Andrei Midoni Thesis

ACADEMIA DE TIINE A MOLDOVEI
UNIVERSITATEA DE STAT DIN MOLDOVA
Cu titlu de manuscris
C.Z.U.: 575.133:582.998.2
MIDONI Andrei
IDENTIFICAREA I EXPRESIA UNOR GENE (Rf) LA

FLOAREA-SOARELUI (Helianthus annuus L.)
03.00.15-GENETIC
Tez de doctor n biologie
Conductor
tiinific:
Duca Maria, dr. hab. biol.,

prof. univ., membru. cor. al AM,
03.00.15 - Genetic
Autorul:
Chiinu, 2010
Midoni Andrei, 2010
SUMAR
ADNOTARE
ANNOTATION
LISTA ABREVIERILOR
INTRODUCERE
1. SISTEMUL GENETIC ASC-Rf LA PLANTE
5
6
7
8
9
14
1.1. Aspecte privind androsterilitatea citoplasmatic
14
1.1.1. Diversitatea molecular a androsterilitii citoplasmatice (ASC)
14
1.1.2. Localizarea genelor rspunztoare de ASC
19
1.1.3. Structura genelor androsterilitii citoplasmatice
19
1.1.4. Efectele induse de genele ASC
20
1.2. Analiza genetico-molecular a genelor restauratoare de fertilitate
24
1.2.1. Diversitatea genelor restauratoare de fertilitate (Rf)
24
1.2.2. Localizarea genelor restauratoare de fertilitate
25
1.2.3. Structura genelor restauratoare de fertilitate
27
1.2.4. Rolul genelor Rf n normalizarea proceselor biologice n F1
30
1.3. Aspeste generale privind sistemele ASC-Rf
33
1.3.1. Diversitatea sistemelor ASC-Rf
33
1.3.2. Interaciunea la diferite nivele a componentelor sistemului ASC-Rf
34
1.4. Concluzii la capitolul 1
35
2. MATERIALUL I METODELE DE CERCETARE
37
2.1. Material de cercetare
37
2.2. Metodele de cercetare
38
2.2.1. Determinarea indicilor morfo-fiziologici
38
2.2.2. Izolarea i electroforeza proteinelor
39
2.2.3. Izolarea i electroforeza ADN-lui
39
2.2.4. Analiza RAPD
39
2.2.5. Analiza CAPS
40
2.2.6. PCR cu primeri specifici
40
2.2.7. Metode bioinformatice de analiz
41
2.2.8. Analiza statistic a datelor
41
41
3. EVALUAREA PARAMETRILOR MORFOLOGICI LA FORMELE STERILE,

FERTILE I CELE CU FERTILITATEA RESTAURAT
42
3.1. Analiza unor parametri cantitativi
42
3.2. Evaluarea autocompatibilitii polenului
49
3.3. concluzii la capitolul 3
53
4. PARTICULARITI DE INTERACIUNE A PRODUILOR DE EXPRESIE

LA GENELE ASC Rf
4.1. Identificarea proteinelor codificate de genele sistemului ASC-Rf
54
4.2. Caracteristica proteinelor asociate cu ASC i Rf
57
4.3. Localizarea celular a proteinelor asociate cu ASC i Rf
65
4.4. Modele de interaciune nucleu citoplasm la diverse specii de plante
66
4.5. Elaborarea modelului ipotetic al enzimei polinucleotid-fosforilaza
73
54

5.
IDENTIFICAREA PREZENEI GENELOR Rf LA DIVERSE GENOTIPURI
DE FLOAREA-SOARELUI
5.1. Polimorfismul molecular la genotipurile ASC, Rf i F1 n baza analizei RAPD
76
5.1.1. Diversitatea genetic evalut n baza primerilor RAPD-OPG 10
76
5.1.2. Diversitatea genetic evalut n baza primerilor RAPD-OPI 16
78
5.1.3. Diversitatea genetic evalut n baza primerilor RAPD-OPH 15
80
5.2. Screening-ul prezenei genelor Rf
82
5.3. Motenirea genelor Rf
83
5.4. Testarea prezenei la genotipurile de floarea-soarelui (PET-1) a markerilor lincai cu
86
76
genele Rf3 (porumb ASC-S)

86
6.
ASPECTE PRIVIND EXPRESIA GENELOR ASOCIATE CU
CARACTERUL RESTAURATOR DE FERTILITATE LA FLOAREA-SOARELUI
6.1. Polimorfismul proteinelor sumare uor solubile din frunzele formelor parentale i
88
88
hibride
6.2. Studiul polimorfismului proteic la flori
90
6.3. Analiza proteinelor sumare din polen
91
6.4. Mecanismul de aciune a genelor de restaurare a fertilitii polenului
92
94
CONCLUZII GENERALE
RECOMANDARI PRACTICE
BIBLIOGRAFIE
ANEXA 1. ACT DE IMPLEMENTARE A REZULTATELOR
DECLARAIA PRIVIND ASUMAREA RSPUNDERII
CURRICULUM VITAE
95
96
97
117
118
119
ADNOTARE
Midoni Andrei, Identificarea i expresia unor gene (Rf) la floarea-soarelui
(Helianthus annuus L.), tez de doctor n biologie, Chiinu, 2010. Teza const din
introducere, ase capitole, concluzii, bibliografie cu 285 de surse, avnd un volum total de 119
pagini, 23 tabele i 53 figuri. Rezultatele cercetrilor sunt publicate n 10 lucrri tiinifice.
Cuvinte-cheie: floarea-soarelui, gene restauratoare de fertilitate, sistemul ASC-Rf, markeri
moleculari, analiz bioinformatic, analiz hibridologic.
Domeniul de studiu: 03.00.15 Genetic
Scopul lucrrii: studiul mecanismelor moleculare ale androsterilitii-androfertilitii,
identificarea genelor restauratoare de fertilitate la diferite genotipuri de floarea-soarelui, cultivate
n Republica Moldova i cercetarea procesului de restaurare i motenire a fertilitii polenului.
Obiective: analiza bioinformatic a genelor Rf i ASC care formeaz sistemele ASC-Rf la
diverse specii de plante; polimorfismul genetic (RAPD) la formele ASC, Rf i F1 corelat cu
particulariti morfologice; determinarea numrului i tipului de interaciune dintre genele Rf
(analiza hibridologic); identificarea prezenei genei Rf1 i strii alelice (CAPS); screening - ul
prezenei markerilor lincai cu gena Rf3 (Zea mays) n genomul florii-soarelui; elucidarea unor
aspecte privind expresia genelor asociate cu caracterul restaurator de fertilitate.
Noutatea tiinific: au fost evideniate particulariti similare dintre sistemul ASC PET1
de la floarea-soarelui i ASCS de la porumb i a fost identificat markerul molecular lincat cu
gena Rf3 (de la porumb) la genotipurile Rf i F1 de floarea-soarelui; s-a determinat localizarea
citoplasmatic a proteinelor Rf i membranar a celor androsterile la plante; a fost modelat
enzima polinucleotid-fosforilaza de la floarea-soarelui implicat n procesul de restaurare prin
poliadenilarea transcriptului ASC care ulterior e digerat de ARN-aze; s-a identificat prezena i
starea genei Rf1 (rf1rf1, Rf1Rf1 i Rf1rf1) la nou linii materne, la 14 linii paterne i la 16 hibrizi.
Semnificatia teoretic: s-a elaborat un model ipotetic de interaciune a componentelor
sistemului ASC-Rf la plante.
Valoarea aplicativ: printre hibrizii nou creai la Drofa ASC x LC Raus Rf i Drofa ASC x
VIR 681 Rf a fost evideniat un indice nalt de autocompatibilitate a polenului caracter
agroeconomic important.
Implementarea rezultatelor tiinifice: rezultatele sunt aplicate n genetic i ameliorare
(organizaia NOVOSEM SRL teza anexa 1), la cursurile de bioinformatic, fiziologie a plantelor.
n baza analizei hibridologice, CAPS-PCR i a datelor morfologice, recomandm ca liniile
homozigote dup gena Rf1 LC 4 Rf, LC 39 Rf, LC 41 Rf, LC 43 Rf, LC Cium Rf i LC Raus Rf s
fie aplicate n crearea unor noi genotipuri hibride.
5

, (Rf)
(Helianthus annuus L.), ,
, 2010. : , 6 , ,
, 285 , 119 , 23 ,
53 . 10 .
: , Rf , CMS-Rf , ,
, .
: 03.00.15 .
, Rf ,
, .
: CMS-Rf ;
(RAPD) ;
Rf ( ); Rf-
(CAPS);
( Rf3); Rf .
:
,
Rf3- ( ) (Rf F1);

Rf CMS ;
-, ( CMS
, -);
Rf- (rf1rf1, Rf1Rf1 Rf1rf1) 9 CMS, 14 Rf 16 ;
: CMSRf .
: Drofa CMS LC Raus Rf Drofa CMS VIR
681 Rf ,
.
:
(NOVOSEM SRL 1), .
, CAPS-PCR

(Rf1Rf1): LC 4 Rf, LC 39 Rf, LC 41 Rf, LC 43 Rf, LC Cium Rf LC Raus Rf.
6
ANNOTATION
Midoni Andrei, Identification and expression of some sunflower (Helianthus annuus
L.) genes (Rf), PhD thesis in biology, Chisinau 2010. The thesis consists of introduction, 6
chapters, conclusions, bibliography of 285 sources, a total of 119 pages, 23 tables and 53
pictures. The results are published in 10 papers on the topic of research.
Keywords: sunflower, fertility restorer genes, CMS-Rf system, bioinformatics,
hybridologic analysis.
Domain of research: 03.00.15 Genetics
Research goal: molecular study of male sterility / fertility mechanisms, identification of
restorer of fertility genes in different genotypes grown in Republic of Moldova, while research of
inheritance and fertility restoration mechanisms in sunflower.
Objectives: bioinformatics analysis of different CMS-Rf systems; genetic polymorphism
(RAPD) in CMS, Rf and F1 correlated with morphological features; number determination and
type interaction of Rf genes by hybridologic analysis; identification and status evaluation of Rf
genes using CAPS-PCR analysis; presence / absence estimation of maize marker linked with Rf3
gene (CMS-S) in different sunflower genotypes; analysis of some aspects associated with Rf
genes expression.
Scientific novelty: similar features were observed between CMS-PET 1 sunflower and
CMS-S maize systems, at the same time was identified molecular markers linked to Rf3 gene
(maize) in Rf and F1 sunflower genotypes; was determined cytoplasmatical (Rf) and membranar
location of CMS proteins in plants; was modeled polynucleotide-phosphorilase enzyme involved
in sunflower restoration processes by polyadenylation of CMS transcripts witch is then digested
by RNases; was distinguished the presence and Rf1 gene status (rf1rf1, Rf1Rf1 and Rf1rf1) in 9
maternal, 14 paternal and 16 hybrid genotypes;
Theoretical significance: was developed a hypothetical model of CMS-Rf components
interaction in plants.
Applied value: in new created hybrids Drofa CMS x LC Raus Rf and Drofa CMS x VIR
681 Rf was estimated the high auto compatibility degree important agronomic character.
Implementation of scientific results: the obtained results are successfully applied in
genetics, selection (NOVOSEM SRL thesis annex 1), in bioinformatics, plant physiology.
Based on hybridologic, CAPS-PCR and morphologic analysis we recommend the
homozygous lines (Rf1Rf1): LC 4 Rf, LC 39 Rf, LC 41 Rf, LC 43 Rf, LC Cium Rf and LC Raus Rf
to be used for creation of highly productive hybrids.
LISTA ABREVIERILOR
aa aminoacid
AC autocompatibilitatea polenului
ADN acid dezoxiribonucleic
AFLP polimorfismul lungimilor de fragmente amplificate
ALDH aldehiddehidrogenaz
ARN acid ribonucleic
ASC androsterilitate citoplasmatic
BAC bacterial artificial cromosom
BC backcross
CAPS digestia secvenei polimorfe amplificate
CBM centrul de biologie molecular
Cic C. citocrom C
cM centimorganide
DDBJ banca de date ADN a Japoniei
DP domen proteic
ExPASy expert protein analiz sistem
kDa kilodaltoni
MT motiv proteic
NCBI centerul national pentru biotehnologie i Informaie
Orf cadru nou de citire
Pb perechi de baze
PCD moartea programat a celulei
PCR reacia de polimerizare n lan
PPR motiv proteic de repetare a cte 35 de aa
RAPD ADN polimorfic amplificat randomizat
RFLP polimorfismul lungimilor fragmentelor restrictionate
Rf restaurarea fertilitii
TRAP polimorfismul regiunii int amplificate
VIR Institutul de Fitotehnie N.I. Vavilov, Sankt Petersburg, Federaia Rus
INTRODUCERE
Actualitatea i importana problemei. Crearea hibrizilor productivi de floarea-soarelui
este de neconceput fr utilizarea liniilor androsterile, liniilor menintoare de sterilitate i a
celor restauratoare de fertilitate. Prezena genelor, ce determin androsterilitatea citoplasmatic
n liniile materne favorizeaz polenizarea ncruciat i obinerea unui grad nalt de
heterozigoie, iar cele Rf n liniile paterne, contribuie la restabilirea fertilitii i obinerea unei
producii nalte de semine, ambele gene constituind sistemul ASC-Rf. Succesul n utilizarea
practic a acestui sistem este determinat de stabilitatea surselor de ASC i corespunztor a
genelor Rf [56].
La floarea-soarelui sunt descrise peste 62 surse de ASC [98] i patru gene restauratoare de
fertilitate:
-
Rf1 identificat pentru prima dat de M. Kinman la linia T 66 006-2 [116] i cartat n grupul
de linkage 6 [91];
Rf2 depistat n majoritatea liniilor fertile, inclusiv i n genotipurile menintoare de

