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COLABORADORES:
2011
CURSO DE CROMATOGRAFIA A GS
Cromatografia um mtodo fsico de separao, em que os componentes da amostra a serem separados
so distribudos entre duas fases, uma estacionria e a outra que se move em uma direo definida. Na
cromatografia gasosa, a fase mvel sempre um gs inerte, pois o processo feito em temperatura
acima do ponto de ebulio do soluto, e o uso de um gs inerte previne a ocorrncia de reaes
indesejveis entre o soluto e a fase mvel.
O PROCESSO DA SEPARAO CROMATOGRFICA
O processo de separao cromatogrfica resultado de repetidos processos de adsoro e dessoro
durante o movimento dos analitos. A separao ocorre devido s diferenas na distribuio de cada
componente entre as duas fases. H duas teorias para explicar o fenmeno cromatogrfico: a formao
de pratos tericos e a separao dinmica (Equao de Van Deemter).
A TEORIA DOS PRATOS TERICOS
uma analogia com o fenmeno de destilao. O prato terico a altura equivalente de um processo de
equilbrio do soluto distribuindo-se entre cada fase e que depende fundamentalmente do processo de
partio. No equilbrio:
Ki =
Ki =
(1)
mi (fm) / Vfm
Onde (Ki) o coeficiente de partio do analito (i), (m) e (V) so massa e volume e (fe) e (fm) indicam
fase estacionria e fase mvel, respectivamente. Logo:
Ki
m i (fe )
Vfe
=
= ki
Vfm
m i (fm )
(2)
A razo entre as massas dita fator de capacidade do analito i (ki), pois expressa o quanto de massa de
cada analito se acomoda na fase estacionria, em relao massa que fica na fase mvel. Quanto maior
o ki, mais massa a coluna acomoda, o que significa maior espessura de fase estacionria ou mais
afinidade do soluto pela fase estacionria. A razo entre os volumes das fases chamada de (), logo:
ki = Ki x
(3)
(4)
(5)
A frao do soluto na fase mvel tem a velocidade da fase mvel. A frao na fase estacionria tem
velocidade zero. A velocidade mdia a velocidade de cada frao, multiplicada pelo valor da frao:
u(mdia) = f1u1+...+fnun
(6)
Como s h duas fraes e uma delas tem velocidade zero, a velocidade mdia do soluto ser:
u(mdia) =
1
u(mvel )
1+ ki
(7)
Se no houvesse a partio, o soluto teria a velocidade da fase mvel. Logo, a frao do soluto na fase
mvel, [1/(1+ki)] a frao que expressa a diminuio na velocidade do composto em relao
velocidade do gs de arraste, sempre menor ou igual a 1.
Convm notar que, quando k aumenta, o tempo de reteno tambm aumenta e a velocidade diminui. k
diretamente proporcional ao tempo e inversamente proporcional velocidade.
Deve-se enfatizar que molculas de mesma espcie no se separam ao longo da coluna. O processo de
troca dinmico: a molcula na fase estacionria vai para a fase mvel e a molcula na fase mvel vai
para a fase estacionria a todo o momento. Logo, o conjunto de mesma espcie move-se na velocidade
mdia caracterstica da espcie, que depende da fase estacionria, da presso e da temperatura.
O espalhamento ocorre, no entanto, por causa do processo de troca
com a fase estacionria e pelo fato de que as molculas de um gs
tm uma distribuio de velocidades, como visto na teoria cintica
dos gases. Esse espalhamento d origem a um formato gaussiano na
distribuio espacial das molculas, o pico cromatogrfico.
Volume de reteno (VR) o volume de fase mvel requerido para eluir um soluto at o mximo do pico.
O tempo de reteno (tR) o tempo para se chegar a esse mximo, contado desde a injeo. Logo:
VR = fluxo x tR
(8)
O tempo de reteno de um composto que no ficasse retido na fase estacionria (k = 0) seria igual ao
tempo que a fase mvel gasta para percorrer a coluna. O volume associado a esse tempo o prprio
volume da fase mvel na coluna (VM).
VM = fluxo x tM
(9)
A velocidade mdia do soluto no-retido (uM) o comprimento da coluna (L) sobre o tempo desse soluto:
uM (mdia) = L/tM
(10)
(11)
No confunda fluxo com velocidade linear, pois o fluxo depende do dimetro da coluna e dimetros
maiores permitem fluxos maiores, mesmo que a velocidade linear seja igual. Por (7), deduzimos:
us
t
V
1
=
= M = M
uM 1 + k i
tR
VR
(12)
Logo, o fator de capacidade (ki) de uma substncia pode ser calculado experimentalmente a partir do
tempo de reteno da fase mvel (ou do composto no-retido) e do tempo de reteno do composto em
estudo naquela coluna, nas condies em que ele est sendo analisado. Por ltimo, podemos estabelecer
que o aumento do tempo de reteno (tR) em relao ao tempo da fase mvel (tM) tambm
influenciado pelo fator de capacidade:
tR = tM (1 + ki)
(13)
Veremos mais adiante que, no caso da cromatografia gasosa, as presses utilizadas na entrada e na
sada da coluna e a temperatura tambm influenciam no processo cromatogrfico.
O MECANISMO DE SEPARAO
Se 2 solutos tm diferentes coeficientes de partio, logo tm diferentes fatores de capacidade (k1 e k2),
os tempos de reteno so distintos e pode-se deduzir a diferena entre eles usando (14):
tR1 tR2 = tM (1 + k1) tM (1 + k2)
tR1 tR2 = tM (k1 k2)
(14)
natural
que
de
todo
chamaremos
pico
de
espalhamento entrpico.
Convm ressaltar que, uma vez separados, os
picos no voltam a se mesclar. A 2 dupla do
cromatograma mostrado NO o que vai
acontecer com a 1 dupla no decorrer do
tempo, pois os picos da 1 dupla podero
alargar, mas estaro ainda mais separados
quando chegarem na posio da 2 dupla.
Todos esses processos se do em sucessivos estgios de equilbrio, de acordo com a teoria dos pratos
tericos. Vistos os principais parmetros cromatogrficos, vamos estabelecer a relao entre esses
parmetros e os tais pratos tericos.
Nos pratos, tericos ou no, de uma coluna de destilao, a separao
ocorre em sucessivas etapas de destilao. Mas existem colunas em que
os pratos no so aparentes. Essas colunas podem, no entanto, ser
comparadas com colunas de destilao de pratos, como na figura ao
lado, e podemos, desse modo, estabelecer seus pratos tericos: se
observarmos que determinada coluna de destilao tem o dobro de
poder de separao de outra coluna com 5 pratos, podemos dizer que ela
tem 10 pratos tericos.
Se a coluna cromatogrfica, por efetuar processos de separao, pode ser comparada com colunas de
destilao, o n de pratos tericos d o poder de separao da coluna. Mais ainda, a altura equivalente
de cada prato terico diz muito sobre o poder de separao de cada fase estacionria. Fases com altura
equivalente pequena tm grande poder de separao, pois tm mais pratos por metro de coluna.
