Enzimas PDF

Enzimas: mecanismo, cinética y regulación
➢ Concepto y clasificación
 Propiedades y características
 Clasificación de enzimas
 Velocidad y orden de reacción
➢ Mecanismo de acción de las enzimas

 Energía de activación y velocidad de reacción
 Sitio activo y energía de unión
 Mecanismos de catálisis
 Coenzimas y cofactores
➢ Cinética enzimática
 Modelo de Michaelis-Menten
 Cinética mutisustrato
 Mecanismos de inhibición
➢ Regulación de la actividad enzimática

 Mecanismos generales de regulación
 Regulación alostérica y cooperatividad
 Regulación de rutas metabólicas
Para © Enrique Castro
Los trabajos de terceros
2011 Enrique Castro retienen su licencia original 1
Propiedades de los enzimas
Propiedades de los enzimas
➢Proteínas
• Ribozimas son excepción
➢Catalizadores
• No alteran la posición del equilibrio (Keq, ΔG)
➢Eficacia
• Aceleran enormemente la velocidad de reacción
➢Especificidad Papaína: inespecífica

• Una única reacción Tripsina: muy específica (R,K)
• Sin reacciones colaterales Trombina: absolutamente específica
(R en secuencia definida)
• No absoluta: varios sustratos
➢Estereoselectivas
• Complementariedad 3D
DHAP GA3P
2011 Enrique Castro Dihidroxiacetona-fosfato L-gliceraldehído-3-fosfato 2
Nomenclatura y clasificación de enzimas
Nomenclatura y clasificación de enzimas
➢Clases
•
➢Subclases
•
D-Glucosa + ATP D-Glucosa-6-P + ADP
1: Oxidoreductasas
• H: Deshidrogenasas Hexoquinasa
• O2 : Oxigenasas (mono-, di-) ATP:glucosa fosfotransferasa
EC 2.7.1.1
2: Transferasa
2: Transferasas
• P: quinasas
7: Fosfotransferasa
• NH2: aminotransferasas
1: grupo aceptor -OH
(transaminasas) 1: compuesto aceptor
• Ac: acetil-transferasas
2011 Enrique Castro 3
Componentes adicionales: Cofactores
Componentes adicionales: Cofactores
➢Cofactor
• No proteico, termoestable, bajo Mrr
• Unido permentemente Covalente:
• Ión metálico esencial para catálisis grupo prostético
Cofactores aportan Holo-enzima =

reactividad química especial apo-enzima + cofactor
Xantina oxidasa
➢Coenzima
• Molécula orgánica esencial para catálisis
• Unión transitoria: co-sustrato

Curvas de progreso de reacción
Curvas de progreso de reacción
k1 Constante
Keq A P de velocidad
k-1
d [ A] d [P]
v = − = = k 1⋅[ A] − k −1⋅[ P ]
dt dt
Curva exponencial
Ecuación de velocidad
[ A]=[ A]0⋅e−kt
En el equilibrio
no hay más reacción neta: vA→P = vP→A
k 1 [ P ]eq
v eq = k 1⋅[ A]eq − k −1⋅[ P ]eq =0 ; K eq = =
k −1 [ A]eq
➢Velocidad inicial
• Elimina dependencia de [P] v0
d [ A]0 d [ P ]0
v0 = − = = k 1⋅[ A]0 − k −1⋅[ P ]0
dt dt
[P]0=0 v0
v 0 = k 1⋅[ A]0
Velocidad y orden de reacción
Velocidad y orden de reacción
➢Reacciones de orden 0 k d [ P]
A P v 0= = k [k] = M·s-1
• No depende de [A] dt
➢Reacciones de 1er orden (orden 1)

• Dependencia lineal de [A]
k
A P
−d [ A] [k] = s-1
v0= =k⋅[ A]
dt
[ A]
ln  =−kt ; [ A]=[ A]0⋅e−kt
[ A]0
➢Reacciones de 2º orden (orden 2)

• Reacciones bimoleculares reales
Pseudo 1er orden
k d[P] • [B] constante (ej. Agua)
A+B P v 0= = k⋅[ A][ B] [k] = M-1·s-1
dt d [ P]
v 0= =k [ B]⋅[ A]=k '⋅[ A]
k d [P] dt
2A P v 0= = k⋅[ A]2
dt k ' =k [ B]
• Etapa limitante monomolecular
k
A+A A + A*
k'
A* P
2011 Enrique Castro k>>k' 6