sterilitate [91];
Rf3 descris de C.C. Jan n 2007, restaureaz fertilitatea la diverse surse ASC i este diferit
de Rf1 [103];
Rf4 identificat la linia Helianthus maximiliani 1631 [56], restaureaz fertilitatea la ASCGIG2.
Cu toate acestea, cel mai studiat i practicat sistem ASC-Rf n ameliorarea la heterozis,
rmne a fi cel ce corespunde citoplasmei PET1 i genei restauratoare de fertilitate Rf1 [56, 92].
Valorificarea acelorai linii parentale pentru obinerea seminelor hibride are ca efect diminuarea
germoplasmei, corelat cu diverse efecte negative. Drept exemplu, n acest caz, putem meniona
utilizarea porumbului ASC-T cu genele restauratoare corespunztoare Rf1 i Rf2 [42, 254], care
a fost marcat de apariia unor pierderi colosale agroeconomice [140], determinate de
sensibilitatea hibrizilor rezultai la aciunea parazitului Helminthosporium maydis [147]. Din
contextul celor expuse, reiese obiectivul prioritar al amelioratorilor privind diversificarea
materialului iniial prin utilizarea unui numr mai mare de genotipuri
n calitate de linii
parentale, fapt care determin att sporirea productivitii, ct i o cretere a rezistenei formelor
hibride la boli i duntori.
Astfel, n cadrul acestei culturi, prezint interes identificarea genelor Rf la un numr ct
mai divers de genotipuri, cu efecte stabile de restaurare a fertilitii, capacitate combinativ nalt
i indici agroeconomici valoroi.
Scopul lucrrii const n studiul mecanismelor moleculare ale androsterilitiiandrofertilitii, identificarea genelor restauratoare de fertilitate la diferite genotipuri de floareasoarelui, cultivate n Republica Moldova i cercetarea procesului de restaurare i motenire a
fertilitii polenului.
Pentru realizarea scopului sunt propuse urmtoarele obiective:
- analiza bioinformatic a genelor Rf i ASC (indici biochimici, domene proteice, structur i
localizare spaial) care formeaz sistemele ASC-Rf la diverse specii de plante;
- polimorfismul genetic (RAPD) la formele ASC, Rf i F1 corelat cu particulariti morfologice;
- determinarea numrului i tipului de interaciune dintre genele Rf (analiza hibridologic);
- identificarea prezenei genei Rf1 i strii alelice (CAPS);
- screening - ul prezenei markerilor lincai cu gena Rf3 (Zea mays) n genomul florii-soarelui;
- elucidarea unor aspecte privind expresia genelor asociate cu caracterul restaurator de
fertilitate (SDS-PAGE, test de fertilitate a polenului).
Noutatea i originalitatea tiinific a rezultatelor obinute. A fost pus n eviden
similitudinea dintre sistemul ASC-PET1 la floarea-soarelui i ASC-S la porumb privind
interaciunea nucleu citoplasm. A fost identificat markerul molecular lincat cu gena Rf3 de la
porumb (ASC-S) la genotipurile restauratoare i hibride (F1) de floarea-soarelui (PET1). S-a
analizat in silico localizarea spaial a proteinelor asociate cu Rf (citoplasmatic) i a proteinelor
asociate cu androsterilitatea citoplasmatic (membranar) la diverse specii de plante, inclusiv la
floarea-soarelui. S-a stabilit un model de amplasare spaial a produsului de expresie orfH522
(din 174 aminoacizi: 23 de la captul N-terminal sunt orientai n interiorul mitocondriei, 17 n
spaiul intermembranar i restul aminoacizilor (aa) de la captul C-terminal n citoplasm).
Evaluarea spectrelor polipeptidice a permis identificarea unei benzi de 90 kDa, care, posibil,
reprezint produsul de expresie a genei polinucleotid-fosforilaza atestat la genotipurile hibride
i asociat cu prezena i expresia genelor restauratoare de fertilitate.
Importana teoretic i valoarea aplicativ a lucrrii. A fost modelat enzima
polinucleotid-fosforilaza de la floarea-soarelui, implicat n procesele de poliadenilare a
transcriptului genei ASC. n cadrul proteinelor Rf de la diverse specii de plante s-au constatat
motive/domene proteice de recunoatere/aciune la nivel de ARN RNA recognition motif,
Radical SAM Superfamily etc., iar la nivelul proteinelor ASC - domene asociate cu apoptoza
celular Retroviral aspartil proteaza, Major Facilitator Superfamily etc. A fost elaborat un
10
mecanism ipotetic privind interaciunea componentelor sistemului ASC-Rf la diverse specii de

plante.
A fost identificat prezena i starea homo-, heterozigot, dominant/recesiv a genei Rf1 la
9 linii materne, 14 linii paterne i 16 hibrizi de floare-soarelui. Benzile polimorfe RAPD i
proteice depistate la formele restauratoare de fertilitate ar putea fi analizate n scopul elaborrii
unor markeri moleculari pentru identificarea acestor genotipuri.
Hibrizii nou-creai Drofa ASC LC Raus Rf i Drofa ASC VIR 681 Rf se evideniaz
printr-un indice nalt al autocompatibilitii polenului caracter agroeconomic important. De
asemenea, n baza analizei hibridologice, CAPS i a datelor morfologice, liniile homozigote dup
gena Rf1: LC4; LC39; LC41; LC43; LC Cium i LC Raus pot fi recomandate pentru elaborarea
unor noi genotipuri hibride. Patrusprezece hibrizi noi care au fost creai n cadrul cercetrilor,
reprezint un material de analiz pentru amelioratorii florii-soarelui.
Aprobarea rezultatelor. Rezultatele cercetrilor au fost prezentate n cadrul Conferinelor
internaionale a tinerilor cercettori (9 noiembrie 2007; 6-7 noiembrie 2008), Congresul al IX-lea
Naional cu participare internaional al Geneticienilor i Amelioratorilor (21-22 octombrie
2010) din RM, precum i la o serie de seminare tiinifice ale catedrei de Biologie Vegetal
(USM) i Centrului de Biologie Molecular (UnAM).
11
SUMARUL COMPARTIMENTELOR TEZEI

Teza de fa cuprinde: adnotare prezentat n mai multe limbi, lista abrevierilor,
ntroducere, 6 capitole, concluzii generale, recomandri practice, bibliografia, declaraia privind
asumarea rspunderii i Nota Bibliografic.
n partea introductiv a lucrrii, este expus actualitatea i importana problemei abordate,
este formulat scopul, elaborate obictivele, descris noutatea tiinific i argumentat importana
teoretic i valoarea aplicativ a lucrrii. De asemenea, au fost inclus aprobarea rezultatelor i
sumarul compartimentelor tezei.
Capitolul 1 Sistemul genetic ASC-Rf la plante conine o analiz profund a datelor din
literatur referitore la actualitatea temei, apelnd la o serie larg de surse bibliografice i
consultarea bazelor de date (NCBI, ExPASy, Protein Data Bank, European Bioinformatics
institute etc.). n cazul de fa, au fost evaluate aa aspecte precum: diversitatea molecular,
localizarea, structura i efectele (genetice, fiziologo-biochimice, fenotipice etc.) genelor
sistemului ASC-Rf. De asemenea, au fost ntreprinse aciuni de a explica interaciunea
componentelor sistemului ASC-Rf la diverse specii de plante.
n capitolul 2 Materialul i metodele de cercetare au fost descrise materialele utilizate
pentru analiz. Au fost elaborate i comentate metodele de cercetare. S-a analizat n paralel
utilizarea att a metodologiilor clasice (analiza hibridologic), ct i a celor moderne (RAPD,
CAPS, SCAR) cu privire la studiul mecanismelor moleculare ale androsterilitii-androfertilitii,
identificarea prezenei genelor restauratoare de fertilitate i cercetarea procesului de restaurare i
motenire a fertilitii polenului.
n capitolul 3 Evaluarea parametrilor morfologici la formele sterile, fertile i cele cu
fertilitatea restaurat au fost evaluate diverse caractere morfologice (nlime, numr frunze,
suprafaa foliar, diametrul calatidiului, perioada vegetativ etc.) i au fost aplicate o serie de
procedee statistce (regresii, corelaii) cu scopul de a efectua o analiz comparativ dintre
genotipuri (ASC, Rf i F1). De asemenea a fost analizat autocompatibilitatea polenului un
caracter agroeconomic important.
Capitolul 4 Particulariti biochimice i de interaciune a produilor de expresie la
genele ASC-Rf. Deoarece, nu este cunoscut secvena proteinelor restauratoare de fertilitate de
la floarea-soarelui, mai nti de toate a fost decis de a efectua un studiu bioinformaional al
tuturor sistemelor ASC-Rf. A fost analizat o serie larg de trasturi distinctive dintre proteinele
asociate cu ASC i Rf. Au fost evideniate asemnri dintre diverse sisteme ASC-Rf, descris
localizarea spaial a produilor de expresie ASC i Rf, identificate DP, expliccate mecanismele
de interaciune nucleu citoplasm i a fost elaborat un mecanism ipotetic al acestei interaciuni
12
la diverse specii de plante. De asemenea a fost elaborat un model ipotetic al enzimii

polinucleotid-fosforilaza de la floarea-soarelui implicat n procesele de restaurare a fertilitii
polenului prin poliadenilarea transcriptului atpA-orfH522 care ulterior este digerat de ARN-aze.
n capitolul 5 Identificarea prezenei genelor Rf la diverse genotipuri de floareasoarelui ntr-o prim etap a fost efectuat analiza RAPD care a scos n eviden un
polimorfism accentuat la urmtoarele forme paterne: Drofa, Valentino, Raus; LC 4 i materne
LC SW38, VIR 101, VIR 116. Au fost identificai ampliconi specifici doar liniilor restauratoare
de fertilitate (OPG 10510, OPG 10680, OPI 16450 i OPI 16550).
Pentru identificarea prezenei genelor Rf i analiza motenirii acestora a fost efectuat n
paralel analiza hibridologic (clasic) i tehnica CAPS (molecular). Astfel, s-adeterminat att
prezena ct i starea genelor restauraatoare la cele 14 linii Rf (Rf1Rf1); nou linii ASC (rf1rf1) i
la 16 hibrizi (Rf1rf1). Au fost descrise cazuri de control a restaurrii androfertilitii
citoplasmatice determinate de prezena unei singure sau a mai multor gene Rf.
Deasemenea a fost identificat markerul molecular lincat cu gena Rf3 de la porumb la
genotipurile restauratoare i hibride de floarea-soarelui. Efectuarea acestui ultim pas, a fost
dictat de similitudinile gsite n urma studiului bioinformaional dintre sistemul ASC-Rf de la
floarea-soarelui (ASC-PET1) i porumb (ASC-S).
Capitolul 6 Unele aspecte legate de expresia genelor restauratoare ale fertilitii
polenului. Fracionarea electroforetic a extractelor de proteine uor solubile din polen, frunze
i flori la formele sterile i fertile a pus n eviden profile heterogene de expresie temporalspaial a genelor asociate cu manifestarea andosterilitii i restaurarea fertilitii. Un nivel nalt
i difereniat al activitii de expresie a genelor s-a observat n fazele micro - i
macrosporegenezei. Componentul polipeptidic cu Mr de 90,0 kDa identificat la genotipurile
hibride i asociat cu expresia genelor restauratoare de fertilitate, conform datelor din literatur ar
putea fi polinucleotid-fosforilaza (modelat la floarea-soarelui n capitolul 4) - protein solubil,
homotrimer conservativ a complexului de degradare a ARN mesager din mitocondrii, ce apare
n electroforeza denaturant ca un fragment de cca. 90 kDa.
13
1. SISTEMUL GENETIC ASC-Rf LA PLANTE

Importana mutaiilor la nivelul genomului mitocondrial sau a celui plastidial rezult pe de
o parte din faptul c, acestea ofer un mecanism pentru obinea androsterilitii citoplasmatice,
iar pe de alt demonstreaz rolul plasmogenelor n procesele reproductive. Genele Rf, la rndul
su necesare pentru restaurarea fertilitii polenului, relev interaciuniea dintre dou genomuri
[78], iar mpreun cu genele ASC ofer un model clasic de investigare a rolului nucleului
citoplasm n ereditate.
Bineneles, numeroase cercetri n acest domeniu se datoreaz rolului practic pe care l are
combinarea androsterilitii citoplasmatice ntr-un printe i existena genelor restauratoare de
fertilitate n cellalt [5], adic, utilizarea sistemului dat n obinerea seminelor hibride, a cror
plante vor manifesta o productivitate nalt, vor fi mai rezisteni la secet, boli i diferii
duntori naturali.
1.1. Aspecte privind androsterilitatea citoplasmatic

Androsterilitatea citoplasmatic trstur transmis matern [120], datorat motenirii
non-Mendeliene a caracterilor [154, 244] este determinat de gene himerice localizate la nivelul
genomului mitocondrial sau a celui plastidial [31, 90, 111, 139, 220].
Pentru prima oar, acest fenomen a fost observat n 1963 de ctre botanistul german Joseph
Gottlieb Klreuter [271], ulterior androsterilitatea citoplasmatic a fost mai amplu descris la un
numr mare de plante [18]. Iar civa ani mai trziu dup J.C. Klreuter un alt cercettor de la
floarea-soarelui P. Leclercq, reuete s obin plante androsterile n urma unor ncruciri
interspecifice dintre Helianthus petiolaris Nutt. i Helianthus annuus L. [134].
1.1.1.
Diversitatea molecular a androsterilitii citoplasmatice (ASC)
Apariia androsterilitii citoplasmatice poate avea variate cauze:
modificarea nivelului unor metabolii eseniali n polen, ca urmare a folosirii unor compui
biologic activi specifici anterei ce au drept int distrugerea esutului tapetal sau a altui esut n
timpul maturrii, astfel nct este oprit dezvoltarea ulterioar a polenului;
o alt cauz, este determinat de sinteza unei proteine toxice, sau introducerea unei gene
ASC ce cuprinde o secven de ADN, care codific un produs citotoxic;
n urma expresrii n esutul tapetal a unor ribonucleaze etc.
14
Conform datelor din literatur, acest fenomen este prezent la peste 140 de specii de plante
[79], dintre care mai jos sunt menionate cele mai importante dintre acestea.
ASC la Zea mays clasificat la rndul su n trei grupe mari: ASC T, ASC C [101] i ASC S
[255]. Prima apare ca urmare a expresiei genei mitocondriale urf13 care codific o protein
toxic de 13 kDa. A doua grup, ASC-C poate fi restaurat de o singur gen nuclear Rf4, n
acest caz proteina asociat cu androsterilitatea are o mas molecular de 17,5 kDa, iar ultima
categorie ASC-S poate fi restaurat de o singur gen nuclear Rf3 [98].
ASC la Phaseolus vulgaris este asociat cu prezena la nivelul ADN-ului mitocondrial a
unei secvene de 3 kb. Aceasta, duce la apariia unui nou cadru de lectur, iar restaurarea
androfertilitii are loc n prezena unei singure gene nucleare Fr [81].
ASC la Petunia ssp. apare n urma rearanjrilor locusului atp9 gena himeric pcf are o
lungime de 354 de codoni [13].
n cazul androsterilitii citoplasmatice de la Raphanus sativus, noul cadru de lectur
asociat cu ASC: orf138 cocine un numr total de 138 codoni [99], iar al doilea - orf125 conine
375 de nucleotide [120].
ASC la Brassica ssp. este de trei feluri: ASC-ogyra, ASC-nap, ASC-pol, ASC-tour [78].
ASC la Oryza sativa de tip Boro este asociat gena chimeric atp6 (urf-rmc), a crei produs
final este un polipeptid de 181 de aa [108].
ASC de la Triticum aestivum determinat de apariia unui cadru de lectur orf256 ca urmare
a unor rearanjamente n carul genomului mitocondrial [190].
ASC de la Sorgum bicolor este asociat cu prezena mutaiilor att la nivelul ADN-ului
mitocondrial: gena coxI, ct i a celui plastidial [31].
Androsterilitatea citoplasmatic de la Vicia faba a fost relatat de Edwardson n 1976
[137].
ASC la Beta Vulgaris rezult n urma dereglrii genelor mitocondriale, astfel nct la
plantele sterile a fost observat absena a dou polipeptide de 21i 32 kDa [205].
La plantele de tutun transgenic mutanii androsterili au fost obinui prin introducerea n
genom a unor gene ce codific ribonucleaze, fenomenul restaurrii n cazul dat, fiind determinat
de prezena unui inhibitor al acestor ribonucleaze [158]. Drept exemplu, se poate relata cazul
cnd introducerea genei rolC de la Agrobacterium rhizogenes cauzeaz androsterilitatea
citoplasmatic la tutun [200] i poarte produce modificri biochimice majore la tomate [65].
ASC de tip Helianthus annuus este datorat apariiei unui nou cadru de lectur orfH522 n
urma inseriei unui fragment de aproximativ 5 kb i a inversiei unui alt fragment de 12 kb [98].
15
Ideea de baz, n ceea ce privete apariia androsterilitii citoplasmatice este determinat

