Teoría y Practica en Cinética Enzimatica

30-07-2015
Seminario-Taller
Principios Bsicos de la
Cintica Enzimtica para el
Diseo y Operacin de
Reactores
Dr. Roberto J. Vega Paulino
rvegap@unmsm.edu.pe
Tema 1
Catlisis y Biocatlisis
Enzimas como catalizadores
Actividad enzimtica
Propiedades y significado tecnolgico
CATLISIS
Sustancia que reduce la barrera
energtica de una reaccin
qumica,
aumentando
la
velocidad de conversin del
sustrato a producto.
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(Enzimas)
Catlisis fisiolgica
Qu es Biocatlisis?
Catlisis de proceso (artificial) bajo
condiciones de reaccin de un proceso
industrial
4
alta especificidad
alta actividad en condiciones moderadas

alto nmero de rotacin
biodegradabilidad
producto natural
complejidad molecular
alto costo de produccin

labilidad
5
Enzimas como Catalizadores. Relaciones

de Estructura funcionalidad
Enzimas son
Protenas
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Catalizadores de la vida
Catalizan las reacciones Bioqumicas
en condiciones suaves
ENZIMA
(protena)
Catalasa
H2O2
Ea= 76 KJ M-1
Ea= 30 KJ M-1
v
t: aos
t: segundos
H2
v * 108
O2

Primaria
sitio activa
Secundaria
Cuaternaria
Terciaria

Enzimas son Protenas Conjugadas
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Modelo de la llave - cerradura
(Emil Fischer 1894)
E: cerradura
S. llave
ES
P
E
Explica la especificidad de la Enzima
Falla al explicar la estabilizacin del estado de transicin
10

Modelo del ajuste inducido
(Koshland 1958)
11
1
2
CoE
Enzimas de acuerdo a sus

requerimientos de cofactor y
coenzima
E-CoE
CoE
ECoE
CoE
12
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S
Especificidad
ES
-
dE
kD E
dt
Actividad
(pequea porcin de la enzima)
Estabilidad
(Capacidad de la enzima de retener su actividad)
E*
13

Desnaturalizacin
Prdida reversible de la actividad biolgica por
desplegamiento de la estructura terciaria, donde no
ocurre cambios qumicos en la protena.
14

Inactivacin
Prdida irreversible de la actividad biolgica porque
existen cambios qumicos en la protena
15
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Proceso Global para la Inactivacin
Const. Equilibrio de desplegamiento
Const. velocidad inactivacin
Estabilidad termodinmica o conformacional

Estabilidad cintica o de largo plazo
16

Estabilidad y Actividad tienen Tendencias Opuestas
Estabilidad: Rigidez molecular
Actividad: Flexibilidad conformacional
17
Concepto y determinacin de la
actividad enzimtica
Definicin termodinmica
Definicin cintica
S
a v-
ds dp
dt dt
p
Disminucin del sustrato
Inactivacin enzimtica
Inhibicin enzimtica
Desplazamiento del equilibrio
t
18
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actividad enzimtica
ds
dp
a v t 0 -

dt t 0 dt t 0
p
t
Representa el mximo potencial cataltico en un
set dado de condiciones experimentales
19
actividad enzimtica
Definicin de una Unidad de Actividad
La Comisin de Enzimas de la Unin Internacional de
Bioqumica: UI.
Una UI se define como la cantidad de enzima que cataliza la
transformacin de un micromol de sustrato por min en
condiciones estandarizadas de T, pH y [S] ptimo.
El katal (kat): nmero de moles de sustrato convertido por segundo

20
Mtodos de Anlisis de la Actividad

Enzimtica
21
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Bioprocesos
- clulas viables
Celulares
- clulas inviables
Acelulares (enzimticos)
Libres
Soportados
Con CoE disociables

Sin CoE disociables
22
Fuente de Enzimas
plantas
Naturales
animales
microorganismos mesfilos
extremfilos
Modificados
mutantes
recombinantes
Ingenerados
Sintticos
mimos
(molcula orgnica para recrear el

sitio activo de una enzima)
23
Produccin de Enzimas
%
1960 1985 2000
Planta, Animal 70
25
< 20
Microbiana
75
> 80
30
24
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Produccin de Enzimas
medio de cultivo
Manipulaciones ambientales condiciones de operacin
modalidad de cultivo
Manipulaciones genticas
mutacin
recombinacin
mutagnesis dirigida
25
Clases de enzimas. Significado

Tecnolgico
oxidoreductasas
Procesos con E con CoE disociables
transferasas
ligasas
liasas
Procesos con E sin CoE disociables
Intracelulares
ATP
nitrilo hidratasa
aspartasa
fumarasa
hidrolasas
Isomerasas
Intracelulares
26
Aplicaciones de Enzimas. Catalizadores de

Procesos
Aplicacin industrial
80 %
Aditivos
Analticas
Otras aplicaciones
Mdicas
Investigacin
20 %
27
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Procesos
S + H2O
P1 + P2
Hidrolasas extracelulares
Sin CoE disociables
Biocatalizadores solubes
Medio de reaccin acuoso
Reacciones irreversibles
28

Procesos
29

Procesos
Novozymes
Fuente: Biocatalysts and Enzyme Technology. Buchholz et al. (2012)

30
10
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Procesos
Ao
Rubro
Detergentes
Textiles
Alimentos
Otros
1992
42
15
37
1995
35
13
34
18
2000
32
30
33
2010
29
27
40
31

Procesos
Fuente: Basic Biotechnology. Ratledge y Kristiansen (2006)
32

Procesos
Empresas lderes en la comercializacin de
Enzimas industriales
Novozymes:
http://www.novozymes.com/en/Pages/default.aspx
Amano Enzyme: https://www.amano-enzyme.co.jp/
Biocatalysts: http://www.biocatalysts.com/
DSM:
http://www.dsm.com/markets/foodandbeverages/en_US/produ
cts/enzymes.html
33
11
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Enzimas usadas tradicionalmente como

catalizadores industriales
34

Enzyme
Source
Applications
35

Enzyme
Source
Applications
36
12
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Biocatlisis en Reacciones de Sntesis

