10.14450/2318-9312.v27.e4.a2015.

pp221-225

Artigo Original

A inibio do sistema conservante de duas

emulses o/a por polissorbato 80
Inhibition of the preservative system of two o/w emulsions by polysorbate 80
Recebido em:
Aceito em:

09/10/2015
27/11/2015

Thalles Yuri Loiola VASCONCELOS, Dbora Patrcia

Feitosa MEDEIROS, Aristides vilo do NASCIMENTO
Instituto Superior de Teologia Aplicada. Rua Coronel Antonio Rodrigues
Magalhes, Bairro Dom Expedito Lopes, 359. Sobral, Cear, Brasil. E-mail:
farmacia.escola@inta.edu.br

ABSTRACT
The inhibition of growth of microorganisms due to the bacteriostatic or fungistatic effect of the formulation may cause
a false-negative result in microbiological analysis. Thus, the evaluation of the inhibitory capacity of the preservatives
present in the sample is critical to an effective microbiological evaluation. The tests were performed to prove the absence
of the inhibitory effect on the growth of microorganisms due to the inhibitory activity of these components. Inhibition of
the formulation preservative effect was carried out by two methods: by the addition of 0.4 % polysorbate 80 and dilution.
The sample was prepared using 10 g of each sample in 90 mL of 0.9 % saline, resulting in a 1:10 dilution. Also, it was
added 0.4 % polysorbate 80 in saline solution to neutralize the parabens and imidazolidine in the formulations. The
neutralization of the inhibitory effect was performed by using 0.4% polysorbate 80 and 1:10 dilution. It observed the
growth of the following microorganisms: Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, and Pseudomonas aeruginosa
in all samples and the positive control, meaning the inactivation of the inhibitory effect of preservatives
Keywords: cosmetic; cosmetic additives; cosmetic stability; parabens; polysorbates

RESUMO
A inibio do crescimento de microrganismos devido ao efeito bacteriosttico ou fungisttico da formulao pode ocasionar
um resultado falso-negativo na anlise microbiolgica. Assim, a avaliao da capacidade inibitria dos conservantes
presentes nas amostras fundamental para uma avaliao microbiolgica eficaz. Os ensaios foram realizados com
objetivo de comprovar a ausncia do efeito inibitrio no crescimento de microrganismos decorrente da atividade inibitria
desses componentes. A inibio do efeito conservante da formulao foi realizada utilizando dois mtodos: por adio de
polissorbato 80 a 0,4 % e por diluio. Foram utilizados 10 g de cada amostra em 90 mL de salina a 0,9 %, resultando
em uma diluio 1:10. Foi adicionado tambm polissorbato 80 a 0,4 % na soluo salina com objetivo de neutralizar os
parabenos e imidazolidinilureia nas formulaes. A neutralizao do efeito inibitrio foi realizada usando polissorbato 80 a
0,4 % e da diluio 1:10. Foi observado o crescimento dos seguintes micro-organismos: Staphylococcus aureus, Salmonella
typhimurium e Pseudomonas aeruginosa em todas as amostras e no controle positivo, significando a inativao do efeito
inibitrio das substncias conservantes.
Palavras chave: cosmticos; aditivos em cosmticos; estabilidade de cosmticos; parabenos; polissorbatos