de rearanjamente complexe ale genomului mitochondrial. Aceasta, indiferent de filogenia speciei
i poziia taxonomic poate fi spontan (Zea mays L., Secale cereale L., Triticum aestivum L.)
[48] sau obinut prin diverse ncruciri interspecifice (Nicotiana tabacum L., Gossypium
hirsutum L., Oryza sativa L., Helianthus annuus L.) [48]. Factorii citoplasmatici (ASC) se
manifest n prezena genelor restauratoare de fertilitate n stare recesiv rfrf. Starea dominant
a acestor factori (Rf) asigur restaurarea fertilitii n generaia Fx att la diverse tipuri de
androsterilitate spontan [117], ct i la cele de origine hibrid [46, 62].
Diferite tipuri de androsterilitate citoplasmatic la foarea-soarelui
Fiecare surs ASC se identific prin ncruciri cu liniile specifice indicatoare de
androsterilitate [48, 97]. Diferitele tipuri de androsterilitate citoplasmatic i pot trage originea
din cteva surse de sterilitate independent de forma ei. Astfel, n funcie de modul de apariie a
ASC putem avea:
androsterilitatea citoplasmatic aprut spontan (din Helianthus annuus L. slbatic)
ANN1, ANN2, ANN3 i ANN4 [208]; ANN5 [213];
sau din forme cultivate de Helianthus annuus L. ANN2101, ANN2108, ANN2112,
ANN2141, ASC G, ASC DP, ASC VL, ASC AN-126 [98];
n urma ncrucirilor intraspecifice ANL2 [84]; ANT1 [227];
prin hibridri interspecifice ANO1, BOL1, EXI1, NEG1, PEF1, PEP1 [208]; ARG1,
ARG2 [34]; EXI2 [207]; GIG1 [240]; MAX1, PET2 [240]; PET1 [134]; PRH1, PRR1 [Christov
M., 1993 cit. 92]; RIG1 [232]; GIG2 [56];
sau induse prin mutagenez MUT1, MUT2 [Christov M., 1993 cit. 92].
n acest mod, dup 1999 au fost raportate cel puin 62 de surse androsterile noi obinute pe
diferite ci la floarea-soarelui [98] dintre care cele mai importante sunt (Tabelul 1.1):
16
Tabelul 1.1. Principalele linii androsterile de floarea-soarelui [98]

Denumirea liniei ASC
KOUBAN
INDIANA 1
VIR 126
397
517
519
521
NS-ANN-81
NS-ANN-2
FUNDULEA 1
AN-67
AN-58
AN-2-91
AN-2-92
CMS-G
CMS-DP
CMS-VL
HEMUS
PEREDOVICK
STADION
ANOMALUS
ARGOPHZLLUS
BOLANDERI
DV-10
EXILIS
EX12
CMG2
CMG3
MOLLIS
NEGLECTUS
CANESCENS
FALLAX
PET:PET
CMS clasica
CMG1
PETIOLARIS BIS
PET34
PRAECOX
PHIR-27
PRAECOX
PRP-28
RUN-29
RESINOSUS 243
RIG-M-28
STRUMOSUS
VULPE
Denumirea speciei
H. annuus lenticularis
H. annuus lenticularis
H. lenticularis
H. annuus
H. annuus
H. annuus
H. annuus
H. annuus
H. annuus
H. annuus texanus
H. annuus
H. annuus
H. annuus
H. annuus
H. annuus
H. annuus
H. annuus
H. annuus
H. annuus
H. annuus
H. anomalus
H.argophzllus
H.bolanderi
H.debilis
H. exilis
H. exilis
H.giganteus
H. maximiliani
H.mollis
H.neglectus
H.niveus canescens
H. petiolaris falllax
P.petiolaris petiolaris
H. petiolaris Nutt
H. petiolaris Nutt
H. petiolaris Nutt
H. petiolaris
H.praecox
H. praecox hirtus
H. praecox praecox
H. praecox praecox
H. praecox
H. resinosus
H. rigidus
H. strumosus
H. RIGIDUS
Codul FAO
ANL1
ANL2
ANL3
ANN1
ANN2
ANN3
ANN4
ANN5
ANN6
ANT1
ANN10
ANN11
ANN12
ANN13
ANN15
ANN16
ANN17
MUT1
MUT2
MUT3
Ano1
Arg1
BOL1
DEB-1
EXI1
EXI2
GIG1
MAX1
MOL1
NEG1
NIC1
PEF1
PEP1
PET1
PET2
PET3
PET4
PRA1
PRH1
PRP1
PRP2
PRR1
RES1
RIG2
STR1
RIG1
1.1.2. Localizarea genelor rspunztoare de ASC

La organismele superioare informaia genetic, este prezent nu numai n nucleu, dar i n
organitele celulare precum cloroplastele sau mitocondrii. Bineneles din punct de vedere
cantitativ, exist diferene majore n ceea ce privete cantitatea ADN-ului: nuclear (4.07.0 x 1014
g), plastidial (0.30.9 x 10-14g) i mitocondrial ((0.10.3)5 x 10-14g) [221]. Organitele ultimui
tip, prezente ntr-un numr mare n celulele plantelor i animalelor [7] au implicaiuni directe n
metabolismul energetic [236]. Activitatea mitocondrial, demonstrat n cadrul meristemului
apical de la Arabidobsis thaliana unde cantitatea acestora crete de la 65 pn la 200 per celul
17
[69] i n celulele tapetale a purumbului, cu o dublare a numrului acestorea per celul [135] pare
s fie reglat de gene nucleare specifice [171] la nivel transcripional i posttranscripional [63].
Totui, acestea datorit existenei propriului genom posed o autonomie genetico-metabolic
demonstrat de patologistul german Richard Altmann [8]. La organismele aerobe genomul
mitocondrial, este foarte variat i poate avea de la 200 kb la Arabidobsis thaliana [235] pn la
2500 kb la Cucumis sativus [150]. Structural materialul genetic al acestuia (compus din
aproximativ 55-60 de gene majoritatea cu funcii necunoscute [121]) este organizat sub form
linear sau circular [141, 179]. La Brassica campestris acesta are o structur tripartit (ADN-ul
dispus sub forma a dou cercuri de aproximativ de 135 kb i unul de 83 kb [184]). La spanac
ADN-ul are form circular cu lungimi de 93 kb i 134 kb [222], iar la gru genomul
mitocondrial, fiind mult mai complex, are o lungime de 430 kb (peste 10 secvene repetitive
[150]). La porumb, ADN-ul mitocondrial are o lungime medie de 570 kb i conine 6 secvene
repetitive [189].
Studiind funcionalitatea acestui genom, se poate afirma faptul c, produii de expresie a
genelor mitocondriale au cele mai variate implicaiuni n procese metabolice: genele coxI, coxII
i coxIII codific citocrom oxidaza [83], cob - Apocitocromul b [39, 40], nad1 i nad5 - NADHUbichinonaoxodoreductaza [244], atp6, atp8, atp9 i atpA - componenii F0-F1 a complexului
ATP-azic [19, 87], iar rps4, rps13 i rps14 codific proteine ribozomale [15, 233], astfel
mutaiile aprute la oricare din aceste gene ar putea fi implicate n apoptoza celular. Iar
experimentele efectuate pe un material enorm de gru au demonstrat rolul genelor mitocondriale
pe parcursul dezvoltrii ontogenetice [263].
n ceea ce privete androsterilitatea citoplasmatic analiza comparativ dintre plantele
androsterile i cele androfertile, din timpul dezvoltrii polenului, (cnd este necesar o cantitate
mare de energie i o activitate mitocondrial normal) [77], pentru primul caz, a scos la iveal o
serie de disfuncii mitocondriale (apariia orf-urilor open reading frame), rezultate n urma
unor rearanjamente complexe sau a inseriei unor secvene strine de ADN [195]. Prin urmare,
identificarea genelor mitocondriale rspunztoare de androsterilitate citoplasmatic, rezult n
multe cazuri n urma analizei materialului genetic dintre liniile fertile i cele sterile. ns, aceast
strategie nu este totdeauna eficient, deoarece uneori diferenele citoplasmatice pot avea mai
degrab un caracter evolutiv fr implicaiuni directe n fenomenul de androsterilitate
citoplasmatic. A doua strategie este determinat de investigarea secvenelor de ADN cu
observaii adecvate n ceea ce privete manifestarea fenotipic. Iar a treia, rezult n urma
comparrii proteinelor sintetizate de mitocondrii dintre liniile sterile i la cele fertile [78]. Astfel,
o serie de autori ajung la concluzia c, genomurile mitocondrial, plastidial i nuclear
18
interacioneaz ntre ele pe parcursul creterii i dezvoltrii, i toate trei sunt indispensabile
pentru o desfurare normal a proceselor vitale la plante [221].
1.1.3. Structura genelor androsterilitii citoplasmatice
Studiul androsterilitii citoplasmatice de la diferite specii de plante: porumb (ASC-T) [41,
195], sorg [10], petunie [250], Brassica napus [210], orez [100], Raphanus sativus [155],
floarea-soarelui [119] etc. a relevat faptul c, acest fenomen apare ca urmare a rearanjamentelor
genomului mitocondrial, prin apariia unor noi cadre de citire.
Spre exemplu analiza comparativ la porumb (ASC-T) dintre genomurile mitocondriale a
plantelor androfertile, sterile i restaurate, au permis identificarea genei ASC: urf 13, care
expreseaz o protein membranar [186] de 13 kDa [43] localizat n amonte de orf 221.
Afirmarea critic, privind avortarea polenului, asociat cu prezena acestei gene i aparine lui
B.G. Gengenbach [71]. Oportunitatea restaurrii la acest tip de citoplasm este cauzat de
inseria unui segment de 5 kb la nivelul genei urf 13 [243], n prezena genei Rf1 care codific o
protein de 15 kDa [67]. Gena Rf2 n cazul dat, nu poate conferi restaurarea androfertilitii,
aceasta codific o aldehiddehidrogenaz i are mai degrab un efect ajuttor al procesului de
restaurare [38]. Studiile citoplasmei androsterile de tip S tot de la porumb, au relevat prezena a
dou cadre de lectur noi: orf355 de origine necunoscut i orf77 cu poriuni asemntoare genei
mitocondriale atp 9 [251]. La sorg, ca i la porumbul de tip S, gena asociat cu androsterilitatea
citoplasmatic (orf107) conine poriuni identice cu gena atp 9, urmat apoi de un segment a
crui codoni sunt asemntori cu gena orf79 de la orez ns, produsul de expresie a acestei gene
nu este pe deplin cunoscut [185].
La gru, situaia privind structura genei ASC - orf256 este complicat de faptul c, aceasta
conine secvene aproximativ asemntoare cu gena mitocondrial cox1 i are aparent aceeai
expresie. Totui, la liniile androsterile a fost observat o protein cu Mr de 7 kDa, care lipsete la
indivizii fertili i cei restaurai [82].
La petunie Yang i col., [250], studiind locusul ASC, ajung la concluzia c acesta este
format din genele: atp9, cox2 i un cadru de lectur necunoscut [250], care expreseaz o protein
de aproximativ 25 kDa.
Examinarea diferitelor categorii de indivizi de Brassica ogyra (sub aspectul
androsterilitii citoplasmatice), au relevat existena unui cadru de lectur orf133, situat n
amontele genei atp8 [16]. Acesta, expreseaz un polipeptid de 19 kDa [73], a crei transcripie
este blocat de prezena genei Rfo [12]. Genotipurile cu citoplasm de tip pol poart locusul
orf224 format din 58 de codoni i o poriune necunoscut, situat n amontele genei atp8 [211].
19
Iar la Brassica napus secvenierea genomului mitondrial de la plantele sterile, relev prezena
unui nou cadru de lectur (orf222), situat ntre genele atp6 i nad5 [22]. La Brassica tournefortii
studiul genei orf263 atest faptul c, aceasta este format din aproximativ 90 de codoni similari
genei nad5, urmat de 45 de codoni asemntori genei atp6, care determin sinteza unei proteine
de 32 kDa, ns funciile i faptul c prezena ei este asociat cu ASC nu sunt nc pe deplin
elucidate [127].
La Raphanus sativus cv. (En. Kosena) gena orf125, asociat cu ASC, are o sructur
asemntoare cu orf 138 de Brassica ogyra i o lungime de 125 de codoni [99].
n cazul fasolei, regiunea ASC, a fost identificat n urma comparrii ADN-ului
mitocondrial ntre liniile sterile i cele cu androfertilitatea restaurat [1], i a fost relevat faptul
c, acesta conine o secven de 239 de codoni numit pvs (Phaseolus vulgaris sterility). n
cazul dat, restaurarea androfertilitii citoplasmatice poate fi determinat ori de aciunea genei
nucleare Fr2, dar care fa de gena nuclear Fr [199], nu determin alterarea ADN-ul
mitocondrial, ci afecteaz profilul transcripional al locusului ASC [30], adic acioneaz la nivel
de ARN.
La floarea-soarelui analiza citoplasmei PET1 a relevat prezena unui cadru de lectur
orfH522 [209], aezat n avalul genei atpA [131] i care codific un transcript de 1,2 kb [119].
Primii 19 aa a acestei gene sunt identici cu atp8 [196], iar toat secvena codific o protein de
aproximaativ 15-16 kDa [171].
1.1.4. Efectele induse de genele ASC
Efectele induse de genele ASC cu precdere, sunt vizibile de-a lungul perioadei
reproductive. Studiul detaliat al acestui fenomen a relevat perturbri de ordin genetic, spaiotemporal, fizio-biochimic i fenotipic.
La nivel genetic: apariia androsterilitii citoplasmatice este cauzat de perturbri ale
genomului mitocondrial, ca urmare a expresiei unui cadru de lectur himer (necunoscut) [78]. Ca
cel mai bun exemplu n acest caz, pote fi citat porumbul cu citoplasm de tip T, unde expresia
genei urf13 duce la androsterilitate [193]. Totodat, experimentele efectuate pe plantele
transgenice de tutun au artat c, produsul acestei gene nu poate provoaca manifestarea
fenotipic a ASC-ului [226], prin urmare expresia i efectul unei gene este n strns
interdependen cu celelalte genomuri celulare.
Prezena genelor ASC poate cauza deformri ale expresiei genelor florale n timp i spaiu.
n acest fel, la gru, transcriptul genei APETALA3 este puternic redus n pistilul liniilor sterile
[173]. n timp ce la morcov, la nivelul carpeloidului florilor ASC a fost observat o scdere a
20
produilor de expresie a genelor Antirrhinum GLOBOSA i DEFICIENS [146]. Ideea conform