Reacciones degradativas
(escaso valor agregado)
Enzimas en solucin en reacciones hidrolticas
Enzimas inmovilizadas en reacciones de hidrlisis e
isomerizacin
Reacciones de sntesis
(elevado valor agregado)
Enzimas con requerimientos de CoE
Enzimas sin requerimientos de CoE
( hidrolasas en medios no convencionales)
37
38
39
13
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40
Proyeccin del Uso Industrial de

Enzimas
Industria Alimentaria
Biocombustibles
41
Alimentacin animal
Fitasas, -glucanasas
Alimentos funcionales y nutracuticos
Lipasas, proteasas, glicosidasas
42
14
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Enzimas
43

Enzimas
44

Enzimas
45
15
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Enzimas
Enzima clave
Prebiticos
(Fructooligosacridos)
Fructosiltransferasa
46
Prebiticos Oligosacridos
47
Estructura de los Fructooligosacridos
48
16
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Flujo de Proceso de la Produccin de

Neosugar
Al-Na
Micelio
Sol. CaCl2
Sacarosa
Agua
(1)
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(2)
(3)
Reactor de lecho empacado

Columna de carbon activo
Columna de Intercambio inico
Columna de carbn vegetal
Concentrador
(5)
(4)
Neosugar G
(5)
Neosugar
49
50
Mecanismo de Transfructosilacin
FOS-4
sacarosa
sacarosa
glucosa
FOS-3
FOS-3
E-Fru
fructosa
51
Vega 2014. Biochemical Engineering Journal 82: 158-165
17
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Screening de fructosiltransferasas para

producir FOS
Vega R. 2012. J. Molecular Catalysis B: Enzymatic 76:44-51
52
Picos Cromatogrficos de FOS
1) FOS-5
2) FOS-4
3) FOS-3
4) Sacarosa
5) Glucosa
6) Fructosa
Vega R. 2012. J. Molecular Catalysis B: Enzymatic 76:44-51
53
Produccin de Biodiesel
Transesterificacin de un triglicrido y esterificacin de un
cido graso libre para producir steres metlicos de cidos
grsos , glicerol y agua.
54
18
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55
56
57
19
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58
59
Tema 2
Cintica enzimtica en sistema homogneo
Hiptesis de la cintica enzimtica
Determinacin de los parmetros cinticos
60
20
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Cintica Enzimtica
Es el estudio de la velocidad de las reacciones enzimticas, variando
las condiciones qumicas y fsicas. Las ecuaciones de velocidad son
importantes en el diseo de un bioreactor enzimtico.
S, P
d [ S ] d [ P]
dt
dt
Time
61
Mecanismo de la reaccin enzima-sustrato
SE
k 1
k 1
ES
k 2
ES
EP
Hiptesis del equilibrio rpido

(Michaelis-Menten)
v k2 [ ES ]
[ E ]t [ E ] [ ES ]
K
k1 [ E ][ S ]
k1
[ ES ]
/[E]t
v
[ ES ]
[ ES ] [ E ]
k2
k2
[ E ]t
[ E ] [ ES ]
1 [ ES ] [ E ]
[ ES ] [ S ]
[E]
K
63
21
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Hiptesis del equilibrio rpido

(Michaelis-Menten)
V [S ]
v max
K [S ]
Vmax
Vmax
donde:
[S]
Vmax k2 [ E ]
K
k1
k1
64
Hiptesis del Estado Estacionario

(Briggs-Haldane)
vP k2 [ ES ]
vs k1[ S ][ E ] k1[ ES ]
vES k1[ E ][ S ] k1[ ES ] k2 [ ES ] 0
[ E ]0 [ E ] [ ES ]
65
Hiptesis del Estado Estacionario

(Briggs-Haldane)
1)
2)
3)
vP
[ ES ]
[ ES ] [ E ]
k2
k2
[ E ]t
[ E ] [ ES ]
1 [ ES ] [ E ]
k1[ E ][ S ] (k2 k1 )[ ES ]
Vmax k2 [ E ]
[ ES ] [ S ]
[E] KM
KM
Vmax [ S ]
K M [S ]
donde:
Vmax
KM
k2 k1
k1
Eficiencia
cataltica
66
22
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Unidades de Vmax
Si v est en mol/L. min, entonces [E]t= mol/L, k+2= min-1 . Se
tiene que conocer el peso molecular de la enzima, la actividad
especfica y nmero de sitios activos.
Si v est en mol/L.min, entonces [E]t = UI/L, k+2 es 1
UI: Unidades internacionales mol/min.
67
1) Lineweaver-Burk
68

