La agarosa electroforesis en gel es la forma ms eficaz de separar fragmentos de ADN de

diferentes tamaos que van desde 100 pb a 25 kb 1. La agarosa es aislado a partir de las algas
gneros Gelidium y Gracilaria, y consta de agarobiose repetida (L y D-galactosa)
subunidades 2. Durante la gelificacin, los polmeros de agarosa asociacin no covalente y
formar una red de paquetes cuyo tamao de poro determinar un gel de propiedades
moleculares de tamizado. El uso de electroforesis en gel de agarosa revolucionado la
separacin del ADN. Antes de la adopcin de geles de agarosa, el ADN se separ utilizando
principalmente de densidad de sacarosa centrifugacin en gradiente, que slo proporcionan
una aproximacin de tamao. Para separar el ADN utilizando electroforesis en gel de agarosa,
el ADN se carga en prefabricados pozos en el gel y una corriente aplicada. El esqueleto de
fosfato del ADN (y ARN) molcula est cargado negativamente, por lo tanto, cuando se coloca
en un campo elctrico, los fragmentos de ADN migrarn a la positively cargo del nodo.
Debido a que el ADN tiene un uniforme relacin masa / carga, las molculas de ADN se
separan por tamao en un gel de agarosa en un patrn tal que la distancia recorrida es
inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular 3. El modelo principal para el
movimiento de ADN a travs de un gel de agarosa es "parcial reptacin", con lo que el borde
delantero se mueve hacia adelante y tira el resto de la molcula a lo largo de 4.La velocidad de
migracin de una molcula de ADN a travs de un gel se determina por el siguiente: 1) el
tamao de la molcula de ADN, 2) la concentracin de agarosa; 3) conformacin de ADN 5, 4)
la tensin aplicada, 5) presencia de bromuro de etidio, 6) de tipo de tampn de electroforesis
en agarosa y 7). Despus de la separacin, las molculas de ADN pueden ser visualizadas
bajo luz UV despus de la tincin con un colorante adecuado. Siguiendo este protocolo, los
estudiantes deben ser capaces de:
1. Comprende el mecanismo por el cual los fragmentos de ADN se separan dentro de
una matriz de gel
2. Comprender cmo la conformacin de laMolcula de ADN determinar su movilidad
a travs de una matriz de gel

3. Identificar una solucin de agarosa de la concentracin adecuada a sus

necesidades
4. Preparar un gel de agarosa para electroforesis de las muestras de ADN
5. La instalacin del equipo de electroforesis en gel y la fuente de alimentacin
6. Seleccionar un voltaje apropiado para la separacin de fragmentos de ADN
7. Comprende el mecanismo por el cual el bromuro de etidio permite la visualizacin
de las bandas de ADN
8. Determinar los tamaos de los fragmentos de ADN separados

Protocol
1. Preparacin del gel
1. Pesar la masa apropiada de agarosa en un matraz Erlenmeyer. Los geles de
agarosa se preparan usando p / v solucin porcentaje. La concentracin de agarosa
en un gel depender de los tamaos de los fragmentos de ADN que se separaron,
con la mayora de los geles que oscilan entre 0,5% -2%. El volumen del tampn no
debe ser mayor que 1/3 de la capacidad del matraz.
2. Aadir tampn de agarosa al matraz que contiene. Agite para mezclar. El gel ms
comn que los amortiguadores son TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA) y de
TBE (45 mM Tris-borato, 1 mM EDTA).
3. Fundir la mezcla de agarosa / tampn. Esto se realiza comnmente mediante el
calentamiento en un horno de microondas, pero tambin se puede hacer sobre una
llama de Bunsen. En intervalos de 30 s, retirar el matraz y agitar el contenido para
mezclar bien. Repita hasta que la agarosa se haya disuelto completamente.

4. Aadir bromuro de etidio (EtBr) a una concentracin de 0,5 g / ml. Alternativamente,

el gel puede tambin ser teidas despus de electroforesis en el funcionamiento de
un tampn que contiene 0,5 mg / ml de bromuro de etidio durante 15-30 minutos,
seguido de decoloracin en la gestin de bfer por un perodo igual de tiempo.
Nota: EtBr es un carcingeno y debe desecharse de forma adecuada segn las regulaciones
de la institucin. Los guantes deben ser usados siempre al manipular geles que contienen
bromuro de etidio. Tintes alternativos para la tincin de ADN se encuentran disponibles, sin
embargo EtBr sigue siendo el ms popular debido a su sensibilidad y costo.
5. Dejar que la agarosa se enfre bien en la mesa de trabajo o por incubacin en un
bao de 65 C el agua. De no hacerlo, se tuerza la cubeta.
6. Coloque la bandeja de gel en el aparato de fundicin. Alternativamente, tambin se
puede pegar los bordes abiertos de una bandeja de gel para crear un molde.
Colocar un peine adecuado en el molde de gel para crear los pocillos.
7. Verter la agarosa fundida en el molde de gel. Permitir la agarosa para establecer a
temperatura ambiente. Retirar el peine y colocar el gel en el cuadro de gel.
Alternativamente, la gEl tambin puede ser envuelto en una envoltura de plstico y
se almacen a 4 C hasta su uso (fig. 1).
2. Puesta en marcha de aparato de gel y la separacin de fragmentos de ADN
1. Aadir colorante de carga para las muestras de ADN para ser separados (fig.
2). Gel de carga de colorante se hace tpicamente en una concentracin 6X (0,25%
azul de bromofenol, 0,25% cianol xileno, 30% de glicerol). Cargando medio de
contraste ayuda a realizar un seguimiento de hasta qu punto su muestra de ADN
ha viajado, y tambin permite que la muestra se hunden en el gel.
2. Programa de la fuente de alimentacin a la tensin deseada (1-5V/cm entre los
electrodos).

3. Aadir tampn suficiente corriente para cubrir la superficie del gel. Es importante
utilizar el mismo tampn se ejecuta como el utilizado para preparar el gel.
4. Coloque los cables de la caja de gel a la fuente de alimentacin. Encienda la fuente
de alimentacin y verificar que tanto la caja de gel y la fuente de alimentacin estn
trabajando.
5. Retire la tapa. Despacioy cuidadosamente cargar la muestra de ADN (s) en el
gel (fig. 3). Un marcador de ADN de tamao apropiado se debern colocar siempre
junto con las muestras experimentales.
6. Sustituir la tapa para la caja de gel. El ctodo (cables de color negro) debe estar
ms cerca de los pozos que el nodo (cables rojos). Compruebe que los electrodos
se conectan en las ranuras correctas en la fuente de alimentacin.
7. Encienda la alimentacin. Ejecutar el gel hasta que el colorante ha migrado a una
distancia apropiada.
3. Observando separados por fragmentos de ADN
1. Cuando se ha completado la electroforesis, apague la fuente de alimentacin y
retire la tapa de la caja de gel.
2. Quitar el gel de la cubeta. Escurrir el exceso de tampn de la superficie del gel.
Coloque la bandeja de gel en las toallas de papel para absorber el bfer adicional
en ejecucin.
3. Quitar el gel de la bandeja de gel y exponer el gel a la luz UV. Esto se realiza
comnmente mediante un sistema de documentacin de gel (fig. 4). Las bandas de
ADN debe mostrararriba como bandas fluorescentes de color naranja. Toma una
fotografa del gel (fig. 5).
4. Deseche el gel y el tampn de acuerdo a las normas de la institucin.

4. Los resultados representativos

La figura 5 representa un resultado tpico despus de electroforesis en gel de agarosa de los
productos dePCR Despus de la separacin, los fragmentos de ADN resultantes son visibles
como bandas claramente definidas. El estndar de ADN o escalera debe ser separado a un
grado que permita la determinacin til de los tamaos de las bandas de la muestra. En el
ejemplo mostrado, fragmentos de ADN de 765 pb, 880 pb y 1022 pb se separ en un gel de
agarosa al 1,5% junto con una escalera de ADN de 2-log.

Figura 1. Un solidificado en gel de agarosa despus de la eliminacin del peine.

Figura 2. Un estudiante de la adicin de colorante de carga a las muestras de su ADN.

Figura 3. Un estudiante cargar la muestra de ADN en un pozo en el gel.

Figura 4. Un ejemplo de un sistema de documentacin en gel.

Figura 5. Una imagen de una electroforesis en gel de mensaje. EtBr se aadi a la

electroforesis en gel antes a una concentracin final de 0,5 g / ml, seguido de la separacin a