creia genele asociate cu ASC n unele cazuri pot conduce la modificri ale expresiei celorlalte
gene florale i aparine lui Bereterbide A., 2002 [14].
Studiul genetico-molecular a androsterilitii citoplasmatice de la numeroase specii de
plante a artat c, acest fenomen este nrudit cauzal cu:
Prezena unor polipeptide noi, himere codificate de mitocondrii cu referire la porumb
[147], sorg [223], rapi [161], floarea-soarelui [11], petunie [250] etc. Aceste polipeptide pot
conine secvene noi de aminoacizi sau secvene care blocheaz omologia cu aminoacizii din
polipeptidul normal. Domenele proteinei nou formate pot conferi polipeptidului diferite caractere
structurale sau funcionale noi [98], care se vor manifesta la diverse nivele.
O alt ipotez sugereaz faptul c, secvenele promotor comune genelor noi, dar i genelor
progeniturilor normale competiioneaz pentru factorii limitativi ce controleaz exprimarea
acestor polipeptide. n acest fel, apare un dezechilibru n ceea ce privete cantitatea de subunitii
enzimatice individuale ce duce la imperfeciuni n biogeneza sau funciile mitocondriilor,
devenind astfel, un factor limitant n dezvoltarea polenului. Aceste ipoteze sunt argumentate de
ASC-T la porumb [101], de ASC de la petunie [13] etc. Genele himere T-urf13 i pcf prezint
secvene promotor similare cu genele mitocondriale normale, dar acestea codific diferite
polipeptide cu caracteristici structurale i funcionale noi.
De asemenea, la plantele androsterile, a fost observat editarea incorect a ARN-ului
genelor mitocondriale. Spre exemplu, la orez transcriptul atp6 este translat ntr-un polipeptid
alterat [100]. O cantitate mare a acestuia, poate cauza ASC prin competiionarea cu proteina
normal atp6. Astfel, a fost raportat c, editarea complet a genei atp6 poate restaura
androfertilitatea de la orez. n cazul ASC-ului baza teoriei difereniale de editare a ARN-ului a
fost elaborat de Hernould n 1992 [86].
Analiza spaio-temporal a plantelor androsterile n majoritatea cazurilor relev faptul c,
dereglrile apar n timpul nfloritului i doar la nivelul organelor reproductive. Aceast ipotez
este confirmat prin studiile efectuate de Bellaoui i col., (1999) [12] pe plantele androsterile de
Brassica napus. La fasole gena ASC este expresat la nivelul esuturilor reproductive i se pare
c produsul de expresie a acesteia, este degradat de prote-aze n celelalte esuturi vegetative
[199]. Studiind expresia fenotipic a 6 gene mitocondriale (cob, coxI, coxII , atp6, atp9 i atpA)
la plantele androfertile, androsterile i cele cu fertilitatea restaurat de floarea-soarelui, Canal L.
i col. n 2001 au observat c, la ultima gen, manifestarea fenotipic este dependent de tipul
celular [27], iar produsul de expresie al ei este prezent ntr-o cantitate mic n antere. ns, n
timpul Profazei II n celulele miocitelor coninutul acesteia crete semnificativ [171]. Astfel,
21
gena atpA care codific F1-ATP-sintaza are un transcript de 1,9 kb fa de 3 kb n liniile sterile,
fiindc noul cadru de lectur orfH522 este transcris cu aceast gen i formeaz o protein de
aproximativ 15 kDa [171], provocnd alterarea procesului de microsporogenez la stadiul de
pachiten. n cele din urm, n Profaza II esutul tapetal este complet degenerat [130]. Ulterior,
aceleai rezultate au fost obinute i de Smart C.J. i col., n 1994 [171]. Modificarea
concentraiei proteinelor aberante pe parcursul dezvoltrii polenului este greu de explicat, n
unele cazuri aceasta poate fi rezultatul creterii cantitative a produilor asociai cu ASC, iar n
altele, ea poate fi determinat de creterea cantitativ a numrului de mitocondrii pe parcursul
dezvoltrii polenului [236]. La liniile cu ASC-PEF1 de floarea-soarelui, gena mitocondrial atp9
sufer o alterare transcripional, n felul acesta, clonarea i secvenierea ei a artat faptul c, ea
are o inserie la captul 3-prim. Probabil acest lucru i st la baza originii ASC-ului [27]. n
modul acesta, degenerarea anterelor n majoritatea cazurilor are loc simultan cu procesul de
microsporogenez la scurt timp nainte sau dup meioza II [129].
Din punct de vedere fiziologic la plante ca i la animale, mitocondria joac un rol important
n signalele de senescen [125] i moarte programat a celulelor (PCD - programmed cell
death). Bunoar, la plantele androsterile a fost observat faptul c, morfologia mitocondriilor
sufer modificri majore n esuturile anterelor i/sau la nivelul nveliului tapetal al florilor
[129], pe parcursul dezvoltrii reproductive.
i, deoarece, funcionarea normal a oricrui
component este ntr-o strns interdependen cu celelalte, plantele androsterile prezint diferite
deformaiuni morfo-anatomice. Astfel, cercetrile electronomicroscopice efectuate pe soie din
timpul microsporogenezei, dup meioza II, atest att dereglri celulare: degradarea membranei
interne a mitocondriilor, a reticulului endoplasmatic (cu cercuri concentrice atipice), a
plastidelor, degenerarea esutului tapetal i formarea prematur a endoteciului [218], ct i la
nivel de esut n general: indivizii androsterili de tutun i petunie prezint abateri ale activitii
oxidative n comparaie cu martorul [197] datorate probabil disfunciilor NADH-dehydrogenazei
mitocondriale [75] n urma disrupiei membranei mitocondriale ca i la porumbul cu citoplasm
androsteril de tip Texas [78]. n acest fel, necesarul mare de energie n timpul
microsporogenezei nu este suportat de mitocondriile deteriorate [201], avnd ca rezultat
avortarea polenului. La floarea-soarelui expresia genei mitocondriale asociate cu ASC cauzeaz
expulzarea citocromului C (un component al lanului transportor de electroni) [214] n citosol,
fapt ce produce PCD [11]. Se pare c aceleai mecanisme sunt prezente i la porumbul
androsteril cu citoplasm de tip S [255]. Astfel, se poate trage o paralel dintre cele dou cazuri
de apariie a androsterilitii citoplasmatice (Tabelul 1.2):
22
Tabelul 1.2. Paralelismul androsterilitii citoplasmatice dintre porumb i floarea-soarelui

Zea mays L. ASC-S
Helianthus annuus L. ASC-PET1
Origine spontan
Origine hibrid
Expulzarea citocromului C din mitocondrie n citosol

Fragmentarea ADN-ului
Apoptoza celular
Fenotipic androsterilitatea citoplasmatic implic manifestri legate de absena:
1. polenului: spre exemplu, proteina membranar URF13 de la porumb este prezent n
toate esuturile vegetative, dar afectate sunt doar gruncioarele de polen [78]. Ipoteza fcut de
Flavell n 1974 remarc posibilitatea interaciunii produilor biosintetici din antere cu proteina
URF13, ducnd la formarea porilor n membrana mitocondrial i ulterior la moartea celulelor
[66]. La fasole manifestarea fenotipic a genei mitocondriale orf239 pare c este dat de faptul
c, proteina ASC este toxic pentru polen [80];
2. anterelor: la Brassica napus care conine propriul material genetic nuclear, iar
mitocondriile recombinate de la Arabidopsis thaliana prezint transformarea anterelor n carpele
i o mulime de perturbri a procesului de dezvoltare per total [138];
3. staminelor: la liniile ASC de gru a fost relatat o transformare a staminelor n nite
structuri asemntoare pistilelor [78];
4. sau a morfologiei florale n general: ca n cazul plantelor androsterile rezultate n urma
ncrucirii diferitelor specii de tutun [180].
Combinarea studiilor electrono-microscopice i fenotipice precizeaz faptul c,
manifestarea fenotipic a ASC-ului este posterioar/rezultatul unor procese: genetice i fiziobiochimice de la nivelul mitocondriei n general. n acest fel, alterarea mitocondriilor n esutul
tapetal este anterioar degenerrii florilor mascule [154].
Generaliznd cele expuse anterior putem conchide faptul c, noile cadre de lectur asociate
cu androsterilitatea citoplasmatic difer de la un sistem ASC la altul, dar adesea poart
segmentele recunoscute a genelor mitocondriale eseniale [36], avnd domenele proteice alterate.
Implicarea mitcondriei n metabolismul energetic este factorul esenial care conduce la ASC [36].
23
1.2. Analiza genetico-molecular a genelor restauratoare de fertilitate

