4.

QUANTIFICAO EM ESPECTROFOTMETRO:
Luciana Correia de Almeida Regitano

Os cidos nuclicos absorvem luz no comprimento de onda de 260 nm. Para

fazer a leitura no espectrofotmetro, normalmente se utiliza uma diluio em gua.
Para estimar a concentrao de DNA utiliza-se a seguinte relao: 1 OD260 = 50 g
DNA dupla-hlice (Regitano, 2001; Sambrook, 2002).
Dessa forma, a concentrao de DNA na amostra obtida pelo seguinte
clculo:
[DNA] = Valor da leitura em O.D. X 50 X Fator de diluio
As protenas absorvem luz no comprimento de onda de 280 nm. Sendo assim,
a relao A260/A280 fornece um parmetro de avaliao da qualidade das
preparaes de cidos nuclicos. Valores inferiores a 1,8 resultam de contaminao
com protena.
Utilize o espao abaixo para anotar o resultado da quantificao:
Amostra

OD260

OD280

Razo

Concentrao

A concentrao de RNA nas amostras tambm ser avaliada por

espectrofotometria, tendo uma alquota de amostra de RNA dissolvida em gua
deionizada, na proporo de 1:100 (5L de DNA: 495 L de gua deionizada

autoclavada). O grau de pureza do RNA ser estimado pela razo entre as

absorbncias medidas a 260 e 280 nm, que deve ser igual ou superior a 1,75
(Sambrook, 2002). Para uma amostra de RNA pura tem-se que: OD260/OD280 = 1,8 a
2,0. Uma densidade ptica igual 1,0 corresponde a 40 g de RNA (fita simples) por
mL. Desta forma a concentrao de RNA na amostra pode ser calculada atravs da
seguinte relao:
Concentrao de RNA (g/mL) = OD260 X Fator de diluio (100) X 40
Utilize o espao abaixo para anotar o resultado da quantificao:
Amostra

OD260

OD280

Razo

Concentrao