RESSONNCIA MAGNTICA

NUCLEAR: Gradus Primus*

Cludia Jorge do Nascimento

Professora do Instituto de Qumica - UnB

Carlos Bloch Jr.

PESQUISA

Professor do Instituto de Qumica - UnB

Pesquisador da EMBRAPA Recursos
Genticos e Bioctenologia
cbloch@cenargen.embrapa.br

* Primeiros passos
INTRODUO
Por quase meio sculo, a determinao de estrutura tridimensional (3D)
de protenas vem sendo feita por
mtodos de cristalografia e difrao
de raio-X; inquestionvel a importncia e a contribuio que aplicaes dessa tcnica tm proporcionado Bioqumica. Entretanto, h mais
ou menos vinte anos, a Ressonncia
Magntica Nuclear (RMN), que j
ocupava um local de destaque nos
estudos estruturais de pequenas molculas, comeou a ser utilizada na
determinao da estrutura tridimensional de peptdeos e protenas em
soluo, independentemente de dados cristalogrficos. Para que isso
fosse possvel, sensveis avanos na
instrumentao e na metodologia
dessa tcnica tiveram que ocorrer,
incluindo-se, entre os mais importantes, o uso de campos magnticos
homogneos de alta intensidade,
novas tcnicas de pulso e a introduo de mtodos computacionais mais
avanados para a produo e a interpretao dos dados de RMN de macromolculas.
Atualmente, mais de duas mil estruturas 3D de protenas determinadas por RMN tm suas coordenadas
atmicas depositadas no Brookhaven
Protein Data Bank (http://
www.rcsb.org/pdb/) e esse nmero
vem crescendo rapidamente. Verificaram-se tambm significativos progressos na determinao estrutural
de outros biopolmeros por RMN,
como o caso dos cidos nuclicos e
dos oligossacardeos, antes obtidos
52

Figura 1: A Radiao Eletromagntica

apenas por difrao de raio-X.
Com a chegada da era ps-genmica, nunca se exigiu tanto dos mtodos para obteno de estruturas 3D
de biomolculas. Tradicionalmente,
esse trabalho tem sido efetuado com
caractersticas quase artesanais devido alta complexidade da tarefa,
ao tempo necessrio para a obteno
de apenas uma estrutura (vrios meses) e aos elevados custos com infraestrutura e manuteno. Por essas e
por outras razes que o uso da RMN
em Bioqumica ainda se encontra
restrito a poucos grupos de excelncia espalhados pelo mundo e que
seus fundamentos tericos permanecem obscuros para a maioria daqueles que tm algum interesse nos mais
recentes avanos dessa nova era de
descobertas cientficas.
O presente artigo tem como objetivo primordial oferecer a leitores
que no sejam da rea de RMN, mas

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 21 - julho/agosto 2001

que possuam noes bsicas em fsica

e em qumica, uma viso global dos
fenmenos que fundamentam essa
tcnica, e da maneira como tais fenmenos so utilizados no processo de
determinao estrutural de substncias relativamente simples, permitindolhes dar os primeiros passos para uma
melhor compreenso das metodologias desenvolvidas na obteno de
estruturas 3D de moleculas bem mais
complexas (peptdeos, protenas e cidos nuclicos) disponveis na literatura.
importante ressaltar que a abordagem escolhida ser bastante simplificada, uma vez que para uma verdadeira compreenso do fenmeno que
representa a Ressonncia Magntica
Nuclear seria necessria uma descrio em termos de Mecnica Quntica,
com a utilizao de operadores qunticos e matrizes de densidade, 1-4 o que
est fora dos objetivos deste artigo.