Genele Rf, indispensabile pentru restaurarea androfertilitii citoplasmatice sunt folosite n
calitate de supresor a ASC-ului, facilitnd astfel, producia seminelor hibride.
1.2.1. Diversitatea genelor restauratoare de fertilitate (Rf)
La majoritatea culturilor agricole, cercetarea hibrizilor cu androfertilitatea restaurat, a
demonstrat c, mecanismul eliminrii androsterilitii citoplasmatice este determinat de prezena
genelor nucleare specifice [13, 106], iar reglarea expresiei genelor mitocondriale prin
intermediul celor nucleare este mijlocul important, care coordoneaz sistemului genetic al
mitocondriilor [48] i n majoritatea cazurilor, una sau mai multe gene nucleare influeneaz
activitatea celor mitocondriale. Asemenea reglare este, n general, postranscripional i se
desfoar la nivel de procesing [13, 112]. Totui, au fost raportate i cazuri de reglare
translaional [120].
Variabilitatea genelor Rf la diferite specii de plante, este de la sine neleas. Prin urmare,
exist cazuri cnd restaurarea androfertilitii citoplasmatice este asigurat de prezena unei
singure gene dominante. n sprijinul acestei ipoteze pot fi aduse o mulime de exemple. Astfel, la
indivizii androsterili de Brassica cu citoplasm de tip nap/pol, restaurarea este determinat de
prezena genei Rfn sau Rfp [22, 144]. Porumbul androsteril de tip S este restaurat sub aciunea
genei Rf3 care reduce profilul transcripional ASC. n acest caz, tipul de restaurare este sporofitic
[239, 252]. O situaie similar porumbului ASC-S apare i la citoplasma PET 1 de la floarea
soarelui [33]. La Raphanus sativus cv. en. (Kosena) n prezena genei Rfk1 (orf687) produsul de
expresie ASC: orf125 scade semnificativ [120], aceeai conjunctur apare i la orez cu ASC-BT a
cror linii restauratoare poart gena Rf1 [5]. La fasole locusul restaurator este format dintr-o
singur gen, denumit Fr [105].
n multe cazuri, ns restaurarea complet a androfertilitii este asigurat de dou sau mai
multe gene Rf. Drept exemplu putem cita porumbul androsteril de tip T, unde liniile
restauratoare sunt purttoare a dou gene Rf1 i Rf2 [44], sorgul cu citoplasm de tip IS1112C
care este restaurat de genele Rf3 i Rf4 [224], petunia cu liniile parentale purttoare a genelor
Rf-PPR591 i Rf-PPR592 [13] etc. Aceste funcii suprapuse pot fi rezultatul dublicrii genelor
(cazul polimeriei necumultive) sau o indicaie a complexitii mecanismului de restaurare a
androfertilitii citoplasmatice (cazuri de complementarism a genelor).
n ceea ce privete floarea-soarelui, n majoritatea cazurilor, restaurarea fertilitii polenului
e asigurat de prezena unei singure gene Rf dominante n stare homo sau heterozigot [102].
La aceast cultur, factorii Rf, pentru prima oar au fost evideniai de M. Kinman la linia T
24
66006-2 [116]. Mai apoi, aceste gene au fost evideniate i n populaiile slbatice [46]. Iar mai
trziu genele Rf au fost depistate i la un ir de soiuri locale: Mezechedesi, Discovalante,
Sloveanska-Siva [229], Maiac, pionerul Siberiei [257]. n 1971 Leclerq a identificat gena
dominant (Msc1) la Helianthus anuus ssp. petiolaris [133] i a presupus ca ssp. petiolaris are
genotipul S Msc1Msc1, n timp ce pentru Helianthus annuus este caracteristic genotipul F
msc1.msc1 [133]. Totodat, a fost stabilit c populaiile speciilor Helianthus annuus L.,
Helianthus argophyllus T., Helianthus praecox ssp. runyonii Helianthus, Helianthus tuberossus
L. conin genele Rf cu frecvena de 57-100% [204], iar soiul Progress - 54,7%. n 1971
Vrinceanu A.V. identific gena Rf la linia MZ-1398, i nealela ei la linia T 66006 [230]. Date
mai complete despre genetica restaurrii androfertilitaii la indivizii de floarea-soarelui au fost
primite de cercettorii americani Dominquez E.N. i Fick E.N. n 1975 [46]. Doi ani mai trziu
Raju B.T. i Reddy P.S. au depistat prezena a 3-4 gene nealele restauratoare de fertilitate [191].
Totui, Vrnceanu A.V. i Stoicescu F.M. au gsit i cazuri de control a caracterului restaurrii
fertilitii determinat de ctre dou perechi de gene, care interacioneaz ntre ele [229, 231].
Studiul comparativ al surselor franceze i canadiene de restaurare a fertilitii masculine a
demonstrat faptul c, acestea conin gene Rf nealele [62]. Pentru sursa ASC BAN-1 au fost
identificate dou gene Rf cu interaciune complementar, dintre care o gen alel cu gena Rf3, i
una - nou, denumit Ra1: [268]. Pentru cel mai rspndit tip de ASC la floarea-soarelui, obinut
n baza citoplasmei ssp. Helianthus petiolaris, majoritatea formelor de cultur sunt menintoare
de sterilitate [6], fiind greu de evideniat genotipuri restauratoare de androfertilitate.
Actualmente, genetica restaurrii este multilateral studiat [191], sunt identificate o serie de gene
Rf cu caracter specific pentru un anumit tip de citoplasm i este studiat modul de aciune a
acestor gene [206, 207].
1.2.2. Localizarea genelor restauratoare de fertilitate
Totalitatea genelor restauratoare de fertilitate au o localizare nuclear [161, 252]. Acest
organit reprezint centrul de direcionare i coordonare a activitilor metabolo-reproductive a
celulei i organismului in general [54, 170, 172].
Localizarea cromozomial a unui factor ereditar se bazat pe analiza lincrii acesteia cu
alte categorii de gene sau markeri moleculari. Corelaiile dintre markerii ADN i diferite trsturi
agronomice pot facilita selecia marker asistat i eventual manipularea cu diferite gene [107].
Actual att pentru diverse specii de plante, ct i pentru floarea-soarelui nu exist hri genetice.
Utiliznd diferite tipuri de markeri: DALP, AFLP, i TRAP au fost ncepute doar, nite lucrri de
construcie a BAC librriilor, [57, 96]. O oportunitate bun n privina cartrii ne ofer markerii
25
RFLP. Acetia sunt cu success utilizai pentru recoltarea diferitelor varieti de hibrizi i
evaluarea diversitii genetice ntre speciile cultivate i cele slbatice [149]. Totodat, folosind
analiza monosomic Bahl P.N. i Maan S.S. n 1973 reuesc s identifice gena Rf7 la linia R5
restauratoare pentru citoplasma de tip G de la Triticum timopheevi [9]. Ulterior Murai K. i
Tsunewaki K. carteaz gena restauratoare de fertilitate Rfd1 n braul lung a cromosomului 7B la
Triticum aestivum cv. cu citoplasma androsteril de la Aegilops crassa [174]. Iar civa ani n
urm a fost nceput construcia linkage-hrilor de la floarea-soarelui [251] i cu ajutorul
acestora s-a evideniat gena Rf1 n cromosomul 2 de la liniile fertile [104]. Ulterior Jan C.C.
reuete s identifice gena Rf3 n cadrul liniilor restauratoare de fertilitate de floarea-soarelui
[103].
Cartarea genelor restauratoare de fertilitate cu ajutorul markerilor moleculari
Principala utilitate a markerilor moleculari este reprezentat de folosirea acestora n diferite
tehnici de identificare i cartare a genelor de interes. Utilizarea acestora a nceput odat cu
descoperirea tehnicii PCR. nct, diverse tipuri de markeri moleculari au fost modificai i
mbuntii continuu, i la momentul de fa, s-a ajuns s existe o diversitate mare a acestora. n
prezent modul de aciune a genelor restauratoare de fertilitate este puin cunoscut, ns cartarea i
ulterior izolarea genelor cu ajutorul markerilor moleculari: RAPD, AFLP, CAPS, RFLP, SCAR
i a hrilor genetice va permite soluionarea acestei probleme. n acelai timp, identificarea
markerilor restauratori de fertilitate va permite realizarea BAC-clonelor (bacterilal artificial
chromosome) care, vor ngloba gena de interes [123].
n 1997 Kamps T.L. i Chase C.D. folosind RFLP markeri depisteaz la porumb, locusul
restaurator de fertilitate Rf3 [109]. Dup cum am mai menionat un an mai trziu Jan C.C.,
reuete s carteze gena Rf1 n cromosomul 2 de la floarea-soarelui, iar trei ani mai trziu Jing R.,
utilizind SSLP markeri [106] carteaz la orez gena Rf4 n cadrul liniei restauratoare IR24. La
aceast linie, cei mai apropiai de gena restauratoare de fertilitate s-au dovedit a fi markerii:
RM171 i RM228 la distane de 3,7 i respectiv 3,4 cM. n 2004 Akagi H. i col., reuesc s
carteze tot la orez gena Rf1 n cromozomul 10. Analiza ulterioar a artat c aceast gen
codific o protein PPR de 791 aa cu 16 motive repetitive [5]. La bumbac, n 2004 Zhang J. i
Stewart J. cu ajutorul tehnicilor RAPD identific markerii lincai cu genele Rf1 i Rf2 [253], cei
mai apropiai de gena Rf1 au fost UBC169700 i UBC 6591500, puin mai deprtat la o distan
de 2,8 cM se afl markerul UBC 188500. La liniile de floarea-soarelui cu citoplasm de tip PET1
la nceput se credea c pentru restaurarea fertilitii sunt responsabile genele Rf1 i Rf2. Mai
trziu ns, s-a remarcat c gena Rf2 este prezent la majoritatea genotipurilor, inclusiv la cele
menintoare a androsterilitii [122]. Acest fapt ne duce la ideea c, gena Rf1 este implicat n
26
mare msur n restaurarea fertilitii. Actualmente, un interes sporit a fost acordat cartrii genei
Rf1 de la floarea-soarelui. Aceast lucru i reuete n 2005 Barbarei Kusterer cu ajutorul
markerilor AFLP i RAPD. Cei mai apropiai de gen au fost evideniai urmtorii markeri:
E31M61_136 la o distan de doar 0,3 cM i OPK13_454 la distana de 0,8 cM. n jurul regiunii
de 1,1 cM au mai fost gsii markerii OPY10_740, E39M48_58, E41M48_113, E39M48_210 i
E32M49_75 [122]. Ulterior, J. Feng i C. Jan identific gena Rf4 la linia Helianthus maximiliani
1631, care restaureaz fertilitatea la citoplasma androsteril GIG2 (obinut prin ncruciarea
dintre Helianthus giganteus i Helianthus annuus). Aceast gen a fost cartat cu ajutorul
markerilor SSR, iar lincai de aceast, au fost evideniai markerii ORS13 i ORS 1114 [56].
La etapa actual, n domeniul biologiei moleculare au loc descoperiri majore, ns (din
cauza complexitii genomului eucariot [260], n comparaie cu cel al procariotelor), problema
cartrii genelor de la diverse specii de plante este i va rmne deschis pe o ndelungat
perioad de timp.
1.2.3. Structura genelor restauratoare de fertilitate
Mai multe studii au denotat faptul c, locusul restaurator:
A. Poate avea implicaii directe n procesul restaurrii fertilitii i alcuit:
1. Dintr-o singur gen cum ar fi cazul liniilor restauratoare de la Raphanus sativus, a crei
produs de expresie este o PPR-protein [21, 120] ce conine 16 repetri a cte 35 de aa [120],
avnd o mas molecular de 76.51 kDa [21] (Figura 1.1):
/translation="MLARVCGFKCSSSPAESAARLFCTRSIRDTLAKASGESCEAGFGGESLKLQSGFHEIKGLEDAIDLFSDMLRSRPLPSVVDFC
KLMGVVVRMERPDLVISLYQKMERKQIRCDIYSFNILIKCFCSCSKLPFALSTFGKITKLGLHPDVVTFTTLLHGLCVEDRVSEALDFFHQMFETTC
RPNVVTFTTLMNGLCREGRIVEAVALLDRMMEDGLQPTQITYGTIVDGMCKKGDTVSALNLLRKMEEVSHIIPNVVIYSAIIDSLCKDGRHSDAQNL
FTEMQEKGIFPDLFTYNSMIVGFCSSGRWSDAEQLLQEMLERKISPDVVTYNALINAFVKEGKFFEAEELYDEMLPRGIIPNTITYSSMIDGFCKQN
RLDAAEHMFYLMATKGCSPNLITFNTLIDGYCGAKRIDDGMELLHEMTETGLVADTTTYNTLIHGFYLVGDLNAALDLLQEMISSGLCPDIVTCDTL
LDGLCDNGKLKDALEMFKVMQKSKKDLDASHPFNGVEPDVQTYNILISGLINEGKFLEAEELYEEMPHRGIVPDTITYSSMIDGLCKQSRLDEATQM
FDSMGSKSFSPNVVTFTTLINGYCKAGRVDDGLELFCEMGRRGIVANAITYITLICGFRKVGNINGALDIFQEMISSGVYPDTITIRNMLTGLWSKE
ELKRAVAMLEKLQMSMDLSFGG"
Fig. 1.1. Produsul de expresie a genei Rfo de la Raphanus sativus [21].

2.
Sau din mai multe gene lincate, care corespund relatrilor fcute la petunie [13] unde au
fost gsite dou gene denumite Rf-PPR591 i Rf-PPR592, (Figura 1.2-1.3). Studiul produsului
PCR a genei rfPPR592 de la Petunia hibrida a artat o similaritudine genetic de 97% cu gena
Rf-PPR591 i 94% cu Rf-PPR592 [13]. De asemenea a fost demonstrat faptul c gena RfPPR592 codific o protein de 592 aa care are 14 motive pentatrricopeptid repititive a cte 35
de aa i este capabil s reduc cantitatea de pcf-protein sintetizat de gena
mitocondriala.
27
(ASC)
/translation="MMRIAVRYCLNGNPFFSFFAYSIAPRHYSTNTCSISVKGNFGVSNEFENVKCLDDAFSLFRQMVTTKPLPSAVSFSKLLKALV
HMKHYSSVVSIFREIHKLRIPVDAFALSTVVNSCCLMHRTDLGFSVLAIHFKKGIPYNEVTFTTLIRGLFAENKVKDAVHLFKKLVRENICEPDEVM
YGTVMDGLCKKGHTQKAFDLLRLMEQGITKPDTCIYNIVIDAFCKDGMLDGATSLLNEMKQKNIPPDIITYTSLIDGLGKLSQWEKVRTLFLEMIHL
NIYPDVCTFNSVIDGLCKEGKVEDAEEIMTYMIEKGVEPNEITYNVVMDGYCLRGQMGRARRIFDSMIDKGIEPDIISYTALINGYVEKKKMDKAMQ
LFREISQNGLKPSIVTCSVLLRGLFEVGRTECAKIFFDEMQAAGHIPNLYTHCTLLGGYFKNGLVEEAMSHFHKLERRREDTNIQIYTAVINGLCKN
GKLDKAHATFEKLPLIGLHPDVITYTAMISGYCQEGLLDEAKDMLRKMEDNGCLPDNRTYNVIVRGFFRSSKVSEMKAFLKEIAGKSFSFEAATVEL
LMDIIAEDPSLLNMIPEFHRDNKK"
Fig. 1.2. Produsul de expresie a genei Rf-PPR592 [13].
/translation="MMRISVRYCLNGNPFFSFFAYSIAPRHYSTNTCSISVKGNFGVSNEFQNVKCLDDAFSLFRQMVRTKPLPSVASFSKLLKAMV
HMKHYSSVVSLFREIHKLRIPVHEFILSIVVNSCCLMHRTDLGFSVLAIHFKKGIPYNEVTFTTLIRGLFAENKVKDAVHLFKKLVRENICEPNEVM
YGTVMNGLCKKGHTQKAFDLLRLMEQGSTKPNTRTYTIVIDAFCKDGMLDGATSLLNEMKQKSIPPDIFTYSTLIDALCKLSQWENVRTLFLEMIHL
NIYPNVCTFNSVIDGLCKEGKVEDAEEIMRYMIEKGVDPDVITYNMIIDGYGLRGQVDRAREIFDSMINKSIEPDIISYNILINGYARQKKIDEAMQ
VCREISQKGLKPSIVTCNVLLHGLFELGRTKSAQNFFDEMLSAGHIPDLYTHCTLLGGYFKNGLVEEAMSHFHKLERRREDTNIQIYTAVIDGLCKN
GKLDKAHATFEKLPLIGLHPDVITYTAMISGYCQEGLLDEAKDMLRKMEDNGCLADNRTYNVIVRGFLRSNKVSEMKAFLEEIAGKSFSFEAATVEL
LMDIIAEDPSITRKMHWIKLHIA"
Fig. 1.3. Produsul de expresie a genei Rf-PPR591 [13].
n aceeai categorie intr genele restauratoare Rf1A i Rf1B din cadrul liniei C9083 de la
orez [234] (Figura 1.4). Prima, are un numr total de 5305 nucleotide i codific o PPR protein
alctuit din 791 aa cu o mas molecular de 87,62 kDa.
/translation="MARRAASRAVGALRSDGSIQGRGGRAGGSGAEDARHVFDELLRRGRGASIYGLNRALADVARDSPAAAVSRYNRMARAGADEV
TPDLCTYGILIGCCCRAGRLDLGFAALGNVIKKGFRVDAIAFTPLLKGLCADKRTSDAMDIVLRRMTELGCIPNVFSYNILLKGLCDENRSQEALEL
LHMMADDRGGGSPPDVVSYTTVINGFFKEGDSDKAYSTYHEMLDRGILPDVVTYNSIIAALCKAQAMDKAMEVLNTMVKNGVMPDCMTYNSILHGYC
SSGQPKEAIGFLKKMRSDGVEPDVVTYSLLMDYLCKNGRCMEARKIFDSMTKRGLKPEITTYGTLLQGYATKGALVEMHGLLDLMVRNGIHPDHYVF
SILICAYANQGKVDQAMLVFSKMRQQGLNPNAVTYGAVIGILCKSGRVEDAMLYFEQMIDEGLSPGNIVYNSLIHGLCTCNKWERAEELILEMLDRG
ICLNTIFFNSIIDSHCKEGRVIESEKLFELMVRIGVKPNVITYNTLINGYCLAGKMDEAMKLLSGMVSVGLKPNTVTYSTLINGYCKISRMEDALVL
FKEMESSGVSPDIITYNIILQGLFQTRRTAAAKELYVRITESGTQIELSTYNIILHGLCKNKLTDDALQMFQNLCLMDLKLEARTFNIMIDALLKVG
RNDEAKDLFVAFSSNGLVPNYWTYRLMAENIIGQGLLEELDQLFLSMEDNGCTVDSGMLNFIVRELLQRGEITRAGTYLSMIDEKHFSLEASTASLF
IDLLSGGKYQEYYRFLPEKYKSFIESLSC"
Fig. 1.4. Produsul de expresie a genei Rf1A de la orez [5].