2) Headdie-Hofstee
Vmax
KM
v/S
3) Hanes
S/v
1/V
K/V
S
69
23
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Integracin de la Ecuacin de Michaelis-Menten
dP
d[S ]
V [S ]
dt
dt
K [S ]
K [S ]
d [ S ] Vdt
[S ]
[ Si ]
0
[S ]
[S]
[P]
[Si]
----
1 [ Si ] V 1 [ Si ] [ S ]
ln(
)
t [S ]
K K
t
-------------
too
[ P ]
1
V 1 [ P]
ln(
)
t [ P ] [ P] K K t
[Poo]
70
Problema 1
-galactosidasa cataliza la hidrlisis de la lactosa en glucosa y galactosa y es
ampliamente utilizada en la industria lctea. Una preparacin de galactosidasa comercial de Kluyveromyces marxianus var lactis est siendo
utilizada en la produccin de leche de baja lactosa. Es conocido que 500 UI de
-galactosidasa por litro de leche se requiere para reducir el contenido de
lactosa en la leche en un 80% durante almacenamiento (considerado
satisfactorio) y usted debe calcular el requerimiento de enzima dosada (mL de
preparacin enzimtica para ser adicionada por L de leche).
Para hacer esto, la actividad de la -galactosidasa de la preparacin enzimtica
se debe determinar. El ensayo enzimtico se basa en determinar la glucosa en
un sistema de HPLC con un detector de ndice de refraccin. El procedimiento
analtico consiste en adicionar 0.3 mL de la preparacin enzimtica, diluida
tres veces, a 1.2 mL de 150 g/L de solucin de lactosa e incubando la mezcla a
35 C y pH 6.4. Las muestras se toman en diferentes tiempos de reaccin y
sujetas a inactivacin enzimtica por calentamiento en agua hirviendo y luego
filtrando antes del ensayo de HPLC. Los siguientes resultados se obtuvieron:
71
T (min)
G (mM) 0
12
18
26
36
48
150
307
461
597
912
942
976
999
1015
Solucin:
1000
900
1000
800
Glucosa (mM)
Glucosa (mM)
1200
800
600
400
700
600
500
y = 75.811x
R = 0.9997
400
300
200
200
100
10
20
30
40
Tiempo (min)
50
60
10
12
14
Tiempo (min)
72
24
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73
Problema 2
Un extracto crudo de glucosa isomerasa se ha obtenido despus de la cultivacin
de Streptomyces flavogriseus y la disrupcin celular en un homogenizador. La
enzima cataliza la isomerizacin reversible de glucosa en fructosa. Una muestra
de 1 mL de este extracto, diluido como se indica en la siguiente tabla, se puso en
contacto con 4 mL de 0. 1 M de glucosa (C6H12O6) solucin. La concentracin de
glucosa se monitore durante la reaccin y los siguientes resultados se
obtuvieron:
Tiempo de
Reaccin (min)
Concentracin de glucosa (g/L)

Dilucin 1:50
Dilucin 1:100
14.40
14.40
13.91
14.15
13.58
13.91
13.27
13.64
13.04
13.46
10
13.03
13.34
74
Calcule la actividad de la glucosa isomerasa en el extracto crudo, expresndola en

UI/mL.
Solucin:
Dilucin 1:100
14.6
14.4
14.6
Glucosa (g/L)
14
13.8
13.6
13.4
14.4
y = -0.1254x + 14.4
R = 0.9994
14.2
14
13.8
13.2
13.6
13
12.8
0
10
Tiempo (min)
12
Tiempo (min)
14.6
Dilucin 1:50
14.4
14.2
Glucosa (g/L)
Glucosa (g/L)
14.2
14
13.8
13.6
y = -0.1971x + 14.4
R = 0.9815
13.4
13.2
13
0
Tiempo (min)
75
25
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76
Problema 3
Derive una expresin de velocidad para la formacin de P del
siguiente mecanismo enzimtico reversible:
k+1
k-1
ES
k+2
k-2
y cul sera el diseo experimental para determinar los parmetros

cinticos?
77
78
26
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79
Problema 4: Cintica enzimtica de multi-sitio

Suponga que una enzima tiene dos sitios activos de modo que el
sustrato se convierte a producto va la secuencia de reacciones:
ESS
k+1
ES
ES
k-1
k+3
ES
+P
ES
k+2
ESS
k-2
k+4
Derive una expresin de velocidad para la formacin de P, asumiendo

el estado quasi-estacionario para ES y ESS
80
81
27
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82
83
84
28
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Problema 5:
Empleando mtodos numricos, muestre cmo las concentraciones
de sustrato, producto y complejo enzima-sustrato cambian con
respecto al tiempo en un reactor por lotes para el simple mecanismo
de Michaelis-Menten.
S [0]= 0.1 mol/L
E [0]= 0.01 mol/L
Los valores de las constante de reaccin son k+1=40 L.mol-1.s-1, k-1=5 s-1
y k+2=0.5 s-1
85
Problema 6:
De una serie de experimentos por lote con una concentracin de
enzima constante, los siguientes datos de velocidad inicial se
obtuvieron en funcin de las concentraciones de sustrato inicial.
[S], mmol/L
Vel. Rx,
mmol/L.min
1
2
3
5
7
10
0.2
0.22
0.30
0.45
0.41
0.5
Determine los parmetros cinticos, por los cuatro mtodos estudiados. Discuta los
resultados
86
Problema 6:
-L-fucosidasa cataliza la hidrlisis de -L-fucosidos en L-fucosa y un
alcohol. La actividad enzimtica se determin por medio de las
velocidades iniciales de la hidrlisis del sustrato sinttico p-nitrofenil
-l-fucopiranosido. Los siguientes resultados se han obtenidos con una
preparacin purificada de -L-fucosidasa del molusco marino Pecten
maximus a pH 4.5 y 50 C.
S
51.52 64.15 69.86 73.12 75.22 79.81 81.47 82.34
10
15
20
S: concentracin inicial de p-nitrofenil -l-fucopiranosido (mM)

V: velocidad de reaccin inicial ( mol p-nitrofenol.min-1.mg-1)
87
29
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88
Una situacin diferente se da lugar si ms error experimental est involucrado.