221

INTRODUO
O mercado brasileiro na rea de cosmticos est
entre os mais importantes do mundo, caracterizando uma
populao vaidosa que considera os produtos cosmticos
como essenciais. Esse segmento teve incio a partir da segunda metade do sculo XX at chegar entre os trs maiores mercados do mundo do incio do sculo XXI (1,2).
Segundo a Associao Brasileira da Indstria de Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosmticos (3), a populao
brasileira uma das mais vaidosas, o que justifica a posio
do Brasil (9,5 %) atrs apenas da China (9,7 %) e dos Estados Unidos da Amrica (16,1 %) no que se refere a esse
bem de consumo, estando frente de pases como Japo
(8,6 %), Alemanha (4,2 %) e Frana (3,7 %).
Os avanos cientficos e tecnolgicos em recentes
dcadas permitiram um melhor desenvolvimento e controle
desses produtos. Sua fabricao baseia-se no binmio eficcia e segurana, pois alm de desempenhar suas propriedades, esses produtos devem ter segurana no seu uso,
sem causar efeitos indesejveis (4, 5).
E para garantir que esses requisitos sejam cumpridos, necessrio executar testes para avaliar as condies
fsicas, qumicas e microbiolgicas (6). A qualidade de
cosmticos e produtos farmacuticos est relacionada com
o grau de conformidade com os requisitos e padres mnimos estabelecidos pela Resoluo da Diretoria Colegiada
(RDC) n 481, de 23 de setembro de 1999, que estabelece
os limites microbiolgicos para produtos de higiene pessoal, cosmticos e perfumes, descritos no Quadro 1 (7,8).
Para a obteno de cosmtico de boa qualidade microbiolgica torna-se necessrio no s a ausncia de microrganismos patognicos, mas tambm a garantia que a

carga microbiana no patognica seja a menor possvel e

que as concentraes dos agentes estejam dentro das concentraes legalmente permitidas.
Para atingir uma boa estabilidade microbiolgica
fundamental que os mecanismos responsveis pela contaminao sejam identificados. Os meios de contaminao
mais comuns so: a gua, o ambiente, o ar, a matria-prima,
os equipamentos e, principalmente, o manipulador (8, 9).
A gua a principal matria-prima da indstria cosmtica (10) e a sua presena, alm de componentes orgnicos na formulao, favorece o crescimento microbiolgico.
Em alguns casos, estes afetam a estabilidade do produto,
devido presena de ons, bem como a contaminao microbiana, o que justifica a avaliao microbiolgica desses
produtos (11).
A fim de garantir a qualidade microbiolgica ideal
de produtos cosmticos, a Farmacopeia Brasileira 5 edio
preconiza a realizao de alguns testes, entre eles a contagem microbiana e a identificao de micro-organismos
patgenos (12). A contagem microbiana procura determinar o total nmero de micro-organismos mesfilos aerbios
totais. A identificao de microrganismos patgenos apenas
identifica crescimento ou ausncia de crescimento de determinados micro-organismos. Alm disso, outro fator importante que o mtodo utilizado seja validado para cada
produto analisado (12,13,14). Porm, antes da realizao
dos testes microbiolgicos, necessria a neutralizao de
substncias conservantes ou antimicrobianas que possam
estar presentes na amostra. Esses conservantes so utilizados em produtos cosmticos no estreis para evitar o crescimento microbiolgico. Entre os mais conhecidos esto
os parabenos (metilparabeno e propilparabeno), cloreto de
benzalcnio, fenis, entre outros (15).

Quadro 1. Parmetros de controle microbiolgico para os produtos de higiene pessoal, cosmticos e perfume, de acordo com a RDC n
481/1999 (7)

Tipo

II

rea de aplicao e faixa

etria

Produtos para uso infantil;

rodutos para rea dos olhos;
produtos que entram em contato
com mucosas

Demais produtos susceptveis

contaminao microbiolgica

Limites de aceitabilidade
a) Contagem de microrganismos mesfilos aerbios totais , no mais que
102 UFC/g ou mL. Limite mximo 5 x 102 UFC/g ou mL
b) Ausncia de Pseudomonas aerugiosa em 1 g ou 1 mL
c) Ausncia de Staphylococcus aureus em 1 g ou 1 mL
d) Ausncia de Coliformes totais e fecais em 1 g ou 1 mL
e) Ausncia de Clostridium sulfito redutor em 1 g (exclusivamente para
talcos).
a) Contagem de micro-organismos mesfilos aerbios totais, no mais que
103 UFC/g ou mL. Limite mximo 5 x 103 UFC/g ou mL
b) Ausncia de Pseudomonas aeruginosa em 1 g ou 1 mL
c) Ausncia de Staphylococcus aureus em 1 g ou 1 mL
d) Ausncia de Coliformes totais e fecais em 1 g ou 1 mL
e) Ausncia de Clostrdium sulfito redutor em 1g (exclusivamente para
talcos)

222

Diversas substncias possuem a funo de neutralizar determinados agentes conservantes em produtos

cosmticos e farmacuticos. Para a neutralizao dos parabenos, o compndio nacional indica a utilizao de polissorbato 80 em substituio ao polissorbato 20 preconizado
pelo compndio americano e com concentrao 10 vezes
inferior (0,4 % p/v). Os polissorbatos, alm de possuir ao
neutralizante dos conservantes, so agentes emulsificantes
e so amplamente utilizados na produo de diversos produtos cosmticos (11,13,16). A neutralizao de substncias antimicrobianas presentes na amostra necessria uma
vez que a presena de conservantes pode inibir o crescimento microbiano, impedindo desse modo a determinao
precisa do nmero total de colnias presente na amostra, ou
a presena de microrganismos patgenos (17).
Assim, a avaliao do potencial do polissorbato 80
para neutralizar o agente conservante um fator que vai
provar a eficcia da anlise microbiolgica.
O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito
neutralizante do polissorbato 80 a 0,4 % em amostras de
duas emulses leo-em-gua, para posterior avaliao da
qualidade microbiolgica de cosmtico nos quais so empregados.

MATERIAIS E MTODOS
O objeto deste estudo foram dois tipos de emulses
leo-em-gua, uma do tipo aninica e outra do tipo no inica. Os componentes de cada uma das formulaes esto
descritos na Tabelas 1.
componentes

(%)
NI

EDTA sdico (Dinmica, Lote: G0743)

0,1

0,1

metilparabeno (Mcassab, Lote: Ah1511)

0,2

0,2

gua purificada

75,9

69,9

glicerina (Anastcio, Lote: 17294)

3,0

3,0

butilidroxitolueno (Dinmica, Lote:

57235)

0,1

0,1

propilparabeno (Farmos, Lote: Jj1911)

0,1

0,1

cera auto-emulsionante no inica

(Farmos, Lote: Pe41184)

16,0

16,0

estearato de octila (AQIA, LOTE:

PF40621)

2,0

8,0

ciclometicona (Emfal, Lote:

220200190/13)

2,0

2,0

0,6

0,6

fase aquosa

fase oleosa

fase complementar
soluo de imidazolidinilureia 50%
(Akema, Lote: A15m705)

Obteno e Padronizao de Suspenso de Patgenos: Em cada tubo contendo 5 mL de caldo BHI (BD
BBL Brain Heart Infusion, Lote: 3092285) previamente
esterilizado foram inoculadas as cepas dos seguintes microrganismos: Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) e Salmonella typhimurium (ATCC 14028), provenientes de cultura em estoque.
Em seguida os tubos foram incubados a 37 C durante 24
horas.
Preparo das amostras: Foram preparados 6 tubos
com 8 mL de soluo salina 0,9 % e polissorbato 80 0,4 %;
3 tubos com 9 mL de soluo salina 0,9 % e polissorbato 80
0,4 %; e 90 mL de soluo salina 0,9 % e polissorbato 80 0,4
% em frasco reagente. Aps esse procedimento, os tubos e
o frasco reagente contendo os diluentes foram esterilizados
por calor mido em autoclave por 15 minutos a 121 C.
Foram adicionados 10 g de cada emulso, separadamente, em bequer, e adicionados 90 mL de soluo salina 0,9
% e polissorbato 80 0,4 % previamente esterilizados, produzindo uma diluio 1:10 aps agitao constante. O mtodo
empregado foi seguido conforme descrito na Farmacopeia
Brasileira 5a ed. (12), diferindo apenas em relao aos componentes neutralizantes (foi utilizado apenas o polissorbato 80
0,4 %).
Avaliao da atividade anibitria: uma alquota de
1 mL da suspenso de S. aureus foi transferida para dois
tubos, cada um contendo 8 mL de soluo salina 0,9 % e
polissorbato 80 0,4 %. Aos tubos foi adicionado 1 mL de
cada emulso (aninica e no-inica) adiluda na proporo 1:10, separadamente. O mesmo procedimento foi realizado para S. typhimurium e P. aeruginosa. Como controles
positivos, 1 mL da suspenso de cada um dos microrganismos patognicos foi transferida, separadamente, para tubos
de ensaio, cada um contendo 9 mL de soluo salina 0,9 %
e polissorbato 80 0,4 %.
Os tubos foram incubados a 37 C por 24 horas em estufa. Ao trmino do perodo de incubao, os resultados foram
lidos pela presena ou no de turvao, indicando crescimento
pela turvao (microrganismos ativos) ou ausncia de crescimento pela ausncia de turvao (microrganismos inativados).

RESULTADOS E DISCUSSO
O resultado do teste de avaliao da capacidade
inibitria dos conservantes das emulses revelou o crescimento de microrganismos patognicos nas emulses diludas e no controle positivo. Desse modo o polissorbato
80 0,4 %, juntamente com a diluio 1:10 das amostras, se
mostrou adequado para neutralizar a ao dos parabenos e
da imidazolidinilureia presentes nas formulaes.
A inibio do crescimento microbiano devido ao
efeito bacteriosttico ou fungisttico de componentes presentes na formulao pode ocasionar resultado falso-negativo nas tcnicas de contagem microbiana, dependentes da

223

formao de colnias ou da presena de turvao para a

deteco de contaminantes.
Nesse trabalho foram utilizados dois recursos para
a neutralizao do sistema conservante das duas emulses:
a diluio (1:10), visando a neutralizao da imidazolidinilureia e a adio, suspenso salina, de substncias
inativantes especficas, tais como o polissorbato 80 0,4 %
(m/v), visando a neutralizao qumica dos parabenos (metilparabeno e propilparabeno), contidos nas formulaes.
Considerando a no-interferncia das substncias neutralizadoras, assim como da diluio utilizada, no crescimento
microbiano, a ausncia da atividade inibitria dos componentes antimicrobianos do produto no mtodo de identificao adotado pode ser constatada na Tabela 2, para a
diluio 1:10 e para todos os microrganismos empregados.

Microrganismos

Creme
Base
Aninico

Creme
Base
NoInico

Controle
Positivo

Controle
Negativo

Staphylococcus
aureus

neutralizao adequada (20). Em estudo de Garcia (2014),

foi utilizado tambm o polissorbato 80 para inativao dos
parabenos para posterior anlise microbiolgica de uma loo fotoprotetora (21).
Bou-Chacra e Ohara (2003) neutralizaram os conservantes em preparaes cosmticas de base lipoflica
utilizando o polissorbato 20 4 % e lecitina 0,5 % (13). Em
contrapartida, Ramos (2010), para a neutralizao qumica, utilizou o polissorbato 80 0,4 % e lecitina 0,5 % em
diluio 1:10. Porm essa metodologia no foi satisfatria
para neutralizao dos conservantes de duas formulaes
estudadas. Desse modo, a concentrao dos neutralizantes
foi alterada para polissorbato 80 3 % e lecitina de soja
0,3 %, alm de diluio 1:100, sendo esta mais adequada
inativao dos conservantes presentes nas duas formulaes. Shaqra e cols (2001) utilizaram o polissorbato 80
1 % para neutralizao dos conservantes presentes em 16
formulaes diferentes de xampus. De forma semelhante,
Moura e cols (2011) utilizaram o polissorbato 80 1 % em
associao com tampo fosfato de potssio pH 7,2 para a
neutralizao dos parabenos de uma amostra de gel contendo extrato hidroalcolico de Schinus terebinthifolius
(23).

Pseudomonas
aeruginosa

CONCLUSO

Salmonella
typhimurium

Os testes realizados indicaram que o mtodo utilizado foi adequado para neutralizar a ao dos conservantes,
pois foi visvel o crescimento microbiano atravs da turvao. importante a utilizao de substncias para neutralizar a ao de componentes de formulaes que apresentem atividade antimicrobiana. Aps a confirmao da
capacidade inibitria do polissorbato 80, possvel realizar
outras avaliaes microbiolgicas com maior confiabilidade, pois foi comprovado que os componentes conservantes
das amostras esto neutralizados e no iro resultar em um
desfecho falso-negativo. Com referncia ao mtodo adotado, a diluio 1:10 foi considerada adequada para a pesquisa dos seguintes microrganismos patognicos especficos: Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa e
Staphylococcus aureus. Dessa forma, houve crescimento
microbiano nas duas bases na presena de polissorbato 80
0,4 %, apresentando assim, eficcia na neutralizao dos
parabenos e da imidazolidinilureia por meio de neutralizao qumica e pela diluio.

Tabela 2. Avaliao do crescimento bacteriano nas emulses aninica

e no inica adicionadas de soluo de polissorbato 80 0,4%

C: houve crescimento bacteriano (turvao); N: No houve

crescimento bacteriano (ausncia de turvao)

Foi observada a presena de turvao, indicativo de

crescimento microbiano, em todas as amostras contendo
creme base aninico e creme base no-inico. As amostras foram comparadas ao controle positivo, sendo possvel
confirmar o crescimento de microrganismos patognicos.
Alguns autores tm comprovado a eficcia do polissorbato 80 em diversas concentraes na neutralizao
de conservantes como o metilparabeno e o propilparabeno
(18,19). Em alguns estudos, como o estudo de Bou-Chacra
e Ohara (2003) e o estudo de Marques e Moreira (2009),
a associao de polissorbato 80 com a lecitina de soja
utilizada (9,13).
De forma semelhante ao presente trabalho, Shaqra e
Al-Shawagfeh (2012), neutralizaram a ao dos conservantes em uma preparao anticida utilizando o polissorbato
80 0,5 % (18). Marques e Moreira (2009) utilizaram uma
associao de polissorbato 80 3 % e lecitina 0,3 % para
inativao dos conservantes presentes em formulaes fotoprotetoras (9). De forma semelhante, Sharif-Abad e cols
(2015) utilizaram a associao de polissorbato 80 3 % e
lecitina 0,5 % para neutralizao do efeito antimicrobiano de cinco amostras de protetores solares, ambos obtendo

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AGRADECIMENTOS
Deixo expressos os agradecimentos Farmcia Escola e ao Ncleo de Bioprospeco e Experimentao Molecular Aplicada (NUBEM) das Faculdades INTA.

REFERNCIAS
1. Capanema LXL, Velasco LOM, Filho PLP, Noguti MB.
Panorama da Indstria de Higiene Pessoal, Perfumaria e
Cosmticos. BNDES Setorial, 2007;(25):132-56.
2. CRF-PR. Manual de Diretrizes Indstria Cosmtica. Comisso de Industria Farmacutica. Conselho Regional de
Farmcia do Estado do Paran.2012. 59p.
3. ABIHPEC. Panorama do setor de Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosmticos. Associao Brasileira da Indstria de
Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosmticos. 2014. 23p.
4. Carvalho A, Meurer V, Pinto T, Yamamoto C. Controle de
qualidade microbiolgica de produtos farmacuticos, cosmticos e fitoterpicos produzidos na Zona da Mata. In:
Anais do 2 Congresso Brasileiro de Extenso Universitria. 2004. Belo Horizonte: UFMG; 2004.
5. Heemann ACW, Guarda CC, Paula D, Siebenrok EN, Bareta GMS, Justi JS, Chociai JG, Semes S, Reple SIF. Guia
da profisso farmacutica: Indstria de produtos de higiene pessoal, cosmticos e perfumes. Conselho Regional de
Farmcia do Estado do Paran. 1 ed. 2010. 23p
6. Itah AY, Udokpoh AE, Ofum MU. Bacteriological quality of some pharmaceutical products marketed by drugs
vendors in Uyo, Nigeria. Afr. J. Health Sci. 2004. 11(34):128-133. DOI: 10.4314/ajhs.v11i3.30789.
7. BRASIL. Agencia Nacional de Vigilancia Sanitaria. Resolucao RDC n 481, de 23 de setembro de 1999. Estabelece
os parmetros de controle microbiolgico para os produtos de higiene pessoal, cosmticos e perfumes.
8. Silva CHPM, Netto H. Contaminao Microbiana em produtos Cosmticos e Seu Controle. Science News. 2002.
1(2):5-7.
9. Marques MC, Moreira LM. Anlise microbiolgica de protetor solar manipulado nas farmcias magistrais do municpio de Ipatinga/MG. Rev. Bras. Farm. 2009. 90(1):137143.
10. Rebello TFS. Boas Prticas. gua. Cosmet. Toiletries.
2001. 13(3):24.
11. Anvisa. Guia de estabilidade de produtos cosmticos. Srie Qualidade em Cosmtico.Vol. 1. Agncia Nacional de
Vigilncia Sanitria. 2004. 52p.
12. BRASIL. Farmacopeia Brasileira. 5 edio, Vol. 1 e 2.
Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Braslia: Anvisa, 2010.
13. Bou-Chacra NA, Ohara MT. Validao de mtodo para
avaliao da qualidade sanitria de preparao cosmtica