Iar a doua gen restauratoare de fertilitate, are un produs de expresie PPR format din 506
aa i o mas molecular de 55,38 kDa (Figura 1.5).

/translation="MARRVAARARARAGGVPRSEGTIQDRARVGSGGAEDALDVFDELLRRGIGAPIRSLNGALADVARDNPAAAVSRFNRMARAGA
SMVTPTVHTYGILIGCCCSAGRLDLGFAALGHVVKKGFRVEPIIFNPLLKGLCADKRTDDAMDIVLRGMTELGCVPNVFSHTIILKGLCHENRSQEA
LELLHMMADDGGGCLPNVVSYSTVTDGLLKGGDPDKAYATYREMLDRRILPNVVTYSSIIAALCKGQAMDKAMEVHDRMVKNGVTPNCFTYTSLVHG
FCSSGQLTEAIKFLEKMCSNGVEPNVVTYSSFMDYLCKNGRCTEARKIFYSMVKRGLKPDITTYSSLLHGYAIEGALVEMHGLFDLMVQSDMQPDHY
VFNTLIYASAKQGKVDEAMLVFSKMRHQGLKPNCVTYNTLINGYCKITRMENALALFQEMVSNGVSPNFITYNIMLQGLFRTGRTGTAKEFYVQIIK
SGKKDLIEQGLLEELDDLFLSMEDNDCSTVSTPAC"
Fig. 1.5. Produsul de expresie a genei Rf1B de la orez [234].
Pe lng genele restauratoare de fertilitate pentru orezul cu citoplasm de tip boro [112],
motivul PPR a fost identificat i la o serie de gene Rf de la alte organisme la Arabidobsis
thaliana [216], porumb [148] etc. Astfel, este foarte probabil ca genele Rf de la diferite specii
de plante, s aib aceea organizare genomic. Studiile recente au artat c, fiecare PPR proteina
este format din dou alfa-helixuri cu partea central format din lanuri hidrofilice ncrcate
pozitiv [120]. Din aceste considerente, o mulime de cercettori au ajuns la concluzia c aceste
proteine, att la plante [216] ct i la animale (proteina LRP130 de la om i BSF de la
Drosophila) [169] pot inti ARN-ul, avnd implicaiuni n reglarea expresiei materialului genetic
extranuclear. La organismele vegetale exist mai multe categorii de gene care codific PPR
proteine i sunt implicate n diverse procese privind expresia genelor mitocondriale sau a celor
plastidiale [216]. La gru proteinele PPR PET309 [157] i Neurospora CYA5 sunt implicate n
stabilitatea i translaia proteinei mitocondrriale coxI [156], la porumb produsul de expresie PPR
28
a genei crp1 este responsabil pentru procesingul transcriptului genei petD i este implicat n
translaia genelor petA i petD [64], acest produs de expresie a fost identificat ntr-o cantitate
mare n stroma cloroplastelor [64]. Mutanii de Arabidobsis ce conin proteina PPR (produsul de
expresie a genei hcf 152) prezent o puternic autofluorescen clorofilian i o multitudine de
defecte privind stabiliatea procesingului transcripilor operonului psbB-psbT-psbH-petB-petD
[160]. Deoarece, pentratricopeptidele sunt oarecum asemntoare cu tetratricopeptidele care
formeaz alfa-helixurile amfipatice [126] este foarte probabil ca acestea s aib o structur
asemntoare [78]. De asemenea, a fost naintat ipoteza c c PPR motivele ar putea codifica
proteinele cu caracter acid, sau fosfoproteinele [216].
B. n alte cazuri factorii restauratori pot aciona conjugat cu alte gene cum ar fi cazul
porumbului cu citoplasma de tip T, unde gena Rf2 are mai degrab aciune compensatorie a
defectelor metabolice cauzate de proteina mitocondrial URF13, reducnd gradul de toxicitate a
acesteea [42]. Totodat s-a demonstrat c, produsul de expresie a acesteea este o
aldehiddehidrogenaz [147], ce face parte din a doua familie a aldehiddehidrogenazelor care au
ca int mitocondria [148], spre deosebire de prima familie, ce are ca int citosolul i nu este
implicat n restaurarea fertilitii, iar a treia familie este implicat n detoxifierea aldehidelor
rezultate n urma peroxidrii lipidelor [145] i are rol antitumoral [215].
La Zea mays aldehiddehidrogenazele implicate n procesul restaurator sunt de dou tipuri
RF2A i RF2B. Prima poate oxida aldehide cu lanul mai mare de 10 atomi de carbon inclusiv i
cele aromatice, iar a doua xideaz aldehide cu lan mai scurt de 10 atomi de carbon. Ambele
proteine intesc mitocondria i sunt produii genelor Rf2a i Rf2b (cu Mr de 214 i 200 kD),
proteinele acestor gene sunt homotetramerice a cror subuniti au 54,2 i 54 kDa [148].
Aceleai aldehiddehidrogenaze cu rol restaurator de fertilitate au fost gsite la:
Tutun: a crei protein are o mas molecular de 59,34 kDa i un numr total de 542 aa
(Figura 1.6).
/translation="MAARVFTSRLSRSLTSSSHLLSRGLIIVDKQKSHLGRIAAYQYSTAAAIEEPIKPAVNVEHTKLFINGQFVDAASGKTFPTLD
PRTGEVIAHVAEGDAEDINRAVAAARKAFDEGPWPKMNAYERSKIFVRLADLIEKHNDQIATLETWDTGKPYEQAAKIEVPMVVRLLRYYAGWADKI
HGMTIPADGPYHVQTLHEPIGVAGQIIPWNFPLLMFSWKIGPALACGNTVVLKTAEQTPLSAFYVAHLLQEAGLPEGVLNIISGFGPTAGAPLCSHM
DVDKLAFTGSTDTGKAILSLAAKSNLKPVTLELGGKSPFIVCEDADIDTAVEQAHFALFFNQGQCCCAGSRTFVHEKVYDEFLEKAKARALKRTVGD
PFKSGTEQGPQIDSKQFDKIMNYIRSGIDSGATLETGGERLGERGYYIKPTVFSNVKDDMLIAQDEIFGPVQSILKFKDVDDVIRRANNSRYGLAAG
VFTQNIDTANTLTRALRVGTVWVNCFDTFDATIPFGGYKMSGHGREKGEYSLKNYLQVKAVVTPLKNPAWL"
Fig. 1.6. Produsul de expresie a genei NtALDH2a [26].
Orez a crei produs de expresie are 553 aa i o mas molecular de 58,91 kDa [175]
(Figura 1.7).
/translation="MAARRAASSLLSRGLIARPSAASSTGDSAILGAGSARGFLPGSLHRFSAAPAAAATAAATEEPIQPPVDVKYTKLLINGNFVD
AASGKTFATVDPRTGDVIARVAEGDAEDVNRAVAAARRAFDEGPWPRMTAYERCRVLLRFADLIEQHADEIAALETWDGGKTLEQTTGTEVPMVARY
MRYYGGWADKIHGLVVPADGPHHVQVLHEPIGVAGQIIPWNFPLLMFAWKVGPALACGNAVVLKTAEQTPLSALFVASLLHEAGLPDGVLNVVSGFG
PTAGAALSSHMGVDKLAFTGSTGTGKIVLELAARSNLKPVTLELGGKSPFIVMDDADVDQAVELAHRALFFNQGQCCCAGSRTFVHERVYDEFVEKA
RARALQRVVGDPFRTGVEQGPQIDGEQFKKILQYVKSGVDSGATLVAGGDRAGSRGFYIQPTVFADVEDEMKIAQEEIFGPVQSILKFSTVEEVVRR
ANATPYGLAAGVFTQRLDAANTLARALRVGTVWVNTYDVFDAAVPFGGYKMSGVGREKGVYSLRNYLQTKAVVTPIKDAAWL"
Fig. 1.7. Produsul de expresie a genei OsALDH2a [175].
29
Arabidobsis thaliana, n cazul dat proteina restauratoare este format din 534 aa i are o
mas molecular de 58,33 kDa [212] (Figura 1.8) etc.

/translation="MASRRVSSLLSRSFMSSSRSIFSLRGMNRGAQRYSNLAAAVENTITPPVKVEHTQLLIGGRFVDAVSGKTFPTLDPRNGEVIA
QVSEGDAEDVNRAVAAARKAFDEGPWPKMTAYERSKILFRFADLIEKHNDEIAALETWDNGKPYEQSAQIEVPMLARVFRYYAGWADKIHGMTMPGD
GPHHVQTLHEPIGVAGQIIPWNFPLLMLSWKLGPALACGNTVVLKTAEQTPLSALLVGKLLHEAGLPDGVVNIVSGFGATAGAAIASHMDVDKVAFT
GSTDVGKIILELASKSNLKAVTLELEESHHSFVCEDADVDQAVELAHFALFFNQGQCCCAGSRTFVHERVYDEFVEKAKARALKRNVGDPFKSGIEQ
GPQVDSEQFNKILKYIKHGVEAGATLQAGGDRLGSKGYYIQPTVFSDVKDDMLIATDEIFGPVQTILKFKDLDEVIARANNSRYGLAAGVFTQNLDT
AHRLMRALRVGTVWINCFDVLDASIPFGGYKMSGIGREKGIYSLNNYLQVKAVVTSLKNPAWL"
Fig. 1.8. Produsul de expresie a genei ALDH3 [212].
1.2.4. Rolul genelor Rf n normalizarea proceselor biologice n F1

La momentul de fa, restaurarea androfertilitii citoplasmatice prin intermediul genelor
nucleare este studiat intensiv [252]. Acesta, reprezint obiectul de studiu nu doar a
amelioratorilor i geneticienilor, ci i a biochimitilor, fiziologilor i a anatomitilor n general.
La nivel genetic factorii restauratori pot fi implicai:
1. n reformarea ADN-ul mitocondrial cazul fasolei [105] cnd factorii Fr altereaz
structura genei implicate n androsterilitatea citoplasmatic [182].
2. Modificarea profilului transcripional a genelor ASC. Astfel, gena Rf3 de la porumbul cu
citoplasm de tip S reduce profilul transcripional a genelor orf335 i orf77 [239, 252]. La
Brassica spp. genele Rf duc la scaderea profilului transcripional a genei ASC orf224 (pentru
citoplasma de tip pol) i orf222 (pentru citoplasma de tip nap) [144] i se pare c sunt
implicate n expresia altor gene mitocondriale [22, 210]. Bazndu-se pe aceste considerente Li i
col. n 1998 emit ipoteza c locusul Rfn/Rfp ar putea fi foarte complex i alctuit din mai multe
gene lincate [144]. De asemenea a fost observat c, locusul restaurator Rf1 (format din genele
Rf1A i Rf1B) de la orez duce la distrugerea ARNm a genei mitocondriale (tip Boro II) asociate cu
ASC: atp6/orf79 [234]. La floarea-soarelui, mecanismul restaurator este determinat de
degradarea transcriptului genei mitocondriale orfH522. n acest caz, se pare c, genele
restauratoare contribuie la poliadenilarea structurii atpA-orfH522, astfel nct ARN-aza2
degradeaz substratul dat [70].
3. Creterea profilului transcripional a celorlalte gene mitocondriale fr a altera expresia
celei asociate cu ASC. Aceste date sunt confirmate de studiile efectuate pe sorg cu citoplasm de
tip IS1112C unde restaurarea este dat de doi loci de fertilitate Rf3 i Rf4 care mresc activitatea
transcripional la celelalte gene, exceptnd orf107, specific citoplasmei androsterile [224].
4. Genele restauratoare pot induce (direct sau indirect) expresia unor gene antiapoptozice.
Dup cum am menionat anterior, la plantele androsterile de floarea-soarelui (PET 1) a fost
relatat expulzarea citocromului C din mitocondrie n citosol, fapt care produce apoptoza [11].
Restaurarea n acest caz are loc ca urmare a poliadenilrii transcriptului ASC [70, 89], acesta
30
fiind ulterior degradat de ARN-aze [70]. Se pare c aceste efecte ar putea fi datorate unui
complex numit degradosome care este format din dou enzime: polinucleotid fosforilaza i
ARN-aza [28]. Ca i la floarea-soarelui (PET 1) i la porumbul cu citoplasm de tip S, ar putea
funciona acelai mecanism androsteril (Tabelul 1.3). n felul acesta, la porumb, analiza
indivizilor sterili, fertili i a celor cu androfertilitatea restaurat prin intermediul genei Rf3 a scos
la iveal c, genele antiapoptozice: VDAC2 (Voltage-dependent anion channel protein 2); BI-1
(Bax-inhibitor); cystatin II i AdoMetDC (S-adenosyl-L-methionine decarboxylase) sunt foarte
puin expresate la liniile materne fa de cele restaurate. Astfel, Zhang Z. i col., n 2005 ajung la
concluzia c una din funciile genei Rf3 este determinat de inhibarea apoptozei celulare [255].
Tabelul 1.3. Paralelismul restaurrii fertilitii citoplasmatice dintre porumb i floarea-soarelui
Zea mays L. ASC-S
Helianthus annuus L. ASC-PET1
O gen Rf3
O gen Rf1
Restaurare sporofitic
Aciuneaz la nivel de ARN a genei ASC