Asuma que para este propsito los siguientes datos obtenidos con -L-fucosidasa
de hgado de abalone. En la cual las cinticas enzimticas se determinan midiendo
las velocidades iniciales de hidrlisis del sustrato sinttico 2-cloro-4-nitrofenil- -Lfucopiranosido en -L-fucsido y 2-cloro-4-nitrofenol, siendo cinticamente
cuantificado mediante la medicin de la absorbancia a 405 nm.
0.5
1.5
2.2
4.8
5.73
7.19
9.68
12.04 13.66
16
20
14
S: concentracin inicial de 2-cloro-4-nitrofenil--L-fucopiranosido (mM)

v: velocidad de reaccin inicial ( moles 2-cloro-4-nitrofenol.min-1.mg-1 )
89
90
30
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91
Problema 7:
Dibuje el perfil de la concentracin de sacarosa sobre el tiempo cuando la
invertasa se adiciona en un nivel de 1 g/L a 50 mM de solucin de sacarosa.
Los parmetros cinticos de la enzima en condiciones de reaccin son:
KM=10 mM y Vmax= 1000 moles.min-1.g-1enzima .
92
93
31
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Tema 3
Cintica de Inhibicin Enzimtica
Tipos de inhibicin de enzimas
94
MECANISMOS DE INHIBICIN:
95
Mecanismos de Inhibicin
1) Inhibicin Competitiva
E + S
+
I
k+3
EI
k+1
k-1
ES
k+2
E + P
V [S ]
K ap [ S ]
K ap K (1
k-3
Ki
k3
k3
[I ]
)
Ki
IC
96
32
30-07-2015
2) Inhibicin No Competitiva
E + S
+
I
k+3
k-3
EI + S
k+1
k+2
ES
+
I
k-1
k+3
k+1
ESI
E + P
k-3
k+4
EI + P
Vap
k-1
Vap [ S ]
K [S ]
V
[I ]
1
Ki
V '[ I ]
Ki
Vap
[I ]
1
Ki
V
INCT
INCP
V ' k4 [ E ]T
97
3) Inhibicin Tipo Mixta
E + S
+
I
k+3
k-3
EI + S
Vap
k+1
k-1
k+2
ES
+
I
E + P
Vap
k+3
k+1
ESI
k-3
k+4
EI + P
k-1
V V ' [ I ] K i'
1 [ I ] Ki
K ap
[I ]
1 [ I ] Ki'
1 '
Ki
Vap [ S ]
K ap [ S ]
V
[I ]
K i'
IMT
1 [ I ] Ki
1 [ I ] K i'
K ap
IMP
98
4) Inhibicin Acompetitiva
E + S
k+1
k-1
k+2
ES
+
I
ESI
V V ' [ I ] K i'
[I ]
1 '
Ki
E + P
Vap
k+3
Vap
k-3
k+4
K ap
EI + P
K
[I ]
1 '
Ki
Vap [ S ]
K ap [ S ]
V
[I ]
K i'
K ap
IACT
K
[I ]
1 '
Ki
IACP
99
33
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DETERMINACIN DE LOS PARMETROS CINTICOS
100
101
# parmetros
2
3
3
4
4
5
Total
Acompetitiva Parcial
102
34
30-07-2015
Grficos Lineales Secundarios

K ap K
1
1
1

[I ]
Vap V VK i
K
[I ]
Ki
INCT
IC
[I]
-Ki
[I]
-Ki
103
V '[ I ]
Ki
Vap
[I ]
1
Ki
V
Lim[ I ]Vap
V V'
[ I ] Ki
V '
1
1
[ I ] Ki
104

IMT
ap
K ap
Vap
K
[I ]
(1 )
V
Ki
ap
ap
1/Vap
1/V
1
1 [I ]

Vap V VKi'
[I ]
Ki
[I]
[I]
105
35
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1
1 [I ]

K ap K KK i
IACT
Ki
[I]
106
Inhibicin Acompetitiva Total por altas

concentraciones de sustrato
Vap [ S ]
K ap [ S ]
K [S ]
V
Vap
1 S K i'
K ap
K
1 S K i'
[S]
-----
-----
-----
------
-----
------
-----
------
V [S ]
[ S ]2
K i'
107
Inhibicin Acompetitiva Total por altas

concentraciones de sustrato
1 K 1 1 [S ]

v V [ S ] V K i'V
S << K
Si
Si S>> K
1 1 [S ]

v V K i'V
1 K 1 1
v V [S ] V
1/v
1/v
1/V
1/V
1/[S]
[S]
108
36
30-07-2015
Problema 1
La enzima -D-galactosidasa cataliza la siguiente reaccin de hidrlisis:
Rafinosa ----> galactosa + sacarosa + fructosa

Se ha determinado que la enzima es inhibida por los productos de la reaccin
siendo uno de ellos un inhibidor competitivo y los dos restantes inhibidores no
competitivos. Los siguientes valores experimentales se obtuvieron en presencia y
ausencia de estos productos
v 10-1 ( mol/ L min)
G (mM)
S (mM)
F (mM)
R (mM)
0.10
0.25
0.50
0.75
1.25
1.75
3.50
7.00
10.0
12.5
15.0
32.5
0
0
0
10
0
0
50
0
0
100
0
0
0
1
0
0
10
0
0
30
0
0
0
1
0
0
10
0
0
100
0.98
2.14
3.10
4.00
4.50
5.40
6.20
6.40
6.60
6.70
6.70
6.80
0.45
1.03
1.70
2.40
3.30
3.80
5.04
5.90
6.30
6.40
6.50
-
0.13
0.33
0.60
0.87
1.40
1.80
3.00
4.20
5.30
6.20
0.17
0.33
0.51
0.78
1.10
1.80
5.50
0.90
1.80
2.60
3.30
4.20
4.50
5.40
5.90
6.0
-
0.8
1.23
1.47
1.80
2.10
2.40
2.50
2.60
-
0,54
0,66
0,78
0,90
1,10
1,10
-
0.90
2.00
3.10
3.80
4.70
5.10
5.90
6.20
6.50
6.60
-
1.60
2.20
2.80
3.50
4.10
4.50
5.10
5.20
-
0.80
0.99
1.20
1.50
1.70
1.80
Determine
el tipo
de
inhibicin que ejerce cada
uno de los productos y las
constantes
cinticas
respectivas.
109
Problema 2
Los siguientes resultados se obtuvieron con una glucosa 6 fosfatasa (EC 3.1.3.9)
purificada de un extracto de hgado de rata. La enzima cataliza la hidrlisis de
glucosa 6 fosfato (G6P) a glucosa (G) y fosfato inorgnico (Pi).
Determine el tipo de inhibicin ejercida por glucosa. Proponga una expresin de

velocidad plausible para la hidrlisis de G6P con glucosa 6 fosfatasa.
Pgina 48
110
Problema 3
La enzima tanasa cataliza la reaccin :
Digalato -----> Galato + c. Glico