Energía de activación y catálisis
Energía de activación y catálisis
0 [P]
 G S  P = G  RT ln   Keq, ΔGº indican dirección de la reacción
[S]
 G 0=−RT⋅ln  K eq  NO indican si ocurre rápidamente
k B T RTG Catalizador reduce ΔG‡

Ecuación de Eyring k = ⋅e
h sin afectar a ΔGO
Ei
Distribución Ni g
de Boltzmann = i⋅e k BT
N Z
ΔG‡ indica velocidad de la reacción

Centro activo
Centro activo
➢Región catalítica especializada Centro activo de Lisozima
• Hendidura 3D superficial (unión S) Proteína =
• Volumen reducido andamiaje para
centro activo en
posición
➢Microentorno único
• Agua excluída (salvo reactiva)
• pKa especiales
➢Multiplicidad de enlaces débiles

• Energía de unión alta (15-50 kJ·mol-1)
• Kd baja (10-2-10-9 M)
Unión de sustrato
a RNasa
➢Especificidad=complementariedad
• Forma 3D complementaria E-S
• Enlace direccionales
• Llave en cerradura / Ajuste inducido
Mecanismos generales de catálisis (1)
➢Estabilización del estado de transición
• Desolvatación del sustrato (sustituye por unión ES)
• Distorsión del sustrato (“tensión” similar a TS)
• Alineamiento de grupos catalíticos
• Reducción de entropía de reactivos Estado de
transición
Energía de unión:
ΔH: Múltiples enlaces débiles E-S
ΔS: Alineamiento adecuado
La energía de unión ΔGB reduce

la energía de activación ΔG‡

Catálisis: unión al estado de transición
Catálisis: unión al estado de transición
Efectos entrópicos: alienamiento de grupos
Efectos entrópicos: alienamiento de grupos
ΔG=ΔH – TΔS
Reducción de ΔS
requiere
inversión en ΔH
ΔH:
Red de enlaces débiles E-S

➢Catálisis ácido-base general
• Aporte/secuestro de H+ o pares e-
• Ionización de grupos
• Ataques nucleofílicos a >C=O
Estado de transición
Sustrato
(péptido)
➢Catálisis redox
• Cofactores redox: grupos oxidantes/reductores
X: grupo del enzima
➢Catálisis covalente H2O rápido
A—B A+B A—B + X: A—X + B:
• Intermediario unido al enzima lento
• Ruta alternativa H2O
A—X A + X:
rápido
➢Catálisis por iones metálicos

• Reactividad especial de orbitales d Mg:complejo de
Enlaces de coordinación coordinación octaédrico
Actividad redox (6 O)
Unión ES: especificidad y estereoselectividad
Unión ES: especificidad y estereoselectividad
➢Complementariedad enzima-sustrato
• Llave en cerradura (Fischer)
• Estereoselectividad: unión a 3 sitios
lisozima Hexasacárido substrato
Encaje inducido en la hexoquinasa

➢Ajuste inducido
• Complementario al unirse (Koshland)
• Energía de unión : cambio conformacional
Inactiva
aa catalíticos Activa
descolocados aa catalíticos en posición 14
2011 Enrique Castro
Mecanismos catalíticos: Anhidrasa carbónica
Mecanismos catalíticos: Anhidrasa carbónica
pKa(H2O) = 14
CO2 + HO —
HCO3 2— A pH 7 [HO—]= 10-7 M
[HO—]/[H2O] = 10-7/55.5 ≈ 2·10-9
Dramático aumento
de acidez de H2O
pKa = 7
Transfiere H+
B: a superficie
de proteína
BH+ (y al medio)
Estabilización
por par iónico
Mecanismos catalíticos: serínproteasas

Coenzimas de nicotinamida
Coenzimas de nicotinamida
Nicotinamida Nicotinamida
oxidada reducida
Nicotinamida adenina dinucleótido, NAD+
Pliege de Rossmann
en la ADH de hígado
Lactato + NAD+ Piruvato + NADH + H+

