-enxerto obtido de sementes germinadas in vitro. As sementes por sua vez
devem ser obtidas de frutos sadios, colhidos de rvores matrizes. Muitas espcies necessitam de
tratamentos especiais para que ocorra a quebra de dormncia de suas sementes. Estratificao a
temperaturas entre 3 e 4C, por 30 a 60 dias, suficiente para sementes de ameixa e damasco,
73

80 a 120 dias para as de pssego, e de 90 a120 para as de mirabolano. No caso dos citros bastase apenas a retirada da muscilagem atravs de lavagem em gua corrente e posteriormente
remoo do tegumento da semente.
Aps a retiradas dos frutos, as sementes devem ser esterilizadas superficialmente em
soluo de hipoclorito de sdio a 0,5 % acrescida de 0,1 % de agente molhante, por 10
minutos, e lavadas com bastante gua. A seguir, so submetidas a um tratamento com gua
quente a uma temperatura ao redor de 50C durante dez minutos; e imediatamente colocadas
em gua temperatura ambiente. As sementes so postas a secar a sombra, podendo ser
utilizada imediatamente, ou ento, tratadas com fungicidas base de cobre e armazenada em
geladeira a uma temperatura de 4 a 5 C.
Para a obteno dos porta-enxertos, as sementes devem ser retiradas dos tegumentos e
submetidas a uma desinfestao em soluo comercial de hipoclorito de sdio (1 a 2% de i. a.)
por dez minutos e lavadas trs vezes em gua destilada estril. Para facilitar a esterilizao, as
sementes devem ser envolvidas por um pedao de gaze. A seguir, elas so colocadas para
germinar em tubos de ensaio, nas dimenses de 25 x 150 mm (uma semente por tubo),
contendo cerca de 15 ml do meio de cultivo MS com 1 % de gar e pH ajustado para 5,7.
Os tubos contendo as sementes so mantidos em ambiente escuro com temperatura ao
redor de 27C por cerca de duas semanas; nessas condies, obtm-se plntulas estioladas que
sero usadas como porta-enxertos. Nessa ocasio, cada plntula dever estar com 10 a 12 cm de
altura e um dimetro ao redor de 1,6 a 1,8 mm. Foi demonstrado que sementes germinadas no
escuro apresentam uma taxa de sobrevivncia dos enxertos maior quando comparadas com
sementes germinadas luz. Alm disso, plntulas estioladas possuem tecidos tenros, o que
facilita a execuo da microenxertia. O porta-enxerto mais utilizado o Poncirus trifoliata (L.)
Raf., pois possui folhas trilobadas, que serve de marcador morfolgico para demostrar o
pegamento ou no da microenxertia.
7.2.3.3.2. Obteno do pice caulinar ou enxerto
Como enxerto, utilizam-se brotos em crescimento. Essas plantas podem estar crescendo
em campo ou, de preferncia, serem estabelecidas e mantidas em casas-de-vegetao. Em
citros, para estimular a brotao das gemas laterais, as plantas devero ser desfolhadas, total ou
parcialmente, cerca de duas semanas antes da data prevista para a realizao da enxertia. Nessa
ocasio, as gemas laterais desenvolvidas devem ser coletadas e acondicionadas em recipiente
com gua destilada. No laboratrio, retiram-se as folhas maiores e procede-se a desinfestao
com lcool 70 % por 2 minutos, seguido de hipoclorito de sdio 1-2 de i. a., por 20 minutos; ou
hipoclorito de clcio a 0,25 % de cloro ativo por 10 minutos e, em seguida. Para a remoo do
resduo dos agentes desinfestantes, lavar trs lavagens com gua estril.
Sob lupa bilocular isolado o meristema contendo 2 ou 3 primrdios foliares, com um
tamanho final de 0,1 a 0,2 mm.
7.2.3.3.3. O ato da microenxertia
A microenxertia propriamente dita feita sob condies asspticas, em cmaras de fluxo
laminar, com material desinfestado ou autoclavado.
Aps todos os procedimentos de desinfestao, o porta-enxerto germinado in vitro
retirado do tubo de ensaio e depositado sobre papel de filtro umedecido para evitar a
desidratao do tecido. O epictilo cortado a uma distncia de 1,5 a 2,0 cm acima do ponto
de insero dos cotildones e a raiz reduzida a 4-6 cm de comprimento. Em seguida, sob lupa
74

binocular com aumento de cerca de 40 vezes, com auxlio de um bisturi, faz-se um corte em
T invertido em relao posio da plntula, de forma que o corte perpendicular a ela seja
executado cerca de 2 a 3 mm abaixo do pice do porta-enxerto. Logo em seguida, faz-se a
exciso do pice caulinar da brotao retirada da planta a ser enxertada, mantendo dois ou trs
primrdios foliares (0,1 a 0,2 mm). O passo seguinte inserir o pice caulinar na base do corte
em T, o que poder ser facilitado com uma leve elevao da epiderme do porta enxerto de
ambos os lados do corte.
Uma vez feita a microenxertia, as plantas so imediatamente colocadas em tubos de
ensaio contendo 15 a 20 ml de meio MS lquido. Uma ponte de papel filtro preparada e
colocada na soluo nutritiva para servir de apoio ao microenxerto. A ponte perfurada na
regio central onde inserida a raiz. Os tubos so mantidos em ambiente controlado, com
fotoperodo de 16 horas dirias de luz (1.000 lux) e temperatura de 27 C, por trs a cinco
semanas, quando os microenxertos j tero brotado, estando com pelo menos duas folhas
expandidas.
7.2.3.3.4. Aclimatizao do microenxerto
Aos quarenta e cinco dias aps a microenxertia, nas condies descritas, o microenxerto
j emitiu de duas a trs folhas, o que possibilita o seu transplantio para um substrato
esterilizado, ou sobrenxertia, dependendo da tcnica adotada.
A aclimatizao pode ser feita em recipientes contendo substrato estril formado por
material com elevado espao de aerao, moderada reteno de gua e baixa salinidade. Aps o
estabelecimento das plantas no substrato, as mudas so cobertas com sacos plsticos e mantidas
nas mesmas condies de laboratrio, ou ento transferidas para uma rea sombreada, em casade-vegetao. Aps uma semana, inicia-se a retirada gradual dos sacos plsticos para ambientar
a planta a condies de menor umidade relativa do ar. Aps quinze dias, o processo de
aclimatizao estar concludo.
7.2.3.3.5. Fatores que influenciam no sucesso da microenxertia
Para a obteno de sucesso na tcnica da microenxertia, deve-se levar em conta alguns
parmetros, tais como: - condies de incubao do porta-enxerto; idade do microportaenxerto; variedade do microporta-enxerto; tamanho e posio do microenxerto; habilidade do
enxertador; condies e tipos de instrumentos; etc.
7.2.3.3.6. Microenxertia visando o rejuvenescimento
Embora uma das principais vantagens da microenxertia com finalidade de limpeza
clonal seja precisamente a no-reverso ao estado juvenil, observa-se algum rejuvenescimento
nas plantas microenxertadas, que pode ser explorado no caso de se desejar propagar
vegetativamente alguma rvore adulta. Em funo da passagem do estado juvenil para o adulto,
espcies lenhosas perdem a capacidade de enraizamento. A microenxertia pode rejuvenescer
meristemas adultos, os quais recuperando a competncia de enraizamento, do origem a plantas
matrizes.
O processo de rejuvenescimento por enxertia geralmente no imediato, sendo
necessria a adoo de enxertia em cascata para a amplificao do fenmeno. Em funo da
extrema juvenilidade do porta-enxerto e da alta relao tecido juvenil/tecido adulto que se

75

obtm ao microenxertar um pice minsculo, o processo de rejuvenescimento pode ser mais


rpido.
O rejuvenescimento s vezes s ocorre aps vrias microenxertias sequenciais, como
ocorre com Hevea brasiliensis, necessitando quatro sucessivas reenxertias e, com Eucalyptus
camaldulensis, onde meristemas retirados de plantas com 83 anos de idade foram colocados sobre
seedlings de 4-6 meses, repetindo a operao a cada 2 meses, e aps a 3 enxertia, o clone estava
apto para multiplicao intensiva, recuperando o aspecto morfolgico e vigor de plantas obtidas
de sementes da mesma rvore.
7.2.3.4. Quimioterapia
A erradicao de vrus em cultura de tecidos e rgos poderia obviamente ser
simplificada se houvesse um composto qumico para limitar a replicao.
A preveno de infeces virticas em algumas plantas influenciada por 2-thiouracil.
Ele pode inibir a sntese de RNA ou vir a ser incorporado no seu RNA, caso o vrus seja no
infectivo (George, 1993).
O composto qumico 1--D-ribofuranos-y1-1,2,4-triazole-3-carboxamide (ribavirin) o
agente antiviral mais usado em cultura de tecidos, mas ele no suficientemente efetivo,
necessitando de outras tcnicas em conjunto para eliminao do vrus (George, 1993).
Na recuperao de plantas de Cymbidium livres do CyMV, adicionou-se ao meio de
cultivo, respectivamente, ditiouracil (0,1 mmol. L1) e ribavirin (0,2 mmol. L-1). Esse tratamento
foi bastante efetivo e a maioria das plantas obtidas permaneceu livre de vrus 2,5 anos aps a
quimioterapia (Porter & Kuehnle, 1997).
7.2.4. Indexao
Consiste na verificao da presena de viroses em uma determinada planta previamente
submetida limpeza clonal. feita tanto pelo uso de plantas indicadoras como atravs de
tcnicas imunolgicas. As tcnicas adotadas variam de acordo com as condies de cada
laboratrio, com os vrus testados e com o nmero de amostras analisadas.
O mtodo mais simples a observao visual das plantas a serem indexadas, porm esse
procedimento pode levar a erros de interpretao e assim plantas com infeco latente podem
ser consideradas como livres de vrus. Outra tcnica simples, mas bastante sensvel o uso de
plantas indicadoras (que exibem sintomas caractersticos de determinados vrus), as quais so
inoculadas com extrato da planta a ser testada ou enxertadas com pequenas gemas. Em ambos
os mtodos as condies ambientais podem afetar o resultado do teste.
Os mtodos sorolgicos, onde se destaca o ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay), so amplamente adotados para indexao, sendo eficientes e rpidos, permitindo testar
um grande nmero de amostras por vez. A desvantagem a necessidade de ter anti-soro
especfico para cada vrus a ser testado.
A indexao tambm pode ser feita pela visualizao das partculas virais presentes nas
plantas testadas, o que s possvel por meio do microscpio eletrnico (ME). No entanto, o
ME um equipamento caro e que deve ser manuseado por pessoas devidamente treinadas.
Atualmente, tcnicas moleculares j esto sendo adotadas para indexao de vrus em
plantas, principalmente nos casos onde os testes sorolgicos tm sido falhos. Dessas, destacamse o uso de sondas radioativas ou no e a Polymerase Chain Reaction (PCR).

76

Em geral, as plantas provenientes de cultura de tecidos apresentam baixa concentrao


de vrus. Assim, as plantas a serem indexadas devem ser plantadas em vasos em casa de
vegetao e testadas vrias vezes para serem consideradas livres de vrus.
Exemplifica-se a indexao de plantas ctricas com o teste denominado de dupla
enxertia. Os testes para o exocorte utilizam o limo cravo enxertado com 3 borbulhas de cada
rvore a ser testada e, 5 cm acima, enxertam-se borbulhas-inculo da variedade indicadora, que
para o viride da exocorte a cidra (Citrus medica L.). Para o vrus da sorose, a indicadora a
laranja doce do cu (Citrus sinensis Osb.). Nos testes para o viride da xiloporose, a tangerina
Parson Special (Citrus reticulata Blanco) usada como indicadora, porm, neste caso utilizado o
limo rugoso. Se a planta a ser testada estiver infectada, sero observados nas brotaes da
planta indicadora, os sintomas da doena.

77

Captulo 8
Multiplicao
8.1. INTRODUO
Murashige (1974) apresentou o conceito de estgios de desenvolvimento durante a
micropropagao sistematizando as etapas de um sistema de propagao in vitro. Esta
subdiviso foi aperfeioada por Debergh e Maene (1981), definindo-se, a partir dai, cinco fases
distintas.
Estgio 0 Fase preparativa (condicionamento da planta matriz)
Estgio I Estabelecimento do cultivo in vitro
Estgio II Proliferao dos Explantes (Multiplicao)
Estgio III Alongamento e enraizamento das Brotaes
Estgio IV Aclimatizao
O objetivo principal da etapa de multiplicao obter a proliferao dos explantes. As
brotaes provenientes desta fase podem ser utilizadas para nova fase de multiplicao, para o
enraizamento ou ainda para a manuteno de um estoque de material vegetal in vitro. Para a
maioria das espcies o mtodo mais desejvel de multiplicao e a organognese direta, pois
proporciona a obteno rpida de um grande numero de propgulos. No entanto, podendo ser
empregadas tambm a organognese indireta passando pela fase de calo - e a embriognese
somtica.
8.2. TCNICAS DA MULTIPLICAO
Neste estgio, deseja-se produzir o maior nmero de plantas possvel no menor espao
de tempo com o mximo de uniformidade das plantas, o que determinar o sucesso na fase de
enraizamento. As principais variveis que podem ser manipuladas para obter melhores
resultados nesta fase so a composio do meio de cultivo, as condies ambientais de
crescimento e os cuidados na manipulao do material durante as subculturas.
8.2.1. Meios de cultivo
Diversos meios bsicos so utilizados na fase de multiplicao, sendo muito comum a
utilizao da mesma composio bsica no isolamento. Macro e micronutrientes, vitaminas,
inositol, fonte de acar e, eventualmente, outros compostos orgnicos como aminocidos e
substancias quimicamente indefinidas, como gua de coco e extrato de malte, constituem o
meio bsico, que pode ser o mesmo para muitas espcies.
As variaes mais freqentes dizem respeito composio de macronutrientes. A fonte
de nitrognio utilizada e o balano entre os ons nitrato e amnio so aspectos que tem
merecido maior ateno. Em culturas de Eucalyptus, por exemplo, verificou-se que ao reduzir
em 50% as concentraes de nitratos de amnio e potssio do meio MS, a taxa de multiplicao
dobrou, e que ao dobrar a concentrao de cloreto de clcio, a taxa triplicou.
A concentrao de sacarose tambm afeta a multiplicao e qualidade dos explantes. Em
geral, emprega-se a sacarose em teores entre 2 a 4%. Abaixo dessa faixa, pode ocorrer clorose
nas culturas e acima dela ocorre a diminiuo demasiada do potencial osmtico do meio.
78

As citocininas constituem a classe de fitorreguladores com maior utilizao na fase de


multiplicao, devido ao seu efeito na quebra da dominncia apical e na induo da proliferao
de gemas axilares (Figura 8.1). O tipo de citocinina e sua concentrao so os fatores que mais
influenciam o sucesso da multiplicao in vitro. Utilizam-se diversas citocininas, como a
benzilaminopurina (BAP), cinetina (KIN), tidiazuron (TDZ). A mais utilizada o BAP,
principalmente pela sua eficincia na multiplicao de partes areas e induo de gemas
adventcias.
As concentraes de citocininas para a multiplicao esto entre 0,01 e 10 mgL-1. Em
concentraes insuficientes de citocininas a taxa de multiplicao baixa e ocorre pouca
eficincia na quebra de dominncia apical e induo da proliferao de gemas axilares. Por
outro lado, elevadas concentraes podem induzir a formao de um grande nmero de
brotaes curtas e pouco teis, tanto para subcultivos quanto para enraizamento, alm de
favorecerem, em alguns casos, a hiperidratao. Outras espcies, no entanto, tm seus ndices
de multiplicao otimizados em baixas amplitudes de concentraes de citocininas, ou seja, o
nmero de brotaes diretamente proporcional concentrao de auxina, passando a ser
inversamente a partir de uma determinada concentrao (Figura 8.1).

Figura 8.1: Nmero de brotaes e razes de explantes de Persea venosa submetidos a


meios com concentraes crescentes de Benzilaminopurina (BAP) (Rodrigues et al, 1998).
comum ocorrer efeito residual de citocinina, o que pode afetar as fases seguintes da
micropropagao, portanto, a definio do tipo e da concentrao tima de citocinina para a
multiplicao pode ser decisiva para a maioria dos cultivos in vitro.
Embora no sejam necessrias no meio de multiplicao, as auxinas podem ser utilizadas
para favorecer o crescimento da parte area. Pesquisadores constataram que metade dos meios
de multiplicao apresentados na literatura continham auxina. Contudo, a relao
citocinina:auxina depende da espcie e, para muitos casos, da variedade. Normalmente, durante
a fase de multiplicao, esta relao mantida em 10: 1, ou seja, para cada mg de citocinina
utilizado 0,1 mg de auxina. O cido naftalenoactico (ANA) e o cido indolbutrico (AIB) so
as auxinas mais empregadas nesta fase.

79

O estado fsico do meio tambm tem influncia sobre a multiplicao de partes areas.
Os meios gelificados so os mais comuns. A concentrao de agar pode variar de 0,5 a 1,2%,
dependendo da pureza do produto e da consistncia desejada no meio de cultivo.
8.2.2. Condies ambientais
Culturas in vitro apresentam uma baixa taxa fotossinttica, mas a luminosidade
imprescindvel para os processos morfogenticos, sendo padronizada juntamente com a
temperatura em diversos laboratrios para todas as espcies. As diferenas nas intensidades
luminosas, dependem da posio do frasco na prateleira e da prpria prateleira da sala de
crescimento. A condio padro de luminosidade ao redor de 2000 lux e o fotoperodo mais
indicado de 16 horas.
A temperatura utilizada nesta fase em geral fica em torno de 20 a 27 oC. Temperatura
acima de 30oC so desfavorveis, no somente para a fisiologia das plantas, como tambm por
aumentar a evaporao de gua do meio, tornando-o mais concentrado, o que pode resultar em
toxidez. Algumas espcies tem melhor desenvolvimento e multiplicao quando so fornecidas
temperaturas alternadas de 25/20oC (luz/escuro).
A condio ambiental interna do frasco de cultura tambm importante. O que mais
interfere na qualidade no microambiente no frasco de cultura so os tipos de tampas e frascos
utilizados, alm da quantidade do meio presente nos mesmos.
A vedao hermtica do frasco, embora previna a contaminao, no permite as trocas
gasosas favorecendo a acumulao de gases, podendo tornar o ambiente txico ao explante.
8.2.3. Manipulao dos explantes
O tratamento dado aos explantes na fase de multiplicao afeta o desenvolvimento das
culturas, sendo que sua maior influncia se verifica na qualidade e uniformidade das plantas
produzidas. Esses fatores podem ser agrupados em trs aspectos: a freqncia das subculturas,
o tipo e tamanho do explante e os cuidados na repicagem.
Aps a inoculao no meio de cultivo, distinguem-se trs fases. Na primeira fase, o
explante se restabelece do estresse sofrido na repicagem e no cresce nem se multiplica. A
segunda fase se caracteriza pelo crescimento e multiplicao exponenciais. Na ultima fase h
um processo de reduo e senescncia, devido ao esgotamento dos nutrientes e da sacarose do
meio de cultivo, falta de gua no meio, ao acmulo de gases no interior do frasco e a barreiras
fsicas ao crescimento do explante. A durao dessas trs fases varia entre espcies, para a
maioria das espcies situa-se entre 25 a 60 dias.
O perodo de incubao (tempo entre repicagens) mais comum de quatro semanas,
entretanto este pode no ser o intervalo ideal para otimizar a taxa de multiplicao, variando
muito de acordo com a espcie, o meio de cultivo e o tipo de explante. O nmero de
repicagens ou subcultivos dependera da espcie e da capacidade de manter as caractersticas do
explante inicial. Espcies como a macieira e pereira, so bastante estveis ao longo de sucessivas
geraes de multiplicao, ao contrario da bananeira e do morango, os quais originam poucas
geraes.
As caractersticas e tamanho dos explantes so importantes e esto relacionadas com a
freqncia de repicagem. Pode-se empregar, como explantes secundrios, segmentos nodais,
tufos de brotaes, subdiviso desses tufos, brotaes e parte destas brotaes. Deve-se
trabalhar com explantes de tamanho mdio, que proporcione alto rendimento e elevada taxa de
multiplicao, explantes muito pequenos acarretam menor velocidade de multiplicao.
Ao tirar a cultura do frasco na hora da repicagem, o explante passa a sofrer um estresse
hdrico, portanto, cuidados devem ser tomados no momento da repicagem quanto preveno
80

da desidratao e manuteno da condio assptica dos mesmos. Estes fatores esto


diretamente associados habilidade do operador, pois quanto menos tempo os tecidos
permanecerem expostos ao ar, menor ser o estresse, o que contribui para a otimizao da fase.
As contaminaes representam um grande problema para a maioria dos laboratrios e
esta presente tambm durante o processo de multiplicao. Bactrias endgenas podem se
manifestar tardiamente a partir de explantes aparentemente limpos, comprometendo o
desenvolvimento da cultura.
Assim como nas demais fases da propagao in vitro, para evitar a disseminao de
microorganismos entre os cultivos, grande ateno deve ser dada s medidas preventivas
durante s repicagens, como por exemplo:
- descarte de frascos com qualquer sinal de contaminao;
- troca freqente do lcool de flambagem e dos respectivos recipientes;
- flambamgem demoradas e repetidas dos instrumentos (pinas e lminas), em intervalos
no superiores ao tempo utilizado para o processamento de cada frasco com cultura, alm de
outras.

81

Captulo 9
Enraizamento
9.1. INTRODUO
Para muitas espcies, sobretudo as herbceas, a fase de enraizamento no tem
constitudo grande problema, enquanto para outras, entre as quais se inclui a maioria das
espcies lenhosas, a elucidao do processo de rizognese no foi ainda conseguida.
Os maiores obstculos ao conhecimento adequado dos fenmenos envolvidos no
processo de formao de razes adventcias residem na dificuldade de isolar e caracterizar os
fatores que controlam estes fenmenos, em virtude da sua complexidade e da grande interao
existente entre eles.
Poucas generalizaes podem ser feitas sobre a rizognese. Aparentemente, h uma
relao quantitativa entre nveis de auxina e citocinina que responsvel pelo inicio do
processo. Todavia, a participao de outras substancias reguladoras de crescimento, como
giberelinas, cido abscsico e etileno, tambm j foi constatada. A influncia de outros fatores,
localizados e translocveis na estaca, tanto promotores quanto inibidores de enraizamento, tem
sido comprovada, bem como a existncia de compostos sinergistas da auxina, que se supe
formarem com esta um complexo co-fator/auxina mais ativo.
Fatores externos, de natureza fsica e qumica, tambm apresentam pronunciada
influncia, estimulando ou inibindo o enraizamento. O explante, tanto no que se relaciona ao
genoma da planta-matriz quanto ao seu estado fisiolgico, de fundamental importncia,
merecendo ateno especial, particularmente no caso de espcies de difcil enraizamento.
9.2. FATORES LIGADOS PLANTA MATRIZ
Um dos fatores determinantes das respostas morfogenticas in vitro, entre as quais o
enraizamento, diz respeito s plantas doadoras de explantes. Estas plantas podem ser tanto as
fornecedoras de explantes primrios quanto aquelas que correspondem ltima fase de
multiplicao in vitro, de onde so obtidos os propgulos a serem enraizados, ou seja, a fase prenraizamento.
Fatores como gentipo, estresse hdrico, substncias de reserva como carboidratos,
nutrio mineral, condies de crescimento da planta (luz, temperatura), sazonalidade,
substncias reguladoras de crescimento e juvenilidade tm sido considerados como aqueles que
apresentam efeitos mais relevantes no enraizamento.
9.2.1. Gentipo
Existem vrias evidncias de que a formao de razes adventcias em segmentos de
caule geneticamente controlada. A grande variao observada de espcies, cultivares e clones,
com relao a maior ou menor habilidade natural em formar razes, tem mostrado a
importncia dos fatores genticos no enraizamento. Tal fato tem dificultado o estabelecimento
de protocolos gerais e funcionais de enraizamento, em virtude das diferentes exigncias entre
clones na formao de razes adventcias in vitro. Em escala operacional, tem sido til agrupar
clones semelhantes, com base no padro de respostas aos diferentes tratamentos.
Na prtica, verifica-se que, de modo geral, os obstculos ao enraizamento podem ser
suplementados, ou diminudos, mediante uma srie de medidas aplicadas antes e durante o
processo de enraizamento, uma vez que estas diferenas genticas manifestam-se por
82

intermdio de fenmenos bioqumicos e fisiolgicos, os quais podem ser manipulados


principalmente por meio de variaes no ambiente fsico.
9.2.2. Estresse hdrico
O estado de turgidez das plantas doadoras de propgulos de fundamental importncia
no enraizamento. O estresse hdrico provoca aumento nos contedos de ABA e etileno nas
folhas, compostos esses considerados inibitrios do enraizamento. O estresse hdrico afeta
tambm nveis endgenos de citocininas, mediante efeito direto na sua sntese nas razes e,
indireto pela reduo do seu transporte para as folhas.
Em culturas de tecidos muito velhas, onde j houve muita evaporao da gua do meio
de cultivo, as plantas tendem a apresentar dficit hdrico e sua utilizao como fonte de
explante pode comprometer o enraizamento. Outro problema relacionado deficincia hdrica
diz respeito preparao dos explantes para o enraizamento in vitro, na cmara de fluxo laminar,
cujo ambiente seco favorece seu ressecamento. A manipulao dos explantes deve ser rpida,
para que possveis estresses hdricos no interfiram negativamente no enraizamento.
9.2.3. Nutrio mineral
O estado de nutrio mineral da planta doadora de propgulos exerce pronunciada
influncia no enraizamento. Existem evidencias que as estacas provenientes de plantas bem
nutridas, porm com teores de nitrognio menores que as plantas bem supridas deste nutriente,
enrazam com mais facilidade, nesta situao o maior ndice de enraizamento atribudo ao
melhor acmulo de carboidratos ou possivelmente pela reduo dos nveis de citocininas na
estaca.
Em cultivo de estacas de videira com soluo nutritiva na ausncia de nitrognio obtevese bom enraizamento de estacas, ao passo que aquelas cultivadas em soluo deficiente em P,
K, Mg e Ca o enraizamento foi prejudicado.
Geralmente, moderadas deficincias de nitrognio so mais benficas ao enraizamento
do que o excesso ou mesmo nveis adequados desse elemento. Entretanto, estremas
deficincias de nitrognio podem ser prejudiciais, uma vez que, sendo necessrio para a
formao de cidos nuclicos e sntese de protenas, o nitrognio importante no processo de
enraizamento. Assim, parece claro que as plantas doadoras de propgulos devem estar bem
nutridas com relao a P, K, Ca e Mg e moderadamente deficientes em nitrognio, para
melhores resultados no enraizamento.
A deficincia de Ca no meio de multiplicao provoca necrose de pices caulinares, e
existem evidencias de que tambm pode acarretar problemas no enraizamento e no
desenvolvimento das microestacas. O clcio pode ser um ativador de peroxidase, uma enzima
que parece ser essencial ao enraizamento.
Um adequado balano nutricional das plantas doadoras de propgulos parece estar
ligado produo de triptofano, precursor natural do AIA e de substncias de reserva (Haissig,
1986). O aumento dos nveis endgenos de AIA pode ser favorecido pelo zinco, por meio de
seu efeito no aumento da produo de triptofano.
O mangans outro mineral que parece influenciar na capacidade de enraizamento de
estacas de plantas de diversas espcies. Em abacate, altos nveis foliares deste mineral foram
encontrados em cultivares de difcil enraizamento, enquanto que cultivares de fcil
enraizamento tiveram nveis muito mais baixos. (Reuveni & Raviv, 1981). Quanto ao boro, este
mineral parece tambm ter um importante papel no enraizamento de estacas, uma vez que est
associado ao metabolismo de auxinas (sntese e/ou recepo).