PRINCPIOS BSICOS DA
ESPECTROSCOPIA DE
RESSONNCIA
MAGNTICA NUCLEAR
A Espectroscopia o estudo da
interao da radiao eletromagntica
(REM) com a matria. Essa radiao
pode ser vista como uma onda com
duas componentes, uma eltrica e outra magntica, que oscilam perpendicularmente entre si, sendo ambas tambm perpendiculares direo de propagao da luz (Figura 1). A interao
entre a radiao eletromagntica e a
matria pode ocorrer de duas formas:
pela sua componente eltrica ou pela
sua componente magntica.
Uma das diferenas fundamentais
entre a RMN e as outras formas de
espectroscopia reside no fato de que,
na RMN, essa interao se d com o
campo magntico da REM e no com o
campo eltrico, como o caso, por
exemplo, do infravermelho ou do ultravioleta.
A REM de interesse em anlises
qumicas vai desde os raios gama (alta
energia) at as ondas de rdio (baixa
energia). Para cada tipo de espectroscopia exigido um tipo de excitao e,
para cada uma delas, existe uma quantidade definida de energia, ou seja,
esses fenmenos so quantizados. Isso
quer dizer que uma radiao de freqncia determinada e caracterstica
absorvida para uma determinada transio.
A RMN encontra-se na regio das
ondas de rdio (radiofreqncias). Em
princpio, pode-se dizer que a RMN
uma outra forma de espectroscopia de
absoro. Em um campo magntico,
sob determinadas condies, uma
amostra pode absorver REM na regio
da radiofreqncia (rf), absoro essa
governada por caractersticas da amostra. Essa absoro funo de determinados ncleos presentes na molcula,
que so sensveis radiao aplicada e,
por isso, esses ncleos so alvo de
estudo para a compreenso da RMN.
1- A DEFINIO DE
SPIN NUCLEAR

Tabela 1: Mostra a correlao existente entre o nmero atmico (Z) e o

nmero de massa (A) com o nmero de spin (I)
A
Z
Exemplos *
I
1
mpar Par ou mpar
H(1/2), 17O (5/2), 15N (1/2)
Meio inteiro
2
Par
mpar
H (1), 14N (1), 10B (3)
Inteiro
12
Par
Par
C (0), 16O (0), 32S (0)
Zero
* O nmero entre parnteses indica o nmero de spin I do ncleo
exemplificado

A grandeza fsica envolvida em

RMN o spin nuclear. O conceito de
spin nuclear provm da Mecnica Quntica, no possuindo conceito equivalente na Mecnica Clssica. Esse conceito fundamental para a compreenso do fenmeno e pode ser compreendido como uma propriedade que
determinados ncleos apresentam. Tais
ncleos, devido sua configurao
nuclear, assumem um comportamento
caracterstico de momento angular,
capaz de gerar um momento magntico (Figura 2), pois uma carga em
movimento gera um campo magntico. O momento magntico gerado
pode ser descrito em termos do nmero de spin I, cujos valores, calculados
pela mecnica quntica5,6, podem ser
0, 1/2, 1, 3/2 etc. Como se sabe,
ncleos que apresentam tanto massas
atmicas quanto nmeros atmicos

Figura 2: Momento magntico

gerado a partir do momento
angular

pares no possuem spin, sendo, conseqentemente, o nmero de spin igual

a zero. o caso do 12C, 16O, 32S etc.
(Tabela 1). Esses ncleos no tm
momento angular associado e, portanto, no exibem propriedades magnticas, o que implica a ausncia de sinais
detectveis por RMN. Ncleos com
spin I 0 so, em princpio, detectveis
por RMN. A deteco desses ncleos
est relacionada a condies experimentais especiais, que no sero aqui
abordadas.
Dentre os diferentes ncleos detectveis por RMN, ncleos com I = so
bastante apropriados para uma compreenso mais simplificada da tcnica.

2- APLICAO DE UM CAMPO
MAGNTICO: A ENERGIA E A
FREQNCIA EM RMN
Na ausncia de um campo magntico, os spins nucleares esto orientados randomicamente, no apresentando nenhuma orientao definida (Figura 3). Entretanto, quando uma amostra submetida a um campo magntico
externo B0, de alta intensidade e homogneo, os spins nucleares tendem a
assumir determinadas orientaes. Segundo a mecnica quntica, o nmero
de spin I determina o nmero de
orientaes que um ncleo pode assumir diante de um campo magntico
externo pela relao7:
nmero de orientaes possveis = 2I + 1
No caso de um ncleo com nmero
de spin I = , apenas duas orientaes
so possveis, quando h aplicao de
um campo magntico: uma parcialmente alinhada com o campo magntico aplicado e outra parcialmente
contra o campo magntico (Figura