A matemtica que deduz a equao que calcula o nmero de pratos tericos para cada soluto est alm
do escopo do nosso curso, de forma que a equao no ser deduzida, mas apenas apresentada:
t
N = 16 R
W
t
N = 2,354 R
W
1/2
(16)
2
= 5,54 t R
W1 / 2
(17)
W a largura do pico e W1/2 a largura do pico na meia-altura em segundos, que mais fcil de medir,
pois difcil precisar onde comea e termina o pico na distribuio gaussiana. A altura equivalente de
cada prato (H) ento:
H = L/N
(18)
A seletividade () de uma fase estacionria em relao a dois solutos A e B dada pela razo entre os
coeficientes de partio dos dois solutos A e B, ou seja: = KA/KB, onde KA KB e 1.
RESOLUO CROMATOGRFICA
A resoluo cromatogrfica entre dois compostos (Rs) no
pode ser dada apenas pela separao entre os mximos dos
picos, como j visto, mas tem de levar em conta tambm o
alargamento que eles sofrem. A equao que expressa a
resoluo leva em conta esses dois parmetros (separao e
alargamento):
t R 2 t R1
R s = 1,18
W1 / 2 (2) + W1 / 2 (1)
(19)
CAPACIDADE DE PICO
Estima quantos picos de mesma concentrao cabem dentro de uma coluna, todos com resoluo 1.
Leva em conta o fato de que os picos alargam ao longo do cromatograma, ainda mais que baseia-se em
condies isotrmicas, quando a corrida leva mais tempo do que na programao de temperatura. uma
medida grosseira de quantas substncias podem ser separadas em uma nica corrida em determinada
coluna, sob condies pr-determinadas.
OS PROBLEMAS DA TEORIA DOS PRATOS TERICOS
A teoria dos pratos tericos no oferece boa descrio dos fenmenos de difuso ou da influncia de
irregularidades na distribuio da fase estacionria que ocasionam caminhos preferenciais dentro da
coluna. A equao de Van Deemter, na teoria da separao dinmica, permite incluir as propriedades da
fase em relao s afinidades com os solutos, as difusividades dos solutos, as diferenas nos coeficientes
de partio, a velocidade de deslocamento da fase mvel, a espessura de fase, a porosidade da fase e o
fluxo do gs de arraste, fatores essenciais para entender a capacidade de separao das colunas
cromatogrficas, e que no so todos contemplados pela formulao dos pratos tericos.
A EQUAO DE VAN DEEMTER
O propsito da teoria da separao dinmica ajudar a entender os processos que causam disperso na
coluna cromatogrfica e identificar as propriedades do sistema cromatogrfico que ajudam a controlar a
disperso. Essa informao facilita a escolha da melhor coluna para executar uma dada separao no
modo mais eficiente.
Na equao de Van Deemter, a altura equivalente do prato terico pode ser calculada pela expresso:
H = 2dp +
2 D g
u
kd2f
2 (1 + k ) 2 D e
(20)
determinado soluto
fator de empacotamento
dp dimetro de partcula
estacionria
H=A+
B
+ Cu
u
Onde:
A = 2 d p
(21)
B = 2 D g
C=
kd 2f
2 (1 + k ) 2 D e
H=
B
+ Cu
u
(22)
BIBLIOGRAFIA
http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/chrom_theory/
http://www.chem.agilent.com/cag/cabu/carriergas.htm
http://www.chem.uoa.gr/applets/appletchrom/appl_chrom2.html
http://www.chemkeys.com/bra/md/mds_11/cagced_2/cagced_2.htm
HTTP://WWW.CHROMATOGRAPHY-ONLINE.ORG/3/contents.html
Acessos entre 7 e 15 de agosto de 2008. Por simplicidade, inclu somente a pgina principal dos sites.
Introduction to Open Tubular Column Gas Chromatography, J. V. Hinshaw & L. S. Ettre, 1994, Advanstar
Communications, Cleveland, OH, USA.
Basic Relationships of Gas Chromatography, L. S. Ettre & J. V. Hinshaw, 1993, Advanstar
Communications, Cleveland, OH, USA.
INSTRUMENTAO O CROMATGRAFO A GS
GS DE ARRASTE: REGULADORES DE PRESSO E FLUXO
A funo do gs usado como fase mvel apenas a de carrear os componentes da amostra atravs da
coluna, sem participar dos processos de interao. Por este motivo chamado gs de arraste. Exemplos
de gases mais utilizados em CG so He, H2 e N2, os mais indicados, de acordo com a teoria da separao
dinmica (equao de Van Deemter).
O cilindro de gs normalmente possui uma vlvula que serve apenas para abrir e fechar a sada de gs.
Na sada do cilindro acopla-se um manmetro para (i) medir a presso no interior do cilindro
geralmente ao redor de 2000 psi quando cheio e (ii) reduzir a presso de sada para o sistema
cromatogrfico (entre 20 e 100 psi). Antes do cromatgrafo, podem ser interpostos filtros, que podem
servir para reter umidade, impurezas do gs de arraste etc., filtros esses que devem ser trocados
periodicamente. Alm disso, o cromatgrafo per se possui um outro estgio de regulao, que estabelece
as presses e fluxos do gs de arraste que entraro na coluna. Para calibrar todo esse sistema, utiliza-se
um bolhmetro acoplado ao final da coluna, sistema simples e eficiente de medir vazo de gs, ao
cronometrar o arraste de bolhas dentro de um tubo de vidro graduado.
Escolhe-se uma dessas bolhas e, com um cronmetro, mede-se o tempo gasto para que ela percorra
certo volume. Dividindo-se o volume percorrido pelo tempo marcado no cronmetro, obtm-se o valor do
fluxo do gs de arraste. O fluxo dividido pela rea que corresponde ao dimetro interno da coluna (seo
reta) dar a velocidade linear mdia ao longo da coluna.
Pode-se tambm medir a velocidade linear mdia atravs da injeo de um composto que tenha
baixssima interao com a coluna, de preferncia numa temperatura que negligencie mais ainda os
efeitos de interao, ou ainda variar a temperatura, mantendo o fluxo, para verificar se a interao pode
ser realmente negligenciada. Um dos compostos mais comuns para esse fim o metano.
De acordo com o manual do Agilent 6890, o cromatgrafo mais vendido da histria, os gases para
cromatografia devem estar entre 99,995 e 99,9995% de pureza. Os nveis de oxignio e hidrocarbonetos
devem ser menores que 0,5 ppm.
A INJEO DE AMOSTRA
Amostras Gasosas
Quando a amostra a ser analisada um gs temperatura ambiente, o injetor no necessita ser
aquecido, uma vez que a amostra j se encontra vaporizada. Dependendo do propsito do experimento o
volume injetado varia, em geral, de 0,1 L (colunas capilares) at um litro (colunas preparativas).
importante lembrar que, para conseguir a forma ideal dos picos e a maximizao da resoluo, empregase um volume de amostra que seja compatvel com a coluna.