83

9.2.4. Carboidratos
O estado nutricional das plantas doadoras de propgulos pode exercer grande influncia
no enraizamento, uma vez que o processo de iniciao radicular requer energia para sua
ocorrncia. A maior influncia dos carboidratos est ligada relao C/N. Valores extremos
desta relao so desaconselhveis. Entretanto, segmentos de caule mais ricos em carboidratos
em relao ao nitrognio, tendem a enraizar melhor. Assim, a reduo da disponibilidade de
nitrognio nas plantas doadoras de propgulos, para permitir um maior acumulo de
carboidratos, como coleta de segmentos de caule em regies da planta onde no haja intenso
crescimento vegetativo e que estejam em desejveis estados nutricionais, alm da aplicao
exgena de aucares e amido so maneiras de favorecer a relao C/N.
Em cultivares de fcil enraizamento, a quantidade de reservas normalmente maior do
que em cultivares de difcil enraizamento. Estes mesmos autores afirmam ainda que segmentos
de caules herbceos, principalmente os estiolados, respondem bem a pr-tratamentos com
aucares, com significativos aumentos no enraizamento.
Estacas estioladas de Populus nigra no enraizaram em gua, AIA ou AIB isoladamente,
mas enraizaram satisfatoriamente quando fontes de carboidratos como ribose, glicose e
sacarose foram adicionadas.
O crescimento vegetativo, em excesso, das plantas doadoras pode diminuir ou at
mesmo impedir o enraizamento, em virtude do baixo acmulo de substncias de reserva.
No se pode afirmar, entretanto, que altos contedos de carboidratos estejam
invariavelmente associados com a maior facilidade de enraizar. A razo disso que vrios
outros fatores esto envolvidos e podem exercer uma influncia mais forte do que o fator em
questo.
9.2.5. Condies de crescimento da planta
A formao de razes em segmentos nodais in vitro influenciada pelas condies de luz
em que foram cultivadas as plantas doadoras de propgulos, ou seja, a fase correspondente ao
pr-enraizamento.
Trabalhos mostram que plantas crescendo sob luz produzem compostos derivados do
cido elgico, que impedem a atividade rizognica do AIA. Estes compostos no foram
encontrados em plantas cultivadas na ausncia de luz ou sob intensidade de luz reduzida.
A reduo da intensidade de luz, alm de influenciar o enraizamento, pode ter efeito no
nmero de razes, s vezes, aumentando, outras diminuindo, dependendo da espcie. As causas
dessa variao, que ocorre at em variedades da mesma espcie, no so ainda conhecidas, mas
parecem estar ligadas a dois importantes fatores do enraizamento: a produo de carboidratos e
o acumulo e transporte de auxinas.
O fotoperodo outro fator relacionado com o ambiente das plantas doadoras de
propgulos, por meio do qual a luz interfere no processo de enraizamento. Propgulos retirados
de plantas crescidas em dias curtos enrazaram mais e produziram sistemas radiculares de
melhor qualidade do que aquelas provenientes de plantas que cresceram em dias longos.
9.2.6. Idade fisiolgica
A maior ou menor predisposio de uma planta em relao formao de razes
adventcias e a outras respostas morfogenticas in vitro determinada geneticamente e varia de
planta para planta. Alm disso, as espcies herbceas em geral respondem mais facilmente ao
estmulo para o enraizamento in vitro do que as lenhosas. No entanto, entre estas explantes
provenientes de material juvenil enrazam quase sempre sem nenhum problema.

84

Considera-se perodo juvenil a poca da germinao da semente at a planta atingir a


habilidade para a florescer. Quando a planta atinge a capacidade para florescer, ocorre uma
srie de mudanas nas atividades metablicas do meristema apical e provavelmente nas gemas
que iro iniciar flores, sendo as mais comuns as variaes dos cidos nuclicos especficos,
enzimas, isoenzimas e variaes nas quantidades de promotores e inibidores endgenos de
crescimento.
Uma das mais importantes conseqncias do envelhecimento ontogentico para a
clonagem a reduo ou at mesmo a perda da capacidade de enraizamento, verificado em
plantas lenhosas adultas.
Dessa forma, o enraizamento in vitro de explantes provenientes de plantas lenhosas
adultas tem constitudo um desafio ainda a ser vencido, para a maioria das espcies lenhosas de
interesse econmico. Todavia, o sucesso obtido com certos gentipos j permitiu ampliar os
conhecimentos a esse respeito, a ponto de possibilitar o estabelecimento de um esquema geral a
ser adotado em tais casos.
Esse esquema consiste, basicamente, em explorar a maior capacidade de enraizamento
de material juvenil, seja pela a utilizao de explantes provenientes de partes juvenis de plantas
adultas, seja pela promoo do rejuvenescimento de partes de planta adulta. Essa medida, com
tudo, no dispensa um cuidadoso estudo para otimizar todos os fatores que afetam o
enraizamento, conforme exposto.
Vale ressaltar que as modificaes morfolgicas e fisiolgicas relacionadas com essa
mudana de fase no ocorre repentinamente, numa determinada poca da planta, mas sim
gradativamente, a medida que se verifica o crescimento das plantas, a partir do incio da
germinao da semente. Essas modificaes podem durar apenas alguns meses, em plantas
herbceas, ou at anos, em plantas lenhosas. Dentre elas esta a perda gradativa da capacidade
rizognica ao longo do caule. A idade da estaca um fator limitante no processo de
enraizamento, sendo a capacidade de enraizamento de estacas, em vrias espcies, maior
quando provenientes de hastes de plantas juvenis do que de plantas adultas. Trabalhos com
Quercus evidenciaram que o enraizamento decresceu de 70% em plantas com trs meses de
idade, para 15%, em plantas com vinte e quatro meses, e 6% em plantas adultas. Esses dados
mostram que o declnio na capacidade de enraizamento pode ocorrer de forma acentuada
dentro do perodo juvenil, uma vez que o decrscimo do enraizamento foi maior do 3o para o
24o ms do que do 24o ms para o estdio adulto.
O conhecimento do fenmeno da reteno da juvenilidade nos tecidos da base do caule
de plantas provenientes de sementes permitiu o estabelecimento do primeiro modelo bsico, j
amplamente aplicado a clonagem de plantas adultas de difcil enraizamento, como eucalipto e
macieira. Esse modelo consiste na obteno de explantes de brotaes surgidas na base da
planta, principalmente como resultado da utilizao de artifcios, tais como injria mecnica nas
razes, anelagem na base do caule, poda drstica a poucos centmetros do colo, aplicao de
substncias reguladoras de crescimento etc. As brotaes surgidas nesta regio tendem a
apresentar caractersticas juvenis. Aps enraizados, estes ramos constituiro matrizes aptas a
fornecer continuamente material de propagao, por meio de podas sucessivas.
9.3. FATORES RELACIONADOS AOS EXPLANTES
Alm das caractersticas descritas das plantas doadoras de propgulos, fatores
relacionados com os prprios propgulos podem exercer influncia no enraizamento in vitro.

85

9.3.1. Estao do ano


Para muitas espcies, principalmente naquelas lenhosas, a poca do ano pode afetar
significativamente o estado fisiolgico da planta e comprometer o enraizamento das estacas.
Trabalhos com estacas de Fcus infectoria evidenciaram maior porcentagem de enraizamento,
quando coletadas na primavera e no vero, em comparao as estacas coletadas no inverno.
Resultados semelhantes foram observados em estacas de citrus, oliveira e abacateiro. Esta
melhor resposta de enraizamento em estacas coletadas na primavera e vero em relao s
estacas coletadas no inverno, pode estar associada aos pequenos perodos de dia do inverno,
onde ocorrem baixa intensidade luminosa e baixa temperatura do ambiente, provocando uma
inativao do crescimento, bem como uma menor quantidade de fotoassimilados das folhas,
antes e depois das estacas preparadas e conseqentemente reduo da produo de substncias
metablicas necessrias para a iniciao e desenvolvimento das razes.
9.3.2. Presena e nmero de folhas
A presena de folhas pode ser essencial ao enraizamento. Neste caso a sua ausncia no
suprida por auxinas, sacarose ou compostos nitrogenados. Todavia, estes compostos
estimulam o enraizamento na presena de folhas. O nmero de folhas tem influncia,
principalmente na velocidade de enraizamento e no nmero de razes formadas. O nmero de
folhas nas estacas de abacateiro influencia no enraizamento. Maiores quantidades de co-fatores
de enraizamento (cido clorognico e cido isoclorognico) foram encontrados nas folhas, em
comparao ao caule e razes. Esta mesma tendncia foi observada para o contedo total de
fenis.
As folhas podem ser tambm fonte de compostos inibidores do enraizamento,
principalmente em plantas lenhosas adultas. Neste caso, a sua presena pode prejudicar o
enraizamento.
9.3.3. Posio do explante na planta matriz
O teor endgeno de hormnios, promotores ou inibidores, varia com as idades
fisiolgica e cronolgica dos tecidos. Desse modo, cada tecido de uma mesma planta pode
apresentar diferentes condies fisiolgicas e anatmicas e, portanto, diversas respostas
morfogenticas, como tambm distintas exigncias de substncias exgenas de crescimento.
Trabalhos com enraizamento em estacas de maracujazeiros doce e amarelo mostraram maior
potencial de enraizamento e maior crescimento do sistema radicular quando as estacas foram
retiradas da poro mediana e basal quando comparado s estacas retiradas da poro apical.
Resultados similares foram observados com enraizamento de estacas de cafeeiro. No entanto,
estacas terminais de abacateiro enraizaram melhor do que as estacas subterminais e basais.
Tem sido demonstrada ainda a superioridade de ramos laterais com relao capacidade
de enraizamento, que por estarem em ritmo de crescimento menos intenso, tendem a acumular
mais carboidratos, aumentando a relao C/N e conseqentemente, o enraizamento.
9.4. MEIO NUTRITIVO NA FASE DE MULTIPLICAO
Um aspecto importante no enraizamento in vitro a composio dos meios de
multiplicao. O cido giberlico tem sido utilizado para promover o alongamento de partes
areas, na fase de pr-enraizamento, de culturas multiplicadas pelo sistema de tufos. Em vrios
sistemas, o cido giberlico no meio de alongamento tem-se mostrado prejudicial formao
de razes. Tambm o contato prolongado das culturas com altas concentraes da citocinina
BAP, na fase de multiplicao, pode exigir at seis subcultivos em meio contendo carvo
86

ativado, para eliminar o efeito residual do BAP e permitir bom enraizamento. Muitas vezes,
testes de enraizamento in vitro no apresentam resultados consistentes em decorrncia da
utilizao de explantes oriundos de meios com diferentes composies qumicas, sobretudo em
relao a substncias reguladoras de crescimento.
9.4.1. Inibidores liberados no meio de cultivo
A formao de razes adventcias normalmente diminui em funo da idade fisiolgica e
do gentipo da planta doadora de propgulos. A idade do rgo que d origem ao explante
um fator limitante no processo de enraizamento, sendo a capacidade de enraizamento, em
vrias espcies, maior, quando provenientes de hastes de plantas juvenis do que de plantas
adultas, o mesmo verdadeiro quando os tecidos iniciais so emitidos de ramos podados ou da
base da planta, quando essa for lenhosa.
As substncias fenlicas produzidas pelos explantes e liberadas para o meio de cultivo
tm sido consideradas inibidoras do enraizamento. Essas substncias so liberadas como
conseqncia de injurias feitas durante a individualizao dos explantes. Sua sntese varia
conforme o grau de lignificao dos tecidos, sendo mais abundante em tecidos adultos do que
em juvenis. Esses compostos fenlicos provocam o escurecimento das superfcies de corte dos
explantes, difundem-se para o meio de cultivo e so altamente inibitrios ao processo de
rizognese.
9.4.2. Substncias reguladoras de crescimento
O controle do desenvolvimento de razes adventcias influenciado por substncias
reguladoras de crescimento, apresentando uma concentrao tima que pode variar entre
espcies, populaes ou clones, algumas promovendo e outras inibindo. Dentre os reguladores
de crescimento que tem sido utilizado em aplicao exgena para promover o enraizamento de
estacas de diversas espcies destacam-se os cidos indolacticos (AIA), indolbutrico (AIB),
naftalenoactico (ANA) e seus sais. Os cidos 2,4 diclorofenoxiactico (2,4D), 2,4,5
triclorofenoxiactico (2,4,5T), 2,4,5 triclorofenoxipropinico, 2,4,5 triclorofenoxibutirico, e o
cido diclorofenoxibutrico tambm estimulam o enraizamento de estacas, quando usados em
baixas concentraes.
A utilizao de reguladores de crescimento no enraizamento uma prtica largamente
difundida, podendo, em muitas espcies de difcil enraizamento, viabilizar a produo de mudas
atravs da estaquia. O cido indolbutrico (AIB) um dos reguladores de crescimento mais
aplicados, sendo efetivo para um grande nmero de espcies. No entanto conveniente
considerar que a eficcia dos produtos auxnicos distinta para cada espcie e est influenciada
tambm pela concentrao e o veiculo que se utiliza para aplica-los.
As citocininas so substncias reguladoras de crescimento envolvidas principalmente na
diviso, crescimento e diferenciao de clulas, sendo as principais a zeatina, a cinetina e a 6benzil-adenina. Geralmente, essas substncias inibem o enraizamento de estacas de algumas
espcies. Entretanto, s vezes, em pequenas concentraes, as citocininas estimulam o efeito do
AIA na formao de razes.
As giberelinas so conhecidas, principalmente, por seu efeito promotor de alongamento
de ramos. H evidencias de que a aplicao de giberelinas em estacas bloqueia a atividade da
auxina na diferenciao dos primrdios de razes, possivelmente por interferncia nos
processos de sntese de cidos nuclicos e protenas. Por isso, baixos nveis de giberelinas nos
tecidos poderiam estimular a formao de razes.
Em geral, encontra-se na literatura que o ABA e o etileno inibem o enraizamento.
Resultados sugerem que o ABA pode ser um importante regulador natural do enraizamento.
87

Quando utilizado em concentraes timas, pode apresentar sinergismo com AIA ou AIB,
porm em altas concentraes pode inibir completamente o enraizamento, mesmo na presena
de auxinas. Quanto ao etileno sabe-se que esse regulador de crescimento influi no enraizamento
de estacas, embora as informaes disponveis sobre o assunto sejam contraditrias.
9.4.3. Outras substncias
Vrias substncias de reao sinergstica com auxina tm sido isoladas em estacas de
fcil enraizamento. Compostos fenlicos (polifenis) so, em geral, considerados co-fatores de
enraizamento, multiplicando o efeito indutor das auxinas, sendo que alguns deles (catecol,
floroglucinol e os cidos flortico, cafico, ferlico, p-cumrico e clorognico) podem atuar
independentemente da presena de auxina. Produtos da oxidao de fenis (as quinonas) so,
entretanto, inibidores.
Os cofatores de enraizamento parecem agir como protetores de auxinas endgenas,
contra a destruio pela AIA-oxidase, como o caso de indol, alfa-naftol e beta naftol.
Entretanto, existem indcios de que sua ao sinergstica pode ir alem da proteo do AIA
contra a AIA-oxidase, aumentando, tambm, a sntese e liberao de auxinas.
9.4.3.1. Carboidratos
Durante o enraizamento, a fotossntese realizada por explantes relativamente baixa e,
como a formao de razes um processo que requer energia, o fornecimento de carboidratos
quase sempre necessario. Essa necessidade tende a ser maior quando se utilizam partes areas
estioladas, uma vez que o estiolamento no permite um adequado acmulo de carboidratos.
Alm de ter a funo de supridor de energia para o enraizamento, os carboidratos atuam na
manuteno do potencial osmtico do meio de cultivo. Embora a glicose, a frutose e outros
carboidratos tenham apresentado resultados satisfatrios em certas espcies, a sacarose tem
sido freqentemente utilizada. Concentraes de sacarose no meio de enraizamento, inferiores
quelas empregadas na fase de multiplicao, tm proporcionado bom resultados no
enraizamento de diversas espcies como: o Eucaliptus, a Sequia sempervirens dentre outras.
9.4.3.2. Sais Minerais
O fornecimento de nutrientes no enraizamento quase sempre necessrio. Embora haja
uma redistribuio de nutrientes endgenos, transportados dos ramos para a base das estacas, o
transporte de N, P, K, Mg, Ca e B no floema no muito eficiente, sobretudo, tratando-se de
Ca e B. O potssio e o clcio so essenciais para a formao de calo e razes. O nitrognio
importante para a iniciao e desenvolvimento de razes que o requerem para suprir a grande
quantidade de cidos nuclicos e protenas. O Mg dispensvel na maioria das vezes.
Com relao aos micronutrientes, devem-se usar quantidades mnimas de Mn.
Entretanto, o Zn e B so necessrios e importantes no processo. O Zn aumenta os teores
endgenos de auxinas por meio do aumento dos nveis de triptofano, seu precursor natural.
O boro tem sido muitas vezes considerado mais importante no crescimento de razes do
que no enraizamento. Mas, em algumas espcies, reage sinergisticamente com as auxinas,
aumentando a porcentagem de enraizamento, o nmero de razes por estaca e o comprimento
de razes. Contudo no tem efeito quando aplicado isoladamente. Em outras espcies, o boro
parece indispensvel no enraizamento, principalmente em material obtido de plantas
desenvolvidas luz. Na ausncia de boro, a influencia de AIB no enraizamento vai apenas at
estdios muito preliminares da iniciao de primrdios. Acredita-se que a ao estimuladora do
88

boro no enraizamento esteja ligada sua interferncia no processo de oxidao, pelo aumento
da mobilizao dos cidos ctricos e isoctricos, ricos em oxignio, para o interior dos tecidos.
Os meios de cultura para o enraizamento se caracterizam, em geral, por uma reduo
nas concentraes de sais e aumento no teor de auxinas. As concentraes dos componentes
dos meios de enraizamento podem ser reduzidas conforme o tipo de sal. O enraizamento de
explantes juvenis de E. marginata foi melhor em meio contendo da concentrao dos sais de
MS e a metade da concentrao de CaCl2.
9.4.3.3. Estado fsico do meio de cultivo
O estado fsico do meio de cultivo outro fator que muitas vezes afeta
significativamente o enraizamento. Certas plantas, quando em meio liquido, principalmente
sobre ponte de papel, formam um sistema radicular mais abundante e mais rico em radicelas,
enquanto, em outros casos, meio semi-slido com gar foi superior ao meio lquido. O estado
fsico pode interferir principalmente na disponibilidade de gua, nutrientes, hormnios e
oxignio presentes no meio. De qualquer forma, se for escolhido o meio gelificado, a
concentrao de gar deve ser inferior aquela utilizada nas outras etapas da micropropagao.
Menores concentraes de gar na fase de enraizamento podem ser benficas para propiciar
maior facilidade na retirada das mudas enraizadas e na lavagem das razes durante a operao de
transplantio.
9.4.3.4. pH
Outro fator que pode, eventualmente, interferir no enraizamento o pH do meio de
cultivo ou substrato de enraizamento. Algumas espcies enrazam melhor com pH prximo a
7,0, e outras na faixa entre 5,0 e 6,0 (Assis & Teixeira, 1998). O que mais freqentemente
observado um decrscimo do enraizamento com o aumento da acidez.
9.4.3.5. Carvo ativado
A formao de razes adventcias em vrias espcies lenhosas tem sido beneficiada pelo
uso de carvo ativado no meio de enraizamento. Dotado de uma alta capacidade de adsoro,
esta substncia tem a propriedade de modificar a composio dos meios de cultura, adsorvendo
uma srie de substncias adicionadas ao meio, ou liberadas pelos explantes ou presentes no
gar. Algumas destas substncias podem ter atividade inibitria, mas outras (promotoras do
enraizamento) so igualmente adsorvidas. O carvo ativo pode adsorver substncias txicas,
principalmente fenis e/ou quinonas, produzidas durante a autoclavagem, ou liberadas de
explantes, cujos tecidos sofreram injurias. Da mesma forma, auxinas, citocininas e vitaminas so
adsorvidas, sugerindo que na presena de carvo ativado, menores quantidades das substncias
adicionadas ao meio estaro, efetivamente, disponveis para os explantes, exigindo certo critrio
na sua utilizao.
Outra propriedade atribuda ao carvo ativado, como sendo benfica no processo de
enraizamento, diz respeito reduo da intensidade de luz na regio de formao de razes. No
entanto, concentraes muito altas de carvo ativado podem at mesmo impedir o
enraizamento.
9.4.3.6. Condies de incubao
89

A intensidade tima de energia luminosa, requerida durante o enraizamento, varia de


acordo com o estdio do explante, bem como com a espcie em questo. De maneira geral,
pouca luz necessria durante os estdios iniciais, j que pode inibir o enraizamento, pelo
menos na fase indutiva do processo. Entretanto, aps este perodo, a luz importante,
principalmente, para o crescimento de partes areas e alongamento de razes, alm de dotar a
planta de maior resistncia ao transplantio.
Tanto a formao da parte area quanto da raiz so influenciadas pelo regime de luz
(fotoperodo), ao qual os explantes so expostos. As respostas a diferentes fotoperodos variam
de acordo com a espcie em questo. Algumas espcies respondem melhor no escuro outras
requerem luz contnua. A maioria das plantas necessita de um perodo de luz que varia entre 8
e 18 horas.
A temperatura outro fator que influencia no enraizamento no entanto parece ter
efeitos distintos de acordo com a fase do processo. Temperaturas mais altas favorecem a
iniciao de primrdios radiculares e temperaturas mais baixas favorecem o desenvolvimento
das razes. A temperatura recomendada para o enraizamento in vitro a mesma que propicia o
desenvolvimento da planta in vivo. Na prtica, o intervalo de temperatura entre 21 e 27oC o
mais utilizado. Em geral, h benefcios em se aumentar a temperatura na base do explante,
mantendo-se a da parte area em nveis mais baixos. Entretanto, essa condio difcil de ser
obtida in vitro.

90

Captulo 10
Aclimatizao ex vitro
10.1. INTRODUO
A ltima etapa da produo vegetal in vitro prepara a planta para a adaptao s
condies ambientais naturais atravs da aclimatizao.
O termo aclimatizao definido como a etapa de adaptao climtica gradual de seres
vivos para um novo ambiente, em um processo orientado pelo homem. Alguns autores
consideram sinnimo do termo aclimatao. Contudo, o termo aclimatao pode ocorrer sem a
interveno humana, ou seja, processos naturais de adaptao ao clima.
10.2. ASPECTOS FISIOLGICOS
Os vegetais so caracterizados por sintetizarem os compostos orgnicos que necessitam
para seu desenvolvimento. Em condies naturais, o fornecimento de nutrientes minerais,
oxignio, gs carbnico, gua, temperatura e luz, possibilita que plantas sintetizem os produtos
dos quais dependem para cumprirem seu ciclo de vida. Por outro lado, nos sistemas de cultura
de tecidos, os compostos orgnicos necessrios ao desenvolvimento vegetal so fornecidos
atravs do meio de cultivo. Este, contm nutrientes com alta disponibilidade e fornece o aporte
energtico. Plantas mantidas nestas condies possuem uma taxa fotossinttica muito reduzida,
por no necessitarem da fixao do carbono do ar para a sntese desses compostos.
Em condies naturais as variaes de temperatura, umidade relativa do ar,
disponibilidade de gua no substrato e radiao luminosa, fazem com que as plantas
desenvolvam mecanismos de controle da transpirao. As clulas superficiais de alguns tecidos
vegetais, principalmente folhas, apresentam uma camada cerosa (cutcula) que impede a perda
excessiva de gua do interior dos tecidos por evaporao. Alguns rgos como folhas, caules
jovens, entre outros, possuem conjuntos de clulas especializadas, chamados estmatos. Estes,
so portadores de mecanismos de abertura e fechamento, permitindo a troca de gases entre o
interior da planta e o ambiente, em diferentes momentos, de acordo com o processamento
fotorrespiratrio. Alm da respirao, os estmatos so responsveis pela eliminao de gua na
forma de vapor para controlar a temperatura, pois, graas ao elevado calor especfico da gua, a
evaporao faz com que sejam resfriadas as molculas adjacentes quelas evaporadas,
amenizando o excesso de temperatura do rgo. Em condies de estresse hdrico associado
baixa umidade relativa do ar, os estmatos permanecem fechados para evitar a desidratao dos
tecidos.
No interior dos frascos de cultivo in vitro a umidade relativa do ar sempre prxima a
100%, e a radiao luminosa bastante reduzida. Nesse ambiente, h pouca exigncia do
sistema de fechamento dos estmatos em funo de no haver restrio de gua. Isso faz com
que as clulas responsveis por este processo sejam pouco exigidas. Alm disso, outra
modificao importante, em conseqncia da elevada umidade do ar, a formao de uma
cutcula pouco espessa e, conseqentemente, com baixa eficincia no controle de perda de gua
nas condies naturais de cultivo.
Em folhas de plantas desenvolvidas in vitro, a densidade de tecido palidico menor.
Nesses tecidos, localizam-se os cloroplastos, que so as clulas responsveis pela assimilao da
energia da luz e o processo de fotossntese. Para a adaptao condio de autotrofismo, h
necessidade da habilitao desses tecidos a desenvolverem condies de captao de energia
91

luminosa necessria para o processo de fotossntese que, em condies in vitro, compensada


pelas substncias disponveis no meio de cultivo.
A alta disponibilidade de lquido no ambiente in vitro, condiciona maior ocorrncia de
osmose e difuso nos processos de absoro de gua e nutrientes. Isto explica o fato da
irrelevncia da existncia de razes nas plantas em desenvolvimento dentro dos frascos. Por
outro lado, esse processo dificulta a comunicao entre os vasos condutores do sistema areo
com as razes, as quais devero ser emitidas para a sobrevivncia no ambiente natural. Outro
aspecto importante a ser considerado, a baixa eficincia das razes desenvolvidas nos meios de
cultivo in vitro. A reduzida quantidade de plos absorventes, ou at mesmo a sua inexistncia,
pode impossibilitar a funcionalidade dessas razes e forar a sua substituio durante a fase de
aclimatizao.
10.3. PREPARAO DAS PLANTAS PARA A FASE DE ACLIMATIZAO
Algumas tcnicas podem ser adotadas durante a fase final do cultivo in vitro, no sentido
de preparar as plantas para que a mudana de ambiente no seja to prejudicial.
Depois das primeiras fases in vitro, quando as brotaes apresentam condio de
tamanho e forma que possibilitem a identificao das principais estruturas da parte area, o
momento de iniciar a preparao para a aclimatizao. A maioria das espcies, principalmente
as herbceas, so submetidas a uma fase de enraizamento in vitro atravs do favorecimento de
um equilbrio hormonal que induza a formao de razes (Figura 10.1). Alm disso, a induo
formao de razes pode ser otimizada atravs do escurecimento do meio com a utilizao de
carvo ativado. Este sistema amplamente utilizado, principalmente na micropropagao de
orqudeas.