Lo que es de importancia en la industria alimentaria en la remocin de ciertos
sabores amargos. Los siguientes valores se han obtenido experimentando con un
preparado de tanasa de Aspergillus sp actuando sobre digalato de sodio.
S mM
0.1
0.2
0.4
0.8
10
50
100
150
200
V
mM/h
0.2
0.38
0.74
1.37
1.65
2.78
2.77
1.65
1.17
0.91
Determine la expresin cintica correspondiente y los parmetros cinticos
111
37
30-07-2015
Problema 4
Fenilalanina amonio liasa (EC 4.3.1.5) de Rhodotorula glutinis cataliza la
conversin de fenilalanina (X) en cido trans-cinmico (Y) y amonio (Z), donde Y
es un inhibidor competitivo y Z un inhibidor acompetitivo parcial. Desarrolle una
expresin cintica paramtrica y evalu los parmetros cinticos aparentes en
trminos de las correspondientes constantes de Michaelis e inhibicin.
112
113
114
38
30-07-2015
Problema 5
La enzima lactasa hidroliza lactosa a galactosa y glucosa. Este ltimo se comporta
como inhibidor.
a) Determine la expresin cintica
b) A partir de la tabla anexa, calcular las constantes cinticas.
V (mmol/mL.min)
Lactosa
(mM)
G= 0mM
G= 5mM
10
9.09
7.9
50
33.3
30
100
50
46.2
250
71.4
68.3
G= 10mM
G= 100mM
G= 1000mM
2.3
0.31
27.5
10.8
1.56
43.2
19.5
3.08
65.7
38
7.39
115
Tema 4
Cintica de Reaccin con dos Sustratos
Mecanismos y Modelos
116
117
39
30-07-2015
118
MSO
MSA
MO, ping-
pong
119
Mecanismo Secuencial Ordenado
KA
KB
120
40
30-07-2015

Hiptesis del Equilibrio Rpido
E + A
EA
EAB
EA + B
EAB
KA
[ E ][ A] [ EA] [ A]
[ EA]
[E] K A
K B'
[ EA][ B] [ EAB] [ EA] [ B]
[ EAB]
[E]
[ E ] K B'
v k[ EAB]
E+Y+Z
[ EAB]
v
[E]
k
[ EA] [ EAB]
[ E ]t
1
[E]
[E]
V [ A][ B]
K A K B' K B' [ A] [ A][ B]
(1)
121

v
VAP [ A]
K AP [ A]
VAP f (b)
'
VAP
[ B]
'
K AP [ B]
'
VAP
f (a)
K AP f (b)
'
K AP
f (a)
V [ B]
[ A]
K B' [ B ]
v
'
K AKB
[ A]
K B' [ B ]
V [ B]
K A K B' K B' [ A]
[ B]
[ A]
122
Mecanismo Secuencial Aleatorio

KA
KB
KB
KA
123
41
30-07-2015

Hiptesis del Equilibrio Rpido
[ E ][ A] [ EA] [ A]
[ EA]
[E] K A
E + A
EA
KA
E + B
EB
EA + B
EAB
[ E ][ B] [ EB] [ B]
[ EB]
[E] KB
[ EA][ B] [ EAB] [ EA] [ B]
(2)
K B'
[ EAB]
[E]
[ E ] K B'
EB + A
EAB
EAB
KB
K A'
E+Y+Z
[ EB][ A] [ EAB] [ EB] [ A]

(3)
[ EAB]
[E]
[ E ] K A'
v k[ EAB]
K B K A' K A K B'
124

[ EAB]
V [ A][ B]
v
[E]
v
k
[ EA] [ EB] [ EAB]
K A K B' K B' [ A] K A' [ B] [ A][ B]
[ E ]t
1
[E]
[E]
[E]
V [ B]
[ A]
K B' [ B ]
v
K A K B' K A' [ B ]
[ A]
K B' [ B]
V [ A]
[ B]
K A' [ A]
v
'
'
K A K B K B [ A]
[ B]
K A' [ A]
125
126
42
30-07-2015
Determinacin de los Parmetros