Efect pleiotrop sau mai multe gene lincate implcate n restaurare
nltur apoptoza celular
Astfel, poate fi remarcat faptul c, mecanismul restaurator, n majoritatea cazurilor, nu se
bazeaz pe modificarea factorilor citoplasmatici, ci pe reprimarea genei corespunztoare din
citoplasm steril [265].
Studiind expresia spaio-temporal a genei restauratoare de fertilitate de la Brassica napus
a fost observat faptul c, transcriptul ASC este foarte puternic redus la formele restaurate n
petale, stamine i carpele, dar nu i n sepale [161]. La Raphanus sativus cv. (en. Kosena radish)
prezena genei Rfk1 (orf687) se pare c nu produce modificri eseniale ale ARN-ul mitocondrial
a genei ASC: orf125, dar, proteina acestuia totui este drastic redus [120] n prezena factorilor
restauratori n stare dominant. La sorg, efectul restaurator este determinat de reglri
postranslaionale pe de oparte, ct i de mbuntirea expresiei unor gene mitocondriale (atp6
[94]) pe de alt parte. De asemenea, analiza extractului proteic din esuturile florale ale formelor
androsterile de petunie, au relevat prezena proteinei URF-S (de 25 kDa) asociat cu ASC-ul. n
acest caz, ntroducerea genlor Rf atest prezena unui polipeptid numit anti-URF-S care intete
proteina androsteril. La floarea-soarelui, studiul comparativ al indivizilor androfertili,
androsterili i cei cu fertilitatea restaurat au relevat c, transcriptul genei mitocondriale atpA
care ar trebui s fie prezent ntr-o cantitate ridicat n miocitele tinere de la toate liniile se afl
31
ntr-o cantitate mai mic la cele sterile, ulterior a fost observat c produii de expresie a genelor
restauratoare intesc aceste miocite i reduc abundena transcriptului atpA-orf522 la formele ASC
(n toate stadiile specifice dezvoltrii gruncioarelor de polen premeioz, leptoten, pachiten,
Profaza2, telofaza2 i spor tnr) punctul culminant al acestui fenomen, este atins n timpul
leptotenului, telofazei II i la sporul tnr [171].
n majoritatea cazurilor, examinarea hibrizilor cu androfertilitatea restaurat arat c
genele nucleare, n stare dominant (Rf), exercit aciune reparatorie n organele reproductive ale
hibrizilor cu androfertilitatea restaurat, normalizeaz proporia hidrailor de carbon, a
aminoacizilor liberi i legai [258]. Totodat, au fost evideniate i cazuri de normalizare a
activitii sistemelor enzimatice cazul genei Rf2 de la porumbul androsteril cu citoplasm de tip
T, avnd aciune detoxificatoare i metaboliznd acetaldehida [42], a crei cantitate crete (la
plantele androsterile) n urma unui proces intens de fermentaie alcoolic. Astfel, genotipurile
restaurate prezint o restaurare a proceselor fizio-biochimice
n general [3, 35], fapt care
contribuie la restabilirea structurii mitocondriilor [269] i la regenerarea sistemei vaselor inelare

n filamentele staminelor i a pistilului, avnd drept rezultat nutriia polenului i fructificarea
florii. n cazul polimeriei cumulative, restaurarea parial a fertilitii, se caracterizeaz prin
dezvoltarea insuficient a vaselor staminale [267], acest grad depinznd de doza genei i de
efectul interaciunii dintre ele [262].
Fenotipic prezena genelor Rf relev o manifestare normal a organelor florale de la liniile
restaurate [13, 74]. Astfel, introducerea genelor Rf1 i Rf2 la porumbul androsteril cu citoplasm
de tip T confer restaurarea [44], iar la linia androsteril de Petunia parodii 3688, prezen genei
restauratoare de fertilitate Rf-PPR592 manifest o reabilitare a dezvoltrii staminelor i anterilor
[13]. Alte studii efectuate n 2006 de Gulyas G. i col., la plantele de ardei rou (Capsicum
annuum L.) care au ncruciat linia androsteril 201 cu o linie restauratoare i au observat c,
hibrizii reyultai prezentau o dezvoltare normal a filamentului staminal, conectivului i a
anterei. Seciunile transversale ale florilor au artat o dezvoltare normal a vaselor conductoare,
iar colorarea polenului cu acetocarmin de 1% a relevat o fertilitate total a acestuia [74]. La
gru (linia androsteril (c)-N26 T), introducerea genei Rfd1, la duce la nlturarea androsterilitii
printr-o dezvoltare normal a rahisului i a spiculeelor [174], iar la linia transgenic de orez
(BTA [ms-bo]rf1/rf1) prezena locusului restaurator Rf1
confer o dezvoltare normal a
rahisului, spiculeelor i o restaurare a fertilitii polenului [113].
32
1.3. Aspeste generale privind sistemele ASC-Rf

Pe lng rolul practic, pe care l au sistemele ASC-Rf, acestea sunt binevenite n studiul
geneticii moderne, oferind o serie de date valoroase cu privire la mecanismele de interaciune a
plasmo cariogenelor.
1.3.1. Diversitatea sistemelor ASC-Rf
Investigaiile microsporogenezei i a restaurrii fertilitii polenului efectuate de Orel L.I.,
la hibrizii de secar de prima generaie, au relevat existen a dou categorii de cazuri: la prima
se refereau cei a cror polen era fertil 100%, iar ntr-a doua intrau indivizii cu doar 50% polen
fertil [261]. Mai trziu Vahrueva .I. a relatat aceeai situaie la genotipurile de porumb. Astfel,
restaurarea liniilor androsterile de tip S determina fertilitatea polenului n proporie de 100%, la
ele restaurarea se efectua n stadiul sporofitic, iar formele androsterile de tip M au prezent doar
50% polen ffertill, restaurarea acestora era n stadiul de gametofit [256]. Aceleai rezultate sub
aciunea genei Rf3 la plantele deporumb cu citoplasm de tip S, au fost obinute de Wen L.Y. i
Kamps T.L. [239]. La sorg, pentru o restaurare total a citoplasmei de tip IS1112C sunt necesari
doi loci restauratori: Rf3 i Rf4 [224]. Iar, la linia transgenic de orez (BTA [ms-bo]rf1/rf1)
prezena genei Rf1 numit i PPR8-1 duce la o restaurare a fertilitii polenului n proporie de
50%, n cazul dat tipul de restaurare a androfertilitii citoplasmatice este de tip gametofitic
[113].
Generaliznd cele spuse anterior, putem conclude c, sistemele de restaurare a fertilitaii
sunt de dou tipuri: sporofitice, care restaureaz fertilitatea n esuturile sporofitice sau n alte
esuturi, nainte de meioz i gametofitice, la care restaurarea fertilitii la nivelul microsporilor
sau a gruncioarelor de polen are loc dup meioz [98].
Deci, o plant hibrid de prima generaie (Rfrf) n cazul restaurrii sporofitice va produce
100% polen funcional, deoarece produsul genei restauratoare de fertilitate i manifest aciunea
asupra mitocondriilor din esutul sporogen nainte de meioz. Astfel, are loc repartizarea
mitocondriilor dintr-o celul diploid (2n) n patru gruncioare de polen (n) cu sindromul
androsterilitii deja supresat. Dar dac, sinteza produsului genei restauratoare de fertilitate are
loc dup meioz, n acest caz, el va fi capabil s nlture androsterilitatea doar n gruncioarele
de polen unde gena restauratoare se afl n stare dominant, rezultnd doar 50% polen
funcional.
ns, n ambele tipuri de sisteme, funcioneaz conceptul de timp critic de restaurare [23],
adic timpul pn la care aciunea genei Rf ar putea supresa maifestarea fenotipic a ASC. Dar
33
dac, gena restauratoare i sintetizeaz produsul de expresie mai trziu, aciunea plasmogenei va
fi prea puternic, ducnd la o avortare indispensabil a polenului.
1.3.2. Interaciunea la diferite nivele a componentelor sistemului ASC-Rf.
n 1999, cercetnd genomurile: nuclear, mitocondrial i plastidial Orlov P.A. i Pyko V.I.,
identific rolul major al interaciunii plasmo cariogenelor n dezvoltarea gruncioarelor de
polen la gru [184]. Dei, rolul fundamental la formarea morfostructurilor n vivo le revine
genelor nucleare, care folosesc citoplasma ca substrat, o serie de etape ale morfogenezei
esuturilor generative sunt direcionate de implicarea egal nucleu citoplasm [266].
La rndul su, savanii institutului de genetic din Belarusia: Palilova A.N., Orlov P.A. i
Voluevici E.A. au ncercat s lmureasc modul de interaciune nucleu citoplasm sub aspectul
ASC-ului i a restaurrii androfertilitii citoplasmatice. Astfel, Palilova A.N. n 1986 aduce la
cunotin un model de sistem ASC-Rf care a avut un rsunet larg n lumea geneticienilor.
Principiul de baza al acestui sistem era reprezentat de faptul c, ASC-ul apare n rezultatul unei
mutaii mitocondriale. Aceasta, perturb interaciunea nucleu citoplasm, n urma creia
rezult o sintez n exces a proteinei represoare cu implicaii n funcionarea mitocondriilor i
dereglarea procesului de microsporogenez. Prezena genelor Rf n stare dominant au rol de
efector i controleaz eliberarea proteinei inductoare ce blocheaz la rndul su represorul i
activeaz sinteza proteinelor mitocondriale [264]. Prin urmare, n cazul unei mutaii la nivel
citoplasmatic, apare un disbalans n cadrul componentelor genomice, fapt ce duce la dereglarea
dezvoltrii esuturilor generative i somatice ale anterelor [266].
ns, modelul expus de Palilova A.N. nu poate fi generalizat pentru toate cazurile existente,
fiindc diverse sisteme (ASC-Rf) difer de la o specie la alta [79]. Dificultatea studiului
interaciunii nucleu citoplasm este dat i de faptul c, n cele mai multe cazuri deficitul
vreunui produs de expresie mitocondrial este letal pentru ntregul organism [161] i pentru a
nelege mai bine mecanismul de interaciune ASC-Rf, aciunile acestora ar trebui clasificate n
mai multe cazuri:
1. Dac apariia ASC este determinat de disfuncii mitocondriale, atunci restauratorii
compenseaz sau nlocuiesc funcia genei mitocondriale distruse [98]. n felul acesta, la
Nicotiana tabacum introducerea n celule a produilor de expresie normali a genei mitocondriale
distruse, asociate cu ASC, duce la restaurarea androfertilitaii citoplasmatice [17].
2. Dac ASC apare ca rezultat al achiziiei unor gene noi care genereaz o substan toxic,
genele nucleare implicate n restaurarea fertilitii afecteaz abundena genei ce codific
substana toxic sau chiar expresia n general a acestei gene [187]. Acest model coincide cu
34
datele obinute: la petunie [77] a crei cadru ASC este format din regiuni ce codific ATPsintetaza subunitatea 9 i citocromoxidaza subunitatea 2, prezena genelor Rf confer restaurarea
[250].
La porumbul androsteril de tip T, genele Rf1 i Rf2 aparent scad acumularea transcriptelor
orf-mitocondriali prin implicarea n evenimentele ARN-procesingului [44, 223], iar gena Rf2
acioneaz conjugat cu Rf1 i are aciune de compensare a defectelor metabolice cauzate de
proteina mitocondrial URF13 reducnd gradul de toxicitate a acesteia [42]. De asemenea, s-a
mai demonstrat c produsul de expresie a acestei gene este o aldehiddehidrogenaz [147].
Analiza porumbului cu citoplasm de tip S, a evideniat c, factorii Rf au efect pleiotrop. n
cazul dat Lanying W. i Christine D.C. ajung la concluzia c ele pot codifica sau reglementa
Mmt modifier of mithocondrial transcripts [128]. Observaii similare au fost fcute i la genele
Rfn de la rapi (Brassica ssp.) i Rf3 de la sorg [144, 210].
3. O alt ipotez este reprezentat de corelaia dintre genele de restaurare i genele
implicate n controlul recombinrii ADN-ului mitocondrial. n acest fel, introducerea genelor de
restaurare ale fertilitii poate determina alterri ale genomului mitocondrial sau o expresie
preferenial a genelor mitocondriale [98]. n consecin, genele Fr (fertility restotrer) de la
fasole produc o pierdere a secvenelor ADN-ului mitocondrial cu caracter ASC [152, 153], avnd
posibilitatea de supresiune a numrului de copii a cromozomului mitocondrial cu caracterul
androsteril [105].
4. De asemenea, mai multe studii au relevat faptul c, transcriptele paternale ale genelor
ASC sunt alterate n prezena genelor nucleare restauratoare de fertilitate [171, 223, 244]. Astfel,
editarea ARN-ului reprezint un alt mecanism potenial care explic aciunea genelor Rf [37].
La floarea-soarelui a fost observat c, citoplasma PET-1 provoac moartea programat a
celulelor (PCD-premature programmed cell death) [11], iar restaurarea androfertilitii n
prezena genelor Rf, [33] duce la instabilitatea ARN-ului mitocondrial din cadrul complexului
atpA-orfH522 [70]. Acest lucru este determinat de poliadenilarea structurii atpA-orfH522 astfel
nct ARN-aza 2 degradeaz substratul poliadenilat [70]. Prin urmare, n multe cazuri genele Rf
altereaz profilul transcriptului mitocondrial reducnd astfel acumularea produilor de expresie
asociai cu ASC [171, 210].
Descoperirea ASC de ctre Leclercq P. n 1966 i identificarea genelor resturatoare de
fertilitate, a deschis noi orizonturi pentru selecionerii florii-soarelui. n acest fel, sistemul ASCRf devine frecvent utilizat (n practica agricol) pentru crearea hibrizilor comerciali. Primul
35
component al sistemului - androsterilitatea citoplasmatic (ASC), este determinat de gene

himere mitocondriale, iar al doilea - genele Rf (nucleare) contribuie la restabilirea fertilitii i
obinerea unei producii nalte de semine.
La floarea-soarelui a fost evideniat c, pentru fiecare tip de ASC: ANN1; ANN5; ANL2;
ANT1 etc. este necesar o anumit categorie de gene Rf. Din cele patru gene restauratoare de
fertilitate identificate, gena Rf1 care restaureaz fertilitatea polenului n cadrul citoplasmei PET1,
rmne a fi cea mai utilizat n crearea hibrizilor productivi. Iar dup cum am menionat anterior,
utilizarea acelorai genotipuri restauratoare poate avea repercursiuni grave agroeconomice.
Din
aceste
considerente,
studiul
mecanismelor
moleculare
ale
androsterilitii-
androfertilitii, identificarea genelor restauratoare de fertilitate la diferite genotipuri de floareasoarelui, cultivate n Republica Moldova i cercetarea procesului de restaurare i motenire a
fertilitii polenului va conduce la acumularea unor cunotine noi, la evidenierea anumitor
particulariti specifice i elucidarea aspectelor de interaciune nucleu citoplasm.
Atingerea scopului a constat n realizarea urmtoarelor obiective:
- analiza bioinformatic a genelor Rf i ASC (indici biochimici, domene proteice, structur i
localizare spaial) care formeaz sistemele ASC-Rf la diverse specii de plante;
- polimorfismul genetic (RAPD) la formele ASC, Rf i F1 corelat cu particulariti morfologice;
- determinarea numrului i tipului de interaciune dintre genele Rf (analiza hibridologic);
- identificarea prezenei genei Rf1 i strii alelice (CAPS);
- screening - ul prezenei markerilor lincai cu gena Rf3 (Zea mays) n genomul florii-soarelui;
- elucidarea unor aspecte privind expresia genelor asociate cu caracterul restaurator de
fertilitate (SDS-PAGE, test de fertilitate a polenului).
36
2. MATERIALUL I METODELE DE CERCETARE