Existem dois sistemas para a injeo de amostras gasosas: seringas e vlvulas.
As seringas so em sua maioria de vidro graduado com um mbolo de ao inoxidvel. A agulha, tambm
de ao inoxidvel, encontra-se colada ao vidro com epxido. Apesar de no possibilitarem a mesma
preciso apresentada pelas vlvulas de injeo, as seringas so teis para a maioria dos propsitos, alm
de baratas e altamente versteis, isto , permitem grande flexibilidade quanto ao volume a ser injetado.
Para a injeo de amostras gasosas, a seringa utilizada deve ser do tipo denominada gas tight,
apresentando vedao especial para gases, permitindo grande reprodutibilidade nas reas dos picos. Esta
vedao evita vazamentos, fato freqente na injeo de gases com seringas comuns.
As vlvulas so mais caras, mas permitem maior reprodutibilidade nas injees. Adicionalmente, so de
fcil manipulao e tambm admitem automao do sistema. Na parte (A) da figura, a amostra
empurrada at que a ala (loop), de volume fixo, seja preenchida (este volume pode ser modificado
simplesmente trocando-se a espira por outra, do volume desejado). Girando-se ento o rotor da vlvula,
o volume contido na espira injetado na coluna (parte B).
Amostras Lquidas
A grande maioria das amostras lquidas requer, para sua rpida volatilizao, que a temperatura do
injetor esteja de 20 a 30C acima da temperatura de ebulio do componente menos voltil. Os lquidos
tm elevado coeficiente de expanso quando se tornam gases, isto , a relao entre volume no estado
gasoso (VG) por volume no estado lquido (VL), ou seja, VG/VL, alta para a mesma substncia em
diferentes temperaturas. Este coeficiente elevado permite que sejam injetados pequenos volumes, o que
maximiza a resoluo do sistema, pois diminui a saturao da fase estacionria e confere uma forma
ideal aos picos eludos. O dispositivo comumente empregado para amostras lquidas a micro-seringa
com agulha hipodrmica, cujos volumes so, como j dito, altamente flexveis.
O uso de solvente + ar + amostra + ar permite que toda a amostra seja introduzida no sistema durante
a injeo e que nenhuma parte da amostra comece a correr a coluna antes do restante e que nada da
amostra fique residualmente dentro da seringa aps a injeo. A explicao para isso fica como exerccio.
O gs de arraste entra no injetor e arrasta a amostra
vaporizada por aquecimento para dentro da coluna. A amostra
introduzida atravs de um septo de material polimrico um
tampo de borracha de silicone, que veda a entrada do injetor
que perfurado por uma seringa de microlitros de
capacidade. A seringa expele a amostra dentro do liner de
vidro, desativado por silanizao e aquecido por um bloco
metlico. Aps o mbolo empurrar a amostra e a seringa ser
retirada do injetor, o septo se fecha naturalmente, impedindo a
sada do gs. O injetor possui, para diviso de fluxo, uma outra
sada, com uma vlvula que controla o quanto de amostra ser
desprezado e o quanto de amostra entrar realmente na
coluna. Junto ao septo h outra sada, para purgar vapores de
resduos de amostra, que fiquem retidos junto ao septo na
retirada da agulha.
Amostras Slidas
Apesar de existirem alternativas, a maneira mais prtica de manipular uma amostra slida em
Cromatografia Gasosa dissolv-la em um solvente apropriado e injet-la com uma seringa usada para
injeo de lquidos.
Uma das alternativas para amostras lquidas e slidas o uso de micro-extrao em fase slida (solid
phase micro-extraction, SPME), em que os vapores da amostra so adsorvidos em uma fibra apropriada e
depois dessorvidos por aquecimento dentro do injetor.
A COLUNA CROMATOGRFICA
A separao efetiva dos componentes da amostra efetuada na coluna cromatogrfica, onde a natureza
do tubo, do suporte slido, o tipo e a quantidade da fase, o mtodo de recheio, o comprimento e a
temperatura so fatores importantes para obter a resoluo desejada. Foram desenvolvidos muitos tipos
de colunas para cromatografia gasosa, porm possvel dividi-las em dois grupos principais: colunas
recheadas e colunas tubulares abertas.
O desenho do corte transversal da coluna direita omite que a parte externa coberta com uma
poliimida, que confere maior resistncia mecnica e flexibilidade coluna de slica fundida. E por isso
que as colunas capilares tm essa cor marrom caracterstica, que pode ser vista na foto esquerda.
A Fase Estacionria
A caracterstica qumica da fase estacionria (FE) influencia na qualidade de separao das substncias
que compem uma dada amostra. Pode-se escolher a fase baseando-se na polaridade da amostra que
ser eluda na coluna. Os tipos de interao que ocorrem com mais freqncia entre a substncia e a FE
so: foras de Van der Walls , interaes dipolo-dipolo e pontes de hidrognio.
Supondo uma FE lquida, onde ocorre partio, em geral os solutos polares so retidos em maior
extenso conforme a polaridade aumenta. Por outro lado, solutos no-polares so retidos em maior
extenso conforme a polaridade diminui. Tratando-se de fase apolar, os solutos apolares iro interagir de
forma semelhante, sem nenhuma seletividade especial, sendo ento separados na ordem dos seus
pontos de ebulio. Nesse ltimo caso, a presso de vapor do composto altera a partio entre fase
mvel e fase estacionria, fazendo com que os compostos de maior presso de vapor (menor ponto de
ebulio) eluam mais rapidamente.
Existe um grande nmero de lquidos que foram usados como fase estacionria, na cromatografia gslquido, e tinham especificaes determinadas, a saber:
No caso da cromatografia gs-slido, onde ocorre adsoro, substncias que so adsorvidas de forma
semelhante podem ser separadas, se apresentarem volatilidades diferentes.
Para gases fixos (O2, CO2, N2, etc.), utiliza-se separao por tamanho, em colunas de peneira molecular,
aonde as molculas que so capazes de entrar nos poros da fase estacionria slida so mais retidas do
que as molculas maiores, que no conseguem penetrar na fase estacionria (passam "por fora"). Por
essa razo, esse tipo de separao tambm chamado de cromatografia de excluso.
Na coluna capilar, a fase pode ser depositada sobre a parede interna do "tubo capilar". Para aumentar a
superfcie de contato com o soluto, trabalha-se com colunas longas (10 a 100 m). O dimetro interno
varia de 0,1 a 1 mm e a espessura do filme lquido depositado na superfcie interna do tubo capilar de
0,1 a 2,0 m.
As colunas capilares mais modernas, no entanto, trabalham com fases ligadas parede da coluna por
reaes de silanizao e que podem ainda ter reaes cruzadas entre as cadeias, ligando as cadeias
entre si. Essas fases ligadas (e entrelaadas) no so solveis, tm maior resistncia mecnica e trmica,
sendo mais resistentes ao uso. As mais comuns so as polisiloxanas (ver tabela abaixo).