Cinticos
A + B
Y + Z
127

GRFICOS PRIMARIOS
128

GRFICOS PRIMARIOS
129
43
30-07-2015

GRFICOS SECUNDARIOS
130

GRFICOS SECUNDARIOS
131
Mecanismo Ping-Pong Bi Bi
Ecuacin de Velocidad en la ausencia de productos Y y Z
V [ A][ B]
K B [ A] K A [ B] [ A][ B]
132
44
30-07-2015
v
V [ B]
[ A]
K B [ B]
K A[ B]
[ A]
K B [ B]
Mecanismo
Ping-Pong
VAP
V [ B]
K B [ B]
V [ A]
[ B]
K A [ A]
K B [ A]
[ B]
K A [ A]
KAP
VAP
KAP
K A[ B]
K B [ B]
V [ A]
K A [ A]
K B [ A]
K A [ A]
133
GRFICOS PRIMARIOS
1/v
1/v
[B]
1/VAP
-1/KAP
[A]
1/VAP
1/[A]
-1/KAP
1/[B]
134
GRFICOS SECUNDARIOS
1/VAP
1/KAP
1/V
-1/KB
1/KA
1/[B]
-1/KB
1/[B]
135
45
30-07-2015
Problemas Resueltos
Problema1: Se ha reportado recientemente la sntesis del antibitico lactmico cefaclor con penicilina acilasa de Bacillus megaterium a partir de cido
7-aminodesacetoximetil 3-clorocefalospornico (7ACCA) y D-fenilglicina metil
ster (FGME) (Zhang et al. Biocatal. Biotransform. 25(1): 59-64, 2007). Con dicha
enzima se ha obtenido los siguientes resultados para la velocidad inicial de
sntesis de cefaclor (v) a distintas concentraciones (mM) de 7ACCA y FGME:
v (mol/min.gcat)
[FGME]
[7ACCA]
2
10
5.56
10.81
15.79
20.51
25.00
8.51
16.33
23.53
30.19
36.36
10.35
19.67
28.13
35.82
42.86
11.59
21.92
31.17
39.51
47.06
10
12.50
23.53
33.33
42.11
50.00
Se pide determinar el mecanismo de reaccin y evaluar todos los parmetros

cinticos de la reaccin
136
Problemas Resueltos
Problema2: La enzima nuclesido difosfato-quinasa cataliza la
siguiente reaccin:
GTP + dGDP
GDP + dGTP
En un experimento con la enzima aislada desde eritrocitos se obtuvieron los

siguientes resultados:
22
Concentracin
dGDP (mol/L)
20
25
40
100
0,095
0,102
0,112
0,125
Concentracin GTP (mol/L)

30
50
200
Velocidad (UI/ml)
0,112
0,141
0,120
0,155
0,136
0,180
0,156
0,218
0,196
0,223
0,284
0,385
Indique cul es el probable mecanismo de reaccin enzimtica y determine los

parmetros cinticos
137
Problemas Resueltos
Problema 3: Los siguientes resultados de velocidad inicial (moles/min g) de sntesis
de Z-aspartame (Z-AM) se han obtenido con un preparado enzimtico comercial:
FAME
(mM)
ZA (mM)
5
10
20
40
2.5
0.55
1.09
2.13
4.08
0.98
1.92
3.70
6.90
10
1.61
3.13
5.88
10.53
20
2.38
4.55
8.33
14.29
La enzima termolisina cataliza la sntesis de Z-AM mediante la unin peptdica de

Z-Aspartato (ZA) y fenilalanina metil ster (FAME)
- Determinar el mecanismo de reaccin enzimtica
- Determinar el valor de los parmetros del modelo cintico que representan
138
dicho mecanismo
46
30-07-2015
Problemas Resueltos
Revisar el Mecanismo de sntesis de
Fructooligosacridos a partir de sacarosa
Biochemical Engineering Journal (2014) 82: 158-165
139
Tema 5
Efecto del pH y la Temperatura sobre la
Actividad Enzimtica
140
Efecto del pH en la Cintica Enzimtica

S
En-1
k-a
+
H+
k-b
+ En
En-1S
k-a
ka
k-1
H+ + EnS
k b
kb
Ka
k a
ka
K b'
k' b
kb'
K a'
k' a
ka'
kb
ka
k1
En+1 + H+
Kb
k-b
kb
En+1S + H+
k2
En + Pi
v k2 [ E n S ]
k1 k2
k1
141
47
30-07-2015
En-1S:
En-1:
ka [ H ][ E n ] k a [ E n1 ] 0
[ E n1 ]
[ E n ][ H ]
Ka
En+1:
[ E n1S ]
[ E n S ][ H ]
K a'
En+1S:
kb [ E n ] kb [ E n1 ][ H ] 0
[ E n1 ]
ka' [ H ][ E n S ] k' a [ E n1S ] 0
k' b [ E n S ] kb' [ E n1S ][ H ] 0
Kb [ E n ]
[H ]
[ E n1S ]
Kb' [ E n S ]
[H ]
142
EnS:
(k2 k' b k1 ka' [ H ])[ E n S ] kb' [ E n1S ][ H ] k1[ E n ][ S ]
k' a [ E n1S ] 0
k1[ E n ][ S ] (k2 k1 )[ E n S ]
[ E n ][ S ] K [ E n S ]
Balance de la concentracin de enzima total
[ Et ] [ E n1 ] [ E n ] [ E n1 ] [ E n1S ] [ E n S ] [ E n1S ]
143
[ Et ] [ E n S ][
K
[ H ] Kb
[H ] K '
(1
) 1 ' b ]
[S ]
Ka
[H ]
Ka
[H ]
v k2 [ E n S ]
v
k [E nS ]
2
[ Et ]
[ Et ]
V [S ]
v AP
K AP [ S ]
VAP
V
[ H ] K b'
1 '
Ka
[H ]
[ H ] Kb
]
Ka
[H ]
[ H ] K b'
1 '
Ka
[H ]
K [1
K AP
144
48
30-07-2015
VAP
V
[ H ] K b'
1 '
Ka
[H ]
dVAP
d[H ]
V
K'
1
( b 2 ' ) 0
'
[ H ] Kb 2 [ H ] K a
(1 ' )
Ka
[H ]
[ H ]* K a' K b'
pH *
pK a' pK b'
2
145
Diseo experimental
146

VAP
V
[H ] K '
[ H ] K b' log VAP log V log[1 ' b ]
1 '
Ka
[H ]
Ka
[H ]
H K a' Kb'
Zona cida (I):
logVAP logV log[ H ] log K a'

logVAP pH logV pK a'
Zona bsica (II):
K a' Kb' H
logVAP logV log[ H ] log Kb'

logVAP pH logV pKb'
147
49
30-07-2015

Zona del ptimo (III):
K a' H Kb'
logVAP logV
pH
VAP
---
----
logVAP
----
---
-----
-----
----
----
-----
----
-----
----pKa
pKb
148
pH
KAP
AP=KAP/VAP
---
----
----
---
-----
-----
----
----
-----
----
-----
-----
AP
AP [1
log AP log log[1