de base lipfila. Rev. Bras. Cienc. Farm. 2003. 39(2):18594. DOI: 10.1590/S15163322003000200009
14. USP. The United States Pharmacopeia Convention. United
States Pharmacopeia. 30. ed. Rockville, 2007.
15. Tariq M, Naveed A, Ali KB, Akhtar R, Shoaib KHM. Fabrication, physicochemical characterization and preliminary
efficacy evaluation of a W/O/W multiple emulsion loaded with 5% green tea extract. Braz. J. Pharm. Sci. 2013.
49(2):341-9. DOI: 10.1590/S1984-82502013000200016.
16. Pramanick S, Singodia D, Chandel V. Excipient Selection
In Parenteral Formulation Development. Pharm Times.
2013. 45(3):65-77.
17. Andrade APA, Oliveira SB, Arajo CMC, Grangeiro PM,
Ramos JS, Vieira SV. Development and validation of a
microbial counting method for mebendazole oral suspension. Braz. J. Pharm. Sci. 2011. 47(3):555-63. DOI:
10.1590/S19842502011000300013
18. Shaqra QMA, Al-Shawagfeh M. Assessment of the harmonized preservatives effecacy test in oral liquid pharmaceutical preparations using reference and none reference test microorganisms. Asian J Pharm Clin Res. 2012.
5(2):141-4.
19. Shaqra QMA, Mashni Y, Al-Momani W. Microbiological quality and in use preservative capacity of shampoo
preparations manufactured in Jordan. Jordan. J. Biol. Sci.
2011. 4(2):113-8.
20. Sharif-Abad NS, Saeedi M, Enayatifard R, Morteza-Semnani K, Akbari J. Evaluation of microbial content of some
sunscreen creams in Irans Market. Int J Pharm Biomed
Res. 2015. 1(2):30-4.
21. Garcia LU. Avaliao da estabilidade fsico-qumica, microbiolgica e determinao do FPS de uma loo fotoprotetora. (Trabalho de Concluso de Curso). Fortaleza:
Universidade Federal do Cear: Curso de Farmcia, Faculdade de Farmcia, Odontologia e Enfermagem. 2014.
22. Ramos SVV. Validao da metodologia analtica aplicada ao controle microbiolgico de formas farmacuticas
lquidas e determinao da eficcia de conservantes (Dissertao). Recife: Universidade Federal de Pernambuco,
Departamento de Cincias Farmacuticas. 2010.
23. Moura TFAL, Rafn FN, Santos ALR. Evaluation of a preservative system in a gel containing hydroalcoholic extract
of Schinus terebinthifolius. Rev. Bras. Farmacogn. 2011.
21(3):532-6. DOI:10.1590/S010295X201100500010

225