AMP
adenina H+
2'P en NADP
NAD+ NADH
• Coenzimas difusibles
• Unión transitoria al enzima
• Co-sustratos

Vitaminas B3
Vitaminas B3
Coenzimas de flavina
Coenzimas de flavina
Riboflavina
vit. B2
Ac. Succínico
FAD
FADH2
Ac. Fumárico
• Coenzimas no difusibles
• Unión firme al enzima
• Grupo prostético (covalente)
Actividad enzimática: Dependencia de T y pH
Actividad enzimática: Dependencia de T y pH
➢Dependencia de T V T 10 Curva bifásica asimétrica
• Energía cinética molecular Q 10 =
VT
• Q10 Desnaturalización
• Estabilidad de la proteína térmica
Ea
Ecuación de RT
Arrhenius
k = A⋅e
20 40 60 80 100
T, ºC
➢Dependencia del pH
• Titulación de grupos ionizables esenciales
(Henderson-Hasselbalch) Grupo Grupo
desprotonado protonado
• pKa aa catalíticos
catalítico catalítico
• Estabilidad de la proteína
Curva acampanada
simétrica


Cinética enzimática: curva hiperbólica y saturación
Cinética enzimática: curva hiperbólica y saturación
Saturación: Vmax
v no aumenta al [S]
v ≠ k⋅[ A]n
Curva de velocidad Saturación implica

no canónica unión enzima-sustrato
k⋅[ S ]
v =
k ' [S ]
E+S E·S P+E
Etapa rápida Etapa lenta

cuasi-equilibrio limitante, acúmulo ES
Cinética de MichaelisMenten
Cinética de MichaelisMenten
k1 k2
E+S ES P+E
k-1 1ª simplificación: v0
A t=0, [P]=0 y k-2 no afecta
d [P]
= v 0 = k 2⋅[ ES ]
dt
d [ ES ] 2ª simplificación: Estado estacionario
=k 1 [ E ]T −[ ES ][ S ] − k −1⋅[ ES ] − k 2⋅[ ES ]=0 [ES] no varía (k1>>k2) Permite calcular [ES]
dt
k 1 [ E ]T [S ] [ E ]T [ S ] VMax: V cuando [S]∞
[ ES ]= ; [ ES ]=
k 1 [S ] k 2 k −1 k k
[S ] 2 −1
k1
k 2 [ E ]T [S ]
v 0=k 2⋅[ ES ]=
k k
[S ] 2 −1 [S] >> KM
k1
k 2 k −1 Orden 0
K M=
k1
V max=k 2⋅[ E ]T
[S] << KM
V ⋅[S ]
v 0 = max Orden 1
K M [S ]
Ecuación de Michaelis-Menten
KM: [S] a la que V=½Vmax
Parámetros cinéticos: K
Parámetros cinéticos: KMM, V
, Vmax
max
y k
y kcat
cat
➢Constante de Michaelis, KM
• Afinidad E-S
• Kd de ES
k 2k −1 k −1
Si k2<< k-1 K M = ≃ =Kd
k1 k1
Alta KM, baja afinidad
Baja KM, alta afinidad
➢Velocidad máxima, Vmax unidades Vmax mide actividad

• Saturación. V max =k 2⋅[ E ]T • Usuales: μmol/min = UI
enzimática, [E]T
• SI: catal = mol/s
• Actividad enzimática: [E]T
➢Constante catalítica, kcat

• k de paso limitante P
• 1er orden: Nº de recambio
V max
k cat = Kcat: nº de molécula S
[ E ]T
convertidas por segundo
Límite de velocidad: Eficiencia catalítica
Límite de velocidad: Eficiencia catalítica
k1 k2 Constante bimolecular
E+S ES P+E de 2º orden
k-1
Velocidad máxima bimolecular:
k cat⋅[ E ]T [ S ] k Límite de difusión (nº choques)
v 0= Si [S] << KM v 0= cat ⋅[ E ]T [ S ] vdifusion=108-109 M-1·s-1.
K M [S ] KM
kcat baja kcat elevada

• KM debe ser bajo
k cat • KM no puede ser bajo
 v diffusion
• Alta afinidad ES KM • Afinidad ES limitada
KM baja KM alta
• alta afinidad, disociación lenta • Baja afinidad, disociación rápida
• kcat lenta • kcat rápida

Gráfico de LineweaverBurke
Gráfico de LineweaverBurke
V max⋅[ S ] 1 K M [S ]
v 0= ; =
1/v0, (μmol/min)-1
K M [S ] v 0 V max⋅[S ]
1 KM [S ] p=KM/Vmax
= 
v 0 V max⋅[ S ] V max⋅[ S ]
1 KM 1 1
= ⋅ 
v 0 V max [ S ] V max 1/Vmax
KM 1
Y= ⋅X 
V max V max
1/[S], mM-1
-1/KM
Gráfico de EadieHofstee
Gráfico de EadieHofstee
V max⋅[ S ]
v 0=
K M [S ] Vmax
v 0⋅K M v 0⋅[ S ]=V max⋅[S ]

v0, (μmol/min)
KM
v 0⋅ v 0=V max
[S ]
v
v 0 =−K M⋅ 0 V max p= -KM
[S ] Vmax/KM
v
v 0 =−K M⋅ 0 V max
[S ]
v0/[S],
Y =−K M⋅X V max
(μmol/min)/mM

Mecanismo de reacciones bisustrato
Mecanismo de reacciones bisustrato
➢Mecanismo secuencial ordenado
•
➢Mecanismo secuencial al azar

•
➢Mecanismo ping-pong
•
Cinética de reacciones bisustrato
Cinética de reacciones bisustrato
➢Reacciones secuenciales
• Ordenadas / al azar
• Complejo ternario EAB
1/v0
1/[A]
➢Reacciones ping-pong
• Ordenadas
1/v0
• Sin complejo ternario EAB

• Intermediario enzima modificada
1/[A]
Mecanismos de inhibición
Mecanismos de inhibición
➢ Inhibición reversible Eliminación del inhibidor Análogos del estado
• Competitivos restaura actividad enzimática de transición
• Muy baja KM (KI)
• Acompetitivos
• Competitivos
• No-competitivos: puros/mixtos
Inhibidor en equilbrio con E E +I EI
KI
KI: constante de [ E ]⋅[ I ]
KI=
disociación de EI [ EI ]
[I ]
=1
KI
➢ Inhibición irreversible
• Agentes desnaturalizantes Fármacos inhibidores irreversibles
• Reactivos de centro activo • Penicilina / transpeptidasa bacteriana
• Inhibidores suicidas • Aspirina / COX
• Disulfiram / AlDH (alcohol)
Efectos cinéticos
• Vmax (kcat o [E]T) H2O +O2
Venenos inhibidores irreversibles
• KM • Inhibidores AchE (organofosforados)
H2O2
• Amanitina / RNApol
Inhibidores suicidas
• Alopurinol / Xantina oxidasa
• 5-Fluorouracilo / Timidilato sintasa Inactivación enzimática permanente
• Deprenil / MAO Recuperación requiere biosíntesis
Inhibición irreversible: bloqueo aa activo
Inhibición irreversible: bloqueo aa activo
➢Cisteín-enzimas
• Agentes S-alquilantes
(iodoacetato, pCl-Hg-benzoato)
I2 antiséptico
➢Serín-enzimas
• Organofosfatos Intoxicación
por pesticidas
Reactivación por
pralidoxima

Inhibición irreversible dirigida
Inhibición irreversible dirigida
Inhibición competitiva
Inhibición competitiva
I se une a E: EI E+ S ES P +E
Excluye unión S +
I
KI=
[ E ]⋅[ I ] V max⋅[ S ]
[ EI ] KI v0 =
[I ]
⋅K M [ S ]
=1 Fármacos inhibidores competitivos
KI EI • Metotrexato / DHF reductasa
• Ibuprofeno / COX
• Sildenafilo / PDE V
1 ⋅K M 1 1 • Estatinas /β-HMGCoA reductasa
= ⋅  v
v 0 V max [ S ] V max v 0=−⋅K M⋅ 0 V max
[S ]
Vmax constante
KMap 
1/v0, (μmol/min)-1
+I 
Vmaxap =
v0, (μmol/min)
I=0 ap [I ] p= -KM
K M = K M⋅1 
KI
ap
1/Vmax V max =V max
constante I=0
p=KM/Vmax
+I 
Inhibición superable
1/[S], mM-1 por aumento de S v0/[S],
-1/KM Vmax/KM
(μmol/min)/mM
Inhibidores enzimáticos análogos de sustrato
Inhibidores enzimáticos análogos de sustrato
Análogo del sustrato

de la DHF reductasa humana
Análogo del sustrato

de la DHPS bacteriana
Inhibición acompetitiva
Inhibición acompetitiva
I se une E+ S ES P +E
sólo a ES: ESI +
I V max
[ E ]⋅[ I ] ⋅[ S ]
KI= 
EI KI v0=
[I ] KM
=1
KI [ S ]
ES I  Fármacos inhibidores acompetitivos
• Camptotecina / Topo I; etopósido / Topo II
• Análogos 2º sustrato secuencial/ping-pong
1 KM 1  K M v 0 V max
= ⋅  v 0=− ⋅ 
v 0 V max [S ] V max  [S ] 
+I  KMap 
1/v0, (μmol/min)-1
p=KM/Vmax Vmaxap 
+I  I=0
v0, (μmol/min)
I=0 ap KM
KM= p= -KM/
[I]
1 
/Vmax KI
V max Vmax/KM
V ap
max= Vmax/
[I]
1 
KI
1/[S], mM-1 v0/[S],
-/KM (μmol/min)/mM
Inhibición no competitiva pura
Inhibición no competitiva pura
E+ S ES P +E
I se une a E y ES
+ +
I I
KI=
[ E ]⋅[ I ] V max
[ EI ] KI KI ⋅[ S ]

=1
[I ] v0 =
KI EI+S ES I
K M [ S ] Fármacos inhibidores no-competitivos
• Digoxina / Na+ /K+-ATPasa
•Tacrina / AchE
• Análogos alostéricos
1 ⋅K M 1  v V
= ⋅  v 0=−K M⋅ 0  max
v 0 V max [ S ] V max [S] 
KMap = Vmax/
1/v0, (μmol/min)-1
+I  Vmaxap 
v0, (μmol/min)
K ap p= -KM
I=0 M=K M
constante
V max
/Vmax V ap
max=
[I]
1  I=0
p=KM/Vmax KI
+I 
Inhibición insuperable
1/[S], mM-1 por aumento de S v0/[S],
-1/KM constante Vmax/KM
(μmol/min)/mM
Inhibición no competitiva mixta
Inhibición no competitiva mixta
k2
E+ S ES P +E
I se une a E y ES
+ + [ ES ]⋅[ I ]
I I K ' I = [ ESI ]
[ E ]⋅[ I ]
KI= [I]
[ EI ] KI K'I  ' =1
[I ] K 'I
=1
KI
k'2 V max
EI+S ES I P +E ⋅[ S ]
'
v0=
1 ⋅K M 1 ' KM
= ⋅  [ S ]
v 0 V max [ S ] V max '
KMap 
1/v0, (μmol/min)-1
+I 
Vmaxap 
I=0 [I]
1 
'/Vmax ap KI
K M = K M⋅
[I]
p=KM/Vmax 1 
K 'I
ap V max
V max = Inhibición insuperable
[I ] por aumento de S
1/[S], mM-1 1 
-'/KM K 'I


Mecanismos genéricos de regulación enzimática
Mecanismos genéricos de regulación enzimática
➢Regulación alostérica Efectos homotrópicos Efectos heterotrópicos
• Modulador se une a otro sitio • Sustrato actuando en otro sitio • Efector <> Sustrato
• Usualmente ⊕ • Tanto ⊕⊖
• Regula KM o kcat
Activador heterotrópico:
aumenta unión de sustrato
➢Regulación covalente
Quinasas
• Mod. Reversible
Señalización
• Proteolisis (irreversible)
Inhibidor heterotrópico:
Zimógenos pancreáticos dificulta unión de sustrato
Coagulación
Caspasas apoptóticas
➢Regulación de la Expresión biosíntesis degradación

• Inducción/represión gen [Proteína] aa
• Ubiquitinación: degradación Expresión es un
• Expresión diferencial de isoenzimas estado estacionario
Regulación alostérica: cooperatividad
Regulación alostérica: cooperatividad
Cooperatividad cinética
Cooperatividad cinética
Cinética no michaeliana Análisis de cooperatividad:
(sigmoidal) representación de Hill
Vmax
½Vmax
K0.5

Cinética cooperativa
Cinética cooperativa
➢ K enzimas ➢ V enzimas
• Efector modula KM • Efector modula Vmax
Cinética sigmoidal:
activación/inactivación
como interruptor
(switch-like)
Modelos de cooperatividad
Modelos de cooperatividad
➢Modelo concertado
• Dos estados conformacionales
• Efector cambia equilibrio T-R
• Inhibidor T, activador R
➢Modelo secuencial
• Subunidades cambian separadamente
• Múltiples formas en equilibrio
Equilibrio R-T
L = T/R Stryer p. 282 fig. 10,15

Reg. por modificación covalente reversible
Reg. por modificación covalente reversible
➢Uso regulador
• Reversible
• Modula actividad
➢Uso no regulador Acilación

• Activación constitutiva Farnesilación
-carboxilación
• Anclaje
sulfatación
Funciones específicas
2011 Enrique Castro no reguladoras 45
Fosforilación como mecanismo regulador
Fosforilación como mecanismo regulador
➢Enzimas modificadoras de proteínas Pi:
• Quinasas / fosfatasas • 2 cargas, 3 pdh, tetraédrico
• Actividad / unión (capacidad enlazante, reorganización)
• Reacción rápida
• ATP ubicuo
➢Dianas fosforilables ΔG≈-25 kJ/mol

• Múltiples sitios de fosforilación Proteína quinasa Δratio P/D x104
• Cambio estado conformacional
• Actividad / unión
Forma Forma
desfosforilada fosforilada
Fosforilación ≠ activación • Actividad enzimática

Proteína fosfatasa • Capacidad de unión
terminación de la señal •Reclutamiento
•Translocación
MKKK
➢Organización en cascada ⊕ A amplificación
señal
⊕ B
• Activación secuencial x10
• Amplificación MKK A*
10
B* ⊕ C
100
MAPK
C*
2011 Enrique Castro 1000 46
Secuencias diana de fosforilación
Secuencias diana de fosforilación
Cada quinasa fosforila -OH
en secuencias específicas
• S/T: quinasas efectoras

• Y: transducción
• H: quinasas efectoras
Cada proteína puede

contener múltiples dianas
para varias quinasas
➢ Múltiples efectos
• P constitutiva
• Localización secuestro
• Activación/inactivación
• Magnitud variable
PKA: ejemplo de enzima reguladora
PKA: ejemplo de enzima reguladora
 PKA AKAP localiza R
• Heterotetrámero R2C2
• 4 sitios cAMP, cooperativos
• S/T-quinasa
• Diana RRpS/T
Subunidades R Secuencia —RRGAI—

ligan 4 cAMP pseudosustrato Subunidades R
(cooperativo) Inhiben a sub. C
Centro catalítico
Activación cooperativa libre, activo
100%-
Actividad quinasa
Subunidades C
sigmoidal Fosforilan dianas
50%- ≈10 µM
proteína proteína
Umbral de
activación -RRpS/T- -RRpS/T-
ATP ADP
[cAMP]i OH O- Pi
Fosforilación de proteínas diana
2011 Enrique Castro (secuencia específica) 48
Reg. por proteolisis: zimógenos pancreáticos
Reg. por proteolisis: zimógenos pancreáticos
Zimógenos inactivos
(Gránulos de almacenamiento)
Activación proteolítica
(extracelular)
Activación
por proteolisis Feedback ⊕
en cascada explosivo
Proteolisis re-posiciona
el centro activo
Activación por proteolisis: coagulación
Activación por proteolisis: coagulación
Proteasa
Fibrinógeno
activa
Dom. 
Proteasa Dom. 
inactiva
Proteolisis
Activación por trombina Fibrinopéptidos
AyB
por proteolisis
en cascada GHR
Monómero
de fibrina
GPR
Polimerización fibrina
• Unión  - GHR
• Unión  - GPR

Isoenzimas como mecanismo regulador
Isoenzimas como mecanismo regulador
➢Isoenzimas Hexoquinasas I-III
• KM Gluc baja (0.1 mM, alta afinidad)
• Igual reacción
Ajuste fino del metabolismo • Inhibición por producto
• Diferente cinética
en cada tejido o compartimento
• Diferente localización Hexoquinas IV (glucoquinasa)
• Diferente expresión • KM Gluc alta (10 mM, alta afinidad)
• SIN inhibición por producto
LDH H4 LDH M4
• KM Lac baja (alta afinidad) • KM Lac alta (baja afinidad) Recambio de isoenzimas LDH
• Inhibición alostérica Pyr • No efecto alostérico Pyr en corazón
(adaptación a aerobio)
Lac Pyr Pyr Lac
NAD+ NADH NADH NAD+

Adaptado Adaptado
producción aerobia Pyr producción anaerobia Lac
Regulación de rutas metabólicas
Regulación de rutas metabólicas
retroalimentación
➢Enzimas reguladas/reguladoras
• Reacciones más lentas (paso limitante)
• Inicio/ramificación/fin de rutas
(etapa de compromiso)
•Regular actividad
•Regular expresión Paso
limitante
retroalimentación
➢Retroalimentación (feedback)
• Usualmente negativo
• Precursores ⊕ / Productos finales ⊖
➢Compartimentación
• Separar tras membranas
• Regulación independiente en zonas g
• Transporte regulado
g'
Etapa de
compromiso

Enzimas como marcadores
Enzimas como marcadores
➢Ensayos enzimáticos
• Medida Vmax (conocer KM)
• Identificació de isoenzimas (selectividad tisular)
CPK3
CPK2

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Enzimas: mecanismo, cinética y regulación

➢ Mecanismo de acción de las enzimas

➢ Regulación de la actividad enzimática

➢Especificidad Papaína: inespecífica

2011 Enrique Castro 3

Cofactores aportan Holo-enzima =

2011 Enrique Castro 4

2011 Enrique Castro 5

➢Reacciones de 1er orden (orden 1)

➢Reacciones de 2º orden (orden 2)

➢ Mecanismo de acción de las enzimas

➢ Regulación de la actividad enzimática

2011 Enrique Castro 7

k B T RTG Catalizador reduce ΔG‡

ΔG‡ indica velocidad de la reacción

➢Multiplicidad de enlaces débiles

La energía de unión ΔGB reduce

2011 Enrique Castro 10

2011 Enrique Castro 11

2011 Enrique Castro 12

➢Catálisis por iones metálicos

lisozima Hexasacárido substrato

Encaje inducido en la hexoquinasa

2011 Enrique Castro 15

2011 Enrique Castro 16

2011 Enrique Castro 17

Lactato + NAD+ Piruvato + NADH + H+

2011 Enrique Castro 18

2011 Enrique Castro 19

2011 Enrique Castro 21

➢ Mecanismo de acción de las enzimas

2011 Enrique Castro 22

Curva de velocidad Saturación implica

E+S E·S P+E

Etapa rápida Etapa lenta

2011 Enrique Castro 23

➢Velocidad máxima, Vmax unidades Vmax mide actividad

➢Constante catalítica, kcat

2011 Enrique Castro 25

kcat baja kcat elevada

2011 Enrique Castro 26

2011 Enrique Castro 27

v 0⋅K M v 0⋅[ S ]=V max⋅[S ]

2011 Enrique Castro 28

➢Mecanismo secuencial al azar

2011 Enrique Castro 29

• Sin complejo ternario EAB

2011 Enrique Castro 32

2011 Enrique Castro 33

Análogo del sustrato

Análogo del sustrato

➢ Mecanismo de acción de las enzimas

➢ Regulación de la actividad enzimática

2011 Enrique Castro 39

➢Regulación de la Expresión biosíntesis degradación

2011 Enrique Castro 41

2011 Enrique Castro 42

2011 Enrique Castro 43

2011 Enrique Castro 44

➢Uso no regulador Acilación

➢Dianas fosforilables ΔG≈-25 kJ/mol

Fosforilación ≠ activación • Actividad enzimática

• S/T: quinasas efectoras