POLISILOXANAS
CH3
H 3C
Si
R
O
CH3
C H3
Si
R
Si
C H3
C H3
Substituintes
Nomes Comerciais
Observaes
carborano
Dexsil 300GC
fenil 5 %
fenil 50 %
trifluoropropil 50%
OV-210 QF-1
moderadamente polar
moderadamente polar, retm compostos
carbonlicos
cianopropil 100%
altamente polar
O Controle de Temperatura
de extrema importncia o controle da temperatura da cmara de vaporizao (injetor), do forno da
coluna cromatogrfica e do detector na Cromatografia Gasosa. Cabe enfatizar que cada um dos trs
componentes exerce funo diferente no sistema cromatogrfico e desejvel que o instrumento possua
controles independentes de temperatura para cada mdulo.
A cmara de vaporizao deve ser suficientemente quente para vaporizar rapidamente a amostra e evitar
perda de eficincia na injeo, mas no decompor termicamente ou rearranjar a amostra. Um teste
rpido aumentar a temperatura da cmara de vaporizao para determinar sua adequao. Se a
eficincia da coluna ou a forma dos picos melhorarem, ser indicao de que a temperatura do injetor
estava baixa, no estava vaporizando corretamente e a entrada dos analitos estava longe de ser
instantnea. Por outro lado, uma mudana drstica na rea, forma dos picos ou tempo de reteno
indica que a temperatura ficou muito elevada e a amostra pode estar decompondo ou rearranjando.
desejvel que a temperatura da coluna enseje tempos de anlise curtos, mas seja suficientemente
baixa para que a eficincia desejada seja atingida. Para algumas amostras, quanto menor a temperatura
da coluna maior sero os coeficientes de partio na fase estacionria e uma melhor separao ser
atingida. Mas preciso enfatizar que em muitos casos no se obtm separao alguma com a coluna em
baixas temperaturas, pois isso tambm depende da natureza da fase estacionria, e uma fase
inapropriada no melhora suficientemente a separao dos componentes em qualquer temperatura.
A influncia da temperatura no detector depende consideravelmente do tipo de detector empregado.
Mas, de forma geral, o detector e sua conexo com a sada da coluna devero estar suficientemente
quentes, para evitar a condensao da amostra e/ou da matriz. Um dos efeitos que a condensao
provoca alargamento dos picos e surgimento de caudas.
figura
mostra
dois
cromatogramas: um em isoterma
e
outro
com
temperatura
programada. A programao no
precisa ser em toda corrida, mas
no
tempo
necessrio
para
ideal
compostos
que
todos
os
grau
de
tenham
torna rapidamente sobrecarregada com a amostra, o que compromete o formato dos picos e a resoluo
cromatogrfica, por que as seringas no conseguem injetar volumes adequadamente pequenos.
Isto levou ao desenvolvimento de um sistema, reprodutvel e regulvel, que descarta a maior parte da
amostra injetada aps a vaporizao (divisor de fluxo), antes de sua entrada na coluna. Desse modo, os
usurios podem trabalhar com solues de mesma concentrao que as empregadas em colunas
empacotadas. a tcnica de escolha para a anlise de solues concentradas.
No acarreta, tambm, qualquer necessidade de interveno operacional (ou conhecimento adicional)
quanto ao processo de injeo e suas variveis (temperatura do injetor e da coluna, volume injetado,
velocidade de injeo, natureza do solvente, etc.) maior do que a experincia j acumulada no trabalho
com colunas empacotadas. a mais simples das tcnicas de injeo a quente.
A variao da taxa de diviso de fluxo, da quantidade efetiva de amostra introduzida na coluna, a
temperatura do injetor e a presso no injetor so as variveis de injeo ajustadas pelo operador quando
se faz a otimizao dessa parte da anlise cromatogrfica.
- Injeo sem diviso de fluxo (splitless)
A injeo de amostras em vaporizadores com a sada do divisor de fluxo temporariamente fechada se
constitui na tcnica de injeo sem diviso de fluxo (splitless) e resulta, obviamente, na transferncia da
maior parte da amostra vaporizada no injetor para o interior da coluna. a tcnica de escolha para
anlise de amostras diludas. Infelizmente, com a sada do divisor fechada, o fluxo de gs dentro do
injetor diminui1 e os tempos de transferncia do vapor das amostras para o interior da coluna se tornam
demasiadamente longos, o que obriga a utilizao de mecanismo de reconcentrao (focalizao).
O mecanismo de reconcentrao consiste na condensao (focalizao) da amostra e do solvente no
incio da coluna, com o forno ainda frio. O subseqente aquecimento do forno cromatogrfico volatiliza
este material condensado, que eludo pelo gs carreador na coluna capilar da forma convencional, isto
, a ordem de eluio fica de acordo com a afinidade individual de cada soluto pela fase estacionria.
Neste tipo de tcnica de injeo, h necessidade de assegurar, durante a transferncia de amostra do
injetor para a coluna, condies para que ocorra a condensao do material a ser analisado, o que ocorre
por dois mecanismos distintos: pelo efeito solvente e pela captura a frio.
Efeito solvente: Trabalha-se com o forno cromatogrfico em temperaturas baixas que permitam a
Captura a frio: Neste caso no se promove a condensao do solvente, mas apenas da amostra. Isto
requer uma grande diferena de volatilidade entre solvente e soluto para efetivo funcionamento (cerca
de 80 a 100C), mas permite, em muitos casos, economizar tempo, evitando resfriar o forno
cromatogrfico a temperaturas prximas ao ambiente a cada anlise.
Se no h diviso de fluxo, todo gs tem de entrar na coluna, que capilar e tem abertura estreita. Quando h diviso, o fluxo que
entra no injetor bem maior, pois a vlvula de split estar aberta, ventilando uma parte do gs de arraste e da amostra, e
tornando o tempo de injeo mais curto.
pode causar degradao de substratos termolbeis, o que s pode ser evitado pela deposio da amostra
dentro de superfcies frias, especialmente desativadas, como o interior das prprias colunas capilares.
O sistema de injeo na coluna a frio (cold on-column) atende os requisitos de reprodutibilidade: simples
(no tem controlador de temperatura), sem componentes eltricos ou eletrnicos, sem septo e de alta
inrcia qumica, pois a amostra depositada diretamente na coluna capilar, em seu segmento inicial, j
dentro do forno cromatogrfico, que passa, assim, a comandar tambm a temperatura da injeo.
Este mtodo exige resfriamento do forno cromatogrfico em temperaturas relativamente baixas, para
evitar efeitos de discriminao na agulha e a vaporizao sbita, com conseqente ejeo de amostra
para fora da coluna. Torna-se necessrio o uso de seringas especiais, providas de agulhas extremamente
finas, que penetram dentro do exguo dimetro interno das colunas capilares.