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 21- julho/agosto 2001

53

Figura 3: Spins randomicamente orientados

4). O ngulo que define a orientao
do vetor com relao a B0 tambm
determinado pela mecnica quntica
(seus valores aproximados so 55 e
125). As duas orientaes representam diferentes estados energticos. Isso
acontece porque um ncleo com spin
cria seu prprio campo magntico,
como j mencionado. Quanto mais
paralelo forem esses dois campos (o
do ncleo e o campo magntico externo), menor ser a energia desse estado. Assim, o estado de menor energia
aquele que se encontra parcialmente alinhado com o campo e denominado estado (ou +), e o estado de
maior energia, o parcialmente contra, denominado estado (ou -)
(Figura 5). As energias desses nveis
podem ser descritas como E = - B0 e
E = B0, o que equivale a dizer que a
diferena de energia entre os dois
nveis pode ser expressa por8: E = (E
- E) = 2B0, desde que I = .
A diferena de energia E que
surge entre os dois nveis est relacionada com vrios fatores, dentre eles,
segundo a equao anterior, a intensidade do campo magntico B0 aplicado:
quanto maior for o campo magntico
aplicado, maior ser a diferena de
energia entre os dois nveis (Figura 6)
e maior a diferena de populao associada a esses nveis. Isso significa que,
para uma melhor resoluo de spins
nucleares em ambientes qumicos semelhantes, so desejveis espectrmetros com campos cada vez mais intensos.
interessante observar que a diferena entre nveis de energia inicialmente inexistente surge devido ao
54

efeito do campo magntico externo B0

aplicado sobre o sistema de spins em
estudo. Essa mais uma das diferenas
bsicas entre a RMN e outros tipos de
Espectroscopia: em infra-vermelho e
ultra-violeta, por exemplo, j existem
diferentes nveis energticos (vibracionais e eletrnicos, respectivamente),
bastando a aplicao de uma radiao
de freqncia apropriada para que
uma transio (vibracional ou eletrnica) ocorra. No caso da RMN, os diferentes nveis energticos devem ser
primeiramente criados pela aplicao
de um campo magntico de alta intensidade (B0); s assim que se pode
proceder Espectroscopia, aplicandose, ento, a radiao de freqncia
apropriada para cada ncleo.
O fenmeno da RMN ocorre na
regio das radiofreqncias (MHz) e a

Figura 4: Direes quantizadas

assumidas pelos spins sob ao
de um campo magntico B0

interao da radiao eletromagntica

com a matria d-se com a sua componente magntica. Portanto, para se
proceder a RMN, deve ser aplicado um
segundo campo magntico (chamado
de B1), proveniente de uma fonte de
radiofreqncia aplicada perpendicularmente ao campo B0. esse segundo
campo magntico que permite a observao de absores em RMN.

entretanto, um estado mais estvel

que o outro, devido a uma interao
entre o campo e o momento magntico
associado ao spin nuclear. A absoro
em RMN , portanto, uma conseqncia das transies entre o nvel de
menor energia e o de maior energia,
possveis pela aplicao de um segundo campo magntico na regio da
radiofreqncia.
O momento angular L e o momento
magntico podem ser representados
por vetores e a proporcionalidade entre eles chamada de constante (ou
razo) giromagntica. Essa constante,
que determina a freqncia de ressonncia do ncleo, constitui um parmetro muito importante em RMN e
representada por , apresentando um
valor prprio para cada ncleo, podendo ser expressa pela relao:
= 2 / hI
onde h a constante de Plank (E =
h).
Se a constante giromagntica for
positiva, como o caso dos ncleos de
1
H e 13C, o estado + representa um
nvel de menor energia. Caso a constante giromagntica seja negativa, como,
por exemplo, para o 15N, ocorre o
oposto.9
Alm de ser responsvel pela freqncia de ressonncia de cada ncleo, a constante giromagntica influencia outros fenmenos importantes
da Ressonncia Magntica Nuclear,10
como o caso do acoplamento de
spins (que ser abordado mais adiante), da sensibilidade dos ncleos, em
processos de polarizao cruzada, entre outros.

3- O CONCEITO DE CONSTANTE
GIROMAGNTICA - A EQUAO
FUNDAMENTAL DA RMN
Na ausncia do campo magntico
externo B0, os estados e so degenerados, uma vez que no h distino
de energia. Aplicando-se o campo B0,

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Figura 5: Nveis energticos

criados pela ao do campo
magntico B0

Figura 6: Efeito do campo B0

na diferena de energia entre
os estados e

n/n = eE/kT
onde k a constante de Boltzmann e T,
a temperatura expressa em escala Kelvin.
Pode-se deduzir que, temperatura ambiente, como a diferena de energia E muito menor que kT (E <<
kT), haver um pequeno excesso de
populao de spins no estado menos
energtico. Assim, para um valor positivo de , haver um ligeiro excesso de
populao para o estado , ou seja,
para os ncleos que esto alinhados
com o campo magntico. Esse excesso

Substituindo-se as equaes anteriores (E = h e = 2 / hI) , podese chegar a:

= B0 /2
que a equao fundamental utilizada
em RMN e que define a condio de
ressonncia para um ncleo com spin
I = .
4- A MAGNETIZAO LQUIDA
Em um campo magntico externo,
o momento magntico apresenta um
ngulo com a direo do campo
magntico B0 aplicado (Figura 4). Segundo a Mecnica Clssica, bastante
til para a visualizao de muitos conceitos de RMN, a interao entre um
ncleo com um momento magntico
e o campo B0 faz com que o momento
magntico precesse em torno daquele
eixo (Figura 7). A freqncia desse
movimento chamada freqncia de
Larmor, e seu valor dado pela expresso anterior = B0 /2 em Hertz.
Os dois estados energticos correspondem, ento, precesso de em
torno do eixo, alinhado (menor energia, se for positiva) ou oposto ao
campo magntico aplicado B0. Considerando que o campo B0 esteja aplicado na direo z, no equilbrio, os
vetores dos momentos magnticos estaro distribudos em dois cones, em
torno dos eixos +z e z (Figura 8).11
A populao dos dois diferentes
estados energticos e (respectivamente n e n) pode ser obtida a partir
da equao de Boltzmann:7

Figura 7: Precesso nuclear

de populao resulta em uma magnetizao lquida na direo +z, uma vez

que no plano xy, a resultante nula
(Figuras 9, 10).
5- O EFEITO DA APLICAO DE B1
SOBRE A MAGNETIZAO
Em RMN, a aplicao do campo B1
feita perpendicular ao campo B0
aplicado (portanto, na direo x ou y).
Assumindo que B1 seja aplicado na
direo x, o campo oscilante nessa
direo equivalente soma vetorial
de dois vetores de igual amplitude,
movendo-se em direes opostas no
plano xy (Figura 11). A magnitude de
cada uma dessas componentes corresponde metade do vetor B1 e somente
uma delas tem efeito no vetor magnetizao. A outra pode, portanto, ser
negligenciada.12,13
O campo B1 aplicado na forma de
um pulso, ou seja, a fonte de r.f.
permanece ligada por perodos con-

trolados da ordem de microssegundos

(s) a milissegundos (ms). O pulso
eletromagntico criado por manipulao da fonte de radiao eletromagntica, ligando-a ou desligando-a, e a
durao do pulso (s a ms) o tempo
para o qual a fonte de radiao se
encontra ligada.
No mtodo pulsado, os ncleos so
excitados em uma regio de freqncias por um ou mais pulsos. Na ressonncia, o campo B1, aplicado na forma
de um pulso, faz com que alguns
ncleos que se encontravam em
situao de equilbrio (magnetizao
lquida em z), apenas sob influncia de
B0 absorvam energia e seus momentos magnticos nucleares passem a
precessar no plano xy (Figura 12).14
Ou seja, o campo B1 altera a direo de
precesso da magnetizao, acarretando, portanto, uma perturbao do sistema, retirando-o do equilbrio.
A nova componente gerada no plano xy pode ser observada com auxlio
de um detector no mesmo plano de
precesso. Para isso, a fonte de r.f.
deve ser desligada. Quando isto ocorre, o sistema tende a retornar situao
original de equilbrio. Este retorno
conhecido por processo de relaxao,
que faz com que os ncleos percam o
excesso de energia e retornem s suas
posies originais de equilbrio.
O decaimento da magnetizao xy
que d origem ao sinal de RMN para
retornar sua posio de equilbrio
exponencial e d origem ao chamado
sinal FID (Free Induction Decay). Os

Figura 8: Cone de precesso

nuclear

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55

Figura 9: Resultante no plano xy

seja, para que a interpretao do espectro seja facilitada, os sinais da FID

so convertidos para um domnio de
freqncias de ressonncia, caractersticas de cada ncleo, atravs de uma
operao matemtica chamada transformada de Fourier. A transformada de
Fourier dos diferentes sinais de FID d
origem ao espectro de RMN comumente analisado15 (Figura 15). Em outras
palavras, um espectro de RMN consiste
em uma srie de ressonncias em diferentes freqncias, denominadas deslocamentos qumicos.
6- O DESLOCAMENTO QUMICO

sinais da FID (Figura 13) so detectados como uma funo do tempo, encontrando-se a todas as informaes
sobre acoplamento e deslocamento
qumico (fenmenos que sero vistos a
seguir) contidos em um espectro de
RMN. Como existem vrios ncleos em
uma amostra, tambm so originados
vrios sinais de FID que se superpem,
de forma que se torna muito difcil a
extrao das informaes desejadas
(Figura 14). Para que as informaes
se tornem acessveis ao usurio, ou