Figura 10.1: Mudas de Syngonium sp enraizadas in vitro, aptas para a fase de aclimatizao
(Imagem: CSFior, JB/FZB-RS).
Para muitas espcies, principalmente as lenhosas arbreas (Figura 10.2), a induo
formao das razes pode ser realizada poucos dias antes da transferncia para ambiente ex vitro,
pois primrdios radiculares induzidos nessa etapa, podem converter-se em razes funcionais no
92

ambiente in vivo. Outra forma adotada a imerso temporria em soluo com auxina e
posterior instalao no substrato in vivo

Figura 10.2: Brotaes de Persea wielldenovii em fase de induo ao enraizamento in vitro


(Fior et al, 2007).
A induo ao incio da condio autotrfica pode ser promovida atravs da manuteno
das plantas em meios de cultivo pobres em sais, com baixa concentrao de sacarose e de
citocininas, na ltima fase in vitro.
Outra alternativa a passagem por uma etapa de cultivo em meio lquido antes da
retirada para a aclimatizao. Trabalhos comprovam que, para muitas espcies, razes emitidas
nessas condies apresentam maior formao de plos absorventes, os quais sero
indispensveis para a absoro de nutrientes e gua na etapa subseqente s fases in vitro. Nesse
caso, adequada, tambm, a reduo da concentrao dos nutrientes e, principalmente, a fonte
de carbono.
A adaptao de salas de crescimento de forma a permitir a entrada de luz natural na fase
final do processo in vitro, outro mtodo que tem permitido bons resultados na sobrevivncia
aclimatizao, alm de reduzir o tempo para o desenvolvimento. Essa tcnica tem sido utilizada
com sucesso para plantas lenhosas como o eucalipto. A elevao da intensidade luminosa,
auxilia no aumento da fotossntese, aproximando a etapa de cultura in vitro das condies
autotrficas. Isto ainda pode ser otimizado se maiores concentraes de gs carbnico forem
fornecidas no interior dos frascos.
aconselhvel que se reduza gradativamente a umidade do ar no interior dos frascos,
dessa forma, se acelera a capacitao dos estmatos para o controle da perda de gua. Alm
disso, permite o espessamento da cutcula, pouco desenvolvida no ambiente in vitro. A abertura
gradual das tampas dos frascos, ainda na sala de crescimento, por 4 a 6 dias antes da retirada
das plantas, uma prtica simples que pode viabilizar esses processos.
Outra tcnica adotada por alguns laboratrios submeter as plantas recm retiradas dos
frascos de cultivo a uma imerso da base das mesmas em gua, por cerca de quatro a cinco dias,
mantendo-as na sala de crescimento. Aps esse perodo, as plantas so transferidas para
substratos adequados e levadas para casa de vegetao com sistema de nebulizao, reduzindo
gradualmente a freqncia de regas.
93

Devido alta concentrao de nutrientes e acares no meio de cultivo, importante


que seja adotado um sistema cuidadoso de retirada dos resduos de meio das mudas que sero
instaladas em condies no asspticas, pois, mesmo microorganismos saprfitas, podem
prevalecer sobre as plantas se esses cuidados no forem adotados. A lavagem das mudas com
gua morna pode auxiliar na remoo do meio.
10.4. AMBIENTE EX VITRO
Retiradas dos frascos de cultivo, as plantas so transferidas para substratos e ambientes
comuns aos cultivos in vivo, precisando, para tanto, condicionar o sistema de absoro de
umidade e nutrientes, alm de intensificar a fotossntese, passando para um estado autotrfico.
Alm disso, no ambiente ex vitro, fica sujeita ao ataque de microorganismos.
O ambiente para a fase de aclimatizao construdo de acordo com a demanda do
laboratrio que produzir as mudas e as espcies que sero aclimatizadas. Podem variar desde
casas de vegetao climatizadas, tneis plsticos ou, simplesmente, pequenas cabanas montadas
sobre bacias na prpria sala de crescimento do laboratrio.
Um dos principais cuidados a serem tomados a limpeza de todo o material a ser
utilizado. Isto evitar prejuzos com organismos saprofticos e, eventualmente, patognicos.
Uma vez introduzidos, estes organismos encontram condies favorveis para seu
desenvolvimento e, na maioria das vezes, ausncia de inimigos naturais.
10.4.1. Umidade
A umidade um dos principais fatores que influenciam a fase de aclimatizao de
plantas ex vitro. Na primeira semana aps a retirada das plantas dos frascos, o percentual de
umidade relativa do ar deve ser prximo a 100%. Para tanto, sistemas de nebulizao
intermitente podem ser montados em locais estratgicos, prximos aos laboratrios.
Temporizadores (timers), com programao de freqncia e tempos de rega adaptados para cada
situao, so amplamente utilizados acoplados a bombas eltricas, dispensando, assim, a
necessidade de acionamento manual dos sistemas. Aparelhos digitais ou analgicos so
facilmente encontrados em casas especializadas, adaptando-se a variadas situaes. Deve-se,
contudo, estar atento s variaes naturais de temperatura e umidade do ambiente, alterando as
freqncias, ou at mesmo desligando o aparelho em determinados perodos, no sentido de
evitar excesso de gua.
Alternativo aos temporizadores, so os aparelhos que funcionam atravs do chamado
sistema de raquete, cujo funcionamento acionado conforme a evaporao de gua
depositada sobre determinada superfcie, sendo diretamente influencia pela demanda
evaporativa do ar no ambiente. Nesse caso, em perodos chuvosos, quando a umidade
naturalmente mais elevada, a freqncia de irrigao ser reduzida sem a necessidade da
interveno no controlador. Desta forma, otimiza-se o aproveitamento da gua, energia eltrica
e mo de obra.
Mecanismos mais sofisticados utilizam sensores de umidade e temperatura, interligados
com sistemas informatizados, os quais controlam o acionamento da irrigao.
Em situaes que o nmero de plantas reduzido e no se dispe de sistemas de
nebulizao, existe a opo das pequenas cabanas com coberturas plsticas ou TNT (fibras
sintticas prensadas) montadas sobre bancadas em casas de vegetao (Figura 10.3), ou mesmo
prximo a janelas, no interior do laboratrio. Assim, atravs da irrigao por pulverizaes
manuais, algumas vezes ao dia, cria-se um ambiente com umidade suficiente para evitar a
desidratao das plantas.
94

Figura 10.3: Aclimatizao de Limonium platyphyllum sob estrutura coberta por TNT
montada sobre bancadas em casa de vegetao. (Imagem: CSFior, FA/UFRGS).
Quando o nmero de plantas baixo, os recipientes de cultivo podem ser pequenos
vasos que, aps irrigados, so cobertos individualmente com saco plstico transparente
formando um microambiente . Em seguida, so mantidos em local fresco e sombreado. Aps
alguns dias (em torno de uma semana), so feitos furos no plstico, a fim de habituar
gradualmente as plantas condio de menor umidade do ar. A cada dia, os furos so
aumentados, em nmero e/ou tamanho, podendo-se remover totalmente os sacos aps 15 a
20 dias.
Outra alternativa vivel o sistema floating, em que as plantas permanecem em
substratos apropriados, em bandejas flutuantes sobre uma piscina com gua ou soluo
nutritiva. Sobre as bandejas, pouco acima das plantas, so montadas cabanas com plstico ou
TNT, com o propsito de manter a umidade relativa do ar em nveis altos. Este sistema muito
prtico e apresenta bom resultados para muitas espcies. No entanto, no recomendado que
as plantas permaneam durante todas as horas do dia em contato direto com a gua da piscina.
O ideal que sejam retiradas durante a noite. Alm disso, as plantas aclimatizadas pelo sistema
floating devem passar por uma fase ps-aclimatizao em condies de menor umidade do
substrato para adaptao do sistema radical. Outro cuidado essencial para utilizao do sistema
floating a preveno contra a contaminao das piscinas com agentes fitopatognicos, pois,
uma vez introduzidos, podem contaminar 100% das plantas atravs da soluo de irrigao.
Independente do recurso utilizado, o importante a manuteno de elevada umidade do
ar, associada hidratao do substrato.
A manuteno de alta umidade, associada a temperaturas amenas e elevadas, pode
ocasionar proliferao de microorganismos patognicos, o que provoca perdas significativas.
Por isso, todos os cuidados fitossanitrios preventivos devem ser tomados no ambiente onde as
plantas permanecero, principalmente nos primeiros dias de aclimatizao. Pulverizaes
peridicas com fungicidas, alternando diferentes ingredientes ativos, alm do uso de barreiras
fsicas entrada de insetos, so medidas muito importantes para manter a sanidade das plantas.

95

10.4.2. Substrato
O substrato adequado para obteno de bons ndices de sobrevivncia de plantas na fase
de aclimatizao deve apresentar elevado espao de aerao, mediana capacidade de reteno de
gua, baixo teor total de sais solveis (igual ou inferior a 2g L-1), e, principalmente, isento de
propgulos de microorganismos patognicos e plantas invasoras. Para tanto, salienta-se a
importncia da desinfestao do substrato antes da sua utilizao.
Durante a primeira semana de aclimatizao, deve-se evitar substratos ricos em
nutrientes, pois, durante esta fase, a assimilao dos minerais pelas plantas muito baixa,
principalmente em funo do estresse causado pela mudana brusca no ambiente. Alm disso,
esse cuidado favorecer o desenvolvimento radical, uma vez que a planta dever emitir razes
para procurar os nutrientes.
Dentre os inmeros materiais que podem ser utilizados para aclimatizao de plantas,
so aqui descritos alguns dos mais comuns.
10.4.2.1. Vermiculita
de origem mineral, amplamente utilizado principalmente como componente de
misturas. produzida a partir de rochas formadas por vrias camadas muito finas e delgadas,
separadas por quantidades microscpicas de gua. Quando exposta temperatura de,
aproximadamente, 1090 C a evaporao desta umidade faz com que sejam formados espaos
porosos que no se desfazem aps o resfriamento. Esses espaos, oferecero elevada
porosidade ao substrato. Quando a vermiculita umedecida, passa de um peso seco de 90 a 150
Kg m-3, para 400 a 500 Kg m-3 aps a hidratao.
A disponibilidade de nutrientes pelo substrato formado por vermiculita muito baixa.
Esto presentes em maior quantidade, porm com baixa expresso, o magnsio e o potssio.
um importante substrato para utilizao em aclimatizao de plantas. Alm da baixa
densidade e alta porosidade, no h necessidade de desinfestao porque o processo de
fabricao elimina qualquer propgulo. No entanto, cuidados devem ser tomados para que no
ocorra contaminao no depsito ou durante a preparao para o uso.
A vermiculita oferecida em diferentes granulometrias, cor branca a parda,
comercializada em embalagens de 50 ou 100 litros. facilmente encontrada em agropecurias e
lojas especializadas em insumos para horticultura.
10.4.2.2. Perlita
Apresenta caractersticas fsicas semelhantes vermiculita. fabricada a partir de
rochas jovens, formadas pelo escorrimento de lavas vulcnicas. Durante o processamento, as
rochas so triturada e, posteriormente aquecidas a 760 C. Semelhante ao que acontece com a
vermiculita, a evaporao da umidade presente no interior dos agregados, faz com que ocorra a
expanso dos espaos internos, aumentando a porosidade.
Quando seca, o peso no ultrapassa 130 kg m-3. Depois de hidratada, pode aumentar at
quatro vezes seu peso. Possui pH entre 7 e 8, e no oferece nutrientes para manuteno das
plantas.
Sua utilizao em aclimatizao pode ser pura ou em misturas.
A perlita comercializada em forma de grnulos de cor branca, com dimetro de 1,6 a 3
mm, podendo, tambm, ser encontrada em lojas de insumos.

96

10.4.2.3. Areia
Apesar de sua elevada densidade (cerca de 1250 Kg m-3) a areia pode ser empregada para
aclimatizao, principalmente em misturas com outros substratos. de fcil aquisio e no
apresenta caractersticas qumicas indesejadas para as plantas. No entanto, deve ser utilizada
com critrio devido a sua baixa reteno de gua e a necessidade de limpeza e desinfestao,
principalmente quando a origem no conhecida.
10.4.2.4. Turfa
Distinguem-se aqui, dois diferentes tipos de turfas assim denominadas: a decomposta e a
turfa de esfagno.
A turfa decomposta formada por resduos orgnicos parcialmente compostados sob
condies anaerbicas, o que ocorre em regies pantanosas. A formao das turfeiras um
processo lento que acontece ao longo de dezenas ou centenas de anos. Em funo disso, e da
importncia do nicho natural delas, sua extrao controlada por rgos ambientais. Contudo,
a indstria de substratos, principalmente na regio sul do Brasil, tem utilizado a turfa em grande
escala.
As principais vantagens da turfa decomposta so a reteno de gua, a baixa densidade e
o elevado espao de aerao, principalmente as turfas fibrosas. Dependendo da condio e do
tempo de formao, podem ser identificadas turfas com variadas propores de fibras, sendo
esta caracterstica inversamente proporcional ao estdio de decomposio. Passando do
avermelhado, marrom, at o preto, proporcionalmente ao estdio de mineralizao.
A turfa decomposta apresenta algumas restries ao uso, principalmente devido ao pH
baixo (prximo a 4).
A turfa de esfagno, por sua vez, um material pouco decomposto, originado de uma
vegetao caracterstica das regies frias de ambos os emisfrios (Sphagnum spp, Hypnum spp e
outros). Possui como principal caracterstica a alta capacidade de reteno de gua, podendo
chegar a 15 vezes o seu peso. Empresas tm explorado a extrao e beneficiamento deste
material, principalmente no Canad.
10.4.2.5. Cascas de rvores e resduos de madeira
Quando tratados de forma adequada, estes resduos da indstria madeireira, apresentam
propriedades interessantes para o uso como substrato. No entanto, cuidados devem ser
tomados no sentido de evitar problemas, principalmente com a decomposio incompleta, o
que torna o material instvel e, se assim utilizado, desencadeia problemas nutricionais para as
plantas, basicamente relacionados ao desequilbrio de nutrientes.
A fim de corrigir possveis desequilbrios, ou oferecer nutrientes em formas de adubao
de base, alguns produtores de substratos incluem fertilizantes qumicos entre os componentes
da mistura. Esta prtica pode no ser adequada em substratos para aclimatizao por motivos
aqui j citados.
Contudo, indstrias produtoras de substratos esto utilizando materiais em grande
escala, puros ou misturados a outros componentes, atendendo perfeitamente a necessidades de
muitos cultivos.
10.4.2.6. Casca de arroz carbonizada

97

Este um dos materiais mais interessantes para aclimatizao de plantas, pois apresenta
elevada porosidade, alta estabilidade, e baixo teor total de sais solveis. Alm disso, o baixo
custo, principalmente na regio sul do Brasil, permite que a casca de arroz carbonizada seja
amplamente utilizada, tanto pura (em aclimatizao, estaquia, etc) como componente de
mistura (Figura 10.4).

Figura 10.4: Aclimatizao de Gypsophilla paniculata em casca de arroz carbonizada e turfa


(2:1) (Imagem: CSFior, FA/UFRGS).
A elevada porosidade da casca de arroz carbonizada, associada a sua baixa reteno de
gua, pode ocasionar problemas, principalmente se o sistema de irrigao no for manejado de
forma correta, pois, em funo da elevada drenagem, h necessidade de uma maior freqncia
de irrigao, a fim de evitar a desidratao do sistema radical das plantas.
A mistura com outros componentes de maior reteno de gua pode favorecer,
principalmente nas pocas de maior demanda evaporativa do ambiente. Citam-se, como
interessantes combinaes, a mistura com turfa, p de coco, vermiculita, perlita, entre outros.
Salienta-se aqui a diferena entre a casca de arroz carbonizada e a casca de arroz
queimada (ou cinza de casca de arroz), cujas caractersticas fsicas da primeira, destacam-se,
basicamente, pela manuteno e estabilidade das partculas.
10.4.2.7. P de coco e fibra de coco
So substratos produzidos a partir do p oriundo do processo de separao das fibras
do fruto do coco, e das fibras propriamente ditas.
Apresenta-se como uma excelente alternativa para aclimatizao de plantas em funo
das caractersticas fsicas, principalmente a elevada porosidade, podendo chegar a mais de 95%,
associada reteno de gua. Contudo, h necessidade de conhecer a composio qumica, em
funo da possibilidade do alto teor de sais solveis. O que pode ser de maior ou menor
proporo dependendo da procedncia do material e do processamento adotado durante a
fabricao.
A estabilidade do material outra caracterstica importante destes substratos. A lenta
decomposio e a constituio das partculas oferecem alta uniformidade ao longo do cultivo.
Este aspecto muito importante, principalmente quando se trabalha com plantas ou fases de
98

cultivo que necessitam longo tempo no mesmo recipiente. o caso da aclimatizao e


desenvolvimento ps-aclimatizao das plantas lenhosas de crescimento lento.
10.4.2.8. Espuma fenlica
Tambm utilizada por floristas como suporte para arranjos, estes materiais so
fabricados atravs de resinas fenlicas de origem sinttica. So comercializados em diferentes
formatos, desde barras macias de diferentes tamanhos e formas, at placas com espessura
entre 2 a 8 cm, nas quais so marcados, superficialmente, pequenos quadrados para a instalao
das mudas, ou sementes, dependendo da finalidade, podendo ser destacados individualmente
com as plantas no momento da transferncia para outro recipiente.
Apesar de sinttico, este material biodegradvel e pode ser mantido com a planta
quando esta for instalada no vaso ou canteiro definitivo.
10.4.2.9. Argila expandida
fabricada a partir de argila hidratada, submetida a altas temperaturas. A evaporao da
gua dos espaos internos da argila, aumenta seu volume, diminuindo sua densidade.
Originalmente fabricada para utilizao na construo civil, a argila expandida foi
gradualmente sendo introduzida no cultivo de plantas. Apresenta baixa densidade, alta
porosidade e baixa reteno de gua.
Para uso em aclimatizao, devem ser adotados alguns critrios, principalmente no
sentido de evitar a desidratao das razes em formao. No entanto, mesmo utilizada pura,
apresenta alto potencial para aclimatizao de epfitas, principalmente orqudeas e bromlias
(Figura 10.5)

Figura 10.5. Aclimatizao de Bromlia sp em argila expandida triturada. (Imagem:


CSFior, JB/FZB-RS).
10.4.3. Recipiente
Em alguns dos tpicos anteriores salientou-se a importncia da escolha dos materiais e
mtodos, em funo da escala de produo. Com isso, podero ser utilizados, desde vasos com
tamanhos variados, at bandejas coletivas com volume de apenas alguns mililitros para cada
planta.
Os recipientes individualizados so teis na aclimatizao em pequena escala, quando se
trabalha com pequenas tendas midas ou outras adaptaes, conforme citado anteriormente.
Um dos recipientes mais utilizados na aclimatizao so as bandejas multicelulares.
Feitas de diversos materiais (polietileno, celulose, poliestireno, etc) e de diferentes nmero de
clulas, podem satisfazer plenamente s necessidades de aclimatizao em grande escala.
99

As principais vantagens das bandejas residem no manejo das plantas em grupos, na


economia com substrato e o baixo custo de aquisio.
As bandejas de poliestireno expandido so amplamente utilizadas. As mais comuns tm
entre 128, 200, 242 e 288 clulas cada (Figura 10.6). No entanto, alguns produtores esto
preferindo materiais alternativos ao poliestireno em funo da dificuldade de desinfestao das
bandejas, pois, na prtica, verificou-se que resduos de substratos se acumulam nos poros das
paredes das clulas da bandeja, o que pode servir de refgio para microorganismos causadores
de doenas em plantas. Alm disso, dependendo da espcie em desenvolvimento, ocorre a
penetrao das razes nestes mesmos espaos, prejudicando a planta e destruindo o torro no
momento da retirada da bandeja.

Figura 10.6: Uso de bandejas multicelulares como recipientes para aclimatizao. A:


Limonium platyphyllum em bandeja de 242 clulas. B: Musa sp em bandeja de 72 clulas (Imagens:
CSFior, JB/FZB-RS e FA/UFRGS)
Alternativas tm sido encontradas em bandejas de mesmo formato, porm fabricadas a
partir de polietileno. Estas, apesar de terem custo mais elevado, so mais durveis, de fcil
limpeza, alm de no terem paredes porosas como o poliestireno.
Trabalhos tm mostrado que, para recipientes com diferentes alturas, h necessidade do
uso de substratos com diferenciado espao de aerao. Ou seja, o espao de aerao do
substrato deve ser inversamente proporcional altura do recipiente a ser utilizado.
Este mais um aspecto a ser considerado, principalmente porque o sucesso da
aclimatizao depende da qualidade do sistema radical das mudas, que, por sua vez, depender
de um adequado aporte de oxignio.
10.4.4. Adubao
A adubao das plantas no estdio de aclimatizao no aconselhada durante a
primeira semana. Em funo das diversas adaptaes anatmicas e fisiolgicas sofridas nessa
etapa, o estresse pelo qual a planta submetida faz com que o aproveitamento dos nutrientes e
aminocidos induzidos pela adubao no seja eficiente. Assim, a proteossntese ser
desfavorecida, aumentando a circulao de aminocidos livres na planta, conseqentemente,
tornando-a mais suscetvel ao ataque de doenas, ou mesmo pragas que, porventura, estejam
presentes no ambiente.
Passada esta primeira etapa, inicia-se a aplicao de soluo nutritiva de forma gradativa,
desde baixa concentrao salina (0,5 a 1 g L-1) nas primeiras aplicaes, at no mximo, 3 g L-1,
para as plantas mais exigentes.
A frequncia das adubaes depender do sistema utilizado e da temperatura mdia do
ambiente. No caso do sistema de nebulizao intermitente, com temperaturas prximas s
100

ideais para as espcies em aclimatizao, pode-se aplicar a cada dois ou trs dias. O mais
importante respeitar a condio e a tolerncia da planta, para que no seja adubado em
excesso.

101

Captulo 11
Cultivo de embries e semeadura in vitro

11.1. INTRODUO
Sob o ponto de vista prtico, o cultivo de embries in vitro permite estudar as
necessidades nutricionais e fsicas para o seu desenvolvimento, superar a dormncia em certos
tipos de sementes, testar a viabilidade das sementes e salvar embries hbridos imaturos
oriundos de cruzamentos incompatveis.
Espcies da famlia Orquidaceae apresentam alguns aspectos que s diferenciam quanto
produo de mudas via sementes. Suas sementes so muito pequenas e contm pouqussimas
reservas de nutrientes. Para que ocorra a germinao em condies naturais, h necessidade de
situaes ambientais favorveis e a presena de fungos micorrzicos que auxiliam na nutrio do
embrio para a sua germinao e desenvoolvimento inicial da plntula. Em condies artificiais,
ou seja, o estabelecimento dessas sementes em meio de cultivo, no h necessidade da presena
do fungo porque o prprio meio supre adequadamente o embrio com nutrientes e
carboidratos. Alm disso, a semeadura de orquideas in vitro permite o aproveitamento maior das
sementes, uma vez que o percentual de germinao ser superior, bem como a sobrevivncia
das plntulas, pois in vitro as condies ambientais so menos adversas.

11.2. PREPARO DAS SEMENTES PARA CULTIVO DE EMBRIES


Os embries esto localizados num ambiente estril dentro do vulo e, portanto, antes
de sua remoo a superfcie externa da semente, ou do fruto, deve ser desinfestada. Por esta
razo, o ndice de contaminao em cultura de embries usualmente muito menor do que em
outros tipos de cultura in vitro. O processo de desinfestao pode ser o mesmo normalmente
utilizado em cultura de tecidos: imerso em etanol 70% por 1 minuto e posteriormente em
hipoclorito de sdio 1,5% por 20 minutos.
11.3. EXTRAO DOS EMBRIES
A extrao dos embries deve ser realizada em cmara de fluxo laminar, sob
estereomicroscpio quando os embries so pequenos, com auxlio pina, bisturi, estilete, etc.
O isolamento de um embrio imaturo, embebido em endosperma lquido,
frequentemente envolve uma inciso na extremidade micropilar do vulo jovem e a aplicao
de presso na extremidade oposta para forar a sada do mesmo. importante que os embries
no sejam injuriados durante esta operao.
Quando so excisados embries no estdio de corao ou mais jovens importante
manter o suspensor intacto. O suspensor um rgo que faz a conexo do embrio em
desenvolvimento ao tecido maternal, responsvel pela biossntese de hormnios endgenos e
transporte de nutrientes. Nos embries maduros este suprimento feito pelos cotildones.
Durante o processo de exciso os embries devem ser mantidos com suficiente umidade
at serem transferidos para o meio de cultivo. Embries muito pequenos, se embebidos em
meio lquido, podem ser transferidos com o auxlio de micropipetas.

102

11.3.1. Fases do embrio


O embrio maduro, com raras excees, uma estrutura bipolar plenamente
desenvolvida, consistindo de um meristema em cada extremidade; a radcula ou primrdio
radicular e plmula ou primrdio foliar e, um ou dois apndices laterais, os cotildones.
O termo pr-embrio utilizado para designar aqueles estdios de desenvolvimento
do embrio que precedem a iniciao dos cotildones. Os estdios iniciais, como globular e
cordiforme, so apropriadamente considerados como pr-embries, embora a distino entre
embries e pr-embries seja, s vezes, arbitrria.
11.3.2. Germinao precoce
Um princpio importante que governa a germinao da semente o gradual aumento do
tamanho do embrio e a proporcionalidade de crescimento de suas diferentes partes para
produzir um seedling.
A germinao precoce caracterizada por um perodo de rpidas divises celulares, no
acompanhadas por alongamento da clula. Ao nvel celular, a germinao precoce no
fundamentalmente diferente da germinao normal, exceto que mitoses so limitadas a
meristemas e que clulas formadas esto sujeitas a vacuolizao e alongamento, resultando em
caules, folhas e razes incomumente longos.
Entre os fatores capazes de suprimir a germinao precoce, cita-se a elevada presso
osmtica, nvel elevado de nitrognio, cido abcsico (ABA), baixa tenso de oxignio e alta
concentrao de potssio. A adio de GA (cido giberlico) ou cinetina induziu a germinao
precoce em embries de cevada, enquanto o ABA a suprimiu e neutralizou os efeitos do GA.
Meios com alta concentrao de sacarose tm sido usados na cultura de embries
imaturos excisados, promovendo o desenvolvimento embrinico e suprimindo a germinao
precoce.
11.3.3. Papel dos cotildones
As evidncias disponveis favorecem a hiptese de que o crescimento de razes e parte
area de embries em cultura depende da presena contnua de cotildones e que, quanto maior
a poro de cotildones removida, tanto mais inibido ser o desenvolvimento dos embries.
Os cotildones podem promover o crescimento do eixo embrionrio, tanto por fornecer
uma maior superfcie de absoro de nutrientes, como por suprir metablitos crticos para o
crescimento.
Outra preocupao consiste em se demonstrar a capacidade de partes do embrio em
regenerar plantas inteiras. Parece que apenas seguimentos de embrio constitudo do meristema
apical so capazes de regenerar plantas inteiras em cultura.
Em alguns casos, a habilidade regenerativa de segmentos do embrio em cultura,
combinada com o potencial de desenvolvimento de gemas iniciais sobre eles, tem oferecido a
possibilidade de produzir seedlings mltiplos a partir de um nico embrio. Em Cajanus cajan foi
possvel obter acima de 3 seedlings de um nico embrio pelo cultivo separadamente da plmula
e dos dois primrdios de gemas axilares dos interns cotiledonares.
11.4. CONDIES DE CULTIVO
11.4.1. Meio de cultivo
Existem dois estdios bsicos de crescimento dos embries no que dizem respeito s
suas exigncias nutricionais. O heterotrfico, no qual o embrio se nutre s custas do

103

endosperma, se estende desde a fertilizao at aproximadamente o estdio de corao. O


autotrfico se inicia no estdio tardio de corao.
Quanto mais jovens os embries, mais difcil o cultivo in vitro devido ao seu pequeno
tamanho e danos durante a exciso e, mais complexas so suas exigncias nutricionais.
Embries maduros germinam e crescem em meio simples constitudo de sais inorgnicos e uma
fonte de energia, a sacarose. Por outro lado, os pr-embries so dependentes no s dos
metablitos presentes em suas clulas, mas tambm daqueles que se difundem do endosperma;
eles requerem diferentes combinaes de vitaminas, aminocidos, reguladores de crescimento e,
em alguns casos, extrato de endosperma, a exemplo do leite de coco. As formulaes utilizadas
so muito variveis e em sua maioria foram determinadas aleatoriamente. Definir o meio de
cultivo que possa sustentar o crescimento e desenvolvimento de embries imaturos se constitui
no aspecto mais importante da cultura de embries.
Sais Inorgnicos: os meios bsicos White (1963), MS (Murashige & Skoog, 1962) e B5
(Gamborg et al., 1968) com algumas adaptaes, so os mais usados nos trabalhos de cultura de
embries.
Carboidratos: a sacarose a fonte de energia mais comumente utilizada para cultura de
embries. Os carboidratos promovem o crescimento das razes ou dos primrdios radiculares e
foliares e so necessrios para uma efetiva vernalizao de embries isolados e desempenham
um papel importante na manuteno da osmolaridade apropriada no meio de cultivo. De modo
geral, quanto mais jovens os embries, tanto maior ser a osmolaridade requerida para o meio.
Embries de Datura no estdio de pr-corao (0.1 mm) exigiram 8-12 % de sacarose; corao
tardio (0.2 mm) 4 %; torpedo precoce (1 mm) 1 %; torpedo (2 mm) 0.1 % e embries quase
maduros cresceram mesmo sem sacarose.
Exemplos de concentraes de sacarose que proporcionaram melhor crescimento de
embries imaturos de diferentes espcies: 12 % de sacarose em embries de cevada (0,6 m) e
linho nos estdios globular e corao; 9 % para embries de cevada (0,2 - 0,8 mm), os quais
aps 9 a 13 dias de cultura foram transferidos para 6% e 3 %, respectivamente.
Desenvolvimento normal e germinao de embries excisados de milho (0,3 a 1,0 mm) foram
obtidos com 5 % de sacarose. Embries de arroz com 5-6 dias de idade cultivados em meio
com 4% de sacarose produziram melhores seedlings do que em 3 % e 6 %. Embries de pepino
na forma de corao (0,1 - 0,8 mm) foram cultivados em 3,5 % de sacarose.
Nitrognio: apesar dos meios de cultura serem supridos principalmente com nitrognio
inorgnico na forma de nitrato, nitrito ou amnio, a adio de vrios aminocidos, isolados ou
em combinao, exerce influncia significativa sobre o crescimento e desenvolvimento de
embries. O amnio, quando usado, preferivelmente combinado com um cido orgnico,
especialmente malato ou citrato. A adio de malato de amnio junto com glutamina em meio
com elevado teor de sais de potssio e baixo de sacarose (0,2 M) resultou num aumento do
crescimento de embries (0,2 - 0,4 mm) de cevada. Quando 4 g.L-1 de malato de amnio foram
includos em meio com valor osmtico de 8 atm, houve excelente crescimento de embries (0,2
- 0,3 mm) de algodo no estdio de corao.
Entre os vrios aminocidos, a glutamina foi o mais efetivo para estimular o crescimento
de embries in vitro em algumas espcies de crucferas, leguminosas, gramineas, etc. A
asparagina tem se mostrado efetiva para algumas espcies e inibitria para outras. A casena
hidrolisada (400 mg.L-1), uma mistura complexa de aminocidos, comumente utilizada para
estimular o crescimento de embries.
104

Vitaminas: as vitaminas tm sido includas em vrios meios empregados em cultura de


embries, no entanto, no tm se mostrado indispensveis, pois, provvel que sendo
autotrficos, os embries so capazes de satisfazer sua necessidade em vitaminas pela
biossntese celular.
Extratos Naturais: uma importante contribuio cultura de embries foi fornecida
adicionando gua de coco (AC) ao meio de cultivo e conseguindo com isto que pequenos
embries crescessem at a maturidade. Subsequentemente, a AC se transformou em um dos
suplementos mais comumente usados na cultura de embries imaturos ou de outros rgos e
tecidos. Presumivelmente, a AC supre as deficincias de certos acares, vitaminas,
aminocidos, hormnios e outros metablitos crticos do meio de cultivo. A gua de coco tem
sido efetiva em estimular o crescimento de embries de diversas variedades de coco, de canade-acar, de cevada, embries de tomate com 20 dias, embries de cenoura com 0,45 - 0,60
mm, embries imaturos de hbridos interespecficos de Vigna e, em alguns casos, no tem
mostrado efeito positivo, ou mesmo, tem apresentado efeitos inibitrios. A AC normalmente
utilizada numa concentrao de 15% e parece ser resistente ao calor, podendo, portanto, ser
esterilizada por filtragem ou autoclavagem.
Efeitos positivos de extratos naturais de plantas sobre o crescimento de embries in vitro
tm sido registrados em muitos casos: extrato de sementes de milho sobre embries de milho;
extrato de megagametfitos de Gingo sobre embries de Gingo; extrato de vulos de Datura
sobre embries de Datura; extrato de tmara e banana, glten hidrolizado de trigo e suco de
tomate (o mais efetivo) sobre embries de cevada; suco de pepino sobre embries hbridos
entre Citrus unshiu x Poncirus trifoliata; extrato de sementes de Datura, Sechium e Lupinus sobre
embries de Datura; AC, extrato de levedura e turfa (o mais efetivo) sobre embries de Ciclama.
A adio de tecidos de endosperma ao meio de cultivo pode induzir resultados positivos
na cultura de embries imaturos. So exemplos: endosperma de cevada colocado sobre o gar
ao redor do embrio (0,5 mm) de cevada; endosperma leitoso de milho sobre embries de
Hordeum e Triticum; endosperma do progenitor feminino sobre embries (menores que 2 mm)
hbridos de Hordeum x Triticum; endosperma imaturo macerado de Triticum sobre embries
hbridos de Triticum x Secale; endosperma de cruzamentos interclonais sobre embries
interespecficos (0,3 - 0,4 mm) de Lilium; endosperma de Trifolium, Lotus e Ornithopus sobre os
prprios embries.
O carvo ativado, por adsorver substncias inibitrias do meio ou produtos txicos
liberados pelos explantes, tambm pode promover o crescimento dos embries.
Reguladores de Crescimeto: os reguladores de crescimento normalmente no so
requeridos na cultura de embries, exceo feita para embries muito jovens de algumas
espcies, onde eles so adicionados para suprimir a germinao precoce ou estimular o
crescimento embrinico.
Auxinas
Apesar dos efeitos inibitrios das auxinas, aplicaes em concentraes extremamente
baixas resultam numa significativa promoo do crescimento do primrdio radicular.
O crescimento das razes e brotos, pela adio de auxina (AIA) em baixas
concentraes, tem sido documentada em embries de vrias espcies.