Tabela: Caractersticas das tcnicas de injeo de amostras em colunas capilares.
Tcnica
Amostra tpica
Com diviso de
fluxo (split)
Sem diviso de
fluxo (splitless)
Coluna a frio
(cold on-column)
Soluo
conc.
termo-estvel
Soluo diluda
termo-estvel
Soluo diluda
termo-sensvel
Reprodutibilidade
Razovel
Substrato
pouco voltil
Discriminado
Efeito
matriz2
Pequeno
de
Boa
Discriminado
Muito boa
NoDiscriminado
Deteriorao
progressiva
Deteriorao
rpida
Uso de
septo
Sim
Sim
No
Substrato
termolbil
No
Recomendado
No
Recomendado
Recomendado
Quando as tcnicas com e sem diviso de fluxo so feitas com injetor automtico, a reprodutibilidade
melhora. As tcnicas on-column j tem opo de injeo automtica desde 1987.
BIBLIOGRAFIA
Preparation
and
Installation
Manual,
Agilent
6890
Series
Gas
Chromatograph,
http://www.ov.ingv.it/geochemistry/images/a15283.pdf, em 06/08/2009
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J. V. Hinshaw e L. S. Ettre, Introduction to Open-Tubular Column Gas Chromatography (Advanstar,
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Communications, Cleveland, OH, USA.
C. A. Saravalle, F. Munari, S. Trestianu; Multipurpose cold injector for high resolution gas
chromatography; Journal of High Resolution Chromatography, Volume 10, pg 288296, 1987.
Manual do cromatgrafo Agilent 6890. Disponvel em http://mmrc.caltech.edu/GCMS/6890-operatingmanual.pdf . Acesso em 05/11/2010.
2
A coluna deteriora mais rpido quando introduzimos quantidades crescentes de amostra, pois quanto mais amostra injetada, mais
substncias que atacam quimicamente a fase estacionria podero estar presentes.
OS DETECTORES
Quando um eluente diferente do gs de arraste passa pelo detector,
este envia sinais eltricos ao registrador, que imprime o cromatograma.
Para 3 componentes (A, B e C) o aspecto do cromatograma ideal (mas
no o obtido na prtica) mostrado ao lado. O detector no responde
passagem do gs de arraste e observa-se uma linha reta, constante
entre cada sinal, a Linha de Base. Quando o eluente (A) alcana o
detector, este sensibilizado, envia um sinal ao registrador e o registro
grfico observado. A funo do detector em sistemas cromatogrficos
acusar a presena e medir a quantidade de componentes no eluente.
Mas um cromatograma no formato anterior s possvel se
todas as molculas alcanam o detector simultaneamente. O
fenmeno da difuso longitudinal no interior da coluna,
contudo, faz com que molculas da mesma substncia
percorram a coluna ao mesmo tempo em que se difundem,
como qualquer outro gs. A linha de base tambm no
completamente estvel, pois h rudo eletrnico natural,
causado por flutuaes da rede eltrica e do equipamento,
por melhor que o sistema tenha sido projetado. Assim, o
aspecto de um cromatograma contendo trs substncias (A,
B e C) mais parecido com o que se v ao lado.
Com respeito seletividade, os detectores podem ser universais, seletivos ou especficos. Os detectores
universais respondem a todos os compostos presentes no eluente da coluna, com exceo da fase mvel;
os seletivos respondem a um determinado grupo de componentes presentes na fase mvel, enquanto
que os especficos respondem a um nico componente ou a um nmero limitado de componentes de
caractersticas qumicas similares. As principais caractersticas para um bom detector so:
Sensibilidade Elevada
A sensibilidade de um detector (S) igual sada de sinal por unidade de concentrao ou por unidade
de massa de uma substncia que entra no detector com a fase mvel. Assim sendo, um detector mais
sensvel ir gerar um sinal eltrico maior para uma mesma quantidade de amostra.
Resposta
A resposta de um detector o valor do sinal eltrico gerado a partir de uma certa quantidade de amostra
que chega at ele. Dependendo da resposta que o detector consiga gerar, ele ser classificado como
universal ou seletivo. Um detector apresenta resposta UNIVERSAL quando responde a todos os
componentes presentes na amostra; o detector de condutividade trmica um exemplo desta classe. A
resposta de um detector SELETIVA quando responde apenas a determinadas classes de compostos; o
detector de ionizao de chama, por exemplo, seletivo aos compostos combustveis.
no
registrador
forma-se
pico
O DCT responde a todos os tipos de compostos orgnicos e inorgnicos que possam ser analisados por
CG e no destrutivo, tornando-se muito til para trabalhos em escala preparativa.
na
chama,
elevando
corrente
pelo
aumento
de
Existem outros tipos de detectores mais seletivos como, por exemplo, o detector de captura de eltrons e
o detector fotomtrico. O primeiro utilizado para anlise de compostos halogenados, anidridos,
perxidos, nitrilas e organo-metlicos, dentre outros. O segundo utilizado normalmente para anlise de
compostos sulfurados e fosforados.
Tabela 3 - Comparao entre os dois detectores
Tipo de Detector
D.C.T.
Faixa de linearidade
105
Quantidade mnima detectvel
10 ng
Sensibilidade do detector
menor
Universo de substncias detectveis
universal
Conservao das amostras
no-destrutivo
Controle da temperatura
rigoroso
D.I.C.
107
10 pg
maior
seletivo
destrutivo
no rigoroso
A fragmentao a produo das partculas ionizadas. O processo mais comum por impacto de
eltrons.
Na deteco dos ons, o impacto dos ons no transdutor adequado, faz com que este impacto seja
traduzido num sinal eltrico. Este sinal ento registrado em papel ou armazenado em computador.
As colunas capilares so mais adequadas ao uso do espectrmetro de massas, pois trabalham com
menor quantidade de gs e amostra, facilitando o trabalho das bombas de vcuo, que so
imprescindveis ao funcionamento do espectrmetro.
i) ionizao por impacto de eltrons.
Neste mtodo, eltrons emitidos por um filamento aquecido so acelerados por meio de campos
eltricos, na direo da regio de ionizao, normalmente visando a sada da coluna capilar na cmara de
alto-vcuo. Os eltrons iro colidir com a amostra, transferindo energia suficiente para ioniz-la.
Dependendo da quantidade de energia absorvida pela amostra, esta poder fragmentar ou no. Mas esta
uma fonte de alta fragmentao, pois a energia do canho de eltrons alta.
CH3OH+ CH3+ + OH
CH3OH+ CHO+ + H2
RH2+ R+ + H2
uma
regio com
campo
ons
produzidos
na
fragmentao
ionizao,
so
que
tiver
relao
m/z
Nos TdVs utilizados em cromatografia gasosa existe ainda um outro elemento, o reflectron. Os primeiros
TdVs apresentavam baixa resoluo em massa e foram pouco usados acoplados em cromatografia. Esta
situao mudou completamente nos anos 90, com o desenvolvimento do reflectron e do acelerador
ortogonal, e teve maior mpeto com os avanos em microeletrnica e computadores.