Zona cida (I):
K AP K
[ H ] Kb
[1
]
VAP V
Ka
[H ]
[ H ] Kb
]
Ka
[H ]
[ H ] Kb
]
Ka
[H ]
H K a Kb
log AP log pH pK a
149

Zona bsica (II):
K a Kb H
log AP log pH pKb
Zona del ptimo (III): K a H Kb
log AP log
150
50
30-07-2015
pH
AP
---
----
logAP
----
---
-----
-----
----
----
-----
----
-----
----pKa
pKb
151
Efecto de la temperatura sobre la Afinidad,

Reactividad y Estabilidad
Rx endotrmica
Efecto de T sobre K
G 0 H 0 T S 0 RT ln K
ln K
H 0 S 0
RT
R
Donde:
Lo misma Ec. para las constantes de inhibicin

152
Efecto de la temperatura sobre la Afinidad,

Reactividad y Estabilidad
Efecto de T sobre kcat
Ea: 4-40 kcal/mol
153
51
30-07-2015
Diseo experimental
154
Representacin esquemtica del efecto de la

temperatura en la actividad y estabilidad
155
Efecto de la T sobre los parmetros de

Inactivacin Enzimtica
Inactivacin trmica enzimtica
e/e0
1
T1
T2
T4
T3
Tiempo
156
52
30-07-2015

r kDe
Cintica de inactivacin de primer orden
kD: constante de velocidad de inactivacin de primer orden tiempo-1

e: Concentracin de la enzima activa UI/unidad de volumen
157

Balance de masa para la enzima en un reactor por lotes
d (eV )
k DeV
dt
de
k De
dt
ln
e
k Dt
e0
e
exp(k Dt )
e0
t1/ 2
ln 2
kD
158

Eia: Energa de activacin para el
proceso de inactivacin enzimtica
Eia: 20-200 Kcal/mol
159
53
30-07-2015

v
k0 exp(
Vap [ S ]
K ap [ S ]
ke[ S ]
K ap [ S ]
Ea
E
)e0 exp{[k Do exp( ia )]t}[ S ]
RT
RT
H
K 0 exp(
) [S ]
RT
160
Problemas Resueltos
Problema 1
161
Problema 1
162
54
30-07-2015
Problemas Resueltos
Problema 2
163
Problemas Resueltos
Problema 3
Los siguientes resultados correspondientes al perfil de pH de una lactasa de
Aspergillus oryzae:
pH
1,75
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
4,8
5,0
A
( mmolgluc/min g)
8,7
15,5
45,4
120
250
379,5
451,5
471,5
477,5
pH
5,2
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
A
(mmolgluc/min g)
478,5
471,5
430,5
332,5
193,0
83,0
29,5
9,5
A partir de la hiptesis de Michaelis y Davidsohn, determinar los valores de pK del

164
complejo activo lactosa-lactasa y calcular el pH terico ptimo de la enzima.
Problemas Resueltos
Problema 1
165
55
30-07-2015
Problema 2
Problemas Resueltos
166
Problema 2
2430.1
) [ AN ]
T
543.9
[ AA]
0.52 exp(
)[1
] [ AN ]
2332
T
62584 exp(
)
T
828446 exp(
167
Problema 3
Problemas Resueltos
168
56
30-07-2015
Tema 6
Inmovilizacin de Enzimas
Cintica Heterognea
Restricciones Difusionales Externas e Internas
169
Enzimas Inmovilizadas
Enzima asociada o contenida en una matriz
Aumento de estabilidad funcional
Facilidad de recuperacin
Desarrollo de procesos continuos
Eficiencia
de uso
Flexibilidad operacional
Control de reaccin
Pureza del producto
Costo fabricacin
Enzimas Inmovilizadas
- adsorcin
Unin
- covalente
Contencin
Agregacin
- inclusin en geles
- retencin en membranas
- CLEC
- CLEA
CLEA LentikatsR
57
30-07-2015
Inmovilizacin covalente de enzimas a soportes activados

ACTIVACIN DEL SOPORTE
Glicidol
NaIO4
NaOH 0.1N
NaBH4
Oxidacin
Guisan et al. (1997)
Inmovilizacin covalente de enzimas a soportes activados

O
Grupos aldehdo
(soporte activado)
C
H
Grupos amino
(lis reactivas)
+ NH
pH 10
CH
NaBH4
C N
Reduccin
Intermedio Base de Schiff
Derivado enzimtico
Estabilizacin de la enzima
por unin covalente multipuntual
A travs de:
varios residuos de la enzima
unidos por brazos cortos al soporte
Rigididizacin
3D
Reduce los cambios

conformacionales inducidos
por codisolventes, temperatura...
58
30-07-2015
CLEA
Cross Linked Enzyme Aggregates
PEG: Polietilino glicol
DS: Sulfato dextrano
PEI: Polietilenamina
A
Glutaraldehyde
PEG
Enzima Soluble
Enzima Precipitada
CLEA
Glutaraldehyde
PEG
Enzima Soluble+ PEI + DS
Enzima Precipitada
CLEA DP
CLEA G
Enzima Soluble
Enzima Precipitada
PRECIPITACION
ENTRECRUZA
MIENTO
CLEA
PVA
CLEA LentiKatsTM
ENCAPSULACION
Fuente: Illanes (2008)
59
30-07-2015
Algunas Aplicaciones
178
1969- 1970 Aminoacilasa Inmovilizada
179
Comparacin de los costos de produccin de Laminoacidos por procesos de lotes y continuo
Industrial Applicattion of Immobilized Biocatalysta 1993. Pag. 3
180
60
30-07-2015
Precio del azcar:

1970: $ 0.07 a $0.08/lb
1974: > $ 0.5/ lb
1976 : < $ 0.1/lb
Estimated world HFS consumption in millions of tons dry basis
182
From starch to HFS.