Cercetrile au fost realizate pe parcursul anilor 2007-2010 n laboratorul Securitate
Biologic al Centrului de cercetare tiine ale vieii, catedra Biologie Vegetal, Universitatea de
Stat din Moldova i laboratoarele Centrului de cercetare i formare profesional Biologie
Molecular, Universitatea Academiei de tiine. Plantele de floarea-soarelui au fost cultivate pe
lotul experimental al Universitii de Stat din Moldova pe parcursul a trei ani de studiu.
2.1. Material de cercetare
Analizele au fost efectuate prin investigarea a 16 linii restauratoare de fertilitate, 12 linii cu
androsterilitate citoplasmatic, cinci linii menintoare i 4 hibrizi de prima generaie material
oferit cu amabilitate de CC AMG MAGROSELECT SRL, or. Soroca, R. Moldova i de
Institutul de Cercetare Vavilov (The N.I. Vavilov All-Russian Research Institute of Plant
Industry), St. Petersburg, Russia.
Schema de ncruciare utilizat n analiza hibridologic a inclus obinerea generaiei I1 prin
autopolenizarea liniilor fertile paterne, a hibrizilor de generaia nti (F1) prin ncruciarea liniilor
parentale, obinerea generaiilor F2 i BC1
de pe aceiai genitori fertili F1. Variantele
experimentale au fost amplasate dup metoda parcelelor randomizate n blocuri, fiecare parcel
avnd o suprafa de 39 - 40 m2 (8-10 rnduri de plante Figura 2.1, distana de semnat
cuprins ntre 70 35 cm.).
Fig. 2.1. Hibrizii: A- Drofa; B- Valentino; C- Sumbred 254 i D- Xenia.

Conform obiectivelor de cercetare, n studiu, au mai fost inclui 14 hibrizi F1 obinui n
rezultatul diferitor combinaii de ncruciare ale liniilor parentale.
La diferite faze de cretere i dezvoltare a organelor vegetative (Figura 2.2) i generative
(Figura 2.3.) au fost colectate eantioane de material vegetal (frunze, polen, flori), care ulterior
au fost investigate imediat sau congelate n azot lichid i pstrate la temperatura de - 80C.
37
A1
A2
E2
B3-B4
E4
M0
M2
E1
F1
F3
M3
M4
Fig. 2.2. Etapele de cretere i dezvoltare a

florii-soarelui [162]:
I- germinare; A1- apariia hipocotilului;
A2- emergena cotiledoanelor i a
primelor frunze vizibile;
II- faza vegetativ; B3-B4- apariia a II
perechi de frunze opuse (4 cm. lungime);
III- faza butonului floral; E1- apariia
butonului floral; E2- butonul are n
diametru
0,5-2 cm.; E4- diametrul
butonului 5-8 cm.;
IV- nfloritul; F1- apariia florilor ligulate
perpendiculare; F3- 3 cercuri concentrice
de flori bine dezvoltate.
V- Faza de Maturare.
M0- cderea florilor ligulate;
M2- partea posterioar a calatidiului de
culoare galben;
M3- partea posterioar a calatidiului este
brun;
M4- toate organele plantei sunt brune.
Etapele de dezvoltare a inflorescenei au fost apreciate dup dimensiunea florilor masculine

[93, 217] (fig. 2.3.):
Discul Floral
Dimensiunea n mm.
Stadiul de dezvoltare
Fig. 2.3. Etape de dezvoltare a inflorescenei la floarea-soarelui.

Viitorul gruncior de polen se afl n stadiul 1- Premeiotic; 2- Leptoten; 3- Pachiten; 4- Profaza II; 5Tetrade; 6- Spor nr.
2.2. Metode de cercetare

2.2.1. Determinarea indicilor morfo-fiziologici
Parametrii morfo-fiziologici: nlimea plantelor, diametrului calatidiului suprafaa foliar,
greutatea a 1000 de semine au fost analizate conform metodelor standart. Fertilitatea polenului a
fost analizat prin reacie de culoare cu soluie de I2 n KI de 1% a [106, 165]. Polenul (15
probe pentru fiecare genotip) a fost analizat la microscopul fotonic (BIOLAM LOMO) dup 30
38
min. i dup 60 minute de tratament. Cmpurile vizualizate au fost fotografiate cu aparatul

digital (CANON POWER SHOT A70).
Gradul de autocompatibilitate a fost apreciat prin raportul dintre numrul mediu de semine
viabile pe calatidiul izolat i numrul mediu de semine viabile pe calatidiu polenizat liber.
2.2.2. Izolarea i electroforeza proteinelor
Extracia proteinelor sumare din frunze, flori la diferite faze de dezvolatre i polen a fost
efectuat n soluie-tampon tris-HCl 6,25 mM, pH 6,8 (n raport de 1:3). Probele proteice
obinute n rezultatul unor serii repetate de purificri cu alcool, aceton i eter au fost liofilizate,
cuantificate i dizolvate n soluie tampon (Tris-HCl, pH=6,8, coninnd SDS 4,24%, zaharoz
(cca 20%), -mercaptoetanol de 6% (v/v), albastru de bromfenol 0,004%) anterior de a fi supuse
fracionrii electroforetice [53]. Electroforeza unidimensional s-a realizat n gel de
poliacrilamid de 14,5% n prezen de dodecilsulfat de sodiu, n sistemul de tampoane
Laemmli [124], utiliznd aparatul de electroforez Consort (EV 243). Operaiile postelectroforetice au fost efectuate conform metodei standard [192].
Masele moleculare ale polipeptidelor au fost determinate n conformitate cu greutatea
molecular a unor proteine standard (SDS Molecular Weight markers Ptoteins, SUA). Logaritmii
maselor moleculare relative ale fraciilor polipeptidice separate au fost determinate n funcie de
indicii mobilitii electroforetice.
2.2.3. Izolarea i electroforeza ADN-lui
Izolarea ADN-ului din esut vegetal, omogenizat n azot lichid, s-a realizat prin incubare
timp de 60 min. la temperatura de 65C n soluia tampon cu CTAB (cetiltrimetil ammonium
bromid) i purificare cu amestec cloroform : alcool izoamilic (24 : 1), izopropanol i etanol
76%, conform metodei propus de J. Doyle, 1987 [47, 198].
ADN-ul obinut a fost cuantificat prin electroforez n gel de agaroz de 1% i msurare
spectrofotometrtic, utiliznd spectrofotometrul NCT 60 (Anglia). Raportul 260/280 a fost n
limita valorilor 1,6 -1,9 iar coninutul de ADN n proba a variat de la 23,8-45,5 ng/l.
2.2.4. Analiza RAPD
Reacia PCR a fost realizata n 25l mediu de reacie: 25 ng ADN, dNTP 200M de fiecare
tip, 1,25 uniti/pe reacie GoTaq ADN-polimeraza n soluia tampon corespunztoare cu pH 8,5
i MgCl2 2,5 mM (Promega), i 0,1 M, primer (Fermentas, Germania). Amplificarea a fost
efectuat, utiliznd termociclul Corbett, Palm Cycler gradient block (Australia) cu urmtorul
program de amplificare: denaturarea: 95 C 5 min; urmat de 40 cicluri: 95 C 1 min., 36 C
1,5
min., 72 C 2 min. i elongarea final 72 C 3 min. Decamerii utilizai (5`39
AGGGCCGTCT-3`); (5`-TCTCCGCCTT-3`); (5`-AATGGCGCAG-3`) au fost selectai n baza

articolului publicat de R. Nandini n 2005 [177].
Produsele amplificrii au fost analizate prin electroforeza n gel de agaroz de 1,6% n
prezena bromurii de etidiu 0,5 g/ml n soluie tampon de migrare 1x TAE la intensitatea de 93
V/10 cm. lungime n camera de electroforez Biocom (Rusia). Pentru determinarea maselor
moleculare relative ale produselor de amplificare au fost utilizate probe cu martori 50-100 bp
DNA Ladder (Promega).
Ampliconii obinui au fost notai conform denumirii primerului asociat cu dimensiunea
ampliconului, de exemplu: OPG10510 amplicon cu dimensiunea de 510 pb obinut n rezultatul
PCR cu primerul OPG10.
2.2.5. Analiza CAPS
Mediul de reacie utilizat pentr PCR CAPS a fost similar celui utilizat n analiza RAPD cu
exceia cantitii de matri - 50 ng i a concentraiei de 0,4 M a primeri-lor specifici: CAPS
H13 sens (5`-GTGTTAGACAAACATCACATA-3`) i antisens (5`-GAGAATTCGCAGT
TGGGTAC-5`) [122].
Programul de amplificare a inclus: 95C - 3 min urmat de 45 cicluri: 94C 1 min., 58C
2 min., 72C 2 min. i 72C 3 min. Ampliconii s-au analizat prin electroforez n gel de
agaroz 1,5% cu bromur de etidiu 0,5 g/ml.
Restricia enzimatic a ampliconilor rezultai (10 L) s-a realizat cu enzima Hinf I 10 units
(Fermentas, Germania) per reacie (volumul total 15 L) conform condiiilor recomandate de
productor. Produsele digestiei au fost analizate n gel de agaroz de 2,5% n prezena unor
probe martor, 50 bp DNA ladder (Sigma, Saint Louis, Missouri, USA).
2.2.6. PCR cu primeri specifici
Aplificarea probelor ADN s-a realizat n mediul de reacie descris anterior cu exceia
programului de amplificare adaptat primerilor analizai (Tabelul 2.1):
Tabelul 2.1. Secvena primerilor - marker lincai cu gene restauratoare de fertilitate
Notaie
STS 10B 1 [56].
STS CMNB-07/800 [159].
SCAR 12M [254].
Succesiunea de nucleotide sens i antisens (5`- 3`)

AAGATCCCATCAAACCACCA
GGTCCACCTTGCGAAGATAA
ATCATCCAACTTAAAGAACC
ACTCGATCGCGCCACTGAA
ATGGAGATTGAAGGGACG
ACACGGAAGACCATGACC
40
2.2.7. Metode bioinformatice de analiz

A fost analizat informaia privind produii de expresie a genelor implicate n manifestrea
fenomenului de androsterilitate i restaurare a fertilitii la diferite specii de plante stocat n
baza de date NCBI [281]. Programele compiuterizate: Protein Workbench 5.0.1. [273]; Swiss
Pdb Viewer ver. 4.0.1. [278]; Swissmodel.expasy.org. [285] au fost utilizate n investigarea unor
proprieti specifice ale proteinelor (masa molecular, punctul izoelectric, hidrofobicitatea,
sarcina electric, frecvena aminoacizilor i strucura secundar). Domenele proteice (DP) au fost
identificate prin intermediul Protein Workbench 5.0.1. [273], iar Phobius [275] a fost utilizat n
caracteristica DP.
2.2.8. Analiza statistic a datelor
Prelucrarea statistic a datelor au fost efectuat dup Dospehov [259]. Analiza corelativ sa realizat cu ajutorul aplicaiei Microsoft Excel, iar studiul regresional prin intermediul
programei Table Curve 2D [284].
n pofida importanei sale economice, genetica florii-soarelui rmne neelucidat o
perioad ndelungat de timp. Pn la etapa actual, nici una dintre genele restauratoare de
fertilitate nu a fost secveniat, iar harta genetic nc nu este pe deplin elaborat. Aceste efecte
se datoreaz genomului destul de mare (cca. 3189 Mpb) comparativ cu alte plante, de ex.
Populus trichocarpa 480 Mpb, Arabidobsis thaliana 157 Mpb sau Genlisea margaritae 63
Mpb. Din aceste considerente, studiul genotipurilor de floarea-soarelui prin diferite tehnici
moleculare (CAPS; RAPD, SCAR, SDS-PAGE) i bioinformatice poate s pun n eviden
aspecte genetice noi privind interaciunea nucleu-citoplasm.
Din aceste considerente, pentru experiene, a fost decis utilizarea celor 16 linii Rf, cinci
linii B, 12 linii materne i patru hibrizi, toate genotipurile au fost oferite cu amabilitate de
asociaia ASP MAGROSELECT, or. Soroca i de colecia VIR Institutul de Fitotehnie N.I.
Vavilov, Sankt Petersburg, Federaia Rus.
41
3. EVALUAREA PARAMETRILOR MORFOLOGICI LA FORMELE STERILE,

FERTILE I CELE CU FERTILITATEA RESTAURAT
Floareasoarelui de regul, are o singur inflorescen terminal i e format din 7003000
de flori [118] hermafrodite crora le este specific fenomenul de protandrie [217]. n interiorul
inflorescenei, florile se dezvolt succesiv de la periferie ctre centru [85]. Staminele sunt n
numr de cinci, iar polenul de culoare galