Universidad Regional Amazonica IKIAM

BIOLOGIA I
Practica N5
Deteccin de Gram+ y Gram- a travs de la Tincin Diferencial

Autores: Quinteros Cevallos Ral Alejandro & Alvarado Castro Joao Gabriel
Primer Semestre
Grupo 3

Introduccin
El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de
ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la
clula y el medio que la rodea. El modo ms simple de aumentar el contraste es la
utilizacin de colorantes.
El mtodo de tincin diferencial ms importante usado en bacteriologa es la
tincin de Gram, llamada as en honor al Dr. Hans Christian Gram. Este mtodo divide
las bacterias en dos grandes grupos, las Gram-negativas y las Gram-positivas. Esto es
esencial para la clasificacin y diferenciacin de microorganismos. (Santambrosio,
Ortega, & Garibaldi, 2009). La reaccin a la tincin de Gram est basada en la
diferencia en la composicin qumica de la pared celular bacteriana. Las bacterias
Grampositivas tienen una gruesa capa de peptidoglicano o murena, mientras que esta
capa es ms fina en las Gram-negativas y est rodeada por una bicapa lipdica externa.
El Peptidoglicano es un polisacrido formado por dos subunidades qumicas, Nacetilglucosamina y cido Nacetilmurmico. (Jaime, 2010).
La tincin diferencial requiere el uso de al menos 3 reactivos qumicos que se
aplican en secuencia a un frotis fijado por calor. El primer reactivo es llamado tincin
primaria o colorante primario. Su funcin es impartir color a todas las clulas. Con el
objetivo de establecer un contraste de color, el segundo reactivo usado es un agente
decolorante, el cual puede decolorar la clula completa o solo parte de ella. El reactivo
final, el colorante de contraste, le da a las clulas decoloradas un color que contrasta con
el del colorante primario. El colorante de contraste no puede ser absorbido por clulas
que no han perdido el colorante primario. De esta manera, tipos de clulas o sus

estructuras se pueden distinguir unas de otras en funcin del colorante que es absorbido.
(Jaime, 2010).
El presente trabajo prctico tiene por objetivo brindar herramientas bsicas para
diferenciar entre dos grupos principales de bacterias: Gram+ y Gram-, y la base terica
y qumica de los procedimientos de tincin diferencial.
Materiales:
Microscopio ptico
Portaobjetos (6)
Mechero
Guantes
Papel de absorcin
Papel de lentes
Aceite de inmersin
Hisopo
Pinzas
Agua (de la llave o destilada)
Muestras (Cultivos)
Cultivo bacteriano 1 (Ecoli)
Cultivo bacteriano 2 (Elecremoli)
Yogurt
Reactivos
Cristal Violeta Gram
Yodo Gram
Alcohol-Cetona
Safranina Gram

Indicaciones de Bioseguridad antes de comenzar la Prctica

Cualquier tipo de prctica que se necesite el manejo de microorganismos
tenemos que practicar tcnicas de esterilidad.

Mantn libre y ordenada tu zona de trabajo, sin cuadernos, mochilas o cualquier

elemento externo que pueda estorbar y resultar contaminado.

Usa mandil y guantes.
Los cultivos de bacterias slo pueden ser abiertos cerca del mechero.
Depositar los materiales utilizados en un recipiente con cloro.
Lavar tus manos con jabn antes de salir del laboratorio.

Procedimiento
1. Se marcaron los seis portaobjetos para cada muestra, limitando el lugar donde se
iba a observar con el microscopio
2. Se introdujo el hisopo en la muestra (que se vaya a utilizar) para esparcirla en
lugar donde se marc en el portaobjetos. A esto se le conoce como preparacin
de frotis.
3. Se dej secar el frotis y luego se fij la muestra bacteriana utilizando calor
(mechero), se pas dos o tres veces el portaobjetos con nuestra muestra a travs
de la llama.
4. Se coloc el colorante primario (Cristal Violeta), dejndolo teir durante un
minuto. Se removi el tinte gentilmente con agua para no daar nuestra muestra.
5. Se coloc el mordiente (Yodo Gram), se lo dejo durante un minuto sobre nuestra
muestra.
6. Para decolorar el mordiente se utiliz alcohol-cetona. lo mximo que puede estar
el alcohol-cetona en la muestra es 10 segundos, por tal se enjuago
inmediatamente con agua.
7. Se cubri el portaobjetos con la tincin de contraste (Safranina Gram),
dejndolo sobre la muestra durante un minuto. Se lav con agua gentilmente el
tinte para no daar nuestra muestra.
8. Se dej secar el portaobjetos con la muestra (para adelantar el secado se lo puede
hacer cuidadosamente, sin tocar el lugar que marcamos para observar, con papel
de absorcin)
9. Prendemos el microscopio para poder observar nuestra muestra
10. Colocamos el portaobjeto con nuestra muestra.