Segundo a equao fundamental

da RMN j apresentada ( = B0 /2),
em um espectro de RMN, todas as
absores devidas a um mesmo tipo de
ncleo deveriam ocorrer a uma mesma
freqncia, uma vez que, segundo
essa equao, a freqncia depende
apenas do campo B0 aplicado e da
constante giromagntica de cada ncleo. O espectro obtido experimentalmente, no entanto, mostra que a situao no exatamente assim, poden-

Figura 10: Magnetizao lquida

Figura 11: Em vermelho esto mostradas as componentes de B1

56

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do ser observadas diferentes absores a diferentes freqncias (Figura

15).
O fator que rege essa diferena de
freqncias de absoro denominado blindagem. Esse fenmeno pode
ser compreendido levando-se em conta a vizinhana (ncleos e eltrons) na
qual se encontra o ncleo que est
sendo objeto de anlise.
Cada uma dessas partculas carregadas est sujeita influncia de campos magnticos. Tomando como exemplo um tomo de hidrognio em uma
molcula, observa-se que, quando ela
submetida a um campo magntico, o
campo induz uma circulao dos eltrons em torno do hidrognio, em um
plano perpendicular ao campo externo. Essa carga circulante gerada tal
que o campo magntico gerado (chamado induzido) pode se opor ou no
ao campo externo. No primeiro caso,
diz-se que os eltrons produzem um
efeito de blindagem sobre o hidrognio, no segundo, o efeito de desblindagem desse ncleo (Figura 16). Dessa forma, o ncleo fica sujeito a um
campo magntico efetivo (Befet = B0 Binduzido), e o grau de blindagem ou
desblindagem depender da densidade eletrnica prxima dele, ou seja, do
ambiente qumico em que ele se encontra. Isso justifica diferentes absores para ncleos prximos a tomos
eletronegativos, onde a desblindagem
maior, uma vez que tomos eletronegativos diminuem a densidade eletrnica dos tomos de hidrognio que
estejam em suas vizinhanas. Para o
etanol (Figura 15), por exemplo, os
tomos de hidrognio do grupo -CH2
encontram-se mais prximos do tomo de oxignio do que os do grupo
CH3. Por isso, a densidade eletrnica
na regio prxima ao grupo CH2 ser
menor que na regio prxima ao grupo
CH3, o que torna os primeiros mais
desblindados com relao a esses ltimos.
Conclui-se, ento, que ncleos em
diferentes ambientes qumicos apresentaro diferentes freqncias de absoro devido a diferentes graus de
blindagem ou desblindagem. A diferena entre essa freqncia de absor-

Figura 12: Influncia de B1 na magnetizao lquida

o com relao a um determinado
ncleo-referncia (chamado padro)
denominada deslocamento qumico.
Assim, ncleos quimicamente equivalentes (em semelhantes ambientes eletrnicos) apresentam o mesmo deslocamento qumico. No etanol, todos os
trs ncleos de hidrognio do grupo
CH3 apresentam o mesmo deslocamento qumico, ocorrendo a mesma
coisa com os dois ncleos de hidrognio do grupo CH2.
Os valores de deslocamento qumico em unidades de freqncia so
valores muito prximos. Por isso,
),
muito usual a chamada escala delta (
dada pela relao:
= amostra x 106 / espectrmetro
onde amostra dada em Hertz e espectrem MHz. A escala , portanto,
metro
adimensional com valores expressos
em ppm. Os ncleos mais blindados
apresentam valores de menores, enquanto os mais desblindados apresentam valores de maiores. No espectro
de RMN de hidrognio (RMN-1H) do
etanol (Figura 15), podem ser observados dois valores de deslocamento
qumico: um primeiro, prximo a 1
ppm, mais blindado em relao ao
segundo, prximo a 3,5 ppm. Como os

Figura 13: Decaimento exponencial do sinal de RMN

ncleos de hidrognio da CH3 so

mais blindados que os do -CH2, os
primeiros absorvem a 1 ppm e esses
ltimos a 3,5 ppm.
7- ACOPLAMENTO SPIN-SPIN
Observando-se um espectro de
RMN, pode-se ver que os sinais originados das absores nem sempre aparecem como picos nicos ou singletos,
mas podem aparecer tambm como
dupletos, tripletos, quartetos etc. (Figura 15), o que est relacionado com
o que se chama acoplamento spinspin. Esse fenmeno originado quando ncleos em diferentes ambientes
eletrnicos esto prximos entre si
(normalmente o efeito observado em
at trs ligaes, exceto quando existirem duplas ou triplas ligaes).
Basicamente, existem dois tipos de
acoplamento spin-spin: o acoplamento homonuclear, quando o acoplamento ocorre entre o mesmo tipo de
ncleos, como, por exemplo, quando
hidrognios em diferentes ambientes
qumicos acoplam entre si, e o acoplamento heteronuclear, que ocorre entre
ncleos diferentes, como, por exem-

Figura 14: FID do etanol

plo, entre hidrognio e carbono.

Por meio da Mecnica Quntica,7
sabe-se que o desdobramento de um
sinal de singleto para dupleto, tripleto,
etc. (chamado de multiplicidade) pode
ser dado pela relao 2nI+1, onde n
o nmero de ncleos vizinhos em
diferentes ambientes qumicos e I o
nmero de spin do ncleo que est
sendo analisado. Para ncleos com
spin I = , a multiplicidade ser dada
simplesmente por (n+1).
Assim, no espectro de hidrognio
do etanol (Figura 15), desprezandose o hidrognio do grupo OH, devido
ao processo de troca qumica, (no
abordado aqui), sero observados dois
sinais devidos a acoplamento homonuclear: um relativo aos hidrognios
da metila e outro aos hidrognios do
grupo CH2, uma vez que se encontram em diferentes ambientes eletrnicos e que, portanto, apresentaro diferentes deslocamentos qumicos. Esses
sinais, entretanto, no aparecem como
singletos (Figura 15). A multiplicidade dada por (n+1): os trs hidrognios da metila tm dois vizinhos (os
dois hidrognios do grupo CH2); logo,
o seu sinal aparecer no espectro como
um tripleto (2 + 1 = 3), observado em
torno de 1 ppm. Analogamente, os dois
hidrognios do grupo CH2 tm como
vizinhos os trs hidrognios da metila
e seu sinal ser um quarteto (3 + 1 = 4),
cuja absoro obervada em torno de
3,5 ppm.
A intensidade dos picos de um
multipleto no a mesma. Ela est
associada ao nmero de transies
naquela determinada freqncia de
cada um dos picos observados. Para
ncleos com I = , a intensidade dos
picos do multipleto pode ser obtida a
partir do tringulo de Pascal (Figura
17), dispensando o clculo dos nmeros de transies associadas a cada um
dos picos. Assim, para um dupleto, por
exemplo, a intensidade dos sinais ser
de 1:1; para um tripleto, de 1:2:1; para
um quarteto, de 1:3:3:1; e assim por
diante, segundo os valores expressos
no tringulo de Pascal.
A distncia entre cada um dos picos
de um multipleto chamada de constante de acoplamento J (Figura 18), e

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 21- julho/agosto 2001

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Figura 15: Espectro de hidrognio do etanol

indica o quanto um acoplamento entre

ncleos efetivo: uma maior constante
de acoplamento significa um acoplamento mais efetivo.
Alm disso, a constante de acoplamento tambm pode servir para identificar diferentes acoplamentos no espectro. Essa identificao facilitada
tendo-se em conta que, se um ncleo
A acopla-se a um ncleo B com uma
constante de acoplamento JAB, a constante de acoplamento de B com A (JBA)
deve ser igual a JAB (JAB = JBA). Tabelas
contendo diferentes valores de constantes de acoplamento para diferentes
grupos funcionais e molculas podem
ser encontradas na Literatura,7-10 o que
facilita a interpretao dos sinais em
um espectro de RMN de uma maneira
inequvoca. Os valores das constantes
de acoplamento J so dados em unidades de freqncia (Hz) e so chamadas
1 2 3
J, J, J,, nJ, dependendo do nmero
de ligaes existentes entre os ncleos
que acoplam (1, 2, 3, , n ligaes,
respectivamente).

poderosa tcnica para a elucidao

estrutural de molculas orgnicas, inorgnicas e principalmente de biomolculas. Essas molculas apresentavam
espectros de difcil interpretao devido, principalmente, superposio de
sinais ao longo de toda a faixa espectral
e/ou em uma dada regio de freqncia17 (Figura 19). A RMN-2D possibilitou a interpretao dos espectros dessas molculas, antes dificilmente identificadas pelos mtodos em uma dimenso.
Para entender as razes disso e o
que um espectro de RMN em duas
dimenses, assim como o seu processamento, necessrio compreender
conceitos como tempo de preparao,

tempo de evoluo e tempo de deteco.