(Courtesy of Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark.)
183
61
30-07-2015
Dos razones para inmovilizar la Glucosa Isomerasa

Glucosa es una enzima cara debido a los rendimientos
de fermentacin bajos (intracelular) y actividad
cataltica baja (sustrato natural xilosa).

La fructosa y glucosa no son estables en las condiciones
de isomerizacin industrial (60 C, pH 7.5)
184
Ejemplos de Glucosa Isomerasa inmovilizada

comercializada
185
Parmetros de Inmovilizacin
Rendimiento de inmovilizacin
YP
PI
P P
.100 c R .100
PC
Pc
de protena
YE
EI
.100
EC
de enzima
Capacidad de carga del soporte

Pc arg ada
Pc PR
M
Ec arg ada Ae
EI
M
62
30-07-2015
Cintica Enzimtica en Fase heterognea

Efectos conformacionales (c)
Efectos microambientales: rest. difusionales (rd)
particin
Cintica intrnseca
Enzima soluble
Efectos conformacionales
Impedimentos estricos
Cintica intrnseca
Enzima inmovilizada
Restricciones difusionales
Cintica efectiva
Enzima inmovilizada
Restricciones Difusionales
p
p0
Restricciones difusionales externas
s0
s
s0
Restricciones difusionales internas
s0
Estado estacionario
P
r J v
p0
s0
'
s
J h (s0 ss )
v'
'
V ss
K ss
M
J [ ];
T
M
V' [ ]
T
Caso I: control por transporte (Ss=0)
r J h s0
L3
M
h [ ]; s K [ 3 ]
T
L
Caso II: control cintico (Ss =S0)
r v'
V 's0
K s0
63
30-07-2015
Conc. del seno

del lq.
Velocidad de conversin de sustrato como una funcin del sustrato
del bulk (Illanes, 2008)
RDE, M-M
V'
h K
s
S
K
S0
K
h (s0 ss )
V 'ss
K ss
v'
V'
64
30-07-2015
Factor de Efectividad
vobs
vobs vinh
vinh
1,0
0,1
0,8
5
V 'Ss
K S
(1 0 )
' s s
f ( , 0 )
0 (1 s )
V S0
K S0
0,6
10
20
0,4
0,2
100
0,0
0
10
15
20
65
30-07-2015
Illanes (2008)
Engasser (1978)
Restricciones Difusionales Internas
J ' A x J '. A x x v ''.A.x A.x (
dJ '
V ''.S
v ''
dx
K S
M
v ' V ' [ 3 ]
T .L
L
D [ ]
T
2
D.
ds
)
dt
Ley de Fick : J ' D .
d 2s V ''.S
0
dx 2 K S
I )x 0
II )x L 2
dS
0
dx
S S0
d 2
2.
0
1
dz 2
S
K
x
L
S
0 0
K
f ( 0 , z , )
ds
dx
d 2
2 . 0
dz 2
V
K .D
''
I )z 0
0
II )z 0.5
d
0
dz
66
30-07-2015
Sol. Numrica
Sol. Analtica (Cintica Primer orden)
Restricciones Difusionales Internas

J '. 4 r 2
r r
4
J '. 4 r 2 v ''. [(r r )3 r 3 ]
r
3
d (J '.r 2 )
r 2 .v ''
dr
J D.
dS
dr
d 2S
D dS V ''.S
2
0
r dr K S
dr 2
I )r 0
II )r R
dS
0
dr
S S0
67
30-07-2015
sp
(1 0 )
f ( 0 , , )
0 (1 )
Perfiles de concentracin dentro de

una partcula de catalizador esfrico
/ 0
Illanes et al. (2003)
68
30-07-2015
1/v
Grunwald (1989). Determination of effective diffusion coefficient: an important

parameter for the efficiency of immobilized biocatalysts. Biochem Educ 17:99102
Handrikov et al. (1996). Enzyme and Microbial technology 18: 581-584
Difusividades de lactosa en varios sistemas

Sistema
K. fragilis en gelatina
(5%, 37C)
Difusividad (cm2/seg)
4.21x10-8
Gelatina (5%, 5C)
1.44x10-6
E. Coli en carragenina y goma de

algarrobo (5%, 32C)
3.53x10-8
Carragenina y goma de
algarrobo (5%, 32C)
1.285x10-8
Agua (25C)
4.9x10-6
Fuente: Castillo et al. (1991)
69
30-07-2015
Mtodo de Clark y Bailey (1983). (Grfico EadieHofstee)

Engasser (1978)
Engasser and Horvath (1973)
Polakovic et al. (2001) (diseo ptimos)
Bruce et al. (1974)
Referencias Bibliogrficas
Illanes A. (2008). Enzyme biocatalysis: principles and applications.
Springer.
Guisan et al. (2007) . Immobilization of enzyme on glyoxil Agarose. In:
immobilization of enzymes and cells. GF. Bickerstaff (ed.). Humana Press.
Engasser and Horvath (1973). J. Theor. Biol. 42: 137-155.
Engasser (1978). Biochimica et Biophysica Acta, 526: 301-310.
Handrikov et al. (1996). Enzyme microbial technology 18: 581-584.
Polakovic et al. (2001). Chemical engineering science 56: 459-466.
Castillo E. et al. (1991). Enzyme and Microbial Technology 13: 127-133.
Bruce et al. (1974). Effect of Diffusional limitations on Lineweaver-Burk
plots for immobilized enzymes. AICHE 20: 503
GRACIAS
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alto costo de produccin

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Fuente: Basic Biotechnology. Ratledge y Kristiansen (2006)

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