11. Una vez ya enfocada nuestra muestra con la lente de 40x, procedemos a agregar
aceite de inmersin para observarla con la lente de 100x
12. Se repiti los mismos pasos (2 11) para las 6 muestras.

Resultados
Tabla 1: Observacin de la muestra de yogurt
Resolucin
100x

Fotografa

Muestra
Yogurt

Tipo de Gram
Gram+

Tabla 2: Observacin de la muestra del cultivo bacteriano 1

Resolucin
100x

Fotografa
No vimos

Muestra
Ecoli

Tipo de Gram
Gram+

Tabla 3: Observacin de la muestra del cultivo bacteriano 2

Resolucin
100x

Fotografa

Muestra
Elecremoli

Tipo de Gram
Gram-

Tabla 4: Observacin de la muestra de

Resolucin
100x

Fotografa
No vimos

Muestra

Tipo de Gram
Gram

Tabla 5: Observacin de la muestra de

Resolucin
100x

Fotografa
No vimos

Muestra

Tipo de Gram
Gram

Muestra

Tipo de Gram
Gram

Tabla6: Observacin de la muestra de

Resolucin
100x

Fotografa
No vimos

Discusin
Al realizar la tcnica de tincin se pueden obtener dos posibles resultados los cuales
dependen directamente de la composicin estructural de las paredes celulares de lo cual
ya se mencion en la introduccin de este documento. Como ya se conoce existen dos
grandes grupos de bacterias; las bacterias Gram positivas poseen una gruesa capa de
peptedoclinaco y dos clases de cidos teicoicos. Por el contrario la capa de
peptidoglicanos de las Gram negativas es delgada se encuentra unida a una segunda
membrana plasmtica exterior de composicin distinta a la interna por medio de
lipoprotenas (Q.F.B. de Fes-Cuautitln-UNAM Mxico, 2011).
El cristal-violeta al tener afinidad con sustancias cargadas negativamente como la
pared celular de las bacterias se adhiere a ambos grupos de bacterias y las tie de color
violeta. Para fijar el color violeta o azul a las bacterias se utiliza el Yodo de Lugol que
acta como mordiente; tambin hace que el color violeta no se disuelva y lo mantiene
incluso luego del enjuagado(Dr Fox & Dr.Figueroa, s.f.).
El mordiente es un agente oxidante y este ayuda a acidificar los cidos teicoicos lo que
aumenta la afinidad por el colorante bsico que sera el cristal-violeta. Luego el papel
que tiene el alcohol cetona es el de decolorar, y lo que hace es quitarle el color a las
Gram positivas disolviendo el cristal violeta de su pared celular ya que la capa de
peptidoglicano que poseen es muy delgada (Ing.Santambrosio & Ing.Ortega, 2009). En
cuanto a las Gram positivas, el alcohol-cetona deshidrata la pared que tiene una gran
cantidad de peptidoglicano cerrando sus poros y haciendo el papel de una barrera la cual
impide que la coloracin se disuelva, tambin se debe a que las Gram positivas tienen
cidos teicoicos los cuales son poco solubles en alcohol-cetona. Por el contrario en la

pared de las Gram negativas al tener una mayor cantidad de lpidos (si son disueltos por
el alcohol-cetona), stos dejan escapar el cristal violeta.
Por otra parte, la safranina al ser un colorante catinico sirve para teir aquellas
bacterias las cuales no pudieron retener el cristal violeta (Gram negativas), ste no
interacta con las Gram positivas ya que estn sobresaturadas de cristal violeta
(Ing.Santambrosio & Ing.Ortega, 2009).
Conclusin

Preguntas

Bibliografa
Jaime, E. (2010). DIAGNSTICO DE LAS INFECCIONES. Obtenido de PDF:
http://www.helicobacterspain.com/congresos/j-esteban.pdf
Santambrosio, E., Ortega, M., & Garibaldi, P. (2009). Tincin y observacin
de microorganismos.. Obtenido de PDF:
http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecn
ologia/practico4.pdf