Tempo de preparao o perodo
durante o qual um sistema de spins
preparado para atingir o equilbrio trmico. Esse tempo pode incluir a aplicao de um ou mais pulsos ou, simplesmente, ser um perodo t 0; pode at
mesmo nem existir, dependendo do
experimento que est sendo realizado.
O importante que o sistema de spins
se encontre em equilbrio antes que o
experimento seja iniciado.
O tempo de evoluo (chamado t1)
constitui o experimento de RMN propriamente dito, durante o qual o sistema de spins evolui fora da situao de
equilbrio pela aplicao de um ou
mais pulsos, dependendo da informao que se deseja obter. O tempo de
deteco (ou tempo de aquisio, chamado t2) o perodo durante o qual se
adquire o sinal do FID.
Um experimento unidimensional
pode apresentar esses trs tempos (Figura 20). O tempo de evoluo (t1)
fixo e o sinal recebido apenas funo
do tempo de deteco (t2), que
varivel. Em um experimento convencional em uma dimenso, o tempo de
evoluo t1 zero e a deteco
realizada imediatamente aps o pulso
de radiofreqncia (Figura 21). Os
spins sofrem ao do campo B1 e o
resultado , ento, detectado. O sinal

A RESSONNCIA MAGNTICA
NUCLEAR EM DUAS
DIMENSES
Nas ltimas quatro dcadas, a realizao de experimentos de RMN em
vrias dimenses elevou sobremaneira
a capacidade de resoluo dessa tcnica, ampliando, conseqentemente, os
seus horizontes de aplicao. A RMN
em duas dimenses (RMN-2D) foi proposta em 1971,16 e hoje representa uma
58

Figura 16: Blindagem e desblindagem de um ncleo

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 21 - julho/agosto 2001

Figura 17: Tringulo

de Pascal mostrando a
intensidade relativa dos
picos para diferentes
valores de multiplicidade (n+1): para um
tripleto, n=2; para um
quarteto, n=3; e assim
por diante.

Figura 18: Constante de Acoplamento (J)

detectado no domnio temporal (FID)

transformado para o domnio das
freqncias mediante a transformada
de Fourier e o espectro resultante um
grfico de amplitude x freqncia,
chamado unidimensional porque apenas um dos eixos corresponde a freqncias de absoro (Figura 15).
Em um experimento bidimensional, vlido o mesmo diagrama temporal (Figura 20). A principal diferena que existem obrigatoriamente dois
perodos variveis: o tempo de evoluo (t1, que em um experimento 1D
pode ser zero) e o tempo de aquisio
(t2). Fazendo-se uma srie de experimentos nos quais variem progressivamente os valores do tempo de evoluo, desde zero at t1, tem-se duas
variaes no domnio temporal: uma
devida a t1 e outra devida a t2. Se uma
srie de FIDs for detectada a partir
desses experimentos nos quais se variam os valores de t1, a transformada de
Fourier ao longo de t2 dessas diferentes
FIDs fornecer uma srie de espectros
1D. Se uma outra transformada de
Fourier for realizada ao longo de t1,
ento poderemos obter um espectro
bidimensional, com sinais observados

ao longo de duas dimenses, F1 e F2.18

Dessa forma, informaes complexas, que antes apareciam em apenas
uma dimenso (por exemplo, hidrognios em ambientes qumicos semelhantes que apresentam deslocamentos qumicos muito prximos, o que
pode levar superposio de sinais),
aparecem agora em duas dimenses,
facilitando a interpretao do espectro
para determinao da estrutura molecular.
O espectro bidimensional resultante pode ser representado de duas formas: o grfico superposto (stacked),
que mostra o espectro em trs dimenses (F1, F2 e intensidade); e o grfico
de contorno, que representa um corte
horizontal do grfico stacked. Esse
corte selecionado pelo prprio usurio de acordo com a intensidade que
se deseja obter. O corte leva a um
grfico bidimensional F1 x F2 (Figuras
22, 23).
Embora o grfico stacked seja mais
fcil de ser visualizado, , entretanto,
mais difcil de ser analisado, uma vez
que interpretao em trs dimenses
se torna mais complexa. Por isso, um
corte transversal que gera um grfico

de contornos (Figuras 22, 23)