105

Citocininas
Os efeitos de citocininas so extremamente complexos devido sua interao com
auxinas e caseina hidrolizada, alm de ser dependente da idade dos embries na ocasio da
exciso. As citocininas combinadas com o AIA podem promover o crescimento e diferenciao
de embries.
Giberelinas
Existem muitas informaes sobre os efeitos do cido giberlico (GA) em embries
maduros extrados de sementes dormentes que no germinam, mesmo em condies ideais. Os
efeitos do GA3 so explicados por duas hipteses: 1) ele promove o desenvolvimento
ontogentico dos embriides sem primrdio radicular queles com primrdio, que ento
desenvolvem razes na ausncia de substncias exgenas de crescimento; 2) proporciona
diretamente a iniciao de uma zona meristemtica radicular e/ou estimula o desenvolvimento
de uma zona radicular j existente.
O GA3 promove o crescimento do eixo em embries de algodo por diviso celular e
dos cotildones por expanso celular. O tratamento com GA diminui o contedo de
carboidratos e nitrognio dos embries e pode ser que o hormnio atue mais no sentido de
diluir os constituintes da clula do que induzindo a sntese de novas macromolculas. A
incorporao de GA3 (1 mg.L-1) aumenta o desenvolvimento de razes em embries plenamente
ou parcialmente desenvolvidos de citros, enquanto que hormnios usualmente conhecidos
como estimulantes do enraizamento, a exemplo do NAA e IBA, o suprimem. Baixas
concentraes de GA (0,01 mg.L-1) podem promover o desenvolvimento de embries jovens
de cevada. O GA tem sido efetivo em estimular o crescimento de embries de feijo,
especialmente quando os suspensores foram excludos.
Etileno
O etileno (0,01-0,1 %) acelera o crescimento de embries extrados de sementes de
ma cultivados in vitro aps a maturao.
cido abcsico (ABA)
Diferentes dos outros hormnios, a resposta quase universal das clulas de plantas ao
ABA inibio do crescimento. Em alguns trabalhos, observa-se que a adio de ABA inibe o
crescimento de embries dormentes e no-dormentes e esta inibio pode ser revertida por GA
ou cinetina. A adio simultnea de BA no s reverte o efeito inibitrio do crescimento
induzido pelo ABA em eixos embrionrios de feijo, mas tambm restaura a atividade
biossinttica. O ABA tem se mostrado o mais efetivo regulador de crescimento em suprimir a
germinao precoce ou estimular o crescimento embrinico. O ABA est normalmente
presente em vulos em desenvolvimento, presumivelmente para evitar a germinao precoce e
manter o desenvolvimento do embrio em um curso normal de embrionia.
gar
O meio gelificado mais comumente utilizado para a cultura de embries e, comparado
ao meio lquido, tem se mostrado superior. A concentrao de gar usualmente varia 0,5 a 1,5
%. O gar deve ser mantido a uma concentrao to baixa quanto possvel, apenas mantendo
uma gelificao suficiente para suportar fisicamente o peso dos embries.
pH

106

Poucos trabalhos tm sido realizados para testar os efeitos do pH sobre a cultura de


embries. Testes em pH variando de 3,8 a 7,4 para embries de Lilium evidenciaram os
melhores resultados em pH 4,4 a 5,0.
11.4.1.2. Condies de incubao
As condies relacionadas com a incubao das culturas so luz e temperatura. Alguns
laboratrios elevam a umidade relativa para evitar a dessecao do meio. Contudo, se a
umidade relativa for demasiadamente alta, pode favorecer o crescimento de microrganismos.
Luz
A incubao de embries maduros necessita de um determinado regime de luz para
induzir a germinao normal.
Uma vez que a luz pode estimular a germinao precoce, conveniente incubar
embries imaturos no escuro durante o perodo de embriognese antes de transferi-los luz
para germinao. Embora a maioria dos embries possa ser cultivada tanto luz como no
escuro, certos embries s podem crescer em uma ou outra condio. Embries rudimentares
de muitas espcies no estdio de corao so sensveis luz quando excisados e cultivados in
vitro. A incubao luz pode ser feita tanto sob luz constante ou como em regime de
fotoperodo. Muitos autores utilizaram 16 horas luz/8 horas escuro.
Temperatura
Comparados s sementes intactas, os embries isolados tm menor preferncia
temperatura para germinar. Usando-se 5 temperaturas para incubao, 5, 10, 15, 20 e 25oC,
verificou-se que sementes de cevada germinaram somente a 15oC, enquanto embries isolados
germinaram a 15, 20 e 25oC.
11.5. CULTURA DE EMBRIES EM VULO
Atravs da cultura de vulos faz-se uma cultura de embries sem que estes sejam
dissecados. A cultura de embries em vulo auxilia a superar as barreiras ps-zigticas como o
aborto do endosperma e proliferao anormal das clulas do integumento.
Na cultura de embries em vulos pode-se usar como explantes desde os vulos
individuais at flores intactas. Esta tcnica pode-se apresentar como uma alternativa para o
estudo das necessidades nutricionais do embrio imaturo.
A cultura de embries em vulos apresenta uma srie de vantagens em relao a cultura
de embries isolados: 1) exige menor mo de obra uma vez que a extrao mais fcil; 2) os
embries no so danificados ; 3) possvel cultivar embries que abortam to cedo que seria
impossvel sua remoo, e em espcies onde ocorre absciso prematura dos frutos.

11.6. ACLIMATIZAO DOS SEEDLINGS


Os principais fatores que podem inviabilizar a aclimatizao ex vitro das plntulas so
contaminaes por microorganismos logo aps a retirada dos frascos de cultivo, e a
desidratao.
Esses problemas podem ser evitados utilizando-se substrato esterilizado e ambiente livre
de outras plantas ou organismos que possam servir de fonte de contaminantes.

107

A umidade do ambiente deve ser prxima a 100% imediatamente aps a instalao das
plntulas e gradualmente reduzida durante 2-3 semanas seguintes.
11.7. APLICAES DA CULTURA DE EMBRIES
11.7.1. Salvar Embries Hbridos Inviveis
O processo da hibridao envolve uma sequncia de eventos que incluem a germinao
do plen, crescimento do tubo polnico, fertilizao, desenvolvimento do embrio e
endosperma, e maturao da semente. Existem algumas barreiras hibridao que podem ser
classificadas em barreiras de pr-fertilizao (isolamento geogrfico, apomixia e
incompatibilidade plen-pistilo) e ps-fertilizao (diferentes nveis de ploidia, alteraes
cromossmicas, eliminao de cromossomos, citoplasmas incompatveis, dormncia de
sementes e colapso dos embries).
Cruzamentos interespecficos e intergenricos oferecem aos melhoristas de plantas um
mtodo para aumentar a variabilidade gentica e para transferir genes desejveis entre espcies,
principalmente das selvagens para as cultivadas. Em tais cruzamentos, podem ocorrer barreiras
tanto pr como ps-fertilizao, resultando em sementes murchas e embries abortivos. Por
exemplo, o plen pode falhar em penetrar um pistilo estranho ou dois genomas muito
distantemente relacionados podem ser incapazes de produzir um embrio vivel quando
combinados entre si. No entanto, o uso de hibridao entre espcies estreitamente relacionadas
est frequentemente limitado por falhas do desenvolvimento do endosperma ps-fertilizao,
ou seja, a fertilizao ocorre e os embries comeam a se desenvolver, porm degeneram antes
de atingir a maturidade devido inabilidade do endosperma em supri-los de nutrientes.
Embries hbridos podem ser salvos se forem removidos antes que ocorra o aborto e
cultivados artificialmente sobre um meio nutritivo.
Em polinizaes controladas entre espcies perenes e cultivadas de soja, embries
hbridos foram abortados entre 5 e 35 dias aps a polinizao, o que contornado com a
cultura de embries 11-33 dias aps a polinizao .
Os citros, de modo geral, apresentam o fenmeno da poliembrionia, onde o embrio
zigtico inibido pelos embries nucelares, sendo esta a causa principal do insucesso no
melhoramento das espcies ctricas. A cultura de embries zigticos in vitro, desde que bem
identificados, viabiliza o processo.
A cultura de embries excisados de cultivar poliembrinica (Citrus aurantium) e de
Satsuma polinizada por P. trifoliata 100-120 dias aps a polinizao, foi feita com sucesso.
vital a distino entre a descendncia zigtica e a nucelar em estdios precoces, o que
poderia ser resolvido com marcadores genticos seguros, que expressassem caractersticas
morfolgicas claramente definidas, como o caso da folha trilobada em P. trifoliata. Apesar de
algumas limitaes devidas variabilidade dos progenitores, as isoenzimas peroxidase e esterase
tm sido analisadas em plntulas com 20 dias in vitro e oferecem boas perspectivas para ajudar o
melhorista de citros a selecionar plntulas zigticas nos primeiros estdios de desenvolvimento
das prognies.
Plntulas hbridas entre Carica papaya e C. cauliflora tm sido recuperadas por cultura de
embries, sendo a ltima resistente infeco pelo vrus da mancha anular do mamoeiro. Tem
sido demonstrada a possibilidade do cultivo in vitro de embries advindos de cruzamentos
interespecficos entre diversas espcies de Phaseolus, levando a regenerao de plantas hbridas.
Plantas hbridas tambm foram obtidas, superando a incompatibiliade interespecfica nos
cruzamentos entre diferentes espcies de cucurbitceas.

108

11.7.2. Produo de monoplides


Outro uso da cultura de embries tem sido a produo de monoplides e monoplides
duplicados. A tcnica consiste essencialmente na hibridao interespecfica seguida da
eliminao somtica de cromossomos de um dos genomas.
O exemplo clssico o cruzamento de Hordeum vulgare como progenitor feminino com
H. bulbosum como masculino. H fertilizao, porm, os cromossomos de H. bulbosum so
rapidamente eliminados das clulas do embrio em desenvolvimento. Como o endosperma se
desenvolve por 2-5 dias e ento se desintegra e a diviso e desenvolvimento das clulas no
embrio monoplide mais lenta, h formao de embries pequenos que precisam ser
excisados e cultivados in vitro para completarem seu desenvolvimento e germinarem.
Posteriormente, nas plantas j estabelecidas, os cromossomos so duplicados. Estes mtodos
tm a vantagem que, com uma frequncia muito alta, os gametas femininos so induzidos a
formar embries.
11.7.3. Superar a dormncia das sementes
A dormncia das sementes pode ser devida a inibidores qumicos endgenos,
requerimentos especficos de luz e temperatura ou resistncia mecnica presente na estrutura
que cobre o embrio. Embries excisados podem superar a dormncia destas espcies (Figura
11.1)
11.7.4. Superar a esterilidade das sementes
Algumas espcies produzem sementes estreis que no germinaro. Esta esterilidade
pode ser devida ao desenvolvimento incompleto do embrio, mutaes das estruturas que
cobrem o embrio resultando na morte dos mesmos, ou algum tipo de dormncia recalcitrante
para a qual nenhum mtodo de quebrar a dormncia tem sido desenvolvido. Tcnicas de
cultura de embries podem ser capazes de produzir seedlings viveis daquelas sementes.
As variedades de maturao precoce de Prunus produzem sementes que no germinam
porque os embries nos frutos maduros so ainda imaturos e incapazes de germinar. A cultura
de embries no programa de melhoramento de pessegueiro para o desenvolvimento de
cultivares de maturao precoce um processo rotineiro. A banana propagada vegetativamente
um exemplo. Problemas com a germinao da semente fazem da banana uma das culturas
mais difceis de serem melhoradas pelos mtodos de manipulaes genticas. A cultura de
embries em banana para superar a esterilidade das sementes, resultando em 50% de
germinao contra apenas 10% pelos mtodos normais.

109

C
A

Figura 11.1: Superao de dormncia de Butia capitata pelo cultivo de embries in vitro. A:
Endocarpos com sementes. B: Semente isolada do endocarpo. C: Sementes desinfestadas em
etanol 70% e NaOCl 1,5%. D: retirada do embrio. E: Embrio em desenvolvimento em meio
de cultivo in vitro. F: Plntula com 25 dias aps a semeadura (Imagens: CSFior, JB/FZB-RS).
11.7.5. Maior aproveitamento das sementes
Quando o nmero de sementes disponveis baixo e h necessidade da formao de
maior nmero de plantas, a semeadura in vitro pode possibilitar a multiplicao das plntulas,
podendo-se obter inmeras mudas a partir de um restrito nmero de sementes. o caso de
trabalhos envolvendo espcies ameaadas de extino (Rodrigues et. al., 1998 e Fior et. al., 2007)
(Figura 11.2 e 11.3).

110

Figura 11.2: Ilustrao de uma semeadura in vitro seguida da decaptao da plntula e


estimulao multiplicao. Detalhes do aproveitamento das brotaes mltiplas como
doadores de explantes para a fase de multiplicao (A) e para enraizamento de microestacas
(B) (Ilustrao: Rodrigues et. al., 1998).

Figura 11.3: Multiplicao de plntulas de Limonium brasiliense. A: Germinao in vitro. B:


Plntula com brotaes mltiplas aps 30 dias em meio com citocinina (Imagens: CSFior,
JB/FZB-RS).

111

Captulo 12
Problemas do cultivo vegetal in vitro
12.1. CONTAMINAO
Os meios de cultivos utilizados para a cultura de clulas, tecidos e rgos de plantas
fornecem as substncias essenciais para o crescimento dos tecidos e comtrolam, em grande
parte, o padro de desenvolvimento in vitro. Dentre os componentes do meio de cultivo
relatam-se a presena da gua, macro e micronutrientes, carboidratos, vitaminas entre outros,
que para a maioria dos microrganismos so fatores primordiais para seus estabelecimentos e
multiplicao. Somados composio do meio, as condies de incubao do material gentico
propiciam ambientes ideais de temperatura, luminosidade e umidade para a proliferao de
microrganismos.
A contaminao por microrganismos continua sendo um dos principais problemas para
a micropropagao de plantas no mundo, podendo limitar o estabelecimento de muitos
materiais.
Os microrganismos contaminantes competem com as plntulas pelos nutrientes do
meio de cultivo e provocam danos diretos e indiretos pela colonizao de seus tecidos, alm
disso, ainda podem eliminar no meio metablitos txicos s plantas. Desta forma, os
microrganismos podem provocar desde a reduo dos coeficientes de multiplicao e inibio
do enraizamento at a morte das plntulas.
Embora condies asspticas sejam usualmente aplicadas, muitas culturas no so, ou
no esto asspticas in vitro. O conhecimento dos focos de microrganismos, assim como os
mtodos de preveno e controle, contribuem para elaborar estratgias visando diminuio
das conseqncias negativas das contaminaes.
Alguns tipos de contaminao so listados de forma a caracterizar as infestaes que
ocorrem em cultivos vegetais in vitro: a contaminao aguda, que ocorre durante o
estabelecimento da cultura, normalmente causada por desinfestaes ineficientes. A
contaminao que ocorre aps o estabelecimento, causada, principalmente por microrganismos
que foram admitidos juntos aos explantes (endgenos), ou ainda contaminao causada por
microrganismos que foram introduzidos durante os subcultivos. Alm destas, pode ocorrer
surgimento de colnias de microorganismos aps longo perodo de armazenamento psesterilizao.
TIPOS DE CONTAMINAO
A lista de organismos descritos como contaminantes em plantas de cultura de tecidos
incluem bactrias, fungos, leveduras, vrus, caros, tripes e formigas.
12.1.1. Bactrias
As bactrias constituem o mais comum e problemtico tipo de contaminao por
microrganismos em cultura de tecidos porque podem ser sistmicos e sua deteco muitas
vezes difcil. Numerosos gneros esto associados com desenvolvimento de plantas in vivo,
incluindo os listados abaixo. Aqueles gneros grifados so encontrados freqentemente em
cultura de clulas in vitro, causando srios problemas. So eles: Acinetobacter, Acetobacter,
Aerococcus, Aeromonas, Alcaligenes, Agrobacterium, Agromyces, Arthrobacter, Azotomonas, Bacillus,
Bordetella, Cellulomonas, Chromobacterium, Citrobacte, Clavibacter, Cloostridium, Corynebacterium,
Curtobacterium, Erwinia, Enterobacter, Flavobacterium, Hyphomicrobium, Klebsiella, Kurthia, Lactobacillus,
112

Micrococcus, Mycobacterium, Oerskovia, Propionobacterium, Pseudomonas, Rhizobium, Rhodococcus, Sarcina,


Serratia, Staphylococcus, Xanthomonas.
Embora alguns gneros de bactrias podem ser patognicos, muitos so encontrados no
solo como saprfitas, ou nas plantas como flora epfita. No entanto, as espcies podem
interferir no crescimento in vitro e conduzir a cultura morte. Para detectar com preciso a
contaminao superficial remanescente, ou detectar contaminao endgena por bactrias,
necessrio cultivar explantes em um ou mais meios de cultura que permitam um rpido
crescimento de microrganismos.
Na Tabela 7.1 so relacionados alguns gneros de bactrias e os gneros de plantas ao
qual esto associados de forma mais frequnte.
Tabela 7.1: Bactrias Gram-positivas isoladas como contaminantes de cultura de clulas
e tecidos. Adaptado de Leifert, Ritchie & Waites (1991)
Espcie da bactria
Gnero da planta
Actinomyces spp.
Malus
Bacillus spp.
Gerbera, Hevea, Pteris, Malus, Viola
Bacillus circulans
Begonia, Fragaria, Primula
Bacillus cereus
Fragaria, Begonia
Bacillus polymyxa
Gerbera
Bacillus pumilus
Astibe, Cotinus, Pulmonaria, Primula
Bacillus subtilis
Astilbe, Cotinus, Malus, Hemerocallis
Bordetella branchiseptica
Hevea
Coryneforms
Fragaria, Geranium
Staphylococcus spp.
Hemerocallis, Paeony
Micrococcus varians/roseus
Dephinium, Hosta
Aps a indentificao de 293 estirpes de bactrias por dois laboratrios comerciais de
micropropagao, foi relatado que 26% eram Staphylococcus ou micrococcus, 19%
Pseudomonas, 13% Bacillus, 12% Enterobacter ou Erwinia, 11% Lactobacillus, 3%
Agrobacterium e 3% espcies de Acinetobacter (Leifert, 1991).
Tabela 7.2: Espcies de bactrias Gram-negativas isoladas como contaminantes de
cultura de clulas e tecidos. Adaptado de Leifert, Ritchie & Waites (1991)
Espcie da bactria
Gnero da planta
Acinetobacter calcoaceticus
Fragaria, Astilbe
Alcaliges denitrificans
ris
Agrobacterium radiobacter
Hevea, Paeony, Grbera
Enterobacter/Erwinia
Coffea, Fragaria, Grbera, Prunus
Erwinia carotovora
ris, Saxifraga, Pteris
Klebsiella oxytoca
Delphinium
Flavobacterium spp.
Fragaria, Gerbera, Hosta
Pseudomonas cepacia
Hevea, Hosta
Pseudomonas putida
Hevea, Gerbera
Xanthomonas spp.
Prunus
Hyphomicrobium spp.
Datura

113

Algumas bactrias patognicas de plantas encontradas como contaminantes, por


exemplo Agrobacterium tumefaciens e Erwinia carotovora, produziram sintomas similares in vivo e in
vitro.
Em comparao, das 240 bactrias isoladas em 12 meses de cultivo de 12 espcies de
plantas, 75% foram Gram positivas e apenas 25% Gram negativas. Mais da metade das
bactrias isoladas foram Staphylococcus, Micrococcus ou espcies de Lactobacillus, os quais so
geralmente habitantes da pele ou outros tecidos de humanos e animais (Kocur, 1986).
Diferentes caminhos para preveno ou tratamento de contaminaes podem ser
necessrios em diferentes laboratrios.
12.1.2. Fungos
Os fungos so organismos heterotrficos, necessitando de compostos orgnicos como
fonte de carbono e energia, como por exemplo, a glicose.
Fungos so os patgenos mais comuns de plantas, bem como habitantes saprfitas de
maior freqncia no solo. Muitos gneros de fungos esto associados com plantas. Em cultura
de tecidos os mais comuns so: Alternaria, Aspergillus, Botrytis, Cndida, Cladosporium, Curvularia,
Chyptococcus, Fusarium, Microsprium, Neurospora, Penicillium, Phialophora, Rhizopus e Rhodotorul.
Os fungos podem crescer como saprfitas no meio de cultivo de tecidos. O crescimento
de hifas pode aparecer no meio, no explante ou em ambos. O patgeno de plantas Alternaria
brassicae pode crescer em cultura de calos de Brssica de forma que no seja percebido, mas
cresce no meio de cultivo como saprfita. Muitos fungos e leveduras contaminantes crescem
bem no meio onde esto as plntulas e at mesmo na ausncia destas (Enjalric et al., 1988).
12.1.3 Leveduras
As leveduras so fungos no filamentosos que habitam a superfcie externa de plantas,
embora se suspeitava que elas poderiam contaminar a cultura de clulas, sua existncia in vitro
raramente tem sido admitida. Um mau cheiro quando o frasco de cultura aberto um indcio
de sua presena (George, 1993).
12.1.4. Vrus
H uma varivel concentrao de vrus nas clulas de plantas intactas. Muitas viroses
no so transmitidas por sementes e os rgos reprodutivos no so infectados. Em particular,
brotos apicais e meristemas de razes so passveis de contaminao muito baixa, ou podem, no
entanto, ser livres de vrus. White (1934) observou que o vrus do mosaico do fumo ocorria na
ponta das razes de plantas infectadas de tomate e persistiam na cultura enquanto estabelecidas
in vitro.
Tem sido reconhecido que, para ocorrer uma infeco viral sistmica, os vrus tm que
ter acesso ao sistema vascular da planta. H vrias evidncias a favor da hiptese de que o
floema funciona como veculo para o transporte do vrus a longas distncias, enquanto que o
transporte clula a clula ocorre via plasmodesmatas, de forma muito limitada (Gilbertson &
Lucas, 1996).
Provavelmente todas as espcies propagadas vegetativamente esto infectadas com um
ou mais vrus, principalmente os latentes que so difceis de serem detectados pela
sintomatologia visual. Esses patgenos so transmitidos e acumulados em propagaes e/ou
plantios sucessivos, e se manifestam na planta infectada pela reduo do vigor e produtividade
das culturas.

114

12.1.5 caros e Trips


Poucos caros e trpes encontrados em cultura de tecidos vegetais tm sido
identificados. Muitos, como Sideroptes graminis, Stemeotorfomemus palidus ou Trhips tabaci, foram
encontradas sendo identificados como espcies habitantes ou pragas de plantas in vivo, enquanto
outros como Tyrophagus putrescentiae podem estar presentes tanto in vivo como in vitro.
Os caros so organismos reconhecidos por terem o corpo constitudo por um nico
segmento e, normalmente, terem quatro pares de pernas. So pragas muito pequenas (menores
que 1mm de comprimento), ocorrendo em todos os ambientes podendo ser levados pela
poeira, insetos e animais (incluindo os humanos). Algumas espcies de caros so encontradas
em vrios tipos de alimentos, enquanto outros so parasitas ou saprfitas nos animais.
Eles normalmente causam pequeno dano direto s plntulas, alm de transportarem
esporos de fungos e bactrias em seus corpos, sendo fonte de mltiplas contaminaes.
Os trpes so insetos tambm muito pequenos (menores que 1 mm de comprimento), e
so os mais comuns no crescimento de plantas in vitro. Eles freqentemente habitam os brotos
apicais de plntulas nos quais causam o amolecimento dos tecidos. Os trpes colocam seus ovos
sob a epiderme das plantas e uma das causas da contaminao in vitro pode ser o
estabelecimento de culturas com explantes contaminados, pois a prpria epiderme limita o
efeito do desinfestante sobre os ovos ou larvas.
As espcies de trpes reportadas como contaminantes de cultivos in vitro so os gneros
Thrips, Allothrips e Frankliniella.
12.1.6 Formigas
As formigas pequenas causam problemas semelhantes aos provocados pelos trpes e
caros, ou seja, podem contaminar o ambiente do laboratrio com esporos de microrganismos.
O efeito da contaminao microbiana em cultivo in vitro
Os microrganismos competem com os explantes em espao, carboidrato (fonte de
energia), nutrientes e outros compostos, podendo tambm liberarem no meio de cultivo
substncias txicas prejudicando ao crescimento do material vegetal.
Alguns fungos e leveduras reduzem o pH do meio para nveis abaixo de trs. As
leveduras Candida e Rhodotorula podem criar um ambiente totalmente desfavorvel para o
crescimento de plntulas. A contaminao por leveduras resulta na morte dos explantes dentro
de um a trs subcultivos aps sua introduo in vitro (Leifert & Waites, 1990).
12.1.7. Fontes de contaminao dentro de um laboratrio de cultura de tecidos
As fontes de contaminaes no so representadas apenas pelo material vegetal e/ou o
homem. O ambiente precrio do laboratrio tambm contribui para as contaminaes.
Os explantes
A superfcie externa dos explantes apresenta uma flora diversificada de organismos
como bactrias, fungos, leveduras, caros e trpes. So nestas reas que estes organismos
encontram condies perfeitas de alimentos para se multiplicarem. Alm dos organismos
situados superficialmente nos explantes, existem os que esto internamente ao mesmo. Os
explantes que levam os contaminantes sobre a sua superfcie podem ser mais facilmente
desinfestados, j os que se encontram dentro dos tecidos so mais difceis de eliminar, e desta
forma podem escapar do efeito dos desinfestantes.

115

O ambiente de trabalho
Devido s correntes de ar e s vestimentas dos manipuladores, ocorre a disseminao de
esporos de fungos e bactrias, bem como caros, trpes e formigas.
Meios estocados por tempo prolongado podem desenvolver colnias de
microorganismos. Isso acontece, na maioria dos casos, devido ao fechamento inadequado dos
frascos, principalmente quando se trabalha com tampas flexveis, como o papel alumnio, por
exemplo.
A sala de crescimento o local onde as culturas iro permanecer sob condies
controladas de temperatura e umidade.
Em regies de clima quente e mido a contaminao se mostra mais alta. Alm destes
fatores, as condies precrias de higiene nestes compartimentos do laboratrio aumentam o
ndice de contaminao.
Os equipamentos, instrumentos e utenslios.
Os equipamentos de um laboratrio como autoclave e cmara de fluxo laminar podem
no estar em perfeitas condies de utilizao. Esporos de Bacillus cereus e B. circulans podem
sobreviver a autoclavagens de 120C por 20 minutos. Diante disso, ateno deve ser dada
correta manuteno e utilizao, detes aparelhos. Todos os instrumentos que sero utilizados
para a manipulao dos explantes aps a desinfestao e/ou durante as transferncias nas fases
de cultivo, devero ser autoclavados ou, no caso de aparelhos termossensveis, desinfestados
atravs de processos qumicos ou irradiao ionizante.
O operador
O operador considerado uma fonte primria de contaminao. A pele, cabelos, roupas
e a respirao podem transportar microrganismos contaminantes para o ambiente de cultivo. A
presena de Staphilococcus ou de Cndida albicans geralmente indica falha de higiene do operador
responsvel pelos trabalhos, pois estes microrganismos ocorrem normalmente no corpo
humano (Montarroyos, 2000).
12.1.8. Medidas de preveno e controle
A determinao exata da fonte de contaminao muitas vezes dificultada. Como
mencionado anteriormente, os microrganismos podem ser introduzidos em vrios pontos no
processo de micropropagao. Contudo, existem formas de se prevenir o aparecimento de
contaminaes, para tanto necessrio que se verifique e controle sistematicamente todas as
operaes e reas onde possam ser introduzidos os microrganismos contaminantes.
As medidas de preveno envolvem diferentes estratgias de evitar a entrada dos
patgenos in vitro.
Seleo e tratamento da planta matriz
Sem dvidas a maior fonte de contaminao primria na cultura de tecidos vegetais
provem da planta matriz. Ao proceder a retirada dos explantes da planta matriz e conduz-los
ao laboratrio, fazem-se necessrio avaliar o estado fitossanitrio da espcie. Descartar partes
vegetais ou plantas com sintomas de doenas e/ou ataque de pragas.
Independentemente do estado fitossanitrio da planta matriz, a primeira medida sua
manuteno em um ambiente mais limpo, como uma casa de vegetao ou cmara de
crescimento, uma vez que no campo a planta est exposta a todo tipo de intempries e insetos
116

que provocam ferimentos e permitem a entrada de microrganismos. Na casa de vegetao, o


controle de insetos e microorganismos torna-se possvel mediante aplicaes de fungicidas,
bactericidas e inseticidas. As aplicaes devem seguir um cronograma rgido, e a coleta dos
explantes deve ser feita, de preferncia, de 24 a 48 horas aps a ltima aplicao. Outras
medidas preventivas muito teis so a manuteno da planta matriz em substrato estril, em
vasos mantidos sobre bancadas e uma irrigao feita exclusivamente no substrato.
Contudo, a manuteno da planta matriz em casa de vegetao no constitui problema
para plantas herbceas, mas torna-se bastante complicado quando se trata de uma planta de
porte arbreo. Neste caso, pode-se fazer uma cobertura dos ramos podados, com sacos
plsticos ou com papel impermevel, recuperando em seguida brotaes novas que se
desenvolvem dentro do ambiente protegido.
Durante a coleta dos materiais que daro origem aos explantes, deve ser mantido o
maior nvel de assepsia possvel, utilizando-se instrumentos limpos ou at esterilizados. No caso
de plantas doentes que no podem ser dispensadas, deve-se procurar coletar explantes de
tamanho bem reduzido. A dificuldade maior nesta etapa reside em se obter material vegetal
descontaminado, sem, no entanto, conduz-lo a morte quando isolado.
O material coletado, principalmente se for proveniente do campo, pode ser mantido em
gua corrente por algumas horas para uma lavagem superficial de partculas de poeira e outras
fontes de contaminao superficial. Em seguida o material sofre uma primeira toalete, quando
so retirados o excesso de folhas e caule sem gemas.
Esterilizao de vidraria
A esterilizao um processo mediante o qual qualquer material torna-se
completamente livre de microrganismos contaminantes (em todas as suas formas).
A esterilizao dos recipientes de vidro e outros utenslios durante os trabalhos de
fundamental importncia. O processo de esterilizao tem incio com a lavagem dos utenslios
que sero utilizados na elaborao do meio de cultivo e dos que sero utilizados durante os
trabalhos de micropropagao. Os detergentes empregados na lavagem devem ser de fcil
remoo. Em alguns casos, faz-se necessrio o emprego de solues limpadoras tipo cido
crmico. Aps a utilizao dos detergentes deve-se proceder lavagem com gua em
abundncia, seguido de vrias lavagens com gua destilada.
Para os recipientes de cultura que continham materiais j contaminados, antes do
descarte dos mesmos, faz-se necessria a autoclavagem durante 20 minutos 121C, visando
eliminao dos microrganismos contaminantes antes da abertura dos recipientes, evitando
assim a disseminao dos patgenos para o ambiente.
As vidrarias que sero utilizadas no preparo dos meios de cultura, aps a lavagem devem
ser secas em estufa e depois guardadas em local protegido. Os materiais que sero utilizados na
cmara de fluxo laminar (placas de petri, recipientes de vidros diversos, pinas e bisturis), aps
secos, devem ser embalados em papel e autoclavados mais uma vez, durante 20 minutos
121C e posteriormente secos em estufa.
Outras formas de esterilizao so mencionadas na literatura, como o caso da
utilizao de calor seco e mido. Na primeira, os materiais so colocados em estufa com
temperatura mnima regulada para 170C na qual devem permanecer por mais de uma hora. O
emprego de calor mido requer que os materiais sejam imersos em guas temperatura de
100C durante 30 a 60 minutos por trs dias consecutivos, e devem ser mantidos, de
preferncia, em uma incubadora entre uma exposio e outra (Montarroys, 2000).

117

Autoclavagem do meio de cultivo e outras substncias


Os meios de cultura, assim como os utenslios utilizados na manipulao de plntulas in
vitro, devem ser esterilizados por autoclavagem a 121C a 1kg/cm2 por 15 a 20 minutos.
Algumas substncias orgnicas so degradadas pelo calor, por isso precisam ser
esterilizadas a frio. Para tanto, utilizam-se filtros especiais de acetato de celulose tipo milipore.
Entre as substncias termossensveis utilizadas em cultura de tecidos de plantas encontram-se a
glutamina, o cido giberlico, a tiamina, o cido abscsico, o cido ascrbico, o cido ctrico e a
maioria dos antibiticos.
Outras reaes tambm podem ocorrer durante a autoclavagem, como reaes entre
aucares e aminocidos (chamada de caramelizao) e a hidrlise de sacarose. Estas reaes se
intensificam com o aumento do tempo da autoclavagem. Assim, aconselhvel manter os
meios na autoclave pelo mnimo de tempo necessrio para completar a esterelizao (Torres,
Caldas & Busi, 1998).
Uso da cmara de fluxo de ar laminar estril
A cmara de fluxo laminar um equipamento que fora a passagem do ar por meio de
um filtro bacteriolgico, de modo que seja criado um ambiente estril com presso positiva,
que evita a entrada de ar externo contaminado. Aps borrifar lcool na cmara, com auxlio de
uma gaze ou algodo, deve-se espalh-lo pelas superfcies internas da mesma, para que ocorra
perfeita descontaminao. Dependendo da regio, como em locais de umidade relativa alta,
aconselhvel repetir a operao por mais uma vez para certificar de sua descontaminao.
importante frisar que em todas as etapas antes da inoculao do material vegetal de crucial
importncia uma desinfestao criteriosa, visto que aps os microrganismos se instalarem in
vitro, o controle torna-se oneroso podendo o laboratrio ter grandes prejuzos.
Portanto, aps a cmara de fluxo laminar estar previamente desinfestada, os frascos ou
tubos com o material vegetal, bem como todos os utenslios devem ser borrifados com lcool
70% para depois serem introduzidos na cmara.
Quanto mais prximo da sada de ar filtrado da cmara, menor a turbulncia e,
conseqentemente, menor ser a chance do mesmo estar infestado por propgulos de
microorganismos. Por isso, deve-se evitar o uso da parte prxima ao limite externo da cmara.
O uso de mscaras aconselhado, visto que a respirao pode liberar contaminantes.
Pinas e bisturis devem ser flambados em lcool 96% constantemente.
Sempre que se retirar as mos do interior da cmara, antes de retorn-las deve-se
borrifar lcool 70%. Alm disso, procurar manter o corpo corretamente apoiado na cadeira,
evitando-se introduzir a cabea na cmara.
Sala de crescimento
o local destinado permanncia das culturas aps a inoculao. As condies de
temperatura e luminosidade so controladas e as condies de assepsia devem ser rigorosas.
A sala de crescimento deve ser exclusiva para as culturas in vitro, devendo-se, portanto,
evitar a introduo de qualquer outro material que no seja para tal finalidade.
Durante o processo de limpeza deve ser evitado o uso de vassoura ou qualquer utenslio
que disperse o p. Para tanto, recomenda-se a limpeza do cho e das prateleiras com pano
mido e algum produto desinfetante.
Descarte de material senescente e contaminado
118

Todo material contaminado e ou senescente deve ser conduzido para a sala de limpeza,
onde ser autoclavado a 121C por 20 minutos para que os frascos possam ser abertos e
lavados, sem o risco de dispersar os microorganismos.
Uso de antibiticos no meio de cultivo
Se a desinfestao do material propagativo no suficiente para a remoo de seus
contaminantes, pode-se optar pela incorporao de antibiticos no meio. Vrios autores tm
descrito o uso dos antibiticos para controle de bactrias isoladas em cultura de tecidos vegetais
ou tem includo antibiticos no meio de crescimento de plntulas para suprimir ou eliminar
contaminaes.
Outros autores tm descrito que certos tratamentos com antibiticos no tm efeito na
contaminao e outros ainda afirmam que muitos dos antibiticos tm sido fitotxicos para as
plantas in vivo e in vitro podendo apenas ser incorporado no meio de cultivo com as plntulas
por determinados perodos de tempo.
A mistura de antibiticos freqentemente mostra efeitos sinergsticos, no apenas no
controle de microrganismos, mas tambm na induo de plantas, uma vez que a concentrao
dos produtos tende a ser menor.
Stimart (1986) testou o controle do contaminante Hyphomicrobium da suspenso de cluas
de Datura com 500 g. L-1 de streptomicina ou 500 g. L-1 de carbenicilina. O efeito no foi
satisfatrio, mas sim quando combinaram ambos os produtos a 100 g. L-1.
A mistura de 10g .L-1 de rifampicina mais 1 g. L-1 de benomyl foi uma combinao
efetiva para o controle de fungos e bactrias de Camellia (Hanus et al., 1987).
Alguns exemplos adicionais do uso da mistura de antibiticos para o controle de
contaminantes so os seguintes (George, 1993):
1) 250 g .mL-1 carbenicilina + 2,5 g .L-1 de amphotericina B por 1 semana. Usado em
cultura de protoplastos de diversas espcies; 2) 15 g .mL-1 de rifamycina + 15 g .mL-1 de
trimethoprim + 0,1 % de fungicida Tilt MBC; 3) 25 g .mL-1 de cefotaxine, 25 g .mL-1 de
tetracycline, 6 g .mL-1 de rifampicin e 6 g .mL-1 de polymixina B; 4) 10 g .mL-1 de
rifampicina mais 1 g.L-1 de benomyl; 5) 50-100 g .mL-1 (dependendo da cultivar) de
kanamicina mais 200 g .mL-1 de cefalotoxime; 6) Mistura complexa 20 g. mL-1 de
gentamicina + 20 g. mL-1 de kanamicina + 30 g. mL-1 de chlrortetracycline + 60 g. mL-1
choramphenicol + 75 g. mL-1 de rifampicina + 750 g. mL-1 de benomyl; 7) VancomicinaHCl + mycostain; 8) 20 g. mL-1 de rimfampicina + 20 g. mL-1 trimethoprin; 9) 250 g. mL-1
de carbenicilina + 25 units. mL-1 de nystatin por uma semana. Cultura de protoplastos de vrias
espcies.
Tratamento da planta me com compostos antimicrobianos
Os antibiticos no necessitam serem adicionados ao meio de cultivo. Os explantes
podem ser embebidos ou colocados em soluo com o antibitico antes da inoculao, ou
ainda, as plantas matrizes podem ser borrifadas com antibiticos por um perodo antes da
retirada dos explantes.
Bactericidas

119

O efeito bacteriosttico da mistura complexa de compostos antimicrobianos em brotos


apicais e axiais de Hevea foi maior quando ele foi adicionado ao meio de cultivo. A embebio
dos explantes no foi efetiva (Enjalric et al., 1988).
Pulverizando plantas de Geranium com 200 g.mL-1 de oxitetraciclina em intervalos
semanais, de maro at agosto, Falkiner (1990) reduziu a incidncia de escoriaes causados
pela bactria sistmica Corynebacterium fascians.
A utilizao de antibiticos em cultura de tecidos uma questo delicada, uma vez que
ele deve manter sua capacidade bactericida ou bacteriosttica, ser solvel, apresentar-se estvel
durante o crescimento das culturas, no ser txica s clulas vegetais, ter amplo espectro de
ao e ter baixo custo. Trabalhos nos quais foi avaliado o nvel de toxidez de vrios antibiticos
demonstraram que os do grupo dos betalactamos, tais como: ampicilina, carbecilina e,
particularmente, as cafalosporinas possuem amplo espectro de ao e sua toxidez mnima nas
concentraes que controlam bactrias. A rifampicina sozinha ou em combinao com
trimetoprima tambm forneceu amplo espectro de ao. Os antibiticos do grupo dos
aminoglicosdeos como a estreptomicina, neomicina, canamicina e gentamicina so os menos
recomendados devido a sua toxidez aos tecidos vegetais (Montarroys, 2000).
Fungicida
Diversos trabalhos so conhecidos por usarem fungicidas sintticos para o controle de
fungos em material excisado e em culturas estabelecidas, mas a fitotoxicidade potencialmente
dependente do gentipo (George, 1993).
Calos de Cymbidium tratados com dimetilsulfxido entre 5-50 g.mL-1, dissolvido e
adicionado ao meio inibiu a formao de plantas. De forma similar, 50 g.mL-1 inibiram a
germinao in vitro de sementes de trs gneros de orqudeas. (George, 1993).
Imazalil (20 g.mL-1) e captafol (100 g.mL-1) contiveram contaminaes fngicas e
crescimento de saprfitas como Alternaria brassicae em cultura de calos de Brassica junceae, sem
ocorrer toxicidade (Pousen, 1988).
No tocante s leveduras, chlotrinazole foi efetivo sobre uma das duas leveduras
identificadas como contaminantes de cultura de meristema de ma. A concentrao 10 g.mL1 de iminooctodine controlou ambos os organismos, no entanto, foi txico para os tecidos a 0,1
g.mL-1 (George, 1993).
12.2. OXIDAO
A oxidao do explante considerada um dos aspectos mais srios relacionados com a
cultura de tecidos. Este tipo de escurecimento est associado ao ferimento que resulta na
liberao e oxidao de compostos fenlicos que inibem o crescimento do explante. De acordo
com George e Sherrington (1984) a oxidao dos compostos fenlicos ocorre em tecidos
lesionados devido ao de enzimas oxidases, freqentemente chamadas de polifenol oxidase,
fenolase e tirosinase (monofenol oxidase), que so liberadas, sintetizadas ou j anteriormente
presentes em substratos adequados e condies oxidativas, quando os tecidos so feridos ou
tornam-se senescentes. As extremidades dos tecidos escurecem rapidamente e so liberados
produtos txicos da oxidao.
Alguns autores citam que nem todos os compostos produzidos so inibidores, porm
tem sido freqentemente constatado que uma vez que a descolorao ocorre, o crescimento
inibido e tecidos podem morrer, a no ser que uma srie de medidas sejam tomadas (Bajaj,
120

1988; Debergh e Zimmerman, 1991). Para controlar a ocorrncia da oxidao, recomenda-se


que se minimizem os danos causados ao explante com a adio ao meio de substncias
antioxidantes; utilizao de meios lquidos; de diferentes agentes de solidificao; e alterao da
composio e concentrao do meio de cultivo (George, 1996).
12.2.1. Natureza dos compostos
O termo oxidao corresponde medida de colorao do meio devido liberao de
compostos fenlicos pelo explante (Gould e Murashige, 1985). A origem das substncias de cor
escura, geralmente castanha ou preta, produzidas por plantas raramente tm sido determinadas,
embora se saiba que so, em geral, misturas de substncias fenlicas complexas. A toxidez
ocorre por fenis que se ligam s protenas por pontes de H+ e pela sua oxidao a quinonas
altamente ativas, que ento tornam-se cclicas ou polimerizadas e/ou oxidam protenas para
formar compostos melnicos, s vezes denominados polifenis. As quinonas podem tambm
ser produzidas a partir de fenis atravs de ao de enzimas peroxidases que podem catalisar
sua oxidao na presena de perxido. Estes e outros radicais livres so liberados durante o
processo de preparo do explante. Substncias fenlicas inibidoras produzidas por explantes de
orqudea Cattleya que avermelham o meio foram identificadas como cido eucmico e tiramina.
Apesar da oxidao de compostos fenlicos ser prejudicial aos explantes, estas
substncias so essenciais s plantas. Os fenis tm importante funo de regular a oxidao do
AIA (cido indolactico, a principal auxina encontrada naturalmente nas plantas). Fenis
liberados em gua a partir de explantes de goiaba promoveram o crescimento de medula de
tabaco e calos de cenoura possivelmente por sinergismo com auxina, apenas tornando-se txico
em concentraes elevadas. Alm disso, as substncias formadas a partir do ferimento podem
promover o enraizamento.
12.2.2. Controle da oxidao
A liberao de exsudatos pelas plantas se constitui em um dos maiores problemas para
o cultivo in vitro (Queralt et. al., 1991). Vrias medidas da oxidao fenlica, tais como: A
remoo dos compostos fenlicos produzidos, atravs de gua corrente como pr-tratamento
de explantes, e a utilizao no meio de cultivo de antioxidantes.
Para controlar a ocorrncia da oxidao, recomenda-se que se minimizem os danos
causados ao explante com a adio ao meio de substncias antioxidantes; utilizao de meios
lquidos; de diferentes agentes de solidificao; e alterao da composio e concentrao do
meio de cultivo (George, 1996).
Grattapaglia e Machado (1998) recomendam, para controlar a oxidao, as seguintes
medidas: lavagem do material antes da desinfestao - em gua corrente, auxiliando na
lixiviao dos compostos fenlicos; utilizao de antioxidantes - cido ascrbico, cido ctrico,
polivinilpirrolidone (PVP) e carvo ativado; incubao inicial dos explantes no escuro.
A ao dos antioxidantes se resume a: o carvo ativado age promovendo adsoro dos
exsudatos liberados pelo explante; o PVP reage com os compostos oxidantes; e os cidos
ctrico e ascrbico reagem com os metais presentes no meio de cultivo, evitando que os
mesmos fiquem disponveis para se oxidarem (Jarret, Rodrigues e Fernandez, 1985; George,
1996).
Adio ao meio da cultura de cidos, como ascrbico e ctrico ou tambm cistena, pode
ser eficiente como antioxidante. Alm das propriedades antioxidantes, o cido ascrbico
121

normalmente acrescido ao meio de cultivo por promover atividade metablica dos tecidos.
Tem maior efetividade quanto adicionado ao meio em concentraes entre 10 e 140 mg/L,
podendo reduzir drasticamente a oxidao (George, 1996).
Siqueira e Inouse (1991) avaliaram diversas tcnicas para o controle da oxidao na
cultura de tecidos de Cocos mucifera L e concluram que o cido ascrbico eficiente no controle
do processo de oxidao, enquanto o polivinilpirrolidone (PVP) no foi eficiente. Em
protocolos de cultura de tecido de palmeiras, o carvo ativado promoveu os melhores
resultados, e por isso passou a ser includo como procedimento padro (Tisserat, 1987).
Gupta (1986), comparando cido ascrbico, cido ctrico e carvo ativado, verificou que
o cido ascrbico controlou a oxidao fenlica em meristemas de bananeira.
O carvo ativado apresentou melhores efeitos no controle da oxidao em explantes de
palmeira, quando comparado ao PVP (Tisserat, 1979).
Prticas de preveno
Minimizar os danos causados ao explante
A oxidao pode ser amenizada reduzindo-se a extenso cortada dos explantes durante a
exciso ou desinfestao. Em algumas espcies, os produtos usados na descontaminao
podem acentuar o escurecimento dos explantes. Por exemplo, o escurecimento de Strelitzia
reginae foi menos severo quando 0.3% de cloreto de mercrio foi usado em substituio ao
hipoclorito de clcio.
Remover os compostos fenlicos produzidos
A presena de substncias fenlicas prejudiciais freqentemente induz os explantes a
produzir exsudatos adicionais, ou seja, a produo pode ser autocataltica. A remoo ou
disperso das substncias medida que so formadas um mtodo eficaz de controle.
O pr-tratamento do material vegetal pode auxiliar na obteno de explantes viveis.
Primeiramente, deve-se evitar que o exsudado do tecido circundante entre em contato com o
explante durante a exciso. Isso pode ser controlado atravs da lavagem das clulas danificadas.
Os explantes devem ser lavados ou deixados em gua esterilizada por duas a trs horas aps o
isolamento, antes de serem transferidas para o meio de cultivo. Por exemplo, sementes de
nogueira e avelaneira so freqentemente imersas em gua corrente por 16 a 24 horas antes da
desinfestao.
O enxge minucioso aps a esterilizao necessrio para retirar substncias qumicas
usadas para descontaminao. Se no forem removidas adequadamente podem provocar a
sntese de substncias fenlicas.
Transferir freqentemente os explantes
O crescimento de explantes pode ser limitado por metablitos txicos mesmo na
ausncia de escurecimento. Se os explantes no mostrarem qualquer sinal de crescimento aps
3 a 4 semanas, suas chances de sobrevivncia podem ser aumentadas atravs da substituio do
meio. A transferncia rpida necessria se o meio em volta de explante se tornar descolorido
ou escurecido. O escurecimento mais visvel em meio slido e se concentra nas proximidades
do explante. Assim, um mtodo eficiente para evitar o escurecimento de tecido a troca de
122

meio mos dias subseqentes a inoculao. O intervalo de transferncia deve ser ajustado de
acordo com a severidade do problema. Em geral, necessrio transferir a cada 1 a 7 dias.
As transferncias frequentes tm custo elevado e s so efetuadas quando novos
explantes so isolados. O escurecimento de extremidade de brotos geralmente cessa quando se
inicia a multiplicao. Segmentos nodais de brotos juvenis de Juglans precisaram ser transferidos
uma vez por semana, durante um perodo de 2 a 3 meses. Aps o incio da proliferao de
brotos, subculturas foram necessrias a intervalos de 4 semanas. Mesmo quando estabelecidos,
calos de algumas espcies podem escurecer e morrer se deixados em meio sem transferncia.
Em cada transferncia, deve-se retirar qualquer tecido que tenha iniciado o processo de
escurecimento.
Uso de meio lquido ou troca de agente gelificante
Explantes so menos sujeitos ao escurecimento se forem cultivados em meio lquido,
onde os compostos fenlicos e os produtos da oxidao so rapidamente diludos. comum,
por esta razo, que o estgio 1 de uma cultura seja efetuado em meio lquido.
Algumas culturas mostram escurecimento em meio gelificado com gar e no com
outros agentes. Da mesma forma, em certos casos, o escurecimento tem sido mais evidente em
concentraes mais elevadas de gar.
Uso de carvo vegetal ativado
A adio de carvo ativado evita o acmulo de inibidores fenlicos, mas pode tambm
adsorver reguladores de crescimento e outros componentes do meio, ou txico a alguns
tecidos. O escurecimento de explantes tem sido evitado em inmeras culturas em
concentraes que variam desde 0,2 at 5 g/L.
Uso de polivinilpirrolidona (PVP)
A extrao de enzimas vegetais ativas , em algumas ocasies, evitada pela presena de
polifenis ou taninos. Em tais casos, vrios compostos (principalmente protenas, amidas e
poliamidas) tm sido adicionados para reagir com os fenis e restaurar a atividade enzimtica. A
cafena uma amida que tem sido usada com sucesso. A poliamina mais eficiente para este
propsito a PVP (polivinilpirrolidona). A PVPP (polivinilpolipirrolidona) tambm eficaz e
utilizada como um adsorvente para a separao cromatogrfica de cidos aromticos, aldedos e
fenis. Os fenis so adsorvidos pela PVP atravs de ligao de H+, impedindo sua oxidao e
polimerizao. A PVP pode tambm combinar-se com compostos fenlicos oxidados
(polimerizados), impedindo assim uma maior oxidao por enzimas fenolases.
Vrios tipos de PVP e PVPP tm sido usados para impedir o escurecimento em cultura
de tecidos, tanto para lavar explantes como para serem incorporados a meios, embora nem
todos tenham atividade biolgica equivalente. Para lavar os explantes tem sido usado a PVP a
1%. Quando adicionado ao meio, as concentraes tm variado de 0,5 a 3 g/L.
Alterarao na composio do meio
Se os cuidados com o explante no resolverem o problema do escurecimento, deve-se
dar ateno ao meio que est sendo usado. O escurecimento freqentemente mais
123

pronunciado em um meio do que em outro, mostrando que ele pode ser causado por nutrientes
inapropriados. O escurecimento , via de regra, menos severo em um meio diludo do que em
um com alta concentrao de sais. Alguns componentes do meio tm sido apontados como
importantes no escurecimento. A reduo da concentrao de KNO3, CaNO3 e sacarose tem
sido eficaz em reduzir o escurecimento. A eliminao do FeSO4 tambm teve efeitos benficos.
Modificar o potencial redox do meio
A tendncia de compostos dissolvidos serem oxidados ou de serem reduzidos depende
do potencial de oxidao-reduo (redox) do meio de cultivo. Esta modificao pode ser obtida
com uso de antioxidantes e pela reduo da disponibilidade de oxignio no meio.
Antioxidantes so substncias que inibem a oxidao e incluem agentes redutores, que
removem o oxignio de outras molculas, e tambm compostos que atuam por mecanismos
alternativos. Agentes que reduzem o potencial redox de solues, so eficazes em prevenir o
escurecimento de tecidos de plantas isolados. Explantes de plantas cujos tecidos so propensos
ao escurecimento podem ser lavados em soluo de um antioxidante aps a esterilizao;
excisados em papel embebido com antioxidante, ou ainda, imersos em soluo de um
antioxidante imediatamente aps a exciso. Compostos usados para estes propsitos incluem o
cido ascrbico (0,4 g/L), cido ctrico, L-cistena, hidrocloreto de cistena, ditiotreitol.
Outros antioxidantes tm sido incorporados ao meio de cultivo, a exemplo de glutation
(200 mg/L), cistena HCl (10-50 mg/L) juntamente com cido ascrbico e cido ctrico,
cistena (20 mg/L), ditiotreitol (0,4 g/L) e rosmanol (antioxidante natural extrado de Salvia
canariensis).
Como a taxa de escurecimento de tecidos dependente do potencial redox das
superfcies cortadas de tecidos excisados, de se esperar que ela seja reduzida diminuindo a
exposio dos explantes ao oxignio.
Danos causados por oxidao podem ser diminudos por exciso rpida, minimizando a
rea de tecido ferido no explante e assegurando que o mesmo, recentemente cortado, seja
mudado para um meio de cultivo ou para uma soluo antioxidante no menor tempo possvel.
Reduo da atividade da fenolase e a disponibilidade de substrato
A taxa de oxidao fenlica ser claramente menos rpida se houver a reduo da
atividade de enzimas oxidativas ou da quantidade de substrato disponvel para a oxidao.
O cobre essencial para o crescimento e no pode ser omitido de meios por perodos
longos sem efeitos prejudiciais. Antes de diminuir o rendimento de plantas intactas, a
deficincia de cobre resulta em mudanas nas quantidades relativas de compostos fenlicos
liberados pela parede celular. Algumas marcas de gar contm quantidades significativas de
cobre. A adio de 6 g/L de gar Difco Bacto introduz, em mdia, 60 a 100 vezes mais cobre
do que est presente no meio MS. O ferro (Fe3+) pode tambm estar envolvido na oxidao de
fenlicos e a omisso de FeSO4 reduz bastante o escurecimento dos explantes.
Agentes quelantes podem propiciar um meio de interferir na ao de enzimas
peroxidases e podem atuar como anti-oxidantes. O EDTA pode inibir a atividade da polifenol
oxidase e sugere-se que este composto remove competitivamente metais essenciais para a
atividade de enzimas oxidadas. O Na-FeEDTA impede o escurecimento de extremidades de
brotos, podendo ser devido a quelao do cobre exigido por enzimas funcionais fenolases. O
124

dietilditiocarbomato de sdio (DIECA) tambm tem sido usado para evitar o escurecimento. A
oxidao dos porta-enxertos em micro-enxertos tem sido evitada adicionando DIECA (1 a 2
g/L) ao meio de lavagem colocando gotculas diretamente nos tecidos na hora de fazer a unio.
O escurecimento de extremidades de brotos excisados foi impedido colocando explantes no
meio MS, cobrindo-os com uma soluo a 0,1% de 8-hidroxiquinolina (8-HQ) por 24 horas, e
em seguida transferindo-os para meio fresco. Este tratamento tambm reduziu
substancialmente a contaminao.
Como a atividade de polifenol oxidase maior em pH 6,5 e diminui com a reduo do
pH, o isolamento de explantes poderia ser realizado temporariamente em meio mais cido. A
imerso de explantes em uma mistura de cido ascrbico e cido ctrico no apenas os expem
a agentes redutores, como tambm a pH mais baixo.
A maioria dos agentes antioxidantes so termossensveis, devendo, portanto, serem
esterilizados por filtro.

12.3. VARIAO SOMACLONAL


O crescimento de clulas vegetais in vitro e sua regenerao em plantas inteiras um
processo assexuado. Espera-se como resultado a multiplicao de clulas geneticamente
uniformes. A grande vantagem desse processo a quebra de barreiras biolgicas impostas pelos
mtodos tradicionais de melhoramento gentico, acelerando o processo de obteno de novos
gentipos.
No final, o processo de cultura pode sim conduzir a uma variabilidade gentica do
material em estudo. A simples passagem de clulas diferenciadas por um ciclo de cultura de
tecidos, no qual ocorrem proliferao de clulas no diferenciadas, constitui uma fonte rica de
variabilidade gentica.
O interesse aumentou com divulgao de mudanas em caractersticas agroqumicas e
promessas de novas fontes de variao variabilidade para o melhoramento vegetal. Em 1981,
Larkin & Scowcroft denominaram o fenmeno de variao somaclonal.
Essa variao tem sido muito aproveitada em espcies como a cana de acar, milho,
batata e o fumo, no desenvolvimento de somadoras resistentes a doenas, especialmente. Podese ter dois tipos de variao somaclonal, a variao herdvel (mutao verdadeira) e variao
epigentica (mutao temporria).
A freqncia da ocorrncia dessas alteraes depende da espcie, metodologia
empregada e das caractersticas estudadas. As variaes encontradas referem-se a poliploidia, a
aneuploidia e quebra de pontos cromossomos, entre outras.
COMO ACONTECE A VARIAO SOMACLONAL
A variao somaclonal pode ser definida como um procedimento mutagnico no
genoma e que resulta numa variao de natureza gentica, citogentica e molecular originada
durante as fases da cultura de tecidos.
Na cultura de tecidos o nico sistema isento de variao somaclonal a cultura de
meristemas, pois as clulas in vitro no passam por um estgio de dediferenciao (reverso de
diferenciao), quando comparado com outros processos in vitro como cultura de calos,
protoplastos e suspenses celulares. Estes sistemas ultimamente mencionados apresentam
maior instabilidade favorecida pelo crescimento desorganizado de calos. Quanto maior o tempo
de durao da fase de crescimento desorganizado, maiores sero as chances de variao
somaclonal.
125

A multiplicao celular acelerada responsvel por quebras cromossmicas. Regies


heterocromticas (tardias) tm sido mencionadas como stios com quebras cromossmicas.
Somaclones regenerados por cultura de tecidos apresentam aspectos morfolgicos
anormais, como: nanismo, caracteres foliares alterados, quimerismos, albinismo, mosaicismo
nas folhas, alteraes de fertilidade.
Variabilidade: comum observar na fase de reproduo de calos que os regenerantes
resultantes diferem dos parentais devido sem dvida presena de clulas aneuploides
totipotentes.
Os calos, protoplastos e as suspenses celulares apresentam instabilidade gentica,
conferindo s plantas delas regeneradas, mudanas cariolgicas e fenotpicas em relao
planta matriz.
Este mecanismo de variao no genoma (endopoliploida, politenia e amplificao ou
diminuio de seqncia de DNA) acontece durante a diferenciao somtica.
Tambm se podem mencionar outros mecanismos, os quais tem relao com o
processo, tais como: mudanas coriotipicas grosseiras, rearranjos cromossmicos crticos,
permuta somtica, permuta somtica ou at combinaes destes processos. Diferentes tipos de
arranjos cromossmicos tais como: translocaes recprocas, delees, inverses, translocaes
no homologas e formao de fragmentos acentricos e centricos. Estes rearranjos podem
provocar perdas, reestruturao e transporte de material cromossmico e provocar a expresso
de genes inertes como resultado da perda ou desligamento do alelo dominante.
Anormalidades: nos tecidos diferenciados isolados e cultivados n vitro a mitose
induzida na presena de reguladores exgenos de crescimento. Tem-se observado em estudos
citolgicos que na diviso podem ocorrer anormalidades como alteraes cromossmicas
numricas e estruturais. O ciclo celular em plantas in vivo afetado por reguladores de
crescimento, temperatura, luz e agitao do meio, mas in vitro o controle inadequado do ciclo
celular a causa da variao. Na regenerao de protoplastos o ciclo celular problema
acentuado. A parede celular removida, novas paredes so formadas e a diviso induzida nas
clulas derivadas dos protoplastos, observando-se alta freqncia de erro na sntese de
microtubos, forma e orientao de segregantes de cromtides, resultando extensiva variao no
numero e estrutura de cromossomos.
Sabe-se que a freqncia de permutas entre cromatinas irms realmente alta em
plantas.
A variao somaclonal permite aumento na variabilidade gentica que pode ser utilizada
eventualmente no melhoramento.
FATORES
A variao observada na cultura de tecidos e na regenerao de plantas pode ser
atribuda a diferentes fatores.
Tipo de explante: comum observar a produo de regenerantes diferentes do tipo
parental num sistema de regenerao que passe pela fase de calos.
Meristemas: considerado como um procedimento que produzir pouca ou nenhuma
variao gnica, pois as clulas no passam por um estdio de dediferenciao.
Embriognese: geralmente, utilizam-se embries imaturos aproveitando sua alta taxa de
morfognese. A incluso de 2,4 - D no meio favorece a estimulao da totipotncia.
Cultura de protoplastos: vm sendo utilizada no melhoramento de espcies de interesse
agronmico, plantas trangnicas e mutantes ou variantes somticos somaclonais. Os

126

protoplastos podem apresentar instabilidade gentica, mudana cariolgicas e fenotipicas em


relao planta me.
Especies cultivadas: as mudanas no estado diferenciado de clulas durante a
regenerao e condies especiais do ambiente da cultura, colocam o genoma em condies de
estresse. Diferentes genomas respondem de forma distinta e, portanto, a variao somaclonal
tem um componente genotpico.
Reguladores: Os fitorreguladores tm ao mutagnico (2,4D), os sais utilizados na
formulao dos meios (pureza e concentrao), o tempo de cultura, nmero de subcultivos,
tipo de explante, gentipo, nvel de ploidia so alguns fatores considerados capazes de induzir
variabilidade in vitro. H evidencias tambm de que o tipo e a concentrao de reguladores de
crescimento podem influenciar a variao observada em plantas regeneradas, algumas das quais
no so sexualmente transmitidas, e portanto, epigenticas. Outros reguladores so: etileno,
BAP e cinetina.
Tipo de tecido: variaes no genoma incluindo endopoliploidia, politenia, amplificao
ou diminuio do DNA, podem ocorrer durante a diferenciao somtica no crescimento e
desenvolvimento de plantas. No difcil que diferenas na freqncia e natureza da variao
somaclonal possam ocorrer quando a regenerao obtida de tecidos de origem diferente. As
variaes esto relacionadas origem dos tecidos e ao sistema de regenerao o que explica
porque alguns sistemas de culturas podem estar associados com variaes especficas.
Outras variaes podem ter origem no tecido doador indicando que a variao pode-se
originar de mutaes somticas presentes na planta doadora, fato observado em alguns
experimentos.
Numero de repicagens: quanto maior o nmero de subcultivos, maior a possibilidade
de ocorrer variao. Algumas espcies so mais sensveis, no devendo-se ultrapassar cinco
subcultivos (exemplo: bananeira).
Estresse: a cultura de tecidos um procedimento que causa estresse no genoma, o qual
levado a responder de modo incomum. Alm dos fitoreguladores, os sais utilizados na
formulao de meios de cultura, so questionados quanto ao seu papel estressante para o
genoma de plantas regeneradas in vitro.
12.4. HIPERHIDRATAO
Este fenmeno bastante comum na cultura de tecidos vegetais e pode causar danos
tanto na taxa de crescimento e multiplicao de explantes como tambm pode dificultar ou
inviabilizar a aclimatizao das plntulas. O termo 'hiperhidratao' tem sido preferido ao termo
'vitrificao', por ser mais apropriado (literalmente, vitrificao indica a converso de um
determinado material em vidro). A hiperhidratao pode ser encontrada em cultivos de brotos e
gemas, brotos regenerados de calos de todos os tipos de plantas, porm seu grau e freqncia
variam acentuadamente entre os diferentes gentipos. mais freqentemente encontrada na
propagao em massa de espcies lenhosas, mas tambm ocorre em certas famlias de plantas
herbceas.
A condio de hiperhidratao pode afetar todos os tecidos e rgos cultivados in vitro.
devida maneira que a cultura foi tratada e tambm uma desordem fisiolgica (e no
patolgica). Embora muitos fatores tenham sido identificados que possam induzi-la, a
hiperhidratao no totalmente previsvel. Tecidos hiperhidratados exibem reduo na
lignificao e isto faz com que os vasos e os traquedeos estejam ausentes ou possuam uma
forma anormal nos caules, gemas e folhas. Os calos podem tambm se tornar hiperhidratados.

127

Tornando-se quebradios, no diferenciando os elementos (feixes) vasculares e sendo noorganognicos. As paredes celulares possuem baixo teor de celulose e nenhuma lignina.
Vrios processos metablicos so alterados em plantas hiperhidratadas. Os brotos
contm menos protena e clorofila do que o normal e a sntese de lignina interrompida. Os
sintomas mais severos de anormalidades so normalmente no-reversveis. s vezes a
hiperhidratao pode ser reversvel, mas no aconselhvel subcultivar brotos anormais, pois a
condio de hiperhidratao usualmente mantida durante a transferncia, e persiste nas
culturas que tenham sido estabelecidas.
Os fatores que mais contribuem para a induo da hiperhidratao so:
- Fatores ambientais: em condies ideais de crescimento, pode haver uma diminuio
deste distrbio. Nas culturas de brotaes de Prunus armeniaca, houve ocorrncia de
hiperhidratao quando adicionados 8,8 mM BAP ao meio com sacarose, mas a incidncia da
desordem causada pelo regulador de crescimento foi muito menor quando o sorbitol era a
fonte de carbono.
Altas temperaturas e baixa luminosidade promovem a hiperhidratao. J foi observado
que a hiperhidratao de cultivo de brotaes regeneradas de hipoctilo e segmentos de
cotildone de Chianthus formosus pode ser reduzida mantendo as culturas 5o C por 10 dias,
antes de retorna-la temperatura ambiente.
A alta umidade relativa contnua provavelmente o fator ambiental mais importante a
causar o incio da hiperhidratao. As brotaes cultivadas em meios lquidos, incluindo aqueles
sustentados em um meio lquido com pontes de papel de filtro, so mais propensas a tornaremse hiperdricas do que aquelas cultivadas em meio gelificado, embora o grau de anormalidade
varie bastante com o gentipo. A reduo da umidade cerca dos brotos ou plntulas em
crescimento pode ser efetuada de vrias maneiras: arejando deliberadamente as culturas,
cobrindo-se a parte superior dos recipientes de modo a escapar algum vapor, usando materiais
que absorvem gua (higroscpicos), cultivando as culturas em gar (meio) inclinado e
controlando a condensao da gua.
- Baixa transpirao dos explantes: os mtodos usados para melhorar a transpirao
podem ajudar a reduzir a hiperhidratao. A transpirao no interior dos brotos melhorada
utilizando-se altos nveis de luminosidade.
- Potencial hdrico do meio: o potencial hdrico do meio, particularmente o componente
matricial, exerce efeito sobre a hiperhidratao, que freqentemente induzida ou piorada em
culturas lquidas submersas, onde os brotos caem dentro ou tornam-se submersos em um meio
semi slido contendo uma baixa concentrao de gar.
O potencial hdrico de um meio de cultivo slido apresenta dois componentes
negativos, um advindo da dissoluo dos sais e componentes orgnicos no meio (potencial
osmtico - s), e outro, de quaisquer agentes geleificantes, como a pectina, o gar (potencial
matricial - m). Assim, uma possvel explicao para o efeito curativo das altas concentraes
de acares e agentes geleificantes, que eles fazem com que o potencial hdrico total do meio
seja decrescido. Um decrscimo no potencial hdrico do meio faz com que a umidade relativa
nos recipientes de cultivo diminua levemente, facilitando assim a transpirao dos brotos
cultivados. Adicionando acar extra ao meio, poderamos reduzir levemente a umidade relativa
nos frascos de cultivo.
- Composio dos macros e micronutrientes no meio: a condio de hiperhidratao
freqentemente ocorre em meios MS sem diluio, mas no em meio com menor concentrao
de macronutrientes. Todavia parece que a hiperhidratao menos influenciada pelo potencial
osmtico de solues de macronutrientes, do que pela concentrao de ons NO3- e NH4+, bem
como o balano entre ambos.
128

- Reguladores de crescimento: em cultivos de brotos, a induo a hiperhidratao pode


ser influenciada pelo tipo e concentrao de reguladores de crescimento usados. Em muitas
espcies, provvel que seja induzida por altos nveis de citocinina, enquanto que nveis
menores induzem a proliferao normal de brotos. As citocininas so particularmente
propensas de induzir a sndrome de brotos vtreos quando elas so adicionadas s culturas nas
quais h um outro fator sub-timo (tal como quando um agente gelificante inapropriado foi
utilizado ou onde as culturas foram submetidas a alta UR ou algum outro stress). A
sensibilidade das plantas ao BAP depende de seu gentipo e de outras condies ambientais
que as culturas esto submetidas.
Em alguns casos, a adio de cido giberlico ao meio de enraizamento pode reduzir a
ocorrncia de hiperhidratao.
De forma resumida, pode-se afirmar que a hiperhidratao poderia ser prevenida ou
induzida por uma ou mais medidas. Abaixo so citadas as principais medidas de preveno:
reduo da umidade nos recipientes de cultivo;
aumento da concentrao do agente gelificante e/ou da sacarose;
utilizao da tcnica de meio em duas fases em lugar do convencional mtodo do meio
gelificado;
cultivo de brotaes em suporte poroso em meio lquido;
diminuio da concentrao de ons amnio no meio;
alterao do pH do meio;
adio de um ou mais cidos orgnicos como o citrato, succinato ou malato ao meio
para regular a assimilao do amnio;
diminuio da concentrao de micronutrientes do meio;
substituio da sacarose por frutose ou galactose, ou ainda a adio de glutationa ao
meio;
transferncia das culturas para um meio sem reguladores de crescimento. Isto pode
permitir a formao de brotos novos sem hiperhidratao;
diminuio da concentrao de fitorreguladores no meio;
alterao na relao auxina/citocinina;
cultivo de brotos ou plantas sob alta luminosidade;
12.4. DECLNIO NO VIGOR DAS BROTAES
Na cultura de tecidos de algumas espcies, as brotaes param de crescer e proliferar
aps um perodo de tempo. Em algumas ocasies, o declnio est associado com a produo de
substncias fenlicas e, em outros casos, pode estar associado com a hiperhidratao. Em
outras ocasies, o declnio foi relacionado com a falta de adequao a nutrientes ou reguladores
no meio. Uma perda de vigor em cultura de brotos de Vitis foi constatado ser devida presena
de mais que 1% de sacarose no meio. Porm, em geral, a causa tem permanecido obscura.
Subcultivos em um meio fresco podem evitar o problema. Este tratamento no
sempre eficaz, como observado em Persea americana, na qual aps 6 meses de subcultivo com
transferncias mensais, em meio WPM, as brotaes tiveram interns curtos e cessaram a
multiplicao de brotos axilares.
A variao nesta taxa comum em cultivos de brotaes de plantas lenhosas, onde a
taxa de multiplicao tipicamente baixa durante as primeiras passagens, porm aumenta
medida que o material cultivado torna-se rejuvenescido. s vezes, a taxa de multiplicao cresce
at um mximo e ento diminui em subcultivos sucessivas. Explantes de Rhododendon chapmanii
produziram 5,8 brotos por explante, inicialmente, aumentando para 7,8 brotos durante os trs
ciclos seguintes de multiplicao, porm diminuindo em subcultivos posteriores.
129

Em outras plantas, a diminuio na taxa de proliferao de brotos pode ser mais


profunda. Em cultivos de brotaes de Carica papaya que haviam proliferado satisfatoriamente,
a taxa de multiplicao de brotos caiu rapidamente de um aumento de oito vezes por subcultura
para cerca de duas vezes. A dominncia apical foi perdida e as brotaes tornaram-se cada vez
mais difceis de enraizar. Este declnio no pde ser revertido pela adio de carvo vegetal ou
maior quantidade de reguladores de crescimento ao meio e poderia ter sido causado pela
presena de um contaminante persistente, pois medida que o crescimento diminuiu, este
microorganismo aumentou em virulncia, causando obciso foliar e finalmente morte da
cultura.

130

Captulo 13
Embriognese somtica
13.1. INTRODUO
A embriognese um processo de desenvolvimento de embries a partir de clulas
haplides ou somticas diplides, sem que haja a fuso de gametas.
Podem ser definidos dois padres bsicos de desenvolvimento de embries na
embriognese somtica in vitro: a embriognese direta, na qual os embries somticos originamse diretamente de tecidos matrizes sem a formao de estdios intermedirios de calos, e a
embriognese indireta, na qual os embries somticos se formam a partir de um calo, que
apresenta clulas em diferentes estdios de diferenciao. Em ambos os padres, o embrio
somtico segue a mesma seqncia de desenvolvimento do zigtico, ou seja, a passagem pelos
estdios globular, cordiforme, torpedo e cotiledonar.
O embrio somtico, de forma similar ao zigtico, tem o aspecto bipolar e as clulas
embriognicas tambm apresentam um conjunto de caractersticas comuns ao comportamento
das clulas embrionrias em diviso ativa, independente do padro direto ou indireto. Estas
caractersticas incluem o tamanho pequeno (100 - 200m), contedo citoplasmtico denso,
ncleos grandes com nuclolos proeminentes, vacolos pequenos e presena de gros de
amido.
Quanto utilizao da embriognese somtica na propagao de diversas espcies,
inmeras vantagens tm sido observadas como alta taxa de multiplicao, escalonamento da
produo pela manuteno da cultura em meio lquido, plantio direto da muda obtida via
embriognese somtica sem necessidade de enxertia e possibilita a transferncia de genes tanto
pela fuso de protoplastos como pela transformao gentica.
13.2. TIPOS DE EMBRIOGNENSE
Embriognese somtica pode ocorrer sob duas formas: natural ou in vitro. O primeiro
tipo ocorre, por exemplo, em nucela de citros, em que embries apomticos se formam sem
qualquer tipo de induo. Os embries somticos podem se formar tambm sobre folhas de
algumas plantas, como ocorre nos gneros Asplenium, Cardamiine, Ranunculus, Tolmiea, etc.
A embriognese somtica in vitro ou induzida depende de estmulos ambientais e/ou
qumicos para que clulas do explante adquiram a competncia morfogentica e se diferenciem
em embries.
13.3. FATORES QUE AFETAM A EMBRIOGNESE SOMTICA
O surgimento dos primeiros embries, a taxa de embriognese (porcentagem de
explantes que produzem embries) e o nmero de embries produzidos por explante
dependem de vrios fatores, entre eles a origem e o tamanho do explante, a composio do
meio de cultivo e os reguladores de crescimento, o rgo fornecedor de explante, a idade, a
poca do ano em que colhido e o gentipo da planta doadora.
A implementao da embriognese somtica ocorre a partir de explantes de origem
diversa, tais como pice caulinar, hipoctilos, discos e segmentos foliares, inflorescncias,
razes, embries zigticos e outros.

131

13.3.1. Meios de cultivo


O tipo e o suprimento dos nutrientes minerais no meio de cultivo essencial para o
cultivo in vitro, podendo variar de acordo com a espcie vegetal e o processo de cultivo. A
induo da embriognese somtica em explantes vegetais, assim como a multiplicao e
crescimento de plntulas, so altamente dependentes da composio dos nutrientes minerais no
meio de cultivo.
A induo de embriognese somtica tem sido correlacionada com determinadas
necessidades nutricionais; entretanto, poucos estudos tm sido dirigidos anlise do consumo
dos componentes nutricionais, o que poderia levar a uma otimizao do meio de cultivo e,
como conseqncia, a um melhor controle dos eventos embriognicos.
Na embriognese somtica, normalmente so empregados pelo menos dois diferentes
meios de cultura. O primeiro otimizado visando induo da embriognese, enquanto o
segundo meio permite o desenvolvimento dos embries. As condies que favorecem a
primeira fase inibem a segunda.
Os meios de cultura mais utilizados so o MS, SH e B5 durante as fases de crescimento
e desenvolvimento de embries somticos. Tais meios caracterizam-se por apresentarem alta
concentrao salina, que exigida nestas etapas.
13.3.1.1. Sais minerais
A composio em sais minerais do meio de cultivo tambm fator determinante para o
sucesso da embriognese somtica. O meio MS, por exemplo, caracteriza-se pela presena de
nitrognio na forma de nitrato de amnio. A forma como o nitrognio adicionado ao meio
contribui para a ocorrncia ou no da embriognese somtica. A adio simultnea de
compostos nitrogenados, na forma reduzida e de nitrato e sua relao, tm efeito estimulatrio
no processo. O nitrognio na forma amoniacal essencial para o desenvolvimento do prembrio de cenoura, por exemplo, pois no h formao de embries na sua ausncia. Alguns
autores, no entanto, acreditam que a quantidade de nitrognio mais importante do que a sua
forma de aplicao. A adio de aminocidos em meio contendo nitrato, tais como Lglutamina, cido L-glutmico -alanina favorece a produo de maior nmero de embries
somticos e com melhor desenvolvimento, quando comparado com meio suplementado com
on amnio.
O potssio tambm tem papel fundamental no processo. A incluso de KH2PO4 ao
meio contendo uma fonte de nitrognio reduzido, tem permitido a obteno de maior nmero
de embries somticos. A exigncia deste elemento foi demonstrada tambm em cultura de
clulas de cenoura, onde o nmero de embries produzidos se correlacionava com o aumento
da concentrao potssio. Em batata doce, observou-se melhor proliferao de calo
embriognico em meio contendo 30 mM de KCl.
A adio de quelatos de ferro favorece o desenvolvimento de embries somticos in
vitro. Em meio desprovido deste elemento, o desenvolvimento do estgio globular inibido.
Em tabaco, o desenvolvimento de embries andrognicos s ocorreu na presena de ferro no
meio de cultivo.
O clcio, quando utilizado na forma de Ca(NO3)2, inibe a embriognese somtica em
cenoura.
O sdio em concentraes entre 46 a 83 mM no apresenta efeito na embriognese
somtica de cenoura.

132

13.3.1.2. Carboidratos
A sacarose tem sido a fonte de carboidrato mais usada na embriognese somtica,
embora outros mono e dissacardeos possam ser utilizados. A concentrao de sacarose
influencia nos processos de iniciao e diferenciao dos embries somticos, uma vez que o
seu metabolismo em plantas regulado por um grupo de genes (sacarose sintetase e sacarose
invertase), cujas respostas so moduladas de acordo com a variao de sua concentrao. O
nmero mximo de embries formados em cultura de clulas de Ranunculus foi em meio de
cultivo com at 2% de sacarose; a concentrao de 5% deste acar inibia ligeiramente este
processo. Sacarose ou maltose foram os carboidratos mais efetivos na induo de embriognese
somtica em cenoura, quando comparados com glicose, manose, rafinose e glicose + frutose.
13.3.2. Reguladores de crescimento
As auxinas e citocininas tm papel importante na embriognese somtica de vrias
espcies vegetais. Algumas necessitam de meio suplementado com cido giberlico ou cido
abcsico para o desenvolvimento de embries, enquanto outras dispensam o seu uso, uma vez
que o processo de induo tenha se estabelecido.
As auxinas promovem a induo e iniciao do processo de embriognese somtica.
necessria em meio de cultivo para diversas espcies, induzindo a expresso da totipotncia de
clulas competentes para a formao de agregados embriognicos. A auxina mais utilizada o
2,4-D em altas concentraes na fase de iniciao das culturas embriognicas, at o estgio de
pr-embrio, resultando em clivagens e gemao sucessivas. Nesta etapa pode ser utilizado
tambm picloran (20 a 100 mM) ou ANA. A seguir, estes processos ocorrem em ciclos
repetitivos, quando a concentrao deve ser alterada para 2 a 5 mM. Aps a iniciao do
processo, a auxina inibe o desenvolvimento dos estdios globular, cordiforme, cotiledonar e
plntulas, sendo pois necessria a mudana para um meio desprovido deste regulador de
crescimento, a fim de promover o desenvolvimento e maturao dos embries. Alm disso, a
manuteno prolongada das culturas embriognicas em meio com 2,4-D causa variaes
genticas e epigenticas que afetam o potencial embriognico. Embries somticos tornam-se
habituados durante perodos prolongados de subcultivos em 2,4-D, perdendo seu potencial de
maturao e capacidade de converso em plantas.
As citocininas (2 a 5 mM) tambm esto relacionadas com o processo de produo de
calo embriognico. As mais utilizadas so a benzilaminopurina, benziladenina, cinetina.
Tidiazuron foi utilizado com timos resultados na embriognese somtica de batata doce.
O cido abcsico (ABA) importante na fase de desenvolvimento e maturao dos
embries somticos por interromper os processos de clivagem e gemao induzidos pelas
auxinas; induzir a sntese e acmulo de reservas e evitar a germinao precoce. Concentraes
de 10-4 a 10-7 mM propiciam bom crescimento, desenvolvimento, produo de embries e sua
converso em plantas.
O cido giberlico pode ser necessrio para converso de embries somticos em
plantas. Na concentrao de 1 mg L-1 estimula a formao de razes em embries somticos de
citrus e seu enraizamento, que pode ser incrementado com a adio de sulfato de adenina (27
mg.l-1). O GA3 apresenta efeito direto na iniciao ou desencadeamento do desenvolvimento de
razes pr-formadas. No entanto, efeitos negativos foram observados na produo de embries
somticos de cenoura ao se utilizar concentraes de 10-8 a 10-5 mM de GA3.
13.3.3. Concentrao osmtica
A embriognese somtica exige alta osmolaridade em funo de sua similaridade com a
embriognese zigtica, na qual o saco embrionrio apresenta alto potencial osmtico. Baixo
133

potencial de gua pode ser obtido pela adio de sacarose, sorbitol e glicerol ao meio de cultivo,
os quais servem tambm como fonte de energia e previnem a germinao precoce e
desenvolvimento anormal de embries somticos de cenoura. Outras substncias como
polietilenoglicol e manitol tambm atuam reduzindo o potencial de gua.
13.3.4. Luz
O processo de induo e iniciao ocorre no escuro para a maioria das espcies, ao
passo que o desenvolvimento se d na presena de luz. Em Ramunculus sceleratus, no entanto, o
desenvolvimento de embries somticos ocorreu tanto no escuro quanto em ambiente
iluminado.
13.4. ESTDIOS E MODULAO DA EMBRIOGNENSE SOMTICA
O processo de embriognese somtica pode ser dividido em duas etapas ou ciclos. No
primeiro (ciclo A), um explante juvenil ou embrionrio, inoculado em meio contendo 2,4-D.
Essas culturas so geralmente mantidas no escuro e geram complexos ou massas prembrionrias, que, por processos de embriognese repetitiva (Clivagem e Gemao), resultam
num ciclo repetitivo de divises celulares, formando complexos celulares suspensor
embrionrio nas gimnospermas, e de embries globulares nas angiospermas. No ciclo B, os
embries tm seu desenvolvimento estimulado pela retirada da auxina do meio, ou incluso de
ABA, citocininas e agente de estresse osmtico na presena de luz, resultando em embries
somticos maduros que podem ser convertidos em plantas.
13.5. APLICAES
 Estudos da fisiologia do embrio;
 Multiplicao de plantas elite: atravs da embriognese somtica possvel produzir
em massa indivduos desejveis. Mangueiras melhoradas, por exemplo, podem ser
multiplicadas atravs da embriognese somtica, com reduo do tempo de
propagao;
 Escalonamento da produo de mudas pela manuteno da cultura em meio lquido,
o que elimina a dependncia de perodos especficos de disponibilidade de material
propagativo, possibilitando obter os propgulos no momento desejado;
 Melhoramento gentico, pela transferncia de genes para obteno de plantas
transgnicas ou geneticamente modificadas, utilizando-se o processo de biobalstica
sobre calos embriognicos ou regenerao de indivduos obtidos por estes processos
ou por fuso de protoplastos. Diversa espcies tm sido transformadas
geneticamente e regeneradas via embriognese somtica com o mamoeiro resistente
ao vrus da mancha anelar, videira resistente ao Grapevine Fan Leaf virus (GFLV);
arroz e soja contendo o gene codificador de cristais proticos de B. thuringiensis, etc;
 Produo de plantas haplides, a partir da cultura de anteras associada a regenerao
via embriognese somtica, possvel produzir plantas homozigotas passveis de uso
em programas de melhoramento;
 Produo de linhagens poliplides de melo, pra, citrus e acacia;
 Eliminao de viroses: os vrus GFLV e o vrus GLR foram eliminados em videira
utilizando a embriognese somtica associada a termoterapia. O mtodo tem sido
utilizado com sucesso em citros e Ophiogon japonicus (Vicient e Martnez, 1998);

134

mamoeiro resistente ao vrus da mancha anelar foi obtido por transformao


gentica seguida de embriognese somtica para regenerao das plantas;
 Pode-se citar ainda a possibilidade de uso para multiplicao de espcies de
determinadas culturas que possuem longo perodo juvenil, visando a acelerao da
produo massal de plantas elite ou a multiplicao rpida de plantas hbridas
estreis ou que possuem embrio imaturo;
 Produo de sementes sintticas: so embries somticos, revestidos (encapsulados)
por algum produto ou no.