100 V durante 1 hora. El gel se expone a la luz UV y la imagen tomada con un sistema de
documentacin de geles.

Discussion
Electroforesis en gel de agarosa ha demostrado ser una manera eficiente y eficaz de separar
los cidos nucleicos. Alta resistencia del gel de agarosa, permite la manipulacin de los geles
porcentuales bajos para la separacin de grandes fragmentos de ADN. Tamizado molecular se
determina por el tamao de poros generados por los haces de agarosa 7 en la matriz de gel.
En general, cuanto mayor sea la concentracin de agarosa, menor es el tamao de los poros.
Tradicionales geles de agarosa son ms eficaces en la separacin de los fragmentos de ADN
entre 100 pb y 25 kb. Para separar fragmentos de ADN de ms de 25 kb, uno tendr que
utilizar campo pulso electroforesis en gel de 6, que implica la aplicacin de corriente alterna a
partir de dos direcciones diferentes. De este modo grandes fragmentos de ADN de tamao
estn separados por la velocidad a la que ellos mismos reorientar con los cambios en la
direccin de la corriente. Los fragmentos de ADN ms pequeas que 100 pb se separ ms
eficazmente mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. A diferencia degeles de agarosa,
la matriz de gel de poliacrilamida se forma a travs de una reaccin de radicales libres qumico
accionado. Estos geles son ms delgados de mayor concentracin, se corren en forma vertical
y tienen una mejor resolucin. En el ADN moderno secuenciacin electroforesis capilar se
utiliza, por lo que los tubos capilares se llenan con una matriz de gel. El uso de tubos capilares
permite la aplicacin de altas tensiones, lo que permite la separacin de fragmentos de ADN (y
la determinacin de la secuencia de ADN) de forma rpida.
La agarosa se puede modificar para crear bajo punto de fusin a travs de agarosa
hidroxietilacin. Agarosa de bajo punto de fusin se utiliza generalmente cuando el aislamiento
de fragmentos de ADN separados se desea. Hidroxietilacin reduce la densidad de
empaquetamiento de los haces de agarosa, la reduccin efectiva de su tamao de poro 8. Esto
significa que un fragmento de ADN del mismo tamao se necesitar ms tiempo para mover a
travs de un bajo punto de fusin en gel de agarosa en oposicin a un estndar de gel de
agarosa. Debido a que los haces de asociarse con un otroa travs de interacciones no
covalentes 9, es posible volver a fundir un gel de agarosa despus de que se ha fijado.

EtBr es el reactivo ms comn usado para teir ADN en geles de agarosa

10.

Cuando se

expone a la luz UV, los electrones en el anillo aromtico de la molcula de etidio se activan, lo
que conduce a la liberacin de energa (luz) como el retorno electrones a estado fundamental.
EtBr funciona por s mismo intercalando en la molcula de ADN de una manera dependiente
de la concentracin. Esto permite una estimacin de la cantidad de ADN en cualquier banda
de ADN particular, sobre la base de su intensidad. Debido a su carga positiva, el uso de EtBr
reduce la tasa de migracin del ADN en un 15%. EtBr es un mutgeno y carcingeno
sospechoso, por lo tanto se debe proceder con cuidado al manipular geles de agarosa que lo
contienen. Adems, EtBr se considera un residuo peligroso y debe ser desechado de manera
adecuada. Manchas alternativos para ADN en geles de agarosa son SYBR Gold, SYBR
Green, cristal violeta y azul de metilo. De stos,El azul de metilo y violeta cristal no requieren
la exposicin del gel a la luz UV para la visualizacin de las bandas de ADN, reduciendo as la
probabilidad de mutacin si la recuperacin del fragmento de ADN desde el gel se desea. Sin
embargo, sus sensibilidades son menores que el de EtBr. SYBR oro y verde SYBR son
altamente sensibles, tintes UV dependientes con menor toxicidad que EtBr, pero son
considerablemente ms caros. Adems, todos los tintes alternativos, o bien no puede ser o no
funcionan bien cuando se aade directamente al gel, por lo tanto, el gel tendr que ser teido
posterior despus de la electroforesis. Debido a coste, facilidad de uso, y la sensibilidad, EtBr
sigue siendo el tinte de eleccin para muchos investigadores. Sin embargo, en ciertas
situaciones, como cuando la eliminacin de residuos peligrosos es difcil o cuando los jvenes
estudiantes estn realizando un experimento, un medio de contraste menos txicas pueden
ser preferibles.
Tintes de carga utilizados en electroforesis en gel sirven para tres propsitos principales.
Primero se aade a la densidad de la muestra, Permitiendo que se hunda en el gel. En
segundo lugar, los tintes proporcionar color y simplificar el proceso de carga. Finalmente, los
colorantes se mueven a velocidades estndar a travs del gel, lo que permite la estimacin de
la distancia que los fragmentos de ADN han migrado.
Los tamaos exactos de los fragmentos de ADN separados puede determinarse trazando el
registro del peso molecular de las distintas bandas de un estndar de ADN contra la distancia

recorrida por cada banda. El estndar de ADN contiene una mezcla de fragmentos de ADN de
tamaos predeterminados que pueden ser comparados contra las muestras de ADN
desconocidos. Es importante sealar que las diferentes formas de ADN se mueven a travs
del gel a diferentes velocidades. ADN plsmido superenrollado, debido a su conformacin
compacta, se mueve a travs de la ms rpida en gel, seguido por un fragmento de ADN lineal
del mismo tamao, con la forma circular abierta viajar el ms lento.
En conclusin, desde la adopcin de geles de agarosa en la dcada de 1970 para la
separacin de ADN, que tienedemostrado ser una de las tcnicas ms tiles y verstiles en la
investigacin ciencias biolgicas.