muito mais utilizado, j que com ele
se obtm um diagrama bastante claro, constitudo por linhas de contorno que so bem mais convenientes
de ser analisadas.
Existem hoje diferentes tipos de
experimentos em RMN multidimensional (2D e 3D) que utilizam diferentes recursos tanto em termos de
software como de hardware.13
Experimentos menos recentes
tambm continuam sendo muito utilizados para elucidao estrutural.
Os experimentos COSY (Correlated
SpectroscopY) e HETCOR (HETeronuclear CORrelation) so exemplos
disso. O espectro COSY fornece correlaes para o mesmo ncleo (por
exemplo, 1H com 1H, Figura 22). O
espectro de 1H aparece ao longo da
diagonal. Os pontos fora dessa diagonal representam correlaes entre
hidrognios no-equivalentes e so
denominados cross-peaks.
Os cross-peaks, como mostra a
Figura 22, devem, obrigatoriamente, formar um tringulo retngulo
com relao aos picos correspondentes na diagonal, em razo da
simetria do espectro, dado de grande
importncia na interpretao do espectro, pois uma garantia de que os
picos realmente esto acoplando.
Caso no seja formado um tringulo
retngulo, pode-se garantir que os
picos em anlise no esto acoplando. Alm disso, o experimento COSY
apresenta tambm a vantagem de
obter os valores das contantes de
acoplamento J em unidades de freqncia Hz, o que representa mais
uma garantia do acoplamento entre
os picos que esto sendo analisados.
No caso do espectro obtido pelo
experimento HETCOR (Figura 23),
o espectro no aparece na diagonal.
Em uma dimenso, aparece o espectro do hidrognio, por exemplo, enquanto em outra dimenso aparece
o espectro do outro ncleo (no caso
do espectro da Figura 23, o outro
ncleo o de carbono-13). O espectro bidimensional mostra as correlaes existentes entre os dois ncleos
como em um grfico do tipo xy.

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 21- julho/agosto 2001

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Figura 19: Espectro de RMN-2D de uma protena (Bloch Jr. C., et al. 1998)

CONCLUSO
Apesar de relativamente recente, a
Ressonncia Magntica Nuclear j
referncia mundial para a anlise de
estruturas moleculares em diversas reas
do conhecimento. Na Bioqumica moderna, essa tcnica permitiu, de forma
indita, a investigao de estruturas
tridimensionais de biomolculas em
condies prximas do estado fisiolgico (solues aquosas). Tal fato pos-

Figura 20: Tempos

possveis em um experimento de RMN
60

sibilitou um considervel avano nos

estudos de dinmica molecular que,
antes da RMN, limitavam-se quase que
exclusivamente a dados cristalogrficos. Mesmo com todo o avano tecnolgico registrado ultimamente nesse
campo, a determinao da estrutura
tridimensional de uma biomolcula
ainda no pode ser considerada uma
tarefa trivial. As limitaes e peculiaridades dessa tcnica, bem como a gigantesca demanda imposta pelos vri-

os projetos genomas concludos neste

comeo de sculo, alm daqueles que
ainda esto por vir, indicam as dimenses do trabalho que se tem pela
frente.
De fato, vrios grupos de pesquisa
tm-se unido em consrcios (The Research Collaboratory for Structural Bioinformatics, http://www.rcsb.org/
index.html), assim como empresas de
biotecnologia (Celera Genomics; http:/
/www.celera.com/), para atacar de for-

Figura 21: Experimento de RMN em uma dimenso

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 21 - julho/agosto 2001

Morales, pelos elaborao e arte de

vrias figuras apresentadas neste artigo.
REFERNCIAS
BIBLIOGRFICAS

Figura 22: Espectro COSY do etanol

Figura 23: Espectro HETCOR do etanol

ma mais eficiente a etapa considerada
mais fascinante e desafiadora desses
vrios projetos, que a determinao
das estruturas tridimensionais de todas
as protenas sintetizadas por um dado
ser vivo, ao longo de todas as etapas
metablicas de seu desenvolvimento.
possvel que os prximos anos
testemunhem iniciativas ousadas, a
exemplo do projeto genoma humano,
na rea de determinao estrutural de
protenas, nos quais, tanto a cristolografia de raio-X quanto a RMN multidimensional devero ocupar papis de-

cisivos na obteno de estruturas 3D

em larga escala. Espera-se que o presente artigo possa dar uma contribuio, por menor que seja, nessa direo
a partir da difuso dos fundamentos
aqui apresentados e como introduo
a uma prxima publicao dedicada
exclusimente RMN de protenas.
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Jos Daniel Figueroa
Villar pelos espectros do etanol gentilmente fornecidos e a Rodrigo A.V.

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2- Farrar, T.C. (1990), Concepts
Magn. Res. 2, 55-61.
3- Farrar, T.C. (1992), Concepts
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