O
reflectron
resoluo,
aumentou
pois
dobrou
a
a
vo,
sem
comprimento
aumentasse,
que
do
o
tubo
diminuiu
espalhamento de fragmentos
de mesma m/z.
ons de mesma m/z podem ter pequenas diferenas de velocidades, o que faz com eles se distanciem
uns dos outros ao longo do tubo de vo. Quanto maior o tubo, os ons ficam mais espalhados. No
reflectron, os ons mais velozes demoram mais do que ons mais lentos para serem freados pelo campo
repulsor e serem refletidos de volta numa trajetria parablica. Assim, aps passar pelo reflectron, os
ons menos velozes de mesma m/z saem na frente (ver figura). Como os que ficam para trs depois de
passar pelo reflectron so os mais velozes, todos esses ons se encontraro em um ponto no futuro. Ou
seja, h um ponto de foco, que convenientemente e exatamente ajustado na posio do detector.
O tempo de vo tem aquisio de dados muito mais rpida do que o quadrupolo, o que faz com que o
TdV seja muito melhor para colunas ultracapilares, que tm velocidade linear muito maior e produzem
picos muito mais finos. O quadrupolo no produz o nmero de varreduras por pico necessrio para uma
descrio quantitativa eficiente dos picos de colunas ultracapilares, alm de deformar o espectro de
massas obtido, por coletar os ons em regies do pico cromatogrfico que tm diferentes concentraes
(ver adiante).
vi)Detectores para Espectrmetros de Massas
Os ons, depois de separados, ou seja, os
que conseguem passar pelo analisador,
vo de encontro ao detector. O detector
pode ser eletromultiplicadora, channeltron
ou microchannelplate, que pr-amplificam
o sinal por processo de avalanche de
eltrons,
gerando
corrente
eltrica
Esquema da eletromultiplicadora
Esquema do channeltron
No caso do tempo-de-vo o detetor deve ser bastante sensvel e rpido, por isso utiliza-se um detetor do
tipo microchannelplate, que consiste de placas com milhares de microtubos em que cada um deles pramplifica o sinal de maneira semelhante a um channeltron. Os eltrons emitidos podem ser novamente
amplificados em outro microchannelplate, gerando uma corrente suficiente para ser medida.
estrutura
em
duplo
microchannelplate
chamada de Chevron.
metaestveis no ocorreria ao mesmo tempo. Poderamos ter ainda mais fragmentos se a molcula de
hidrognio fosse HD ou D2 (onde D deutrio).
m/z
Frag.
1
H+
6
C+2
6.5
(CH)+2
7
(CH2)+2
7.5
(CH3)+2
m/z
Fragm.
12
C+
13
(CH)+
14
(CH)+
15
(CH3)+
16
(CH4)+
8
(CH4)+2
ANLISE QUANTITATIVA
A cromatografia gasosa permite realizar anlises qualitativas e quantitativas. A qualitativa baseada na
velocidade com que cada componente da mistura atravessa a coluna, utilizando-se o parmetro Tempo
de Reteno (tR). O tempo de reteno de uma substncia o tempo gasto do momento em que a
amostra injetada, at o momento em que o mximo do pico sai da coluna e detectado.
O tempo de reteno caracterstico de uma dada substncia, em condies determinadas de anlise.
Dessa forma, para uma dada coluna, um dado gs de arraste e condies de temperatura e presso
estabelecidas, cada substncia tem um tempo de reteno prprio, que permite sua identificao atravs
da comparao com a anlise de padres, realizada sob as mesmas condies.
Compostos diferentes, no entanto, podem ter os mesmos tempos de reteno. Para uma anlise
qualitativa mais acurada, necessrio o uso de detectores como os espectrmetros de massas, que
fornecem espectros especficos para cada substncia (somente ismeros ticos so praticamente
indistinguveis em cromatografia gasosa). Outra possibilidade a injeo em mais de uma coluna, onde
ento o conjunto dos sucessivos tempos de reteno para cada composto seria cada vez mais especfico.
A anlise quantitativa, por outro lado, est relacionada com a rea formada sob os picos, pois a
intensidade do sinal do detector proporcional quantidade de substncia presente na mistura injetada.
Para se realizar uma anlise cromatogrfica necessrio que o cromatograma obtido esteja bem
"resolvido". Este termo, "resolvido", significa boa separao entre os picos e picos de boa simetria, de tal
forma que se possa determinar com preciso, tanto os tRs como as reas dos picos.
Na prtica, com os parmetros cromatogrficos adequados e dependendo de amostra, tcnica de injeo,
equipamento, volume injetado e coluna utilizada, pode-se obter o registro cromatogrfico com picos bem
separados e simtricos, isto , com boa resoluo, pelo menos para os analitos de interesse.
Quando isso impossvel, a espectrometria de massas oferece a opo do monitoramento seletivo de
ons, onde o espectrmetro de massas monitora os ons que, no tempo de reteno do analito de
interesse, so exclusivos desse analito e no existem nos compostos que por acaso estejam co-eluindo
no mesmo tempo de reteno e que tambm pertencem matriz em que o analito se encontra. Desse
modo, o detector de espectrometria de massas torna-se especfico, e pode-se medir a rea do pico
cromatogrfico em relao queles ons, sem que haja interferncia de outros compostos. Desvantagem:
a intensidade de sinal bem menor do que com o total de ons, a relao sinal/rudo piora, e, se os ons
especficos forem de baixa intensidade a quantificao pode ficar muito prejudicada.
A REA DO PICO CROMATOGRFICO
A rea do pico cromatogrfico, que se origina a partir da passagem de determinada substncia pelo
detector, proporcional quantidade de substncia presente na amostra e a determinao dessa rea
servir para quantificar o constituinte da amostra. O clculo da rea pode ser feito por algumas tcnicas
de integrao. Mas, para que o valor de rea expresse concentrao, so necessrias algumas condies:
1. A existncia de padres com pureza confivel, que possam ser utilizados nos clculos.
2. Os compostos de interesse no podem sofrer decomposio trmica ou decomposio cataltica no
sistema cromatogrfico e nem ficar retidos permanentemente.
3. O pico de interesse deve corresponder somente a uma substncia, ou seja, no tenha ocorrido
coeluio, a no ser que o detector seja um espectrmetro de massas e exista a possibilidade de se
fazer o monitoramento seletivo de ons.
4. A quantidade de massa analisada deve estar na faixa linear de resposta do detector, do amplificador
e do sistema de integrao.
5. Dependendo do mtodo de clculo, o operador deve ter conhecimento da existncia ou no de
substncias no detectveis e/ou no eludas.
6. Deve haver repetibilidade na operao do cromatgrafo, isto , nas temperaturas, vazes e
programaes utilizadas, para que se possa reproduzir corretamente dados de reteno e resoluo.