135

Captulo 14
Biorreatores
14.1. INTRODUO
A metodologia tradicional de micropropagao baseia-se em cultivos em pequenos
frascos, e uso de meio nutritivo gelificado, o que acarreta intensa manipulao das culturas e
envolve um grande contigente de mo-de-obra especializada. Outra desvantagem destas
tcnicas a dificuldade em controlar as propriedades qumicas e/ou fsicas nos frascos de
cultura.
importante desenvolver novas tcnicas de propagao para superar as limitaes da
micropropagao convencional. O uso dos chamados biorreatores uma forma considerada
como alternativa para reduzir os custos de produo.
14.2. ORIGEM DOS BIORREATORES
Os primeiros biorreatores derivaram dos equipamentos denominados fermentadores,
desenvolvidos para o cultivo de fungos e bactrias para fins industriais. Historicamente, foram
mais conhecidos por fermentadores e estavam direcionados para o cultivo de clulas ou
microrganismos, com vistas a produzir metablitos secundrios, alcalides, antibiticos, entre
outros.
O nome fermentador est relacionado etimologicamente com fermentao que, na sua
raiz latina, deriva de fermentare, cujo significado ferver, isto , produzir bolhas de ar, numa
aluso ao fato dos fermentadores serem destinados a processos fermentativos como, por
exemplo, a produo de lcool, onde as leveduras regeneram NAD a partir de sua forma
reduzida NADH, com produo de etanol e CO2, na qual este ltimo, pela apario de bolhas,
d a idia de fazer ferver o meio lquido nutritivo.
Inicialmente, e pelo fato de serem destinados a usos industriais, esses fermentadores
foram de grande capacidade: de 20 a 4000 litros de meio nutritivo. Em decorrncia disso, estes
devem ter acurado sistemas de oxigenao, agitao mecnica do meio lquido, monitoramento
de pH, da temperatura e da formao de espuma, que asseguram parte bitica
(microrganismos) sobreviverem nesse ambiente abitico artificial, visando aumentar seus
rendimentos (biomassa, metablitos secundrios, antibiticos) porm com custos altos de
instalao.
14.3. ADAPTAES PARA USO EM CULTIVO DE CLULAS
Recentemente os biorreatores comearam a ser utilizados para os cultivos de clulas,
tecidos, gemas e plntulas, tendo como objetivo final a produo de mudas em larga escala. O
primeiro relato sobre o uso de biorreatores para a propagao vegetal foi feito por Takayama e
Misawa (1981) para a micropropagao de begnia.
Podem ser conceituados como equipamentos para cultivos sob imerso temporria ou
permanente de clulas, gemas, embries ou qualquer tipo de propgulo que possa ser utilizado
na micropropagao. So sistemas usados para micropropagar plantas, visando a otimizao,
bem como a reduo dos custos da operao. Muitas vezes, os custos de produo de mudas
provenientes de cultivo in vitro, a partir de meios gelificados, no compensam sua produo, por
causa dos melhores preos obtidos pela propagao convencional.
136

Estes equipamentos utilizam meio de cultivo lquido e permitem a renovao do ar


durante o cultivo, bem com o monitoramento de alguns parmetros essenciais ao crescimento
do propgulo, tais como pH, oxignio dissolvido, temperatura e concentrao de ons. Alm
disso, fornecem condies timas de crescimento pela regulao de vrios fatores qumicos e
fsicos do ambiente in vitro.
Uso de meio lquido para a micropropagao pode ser benfico para o desenvolvimento
de novos sistemas de regenerao, livres de desordens fisiolgicas muito freqentes em alguns
cultivos, causando perdas significativas. O meio lquido freqentemente resulta em maior
crescimento e multiplicao que o meio gelificado. Alm disso, computadores podem ser
usados como sistemas de controle de biorreatores e eles tem vrias vantagens sobre o sistema
convencional de micropropagao em termos de automao, economia de trabalho e custos de
produo.
Aplicados produo de embries somticos e sementes sintticas, essa metodologia
exige completo domnio sobre o processo de induo e seleo de calos embriognicos, bem
como da diferenciao e encapsulamento dos embries, alm da germinao das sementes.
Experimentos de multiplicao in vitro de abacaxizeiro, nos sistemas de micropropagao
em cultura estacionria e no sistema de imerso temporria, apresentaram mdias de
multiplicao de 5,9 e 131,2 brotos por explante, respectivamente. Neste trabalho, a eficincia
do sistema de imerso temporria permitiu um aumento significativo na taxa de multiplicao.
A aplicao de tcnicas de cultura por biorreatores para a micropropagao
considerada como uma das vias para reduzir os custos de produo e automao. Vrias
cultivares de Lilium foram propagadas com sucesso por biorreatores.
Trabalhos com babata, banana e gladiolo, evidenciaram que a utilizao de biorreatores
facilitou a propagao em larga escala destas espcies.
14.4. FATORES QUE PODEM SER CONTROLADOS ATRAVS DO USO DE
BIORREATORES
a) pH do meio;
b) oxignio dissolvido: a concentrao de oxignio dissolvido ao ser medida por um
eletrodo, pode controlar a velocidade de agitao, a qual responsvel pelo aumento da
concentrao de oxigenao disponvel no meio lquido para o metabolismo celular. Como o
oxignio no completamente sluvel em gua, sua quantidade rapidamente consumida
quando seu fornecimento interrompido, especialmente em alta densidade celular. No
crescimento de bulbilhos de Lilium Marcopolo em biorreator de 20 litros, o do meio lquido
diminuiu rapidamente de 8 para 4 mg/L aps 2 semanas. Isso demonstra que a concentrao de
oxignio dissolvido do meio lquido foi afetado pela taxa de crescimento das clulas e/ou
tecidos.
c) fornecimento de CO2 : a concentrao de CO2 influencia no pH do meio. Uma alta
aerao pode resultar em uma rpida renovao de gases e substncias volteis como o CO2,
etileno e etanol. Logo, a alta taxa de aerao reduz consideravelmente a concentrao de CO2
nas culturas.
d) densidade de inoculao: as clulas vegetais normalmente no crescem em baixa
densidade populacional porque perdem certas substncias essenciais por difuso.

137

14.5. CONSTITUIO DOS BIORREATORES


Basicamente, os biorreatores tradicionais apresentam os seguintes componentes: frasco
de cultivo, motor eltrico conectado a um eixo que se estende at o interior do frasco, bomba
compressora de ar, sensores de temperatura, pH e oxignio. Os frascos podem ser de vidro, ao
inoxidvel, policarbonato, polipropileno ou qualquer outro material que suporte autoclavagem a
121oC durante 15 a 30 minutos.
A homogeneizao do meio de cultivo e a aerao do material em cultivo so feitos de
diversas formas, sendo a mais comum a injeo de ar a uma determinada presso, combinada
com o movimento de uma hlice no interior do rasco de cultivo.
Alguns tipos de biorreatores utilizados para o cultivo de pices caulinares e embrio
Tipo aerador agitador: a agitao feita por meio de hlices conectadas a um eixo
giratrio. A desvantagem desse modelo que para haver uma boa homogeneizao do meio,
necessrio que a hlice gire em velocidades suficientemente elevadas, o que, em geral, causa
dano mecnico acentuado ao material em cultivo.
Tipo tambor rotatrio: o frasco de cultivo gira suavemente em movimentos rotacionais
sobre dois eixos. Aqui o dano mecnico mnimo, entretanto, o nvel de oxigenao s
adequado quando se utilizam meios de cultura com alta viscosidade.
Tipo filtro rotatrio: apresenta um filtro conectado um eixo central por onde o meio de
cultivo descarregado. Esse elemento responsvel igualmente pela homogeneizao, bem
como pela aerao do material em cultivo.
Tipo de imerso temporria: o meio permanece em contato com explante por um
perodo pr-determinado. Em seguida, o meio drenado e o explante deixa de ficar em contato
direto com o meio de cultivo (Figura 14.1).

Figura 16.1: Biorreatores de imerso temporria

Tipo borbulhamento: a homogeneizao do meio, bem como a aerao so feitos via


borbulhamento de ar no fundo do frasco

138

Tipo fase gasosa: apresenta um suporte perfurado sobre o qual o material em cultivo
posicionado. O meio de cultivo , em seguida, drenado pela base do suporte e novamente bombeado e
pulverizado a intervalos pr-estabelecidos.

139

Captulo 15
Termos utilizados em cultura de tecidos
Sendo a Biotecnologia eminentemente multidisciplinar, foram includos, alm de termos
especficos, vocbulos de reas relacionadas, como gentica e biologia molecular. Os conceitos
de cada termo foram explicitados de forma simples e concisa para facilitar o entendimento do
leitor.
A
Abaxial: 1) Face inferior ou dorsal da folha. 2) rgo cuja localizao est distante do
eixo sobre o qual se insere.
Absciso: Processo fisiolgico de separao de um rgo sem causar injrias no local
de insero. Aplica-se a rgos tais como folhas, flores e frutos que se destacam da planta
geralmente aps a formao de uma zona de absciso na sua base.
cido abscsico (ABA): Hormnio vegetal pertencente classe de sesquiterpenos, ou
seja, constitudo de trs unidades de isopreno. biossintetizado a partir do cido mevalnico
em razes e folhas maduras, principalmente, em resposta estresse hdrico. Est envolvido nos
seguintes efeitos fisiolgicos, entre outros: fechamento de estmatos, inibio do crescimento
de parte area, germinao e desenvolvimento de sementes ( acmulo de protenas de reserva e
lipdios, aquisio de tolerncia a dessecao e induo e manuteno da dormncia de
sementes).
cido Desoxirribonuclico (DNA): Material gentico bsico da maioria dos
organismos. O DNA consiste de uma seqncia de quatro monmeros de nucleotdeos ligados
covalentemente, os monofosfatados de desoxiadenosina (dAMP), desoxiguanina (dGMP),
desoxicitidina (dCMP) e desoxitimidina (dTMP). A molcula de DNA polar, constitudas por
duas fitas complementares, dispostas paralelamente, possuindo nmero varvel de
nucleotdeos. A configurao espacial do DNA uma dupla hlice. Contm as informaes
genticas determinantes dos caracteres hereditrios transmitidos descendncia mediante a
codificao da seqncia de aminocidos em polipeptdeos e protenas.
cido giberlico (GA3): Hormnio vegetal isolado do fungo Gibberella fujikuroi. Dentre
os efeitos fisiolgico incluem-se estmulo da diviso e/ou alongamento celular, induo e
expresso de florao, partenocarpia, germinao e quebra de dormncia.
cido 3-indolactico (AIA): Hormnio vegetal, foi a primeira auxina identificada.
de ocorrncia natural e induz o alongamento celular. Dentre seus efeitos fisiolgicos incluem-se
crescimento do caule, iniciao da atividade cambial em plantas lenhosas, tropismos,
dominncia apical, diferenciao polar de razes nas estremidades de estacas de caule,
desenvolvimento da flor, crescimento do fruto, induo de partenocarpia, absciso foliar e de
frutos e induo da epinastia.
cido nuclico: Polmero de nucleotdeos. Cada nucleotdeos possui um anel cclico
heterogneo com tomos de carbono e nitrognio ( bases nitrogenadas), um acar com 5
140

carbonos dispostos em forma de anel (pentose) e um grupamento fosfato. As bases


nitrogenadas so purinas (adenina e guanina) e pirimidinas (timina, citosina e uracila). Os cidos
nuclicos abrangem o cido desoxirribonuclico (DNA) e cido ribonuclico (RNA).
cido ribonuclico (RNA): Molcula linear constituda de uma cadeia nica de
ribonucleotdeos, contendo quatro monmeros de nucleotdeos, os monofosfatados de
adenosina (AMP), guanosina (GMP), citidina (CMP) e uredina (UMP). Estruturalmente, a
molcula de RNA similar a de DNA, porm na molcula de RNA o acar presente a
ribose. Entre os RNAs existentes esto includos os RNA mensageiros (mRNA), RNA
ribossomais (rRNA) e RNAs transportadores (tRNA). O RNA sintetizado a partir de uma
molcula-molde de DNA pelo processo de transcrio, possuindo a funo de transferir essa
informao gentica do DNA para a biossntese protica (traduo). Certos vrus possuem
RNA como material gentico que, em alguns casos, pode ser sintetizado usando o prprio
RNA viral como molde.
Aclimatizao: Processo de adaptao gradual de um organismo uma condio
ambiental diferente. Por exemplo, plantas proveniente de cultura de tecidos devem ser
aclimatizadas antes de serem transplantadas para casa de vegetao ou campo.
Acrpeto: Em direo ao pice; usado para descrever, por exemplo, a direo de
transporte ou desenvolvimento sucessivo de rgos.
Adaptao: Processo em que um organismo, populao ou espcie tornam-se ajustados
ao ambiente, podendo envolver mudanas morfolgicas, bioqumicas, fisiolgicas ou
comportamentais no indivduo, tornando-o capaz de sobreviver e reproduzir, em comparao
com outros membros da mesma espcie.
Adaxial: 1) Face superior ou ventral da folha. 2) rgo cuja localizao est mais
prxima do eixo sobre o qual se insere.
Adventcio: rgo vegetal formado em posio diferente daquela onde se origina no
curso normal de desenvolvimento. Por exemplo, raiz desenvolvida em um seguimento de caule
ou diferenciao de uma gema a partir da raiz.
Agmica: Refere-se a reproduo assexual, sem que ocorra a unio de gametas.
gar: Produto vegetal extrado de algas marinhas, usado para geleificar o meio de
cultivo.
Agente desinfestante: Substncia usada para eliminar ou inibir o crescimento
microorganismos em utenslios, equipamentos ou tecidos vegetais.
Agente seletivo: Substncia que permite a distino de organismos vivos com
determinadas caractersticas fisiolgicas. Por exemplo, antibiticos ou herbicidas adicionados ao
meio de cultivo permitem selecionar clulas com genes de resistncia a essas substncias.

141

Aglutinao: Reao produzida quando se mistura um antgeno com um anticorpo. Por


exemplo, se o antgeno for uma toxina, o anticorpo formado para neutralizar a toxina recebe o
nome de antitoxina.

Agrobacterium rhizogenes: Bactria de solo, tipo bacilo, aerbica, Gram-negativa. As


linhagens virulentas possuem, alm do DNA cromossmico, um plasmdeo denominado Ri.
Quando esses patgenos infectam a clula vegetal, uma poro desse plasmdeo (T-DNA)
transferida e integrada no genoma da planta, causando a doena denominada hairy root
(proliferao de razes). Essa bactria tem sido usada em transformao gentica de plantas.
Agrobacterium tumefaciens: Bactria de solo, tipo bacilo, aerbica, Gram-negativa.
As linhagens virulentas possuem, alm do DNA cromossmico, um plasmdeo denominado Ti.
Quando essa bactria infecta a clula vegetal, uma poro desse plasmdeo (T-DNA)
transferida e integrada no genoma da planta causando a doena denominada galha-de-coroa
(tumor). Essa bactria tem sido utilizada em transformao gentica de planta.
gua deionizada: gua purificada de baixa condutividade, cujos ctions e nions
foram removidos, atravs da sua passagem por uma resina de troca inica.
gua destilada: gua purificada pelo processo de destilao. A gua aquecida e seu
vapor condensado em uma coluna de destilao.
Agrotxicos: produtos e agentes de processos fsicos, qumicos ou biolgicos
destinados ao uso nos setores de produo, no armazenamento e beneficiamento de produtos
agrcolas, nas pastagens, na proteo de florestas nativas ou implantadas, e de outros
ecossistemas e tambm de ambientes urbanos, hdricos e industriais, cuja finalidade seja alterar
a composio da flora ou da fauna a fim de preserv-la da ao danosa de seres vivos
considerados nocivos. Tambm engloba produtos empregados como desfolhantes, dessecantes,
estimuladores e inibidores de crescimento.
Albino: organismo desprovido de pigmentao.
Albmen: Tecido que contm substncias nutritivas na semente; o mesmo que
endosperma.
Alelo: Forma alternativa de um gene, situado em um mesmo loco em cromossomos
homlogos, responsvel pelas diferentes manifestaes fenotpicas de um carter, apresentando
segregao monognica.
Aleurona: Reserva protica na forma de gros que ocorre em determinadas clulas de
sementes (camada de aleurona) de certos cereais como o trigo e a cevada. Os gros, que so
vacolos modificados, secretam enzimas hidrolticas para mobilizar reservas do endosperma.
Alginato: Polissacardeo encontrado em paredes celulares de algas marrons, utilizado
como estabilizador e agente texturante no encapsulamento de embries somticos (formando
as sementes sintticas).

142

Alogamia: Unio de um gameta masculino e um feminino produzidos em indivduos


distintos.
Ampicilina: antibitico pertencente ao grupo das penicilinas que inibe a biossntese de
mucoprotena da parede celular dos organismos susceptveis.
Anabolismo: Reaes biossintticas em organismos vivos levando formao de
clulas complexas a partir de componentes simples, utilizando a energia armazenada na clula.
Anfase: Fase da diviso celular aps a metfase que se inicia quando os centrmeros
tornam-se, funcionalmente, duplos. Com a separao dos centrmeros, as cromtides migram
em direo aos plos opostos da clula.
Andrognese: Partenognese masculina - desenvolvimento haplide de uma plntula
ou de suas partes a partir de gameta masculino. A andrognese ocorre a partir de gros de
plen, tanto na antera completa como em gros de plen isolados.
Aneuploidia: Perda ou ganho de cromossomos atravs de vrios processos que
resultam em complementos cromossmicos anormais na metfase.
Anterdeo: Gametngio masculino, em plantas vasculares inferiores, no qual os gametas
masculinos so formados.
Antese: Processo de abertura da flor.
Antibiose: Associao antagnica em que um organismo impede o crescimento e o
desenvolvimento de outro, pela liberao de substncias prejudiciais no meio.
Antibitico: Composto orgnico, geralmente produzido por microorganismos, que
mata ou inibe seletivamente o crescimento de outros microorganismos. Dentre os antibiticos,
tm-se as penicilinas, as cefalosporinas, os aminoglicosdeos e as tetraciclinas.
Antioxidantes: produtos qumicos que evitam a oxidao.
pice caulinar: Poro terminal (0.5 a 2 mm) de um broto composta pelo meristema
apical (0,01 - 0,3 mm) acompanhado de primrdios foliares e tecidos adjacentes da haste.
Apoximia: Reproduo assexual que resulta na formao de um embrio sem prvia
fertilizao, a partir de uma nica clula ou de um conjunto de clulas. Pode ser de duas formas:
apogamia e partenocarpia.
Apogamia: Desenvolvimento direto do esporfito a partir de qualquer clula no
reduzida do gametfito (saco embrionrio), mas no oosfera. Como ocorre sem a formao de
gametas, resulta na propagao assexuada do gentipo materno, em forma de semente.
Arquegnio: Gametngio feminino, em plantas vasculares inferiores, na qual os
gametas femininos so formados.

143

Assepsia: Na cultura in vitro, significa ausncia de microorganismo.


Autoclavagem: Fornecimento de calor sob presso com o objetivo da esterilizao.
Autotrficas: Plantas ou outros organismos capazes de sintetizar suas prprias
substncias orgnicas, a partir de componentes inorgnicos simples, mediante fotossntese ou
quimiossntese.
Auxinas: Classe de reguladores de crescimento vegetal, quimicamente ou
funcionalmente relacionados ao hormnio natural AIA (cido indolactico), que causam
alongamento celular, dominncia apical, enraizamento e outros fenmenos. As auxinas mais
usadas em cultura de tecidos vegetais so: ANA (cido naftalenoactico), 2,4 D (cido 2,4diclorofenoxiactico) e AIB (cido indolbutrico).
Auxotrficas: Clulas ou organismos cujo crescimento e desenvolvimento dependem
da presena, no meio de cultivo, de suplementos, porque no podem sintetizar certos
metablitos necessrios exigindo um requerimento especial de nutrientes exgenos.
Axnico ou Axeno: Cultivo completamente livre de uma associao com qualquer
microorganismo, seja vrus, bactria, micoplasma, fungo ou outro semelhante. s vezes,
usado como sinnimo de assptico.
Axilar: Gema axilar refere-se gema localizada na axila das folhas.
B

Bacillus thuringiensis(Bt): Bactria Gram-positiva, que infecta insetos, sendo usada


como inseticida biolgico. Essa bactria produz cristais proticos durante a esporulao. Esses,
quando ingeridos por insetos, formam produtos txicos, que permaeabilizam a membrana do
epitlio do intestino, levando a lise dessas clulas e, consequentemente, morte do inseto.
Plantas transgnicas expressando toxinas de Bt foram desenvolvidas e demonstraram
resistncia contra uma srie de pragas como heliothis virescens e outros lepidpteros.
Baculovrus: Vrus pertencente famlia Baculoviridae. Infectam artrpodes, sendo
utilizados como inseticidas biolgicos. Os baculovrus modificados tambm so usados como
vetores de expresso para a produo de protenas recombinantes em culturas de tecidos de
insetos.
Base Gentica: Variao gentica total presente em uma espcie.
Baspeto: Em direo a base, podendo se referir, por exemplo, a processos como o
desenvolvimento sucessivo de rgos ou transporte de auxina.
Biobalstica: Mtodo utilizado para a introduo de material gentico no genoma de
organismos, por projeo de partculas de ouro ou tungstnio, cobertas com DNA. um dos
mtodos mais utilizados para a obteno de plantas transgnicas, Principalmente aquelas
recalcitrantes transformao via Agrobacterium. Os microprojteis cobertos com DNA podem
144

ser acelerados por diferentes mtodos; no entanto, o mais empregado na obteno de plantas
transgnicas o gs hlio sob alta presso.
Biodegradvel: Material que degradado pela ao de microrganismos.
Biodiversidade: Diversidade biolgica. No sentido geral, o somatrio das formas de
vida que habitam o planeta. Nesta definio, incluem-se as diferentes espcies presentes em um
determinado ambiente, a diversidade gentica dentro de uma espcie e os distintos ecossistemas
presentes em um determinado ambiente.
Bioensaio: Teste de avaliao da resposta de um organismo a determinado tratamento.
Antigamente usado para quantificar, por exemplo, a concentrao em extratos vegetais. Em
transformao de plantas, engloba as diferentes tcnicas e experimentao in vitro ou em casa de
vegetao, para avaliao de plantas desafiadas por um patgeno especfico ou submetidas a
estresse bitico ou abitico.
Biotica: Conjunto de normas propostas em conseqncia de importantes avanos nas
cincias biolgicas, objetivando garantir a sobrevivncia humana e a qualidade de vida.
Bioluminescncia: Produo de luz por um organismo vivo (por exemplo vagalume),
resultante de uma reao qumica (catalisada por uma enzima), na qual um precursor inativo
convertido em um qumico emissor de luz.
Biorreator: Recipiente onde ocorre reao biolgica, em geral, fermentao ou
biotransformao. O mesmo termo tambm empregado para designar um sistema de
desenvolvimento de plantas in vitro onde ocorrem ciclos de imerses temporrias de explantes
em meio de cultivo lquido.
Biossegurana: Termo genrico que envolve estudos e normas para o controle e a
minimizao de riscos biolgicos advindos da prtica de diferentes tecnologias. Por exemplos,
laboratrios so classificados de acordo com o risco que oferecem para os seres humanos e o
ambiente.
Biossegurana/Lei: Lei n 8 974, sancionada em 5 de janeiro de 1995, que estabelece
os princpios que regulam a biossegurana, relativa a manipulao e liberao no ambiente de
organismos geneticamente modificados.
Biotecnologia: a utilizao de seres vivos - micro ou macroscpicos - ou de suas
partes, para a produo de bens ou servios. A Biotecnologia denominada Clssica ou
Convencional um conjunto de processos, mais ou menos controlados, que consiste na
utilizao de seres vivos naturais ou suas partes. Muitos destes processos j vem sendo
utilizados pela humanidade h milnios, para a produo, por exemplo, de pes, queijos,
bebidas fermentadas como vinhos e cervejas, ou ainda soros, vacinas e antibiticos, etc. A
Biotecnologia Moderna, como conhecida, utiliza metodologias avanadas de gentica,
biologia molecular e cultura de clulas e tecidos para a seleo, engenharia gentica e clonagem
de espcies e variedades biolgicas, assim como complexos processos fermentativos para fins
produtivos. Desta forma, a Biotecnologia est hoje associada a vrias reas, gerando inmeros
produtos, processos e servios.
145

Bitipo: 1) Grupo de organismos com o mesmo gentipo. 2) Caracterstica fisiolgica


ou anatmica de um organismo adaptado a um tipo especfico de ambiente, diferente da
caracterstica da mesma espcie adaptada a outro ambiente.
C
Caliclone: Plntulas (variantes clonais) derivadas de forma clonal a partir de um calo, ou
plantas derivadas do cultivo de um calo mutado.
Calo: Aglomerado de clulas no organizadas, irregularmente diferenciadas, que se
multiplicam desordenadamente e se desenvolvem a partir de tecidos vegetais, normalmente em
resposta a injrias qumicas ou fsicas.
Canamicina: Antibitico da classe dos amiloglicosdeos, produzidos por cepas de
Streptomycetimyces kanamycetius. uma substncia polibsica, termoestvel, hidrossolvel
constituda de dois aminoacares. Apresenta atividade antibacteriana contra muitas espcies
aerbicas Gram-positivas e Gram-negativas.
Carbenicilina dissdica: Penicilina semi-sinttica ativa contra ampla variedade de
bactria Gram-positivas e Gram-negativas.
Cefalosporina: Classe de antibiticos que tem ao bactericida ou bacteriosttica,
dependendo da suscetibilidade do microrganismo. mais eficiente em microrganismos em
diviso celular ativa que em clulas em repouso. Atua como inibidor da biossntese da parede
celular.
Catabolismo: Quebra de molculas complexas em um organismo vivo com liberao
de energia.
Clula diferenciada: Qualquer clula no-meristemtica.
Clula no diferenciada: Clula meristemtica.
Cbrido: Hbrido celular vivel, produto da hibridao somtica, com diferentes
misturas de genomas e com um nico genoma nuclear.
Ciclo celular: Perodo compreendido entre uma diviso celular e a diviso subseqente,
levando formao de duas prognies. Engloba uma interfase e uma mitose.
Citocinese: Fase da diviso celular em que ocorre o processo de clivagem e separao
do citoplasma. A citocinese tem incio na anfase da mitose e termina aps a telfase.
Citoplasma: Corresponde ao material celular contido entre a membrana plasmtica e o
ncleo, composto de citossol e organelas.

146

Citosina (C): Base nitrogenada, pertencente classe das pirimidinas, constituinte dos
cidos nuclicos (DNA e RNA).
Citossol: Parte do citoplasma desprovida de membranas e estruturas.
Citocininas: Classe de reguladores de crescimento vegetal, quimicamente ou
funcionalmente relacionados ao hormnio natural 'zeatina', que causam diviso celular,
diferenciao celular e de brotos, quebra de dominncia apical e outros fenmenos. As
citocininas mais usadas em cultura de tecidos vegetais so: KIN (cinetina), BAP
(benzilaminopurina) e 2iP (2-isopentenil-adenina).
Clonagem: Ato de se obter novas culturas atravs de subcultivos, ou de inserir um gene
especfico ou uma seqncia de DNA em uma molcula vetora.
Clone: Populao de plantas oriundas de um nico indivduo por propagao
vegetativa, ou populao de clulas oriundas por mitose de uma nica clula isolada, ou
populao de clulas ou organismos de gentipo idntico.
Cloranfenicol: Antibitico originalmente obtido de Streptomyces venezuelae, que inibe a
sntese protica em bactrias ao se ligar subunidade 50S do ribossomo em organismos
susceptveis. Tem ao contra organismos Gram-positivos e Gram-negativos.
Cloroplasto: Organela encontrada no citoplasma das clulas de plantas, possuindo duas
membranas e, no seu interior, corpsculos denominados grana. Os grana fazem parte de um
sistema de membranas, organizados em pares paralelos e ligados pelas extremidades, que
formam o tilacide. O processo fotossinttico inicia-se na estrutura lamelar do grana, onde a
clorofila capta a energia solar e segue com a produo de acares, como glicose, utilizando
para isso os compostos energticos provenientes da etapa luminosas.
Clorose: Despigmentao da planta pela perda da colorao verde devido falta de
exposio da planta luz, bem como por deficincia nutricionais, genticas ou doenas.
Co-cultura: Cultivo simultneo de dois organismos ou de um organismo e um explante,
em meio de cultivo. Por exemplo, uma das etapas do processo de transformao via
Agrobacterium envolve a co-cultura da Agrobacterium e do explante vegetal.
Co-dominncia: Expresso de ambos alelos em um indivduo heterozigoto, ou seja,
situao onde nenhum dos dois alelos de um locus dominante sobre o outro.
Colchicina: Alcalide que interfere na organizao das fibras do fuso, impedindo a sua
formao e a conseqente disjuno dos cromossomos-filhos. A aplicao dessa substncia em
clulas mitticas pode resultar em duplicao cromossmica.
Competncia: 1) Estado fisiolgico de bactrias que pode ser induzido artificialmente,
resultando em um aumento da capacidade das clulas de receberem DNA exgeno. 2) Em
culturas de tecidos vegetais, refere-se a capacidade das clulas de reagirem a sinais especficos
para dar origem a uma nova planta ou iniciarem um processo morfogentico.

147

Crescimento: Aumento da massa seca ou protoplasma de um organismo, associado ao


desenvolvimento. Em muitas situaes envolve diviso celular, expanso, diferenciao e
morfognese.
Criobiologia: Estuda o efeito de baixas temperaturas no organismo vivo e a sua
conservao.
Criopreservao: Conservao a baixas temperaturas, normalmente a temperatura no
Nitrognio lquido (-196 oC).
CTNBio ( Comisso Tcnica Nacional de Biossegurana): Comisso criada pelo
poder executivo em cumprimento Lei Nacional de Biossegurana n 8 974, publicada no
Dirio Oficial da Unio, em 5 de janeiro de 1995. Essa comisso foi instalada em junho de
1996, sendo responsvel pela elaborao das normas de biossegurana relacionadas com
organismos transgnicos. Dentre outras atribuies da CTNBio, esto a autorizao e
fiscalizao de laboratrios e experimentos de campo com OGMs.
Cultivar: Variedade cultivada de plantas, a qual se distingue por caractersticas
fenotpicas e que, quando multiplicada por via sexual ou assexual, mantm suas caractersticas
distintivas.
Cultura de clulas: Cultivo em meio nutritivo de clulas isoladas ou de pequenos
grupos de clulas similares, em condies asspticas e controladas de luminosidade e
temperatura.
Cultura de embries: Refere-se aos processos de crescimento e desenvolvimento de
embrio zigtico in vitro independentemente da idade, tamanho e estdio de desenvolvimento
em que o embrio foi excisado e colocado no meio de cultivo. Essa tcnica tem sido empregada
para recuperar hbridos raros de cruzamentos incompatveis, superar dormncia de sementes,
estudar aspectos nutricionais, e/ou fisiolgicos do desenvolvimento do embrio.
Cultura em suspenso: Cultura de clulas individuais, agregados ou tecidos em meio
lquido, freqentemente sob agitao para fornecer aerao adequada.
Cultura de tecido: Refere-se s tcnicas de cultura em meio nutritivo, em condies de
mxima assepsia possvel, de clulas, tecidos ou rgos de plantas, sob controle de
luminosidade e temperatura. Esse mtodo tem sido empregado na recuperao de plantas livres
de vrus e outros agentes causadores de doenas; na conservao e intercmbio de
germoplasmas in vitro; micropropagao rpida de gentipos elites; produo de haplides;
transformao gentica de plantas, dentre outras.
Cultura primria: Cultura obtida diretamente de partes de tecidos ou rgos da planta
matriz. Deve-se considerar como tal at o primeiro subcultivo, a partir do qual d lugar a uma
cultura secundria.
D

148

Dalton: Unidade de massa atmica correspondente a 1,66 x 10-27 quilogramas.


Decdua: plantas cujas folhas caem em determinada poca do ano.
Desdiferenciao: Processo no qual uma clula diferenciada perde suas caractersticas
especficas, reassumindo atividades meristemticas. Por exemplo, no processo de organognese
indireta a passagem para a fase de calo um processo de desdiferenciao, no qual as clulas
perdem sua identidade original e assumem caractersticas mais simples.
Desenvolvimento: Crescimento integrado de um organismo pluricelular ou parte dele,
associado a mudanas na forma e na complexidade, por padres sucessivos de diferenciao e
morfognese.
Desinfeco: Eliminao de microorganismos localizados internamente aos tecidos.
Desinfestao: Eliminao de microorganismos localizados em superfcie de utenslios,
equipamentos, ou tecido e rgo vegetais.
Diferenciao: Srie de modificaes que ocorrem em clulas meristemticas e
resultam em tecidos ou rgos inteiros de um organismo.
Diacinese: ltimo estado da prfase da primeira diviso meitica onde os
cromossomos atingem a condensao mxima e ocorre o rompimento da membrana nuclear.
Diplide: Clula ou planta com duas vezes o nmero bsico de cromossomos (2n).
Diico: 1) Espcie ou vegetal que produz flores de sexos distintos em indivduos
diferentes. 2) Refere-se tambm, a protalos que produzem gametas de um mesmo sexo.
Diversidade gentica: Variao hereditria devido constituio gentica dos
indivduos de uma populao, sendo responsvel por parte das suas diferenas fenotpicas.
Dormncia: condio em que o crescimento suspenso ou reduzido por controle
endgeno, mesmo quando as condies ambientais so favorveis. Ocorre em rgos de
reserva (bulbos e tubrculos), em gemas e em sementes, entre outros rgos vegetais. Uma
semente vivel considerada dormente quando no germina ao ser submetida a condies
favorveis para tal (temperatura, umidade, oxignio)
Dominncia apical: Supresso do crescimento das gemas laterais pela gema apical.
E
Eletroporao: Metodologia para transformao de clulas pela qual protoplastos e
DNA a ser introduzido so misturados e submetidos a uma corrente eltrica por um curto
perodo, fazendo com que sejam criados poros transitrios na membrana citoplasmtica, por
onde o DNA exgeno penetra na clula.

149

ELISA ( enzyme-linked immunosorbent assay): Teste para deteco imunolgica


que se baseia na ligao de anticorpos especficos a uma protena. No ELISA direto, o
anticorpo est conjugado a uma enzima e na presena de um substrato para esta, a protenaalvo identificada pela formao de um produto colorido. No ELISA indireto, o anticorpo
(primrio) que se liga diretamente protena no marcado. utilizado um outro anticorpo
marcado (secundrio), que reconhece o anticorpo primrio, para a deteco da protena.
Embrio: Estado precoce de desenvolvimento de uma planta, consistindo de
primrdios de raiz, broto e folhas.
Embriognese: Processo de iniciao e desenvolvimento de um embrio que pode ser
sexual (embrio zigtico, embriognese propriamente dita) ou assexual (embrio somtico,
embriognese somtica).
Embriide: Estrutura semelhante ao embrio, porm, originria de uma clula
somtica. Tambm chamado embrio somtico ou embrio adventcio.
Endosperma: Tecido de reserva das sementes de angiospermas, em geral, triplide,
originado da fuso dos dois ncleos polares do saco embrionrio com o segundo ncleo
generativo procedente do tubo polnico.
Epictilo: parte area de um embrio ou plntula situada acima do ponto de insero
dos cotildones.
Epiderme: Camada externa de clulas de origem primria que reveste o corpo da
planta.
Epigentico: Modificao fenotpica sem alterao no material gentico do organismo,
normalmente em resposta a fatores ambientais.
Epinastia: Curvatura descendente de folhas devido ao crescimento assimtrico do
pecolo.
Escutelo: Cotildone nico da semente de uma gramnea.
Espcie indicadora: Planta que reage a certas infeces virticas ou fatores ambientais
com produo de sintomas especficos. Utilizada na deteco e identificao desses fatores.
Esporos: 1) Estrutura reprodutiva assexual, consistindo de uma ou mais clulas, que
capaz de originar um novo organismo sem unio de gametas. 2) Forma dormente apresentada
por algumas bactrias para se protegerem contra calor, luz solar e perda de gua.
Estril: Isento de qualquer forma de vida.
Esterilizao: Processo de eliminao de qualquer forma de vida microbiana, efetuado
por autoclavagem, filtrao, radiao ionizante ou ainda por esterilizantes qumicos.

150

Estilolamento: Desenvolvimento de partes areas aclorofiladas por falta de iluminao


suficiente. Nessas plantas, os cloroplastos no se desenvolvem. Os entrens so alongados
tornando a planta alta com caule delgado.
Etileno(C2H4): Fitohormnio produzido pelas plantas, envolvido na senescncia e
absciso foliar e na maturao de frutos. um gs simples, insaturado de carbono.
Exciso: Remoo de parte da planta ou rgo, por meio de um corte.
Explante: Segmento de tecido ou rgo vegetal usado para iniciar uma cultura in vitro.
F
Fentipo: Conjunto de caractersticas morfolgicas, anatmicas e/ou bioqumicas
associadas determinada clula, planta ou outro organismo, resultante da interao gentipoambiente.
Fertilizao: processo da unio dos gametas masculino e feminino para formar o
zigoto.
Fitohormnio: Substncia orgnica produzida pela planta, de baixa massa molecular
que, em pequenas concentraes, promove, inibe ou modifica processos fisiolgicos,
geralmente em locais diferentes daqueles onde foi induzida.
Fitorregulador: Substncia sinttica, no produzida naturalmente que, quando aplicada
planta em quantidades diminutas, estimulam, inibem ou modificam o crescimento ou
desenvolvimento (efeito semelhantes aos dos fitohormnios).
Flambagem: Ato de esterilizar instrumentos, expondo-os chama.
Floema: Tecido condutor da seiva elaborada nas plantas vasculares, constitudo
basicamente de elementos crivados, clulas parenquimticas, fibras e esclerdeos.
Fton: Unidade indivvel eletromagntica com um quantum de energia, com
propriedade de onda e partcula. Um mol de ftons (um mol de quanta) equivalente ao
nmero de Avogadro de partculas (6,022 x 1023). 1 mol de ftons = 1 Einstein.
Fotossntese: Srie de processos nos quais parte da energia eletromagntica da radiao
solar convertida em energia de ligao qumica que poder ser utilizada para biossntese.
Fototropismo: movimento ou crescimento orientado em relao ao estmulo luminoso.
Friabilidade: Capacidade das clulas vegatais se separarem uma das outras, quando
cultivadas in vitro. Por exemplo, calos mantidos em meios com altas concentraes de auxinas,
em geral se tornam friveis.
Fluxo laminar: Fluxo sem turbulncia.
151

Fungo: Grupo de organismos aclorofilados que pertencem ao reino Fungi, em sua


maioria microscpicos, que se reproduzem, normalmente, por meio de esporos sexuais e
assexuais. Possuem miclio com um ncleo bem definido por uma membrana.
Fuso de protoplastos: Unio de clulas desprovidas de paredes celular resultando em
uma clula hbrida com material nuclear das diferentes clulas de origem.
G
Gene: Unidade do material de herana; seqncia ordenada de nucleotdeos que
compreende um segmento de DNA.
Germoplasma: Variabilidade total disponvel para uma espcie.
Gene Marcador: Gene que expressa caractersticas bem notrias, o que permite
estabelecer a sua presena no genoma e facilita a deteco de eventos de recombinao.
Giberelinas: Grupo de reguladores de crescimento de plantas que estimulam o
crescimento e a formao de brotos.
H
Haplide: Condio correspondente a um conjunto nico de cromossomos no
pareados em cada ncleo. caracterstica dos gametas.
Heterose: Fenmeno pelo qual organismos hbridos (heterozigotos) demonstram valor
adaptativo superior aos homozigotos correspondentes. Vigor hbrido que se manifesta no
hbrido F1 tornando-o superior aos seus progenitores, pela expresso gentica dos efeitos
benficos da hibridao.
Heterotrfico: Organismo incapaz de produzir hidratos de carbono a partir de gua e
dixido de carbono. Estes compostos devem ser fornecidos ao organismo para sua
sobrevivncia.
Heterozigotos: Indivduos com alelos diferentes em um ou mais locus em
cromossomos homlogos.
Hibridao: fuso de gametas geneticamente diferentes que resultam em indivduos
hbridos heterozigticos para um ou mais loci.
Hibridao de clulas somticas: Fuso in vitro de duas clulas animais, ou
protoplastos vegetais, derivados de clulas somticas, geneticamente diferentes, usualmente de
espcies diferentes. Tem uso potencial no melhoramento gentico de plantas como um
processo para introduo na variabilidade gentica.

152

Hbrido: 1) Qualquer macromolcula composta de duas ou mais pores de origens


diferentes. 2) Produto do cruzamento de dois ou mais progenitores geneticamente distintos;
heterozigoto.
Hbrido interespecfico: Hbridos produzidos entre espcies diferentes, como por
exemplo, hbridos entre espcies cultivadas e silvestres afins. Apresentam grau varivel de
fertilidade, desde a esterilidade at a completa fertilidade.
Hbrido simples: Hbrido resultante do cruzamento entre duas linhagens.
Hbrido duplo: Hbrido resultante do cruzamento entre dois hbridos simples.
Hidroflico: 1) Possui afinidade pela gua. 2) Caracterstica de substncias que
interagem com a gua.
Hidrofbico: 1) Falta de afinidade pela gua. 2) Caracterstica de substncias que
repelem a gua e que interagem entre si, gerando um ambiente ou fase no aquosa.
Hidrlise: quebra de uma molcula ou polmero pela gua.
Hiperhidratao: Manifestao fisiolgica de tecidos vegetais em funo de excesso de
absoo de gua durante o processo de cultivo in vitro (tambm chamada de vitrificao).
Hiperplasia: Aumento de volume dos tecidos vegetais por multiplicao anormal das
clulas.
Hipertrofia: Crescimento excessivo de um tecido ou rgo, ou parte de um organismo
pela expanso no tamanho das clulas, como resultado do aumento da atividade funcional.
Hipoctilo: Parte caulinar do embrio ou plntula localizada entre o ponto de insero
dos cotildones e o incio da radcula.
Homeostase: Manuteno das condies fisiolgicas internas de um organismo de
maneira relativamente estvel. No caso de distrbios, ocorre o restabelecimento do equilbrio
por auto-regulao. 2) manuteno do equilbrio entre o organismo e o ambiente.
Homozigotos: Indivduos que tem alelos idnticos nos cromossomos homlogos.
I
Incubao: 1) Manuteno de culturas de bactrias, tecidos ou rgos de plantas a
temperatura controlada favorvel ao crescimento, por um determinado perodo. 2) Perodo de
tempo entre a penetrao de um patgeno em um hospedeiro at o aparecimento dos primeiros
sintomas.
Indexao: Processo de deteco de patgenos em plantas ou culturas, visando
identificao de plantas sadias.
153

Inculo: Poro de uma cultura destinada ao incio de uma outra.


Inoculao: Introduo de bactria, fungo, parte da planta ou clulas animais em meio
nutritivo, para o estabelecimento da cultura.
Interfase: Perodo do ciclo celular, compreendido entre duas divises mitticas
sucessivas da clula eucaritica, subdividida nas fases G1, S e G2.

In vitro: Em vidro ou sob condies de laboratrio, em meio de cultivo, em


condies o mais asspticas possvel.

In vivo: Se referem a fenmenos que ocorrem nas clulas ou organismos vivos.


J
Juvenilidade: Fase de desenvolvimento durante a qual uma planta incapaz de
manifestar a reproduo sexual principalmente em plantas lenhosas. a fase inicial do
crescimento, aps a germinao da semente e antes da primeira fase reprodutiva sexuada.
L
Latncia: 1) Estado de inatividade entre um estmulo, como a infeco de uma planta
por um patgeno, e a resposta por ele provocada no hospedeiro, sem apresentao de
sintomas. 2) Semente que no germina durante o estado de repouso, ou seja, dormente, mas
capaz de se desenvolver sob certas condies.
Linhagem: 1) Em plantas, uma variedade cultivada que, mediante processo de
melhoramento, tornou-se uniforme para um grande nmero de caractersticas. 2) Em
transformao de plantas, diz-se que uma planta transgnica e a respectiva prognie constituem
uma linhagem. 3) Em bactrias e outros microrganismos, refere-se a uma populao de
indivduos geneticamente idnticos com algumas caractersticas que os diferem de outras
populaes da mesma espcie.
Linhagem endogmica: Linhagem produzida por endogamia continuada, sendo quase
homozigtica, ou seja, desenvolvida por sucessivas autofecundaes e acompanhada de seleo.
Liofilizao: Tcnica de desidratao que utiliza vcuo e baixas temperaturas. Usada
para a preservao de linhagens de microrganismos, entre outras aplicaes.
Lux: Unidade de medida da luz incidente que ilumina uma superfcie de 1 m2 situada a 1
m da fonte de irradiao.
M

154

Macronutriente: Elemento mineral exigido em quantidades relativamente grandes


(comparados aos micronutrientes) necessrio para o crescimento e desenvolvimento normal de
clulas, tecidos vegetais ou planta. So eles: carbono, oxignio, hidrognio, nitrognio, fsforo,
potssio, clcio, magnsio e enxofre.
Marcador gentico: Gene que pode ser facilmente identificado fenotipicamente,
permitindo selecionar clulas ou indivduos portadores ou no do respectivo gene. Os
marcadores genticos so utilizados para o mapeamento de outros genes.
Marcador molecular: Marcadores genticos (protenas ou seqncia de DNA) que so
detectados por mtodos bioqumicos. Permite identificar o polimorfismo diretamente do DNA
e associ-lo a genes de grande efeito (caracteres qualitativos).
Megsporo: Esporo haplide (n) que origina o gametfito feminino (saco
embrionrio).
Meio nutritivo: Combinaes de sais minerais (macro e micronutrientes), carboidratos,
vitaminas e reguladores de crescimento, quimicamente definido e utilizado para o crescimento
de clulas, tecidos ou rgos in vitro. Pode ser gelificado (adicionando-se gar ou outro agente
para gelificao) ou lquido.
Meiose: Diviso celular que ocorre em eucariotos, no qual clulas 2n originam clulas
haplides (n).
Melhoramento gentico de plantas: a cincia de modificar o padro gentico das
plantas para seu uso econmico.
Metabolismo: Conjunto de reaes bioqumicas integradas de um organismo vivo.
Meristema: Grupo de clulas vegetais no diferenciadas, que se dividem ativamente. Os
meristemas podem ser apicais (extremidades de brotos e razes), laterais (cmbio vascular0) e
intercalares (regio nodal e base das folhas jovens).
Meristemide: Uma clula com caractersticas que se assemelham quelas do embrio
ou meristema apical e capaz de manifestar sua totipotncia, originada por diferenciao de
clulas do calo.
Microenxertia: forma de propagao assexuada in vitro que consiste em excisar parte de
uma planta e introduzi-la em outra planta tambm estabelecida in vitro.
Micronutriente: Elemento mineral exigido em quantidades relativamente pequenas
(comparado aos macronutrientes) necessrio para o crescimento e desenvolvimento normal de
clulas e tecidos vegetais ou planta. So eles: ferro, mangans, zinco, cobre, molibdnio, cloro e
boro.
Micropropagao: Propagao in vitro, ou propagao por cultura de tecidos de
plantas.

155

Microrganismo: Organismo de dimenso microscpica, tais como fungo e bactrias.


Micrsporo: 1) Esporo haplide uninucleado que se desenvolve no gro de plen
(gametfito masculino). 2) Gro de plen uninucleados nas fanergamas.
Mitose: Processo de diviso celular no qual uma clula diplide (2n) d origem a outras
duas clulas diplides (2n) geneticamente iguais entre si e clula-me.
Minitubrculos: Pequenos tubrculos (5-15 mm) formados em cultura de brotos ou
em propgulos de espcies tuberosas.
Monica: Planta que contm flores masculinas e femininas no mesmo indivduo, em
inflorescncias distintas.
Morfognese: Associada a emergncia e forma de novos rgos e seus arranjos durante
o ciclo de vida que resulta nas caractersticas de tamanho, forma e estrutura de um organismo.
Morfologia: Cincia que estuda a forma e a estrutura de um organismo e suas relaes
de tamanho, proporo e simetria.
Mutao: Alterao na seqncia de nucleotdeos de um gene em um cromossomo que
pode levar perda de sua funo normal.
Mutagnese: Processo de mutao induzida por agentes qumicos ou fsicos. Em
cultura de tecidos vegetais, utilizada como forma de aumentar a variabilidade gentica que,
posteriormente, selecionada para gerar gentipos superiores.
N
Necrose: Morte de clulas ou tecidos, em totalidade ou em parte, resultante da ao de
agentes biticos ou abiticos.
Neoplasma: refere-se ao crescimento anormal de clulas que se multiplicam mais
rapidamente que as normais, formando um tumor.
Ncleo: Organela densa encontrada somente em clulas eucariticas, delimitada por
uma dupla membrana e que contm a cromatina. Nessa organela, ocorrem a replicao e a
transcrio do DNA, essenciais para as clulas.
O
OGM: Abreviao de organismo geneticamente modificado. O mesmo que transgnico.
Organognese: Processo de neo-formao de partes areas ou razes em cultura de
tecidos ou clulas; contrasta com embriognese.
Organognese direta: processo em que no ocorre passagem pela fase de calo.
156

Organognese indireta: Organognese que passa pela fase de calo.


Osmose: Passagem espontnea de um solvente de uma soluo mais diluda para outra
mais concentrada, atravs de uma membrana semipermevel, que permite somente a passagem
do solvente.
rgo: Grupo de tecidos organizados.
Oxidao: Escurecimento de tecidos cortados que resulta da reao de compostos
fenlicos, liberados ao meio, com o oxignio.
P
P/V: Peso/Volume - indica a concentrao de um composto slido em gua.
Exemplo: sacarose 3% (p/v), significa 30 g/1000 ml.
Partenocarpia: Desenvolvimento do fruto sem fertilizao e, consequentemente, sem
sementes.
Partenognese: Desenvolvimento do embrio a partir de vulos no fertilizados.
Patgeno: Organismo que pode causar uma doena.
Penicilina: Grupo de antibiticos bactericidas que atuam sobre bactrias em
crescimento, inibindo a sntese da parede celular durante o processo de diviso.
Periplasma: Espao entre a membrana plamtica e a parede celular ou entre a
membrana plamtica e a membrana externa (no caso de bactrias ou fungos).
Plntula: planta que se desenvolve aps a germinao da semente; planta recmgerminada.
Plasmlise: Contrao do protoplasma de um tecido ou clula em que a turgescncia
igual a zero, resultante da perda de gua da clula para o meio.
Pleiotropia: Situao na qual a expresso de um gene afeta mais de uma caracterstica
fenotpica.
Poliembrionia: Desenvolvimento de mais de um embrio em uma nica semente.
Poliplide: Mltiplo do nmero bsico de cromossomos maior que o normal (diplide,
triplide, tetraplide, stc).
Polignico: Carter controlado por mais de um gene que, individualmente exerce um
pequeno efeito no fentipo.

157

Polimorfismo gentico: Ocorrncia em uma populao de dois ou mais alelos onde o


alelo mais raro encontrado em uma freqncia que no pode ser mantida por mutao
recorrente. Na prtica um lco considerado polimrfico quando o alelo mais raro, apresenta
freqncia maior que 1 %.
Polinizao: 1) Em angiosperma, refere-se transferncia do plen de uma antera para
o estigma de uma flor. 2) Em gimnospermas, refere-se transferncia do cone masculino para
o feminino.
Polinizao cruzada: Transferncia do plen da antera de uma flor para o estigma
receptivo de outra, em plantas diferentes.
Polinizao in vitro: Tcnica utilizada para contornar possveis barreiras de
incompatibilidade pr-zigticas fertilizao, presentes no estigma, estilete ou ovrio. . Essa
tcnica consiste na deposio de plen, em condies asspticas, em vulos isolados ou com
placenta.
Potencial versus competncia: Em teoria, todas as clulas so totipotentes e tm o
potencial para regenerao, entretanto, na prtica, somente algumas so competentes para a
regenerao.
Presso de seleo: Intensidade com que a seleo natural ou artificial opera.
freqentemente medida pela alterao da freqncia de um gene por gerao.
Presso osmtica: Presso exercida por uma soluo, que funo da concentrao
total de ons e molculas em soluo. A expresso mais utilizada para se referir a esse parmetro
em clulas vegetais potencial osmtico, numericamente equivalente presso osmtica, mas
com sinal negativo.
Prognie: Gerao proveniente de um cruzamento em particular.
Progenitor: Aquele que gera; genitor, pai; ascendente.
Propagao clonal: Reproduo assexual de plantas, resultando em indivduos
geneticamente uniformes. Pode ser por micro ou macropropagao.
Propagao in vitro: Propagao de plantas em ambiente controlado, usando frascos
de cultura, tcnicas asspticas e um meio nutritivo adequado para o crescimento e
desenvolvimento do explante inoculado.
Propagao vegetativa: Ver propagao clonal.
Propgulo: Qualquer parte vegetativa de uma planta, destinada a propagao.
Protocormos: Pequenas estruturas que se diferenciam e do origem a embries. Como
exemplo, so as primeiras estruturas clorofiladas de aspecto globular que se formam em
semeadura de orqudeas.

158

Protoplasto: Clula desprovida da parede celular.


Q
Quelante: Substncia capaz de reagir com um on metlico e formar um composto
estvel.
Quiescncia: Parada temporria no desenvolvimento ou de outra atividade, devido a
condies ambientais desfavorveis.
Quimera: Planta ou animal que possui clulas com constituies genticas diferentes.
Plantas transgnicas quimricas so plantas que possuem algumas clulas trasformadas e outras
no transformadas.
R
Reao de hipersensibilidade: Resposta de defesa de plantas contra o ataque de um
patgeno, causado a morte das clulas vegetais no stio de infeco e impedindo que ocorra a
difuso do patgeno para outras partes da planta.
Recalcitrante: 1) Gentipo de difcil regenerao ou transformao in vitro. 2) Semente
intolerante dessecao, geralmente, com baixa longevidade. 3) Refere-se a materiais no
biodegradveis no solo.
Regenerao: Formao de novas partes a partir de tecidos derivados in vitro; em
particular, formao de plantas completas a partir de calos ou rgos em cultura.
Regenerao adventcia: Regenerao de um rgo vegetal em uma regio diferente
daquela onde originalmente formado. Por exemplo, desenvolvimento de parte area a partir
de discos foliares in vitro.
Rejuvenescimento: Reverso da fase adulta para a juvenil.
Repicagem: Subdiviso de uma cultura em vrios novos explantes, os quais so
transferidos para um novo meio.
Reproduo assexual: Reproduo que no envolve clulas germinativas ou fuso de
ncleos.
Reproduo sexual: Reproduo que envolve a formao e a fuso de dois tipos
diferentes de gametas, levando formao do zigoto.
Resgate de embries: Processo de recuperao in vitro de embries raros resultantes de
cruzamentos incompatveis. Em geral, realizado mediante cultura de embries.

159

Resistncia: 1)Propriedade da planta de reduzir ou impedir a multiplicao de um


organismo patognico ou vrus, ou apresentar sintomas atenuados quando expostos a uma
infeco. 2) Habilidade de suportar a exposio a um fator causador de danos em potencial,
sem que ocorram injrias.
Resistncia horizontal: Termo utilizado para designar o tipo de interao entre o
patgeno e a planta hospedeira, em que a resistncia efetiva contra todas as raas do
patgeno. tambm conhecida como quantitativa, polignica ou no-especfica.
Resistncia Vertical: Termo utilizado para designar o tipo de interao entre o
patgeno e a planta hospedeira, em que a resistncia alta para uma ou mais raas, porm
infectiva contra outras. tambm conhecida como qualitativa, monognica ou especfica.
Retrocruzamento: Cruzamento de um hbrido F1 com um dos progenitores.
Rifamicina: Antibitico que reprime a iniciao da sntese de RNA em clulas
bacterianas susceptveis, pela inibio do RNA polimerase DNA dependente. Em geral,
efetivo contra bactrias Gram-positivas e Gram-negativas.
Risco: Probabilidade de ocorrncia de um evento no intencional multiplicada pelas
conseqncias que podem surgir se ele ocorrer. praticamente impossvel a previso e
determinao do risco.
S
Saco embrionrio: Gametfito feminino de uma angiosperma, em geral composto de
sete clulas: uma oosfera, duas sinrgides, trs ou mais antpodas (cada uma dessas categorias
citadas apresentam um nico ncleo) e uma clula central (binucleada).
Segregao: Refere-se distribuio de genes na prognie, aps a meiose.
Soluo-tampo: ver tampo.
Soma: Conjunto de clulas somticas (2n) de um organismo.
Senescncia: Degradao celular culminando com a morte das clulas.
Somaclone: Propagao clonal de clulas somticas.
Somtico: Refere-se aos processos e estruturas que envolvem as clulas de um
organismo, exceto as reprodutivas.
Subcultura: Ato de transferir uma poro de cultura para um novo meio.
Suspenso celular: Cultura de clulas ou agregados celulares em meio lquido,
freqentemente sob agitao.

160

T
Tampo: Soluo salina que minimiza alteraes na concentrao do on hidrognio
(pH) quando se adiciona um cido ou uma base.
Tamponado: Soluo ou meio tratado com um composto qumico para resistir a
mudanas no pH.
Taxa de multiplicao: Relao entre um explante inicial e o nmero de novos
explantes produzidos num determinado perodo.
Tecido diferenciado: Qualquer tecido no meristemtico.
Tecido no diferenciado: Tecido meristemtico ( um tecido organizado, mas no
diferenciado).
Tecido no organizado: Calo (somente).
Tecido organizado: Qualquer outro tecido, exceto o calo.
Tempo de gerao: Perodo de tempo que um indivduo leva para completar o seu
ciclo de vida.
Termoterapia: Tratamento com temperaturas elevadas, objetivando principalmente a
desativao de vrus.
Tonoplasto: Membrana que delimita vacolos de clulas vegetais.
Totipotncia: Capacidade de clulas individuais expressarem o fentipo da planta
completa da qual foram derivadas.
Tropismo: Movimento ou crescimento que ocorre em resposta a um estmulo
unidirecional e que resulta na disposio de uma parte da planta em um sentido relacionado
direo do estmulo.
Tumor: Massa constituda pela proliferao anormal de clulas de um tecido em um
organismo multicelular.
V
V/V: Volume/Volume: indica a concentrao de um composto lquido.
Variao somaclonal: Variao transmitida sexualmente (hereditria); variao
observada em plantas obtidas por cultura in vitro de tecidos somticos.

161

Variedade: Termo utilizado para subclassificar grupos dentro de uma espcie vegetal.
Uma variedade constituda de um grupo de indivduos que se assemelham fenotipicamente
em relao a vrias caractersticas uniformes e estveis que a distinguem de outras variedades.
Vernalizao: processo utilizado para conferir competncia de florescimento a plantas,
pela exposio dos tecidos em crescimento ativo a baixas temperaturas (geralmente, 5 C), por
um determinado perodo de tempo.
Vitrificao: Manifestao fisiolgica devida ao excesso de absoro de gua em cultura
de tecidos, tornando os brotos vitrificados e quebradios ( o termo mais correto
hiperhidratao).
X
Xilema: Tecido condutor de gua e sais minerais em plantas vasculares, caracterizado
pela presena de elementos traqueais. Tambm pode ser considerado um tecido de
armazenamento e sustentao, especialmente no caso do xilema secundrio.
Z
Zeatina: Hormnio vegetal pertencente a classe das citocininas, de ocorrncia natural,
especialmente, em gros imaturos de milho.
Zigoto: Clulas diplides resultantes da fuso de gametas.

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