7. Deve haver amostragem correta do sistema a ser analisado.
8. Preciso e exatido devem estar altura das exigncias do mtodo analtico na determinao das
reas dos picos.
9. A anlise das fontes de erro ao longo do processo deve expressar o resultado final com a preciso e
a exatido corretas1.
DETERMINAO DAS REAS DOS PICOS
A escolha do mtodo a ser utilizado na determinao das reas depender da preciso e da exatido
desejadas, do tempo e dos recursos humanos, tcnicos e financeiros disponveis. Como exemplo, a tabela
mostra os resultados da determinao das reas do cromatograma de uma mesma amostra feitos por
diferentes tcnicas de integrao.
Tabela 4 - Comparao das tcnicas de integrao de reas
planmetro triangulao HL (1/2 H)
rea D.R. rea D.R. rea D.R.
mdia
mdia
mdia
Propano
0,04
20
0,05
14
0,04
12
Isobutano
4,8
1,7
4,8
8,7
4,5
3,8
n-Butano
14,0 5,6 13.7 4,5 13,6 1,6
1-Buteno
18,5 3,3 18,5 4,8 18,6 3,1
trans-2-Buteno 20,2 6,5 20,3 3,3 20,1 2,0
cis-2-Buteno
16,1 3,7 15,8 1,6 16,4 3,7
Butadieno
18,2 2,0 18,3 1,8 18,2 1,7
Isobuteno
8,1
5,7
8,6
3,7
8,6
2,2
Tempo de
45/60
45/60
50/60
clculo (min)
D.R.R.
4,1
4,1
2,6
D.R.= desvio relativo
cortar e pesar
rea
D.R.
mdia
0,01
14
5,0
2,0
15,0
2,8
18,4
1,2
20,1
1,4
15,9
1,5
17,6
1,2
8,0
2,1
100/120
disco de bola
digital
rea
D.R. rea D.R.
mdia
mdia
0,04
18
0,03
10
4,6
0,4
4,6
0,9
14,1
1,0 14,1 0,4
18,7
2,5 18,7 0,3
20,2
1,1 20,2 0,2
16,1
0,7 16,0 0,4
18,3
0,7 18,3 0,5
8,1
2,6
8,2
0,5
15/30
5/10
1,7
1,3
0,4
D.R.R.= desvio relativo ao valor real
Numa anlise quantitativa, sempre que possvel, deve-se expressar o resultado final no s com o nmero de significativos
correto, mas tambm com a margem de erro devidamente determinada e expressa em algum parmetro conhecido (desvio padro,
coeficiente de variao, intervalo de confiana etc.).
2
A tcnica de adio-padro no ser discutida neste texto.
NORMALIZAO INTERNA
A rea de um sinal cromatogrfico dada pela equao a seguir e proporcional concentrao da
substncia que passa pelo detector: S = K C Vinj
Onde S rea de pico, determinada no cromatograma, K a cte. de proporcionalidade que depende da
interao do eluente e do sistema de deteco, C a concentrao da substncia eluda e Vinj o
volume injetado. Se K a mesma para todos os componentes da amostra e todos eles esto
devidamente registrados no cromatograma, pode-se considerar que o percentual de rea corresponde ao
percentual de massa. Por exemplo, observe uma amostra que contm somente as substncias A, B e C.
S = K V = K m
%B =
%B =
Vantagens:
SB
(S A + S B + S C )
Limitaes:
simples e prtica, sendo ideal para anlises de essa tcnica no serve para amostras mais
rotina em que a exatido no um fator
importante.
independe do volume injetado.
complexas.
exige o registro de todos os componentes da
amostra.
EXERCCIOS
1)Uma amostra de trs substncias A, B e C foi analisada cromatograficamente e foram obtidos 3 picos
distintos. O papel que registrou estes picos foi recortado no formato de cada um deles, de modo que
cada pico foi pesado numa balana analtica e se obteve 0,5710 g, 0,2230 g e 0,1240 g para A, B e C,
respectivamente. Supondo que o papel tenha peso uniforme, calcule a % de B na amostra, levando em
conta que o fator de resposta do detector igual para as trs substncias.
2)H possibilidade de se fazer uma anlise por cromatografia gasosa se a constante K for diferente para
cada componente da amostra? Justifique, descrevendo o procedimento a ser efetuado.
NORMALIZAO DE REAS
Na normalizao interna levou-se em considerao que a resposta do detector sempre a mesma para
qualquer substncia, ou seja, K o mesmo para todos os componentes da amostra. Se isso fosse
verdade, a substncia B teria a mesma rea das substncias A e C se essas trs substncias estivessem
na mesma concentrao. Isso acontece somente se o detector tem a mesma sensibilidade para todos os
componentes dessa amostra.
O que normalmente ocorre que o detector responde de maneira diferente para cada substncia e, para
uma mesma quantidade em massa de substncias diferentes, fornece, como resultado, reas
completamente dspares. Neste caso, a rea obtida precisa ser corrigida. Essa correo feita pela
determinao do valor da constante de proporcionalidade K para cada um dos componentes da amostra,
que conhecida como fator de correo ou fator de resposta (f), a partir do cromatograma obtido de
padres das substncias que compem a amostra.
O procedimento adotado para determinar os fatores de resposta :
Por exemplo, para calcular os fatores de resposta das substncias A, B e C de uma amostra contendo
somente essas trs substncias podemos, a partir das reas dos picos no cromatograma da soluo
padro, empregar as seguintes expresses:
SA = KA x CA x Vinj
SB = KB x CB x Vinj
SC = KC x CC x Vinj
Onde se segue a mesma notao da nomalizao interna. Nesse caso, se a substncia B for escolhida
como referncia, o seu fator (fB = KB/KB) ser 1. J as reas dos compostos A e C teriam de ser
convertidos no equivalente em rea do composto B , ou seja:
KA
K
K B C A Vinj S A B = K B C A Vinj
KB
KA
K
K
C K B C C Vinj S C B = K B C C Vinj
KC
KB
S A = K A C A Vinj
S C = K C C C Vinj
fB = 1 ;
f C = KB / K C
Esses fatores convertem as reas de A e C para o equivalente em rea do composto B. Isto , todas as
reas agora, depois de corrigidas, esto relacionadas mesma resposta de detector e podem ser
somadas como se fosse uma normalizao interna.
Depois de determinar os fatores de resposta das substncias a partir dos padres, deve-se corrigir cada
rea no cromatograma da amostra, e o clculo da concentrao similar ao clculo percentual da
normalizao interna, s que neste caso utiliza-se as reas corrigidas3. Assim, o clculo percentual de
uma amostra contendo as substncias A, B e C fica:
%A =
S A fA
SB fB
S C fC
%B =
%C =
(S A fA + SB fB + SC fC )
(S A fA + SB fB + SC fC
(S A fA + SB fB + SC fC )
EXERCCIOS
1)O cromatograma A corresponde a uma alquota de 1,5 L de uma amostra contendo somente as
substncias A, B, C, D e E, e o cromatograma B a uma alquota de 1,0 L de uma mistura padro (em
%p/p) de A (32%), B (38%) e C (30%). Considerando que B tem o mesmo fator de resposta que E e
que C tem o mesmo que D, determine os valores de rea por triangulao e o teor de A na amostra.
Cromatograma 2
tR (min)
Cromatograma 1 - injeo de amostra
tR (min)
Cromatograma 2 - injeo de padro
S x = f x C x V inj
no cromatograma 1
S 'x = f x C
'
x
'
V inj
no cromatograma 2
Onde Sx e Sx so, respectivamente, as reas que a substncia X gerou nos cromatogramas de amostra
e de padro; Cx e Cx referem-se s concentraes de X nas solues amostra e padro, fx o fator de
resposta da substncia X frente ao detector utilizado e Vinj e V'inj os volumes injetados de amostra e de
padro. fX e Cx so as incgnitas que podem ser determinadas pelas duas equaes.
Para melhorar a preciso do mtodo e tambm verificar a faixa de linearidade, pode-se construir uma
curva de calibrao (rea concentrao). Os volumes injetados e a atenuao a diferentes
concentraes dos padres da substncia de interesse devero ser os mesmos5.
O procedimento adotado para fazer a curva de calibrao simples:
Observando-se o exemplo da figura e considerando C1< C2< C3< C4< Cn temos que:
Curva de calibrao - Padronizao Externa
rea
Concentrao
Limitaes :
que
demandem
preparaes
EXERCCIO
1)1,0 L de uma mistura de 0,537 g de n-butanol e 0,497 g de dioxano foi injetada em uma coluna
carbowax em um cromatgrafo gs, obtendo-se reas de 520 mm2 para o n-butanol e 635 mm2 para o
dioxano. 1,0 L de uma mistura desconhecida das mesmas substncias forneceu as reas de 400 mm2 e
228 mm2, respectivamente.
Determine a concentrao % p/p de cada solvente na mistura desconhecida.
5
Obviamente, alguns outros parmetros que podem alterar a rea ou a sensibilidade analtica como a temperatura do forno do
detector, corrente de alimentao para o DCT, vazo do gs de arraste, etc. devero ser constantes. A atenuao de trabalho e o
volume injetado fazem parte da constante no grfico.
6
A utilizao de vlvulas de injeo com volumes fixos acarreta menor erro de injeo.
PADRONIZAO INTERNA
Na tcnica de padronizao externa corre-se o risco de no analisar a amostra exatamente nas mesmas
condies dos padres. Isso pode acarretar concentraes inexatas, principalmente pelos erros no
volume injetado e na preparao da amostra. Por outro lado, isso no problema na normalizao, j
que os clculos (percentual em rea e fator de resposta relativo) so feitos a partir da relao entre as
constantes de dois analitos que esto em um mesmo cromatograma, e alteraes que ocorram na
sensibilidade do detector, no volume injetado e perdas na preparao da amostra afetaro os dois picos
de modo igual, no interferindo dessa forma no clculo quantitativo final.
A padronizao interna a tcnica na qual o padro injetado conjuntamente amostra desconhecida,
isto , ele dissolvido na amostra bruta, ainda antes da preparao para injeo, e servir de base para
os clculos quantitativos da substncia a ser analisada a partir de uma relao de reas. A tcnica
similar padronizao externa, porm, como veremos adiante, o volume injetado e as perdas na
preparao agora so parmetros que pouco afetam a anlise. O grande problema escolher um padro
interno7 adequado para a amostra a ser analisada, pois este deve atender aos seguintes requisitos:
No pode estar presente na amostra.
Deve ter comportamento cromatogrfico similar ao da substncia a ser analisada.
Estar numa concentrao conhecida.
Ser estvel termicamente.
No ficar adsorvido permanentemente na fase estacionria.
No co-eluir com ningum ou ele e o analito terem ons distintos dos compostos que co-eluam, para
poder monitorar ons seletivamente no espectrmetro de massas.
Observe o exemplo a seguir:
Essa tcnica restrita a solues lquidas e slidas, dada a dificuldade em adicionar, com preciso, padres internos gasosos em
amostras gasosas.
bvio, pelos cromatogramas da figura, que a substncia escolhida bom padro interno (PI) para essa
amostra, pois no est originalmente no cromatograma 1 (no h pico da amostra com o tempo de
reteno do PI), e o PI tem comportamento cromatogrfico similar ao do componente X. Fazendo a
relao da rea do componente X (SX) com a rea do padro interno (SPI), pode-se calcular a
concentrao do componente X na amostra, utilizando a equao final de desenvolvimento a seguir:
Sx
K C x Vinj
= x
S PI K PI C PI Vinj
Como:
Kx
= fX/PI
K PI
A equao fica:
Sx
C
= fx /PI x
SPI
CPI
Num mesmo cromatograma, os volumes injetados so iguais para X e para PI e a equao simplificada
vlida para o cromatograma dos padres com X e PI e para o cromatograma com amostra e PI.
No cromatograma do padro (Crom. 5), determina-se o fator de resposta relativo entre X e PI (fX/PI),
pois ambos tm concentraes e reas conhecidas. Esse fator relativo (fX/PI ) igual nos cromatogramas
da amostra e dos padres e, ao relacionar as reas do analito com a rea de PI na amostra (crom. 4),
como se conhece a concentrao do padro, calcula-se a concentrao de X na amostra.
Assim como na padronizao externa, essa anlise pode ser realizada mediante a construo de uma
curva de calibrao. Essa curva de calibrao feita da seguinte forma:
Preparam-se vrios padres com vrias concentraes conhecidas da substncia a ser analisada.
Em cada padro adicionada uma quantidade tal de padro interno que a rea de X no fica muito
maior que a rea do PI ou vice-versa9.
Cada um dos padres injetado e so medidas as reas do analito e do padro interno.
No grfico, a abcissa (x) a razo da concentrao (ou massa) do analito pela concentrao (ou
massa) do padro interno e a ordenada (y) a relao entre as reas do analito e do padro interno.
Para a anlise da amostra desconhecida introduz-se, de preferncia, a mesma quantidade de padro
interno utilizada no preparo dos padres.
Injeta-se a amostra com padro interno, calculam-se as reas de X e de PI e as relaes entre elas e
interpola-se no grfico obtido anteriormente, para obter a relao de concentrao. A partir do
resultado obtido, calcula-se a concentrao de X na amostra desconhecida.
Pode-se expressar o eixo X somente como Cx , se a concentrao do PI for mantida constante para
todos os padres e amostra.
Vantagens :
Sx/Spi
40
No
30
so
necessrios
vrios
padres,
20
10
0
0
0,1
0,2
0,3
Cx/Cpi
0,4
Limitaes :
Dificuldade na escolha de um padro interno que
atenda todos os requisitos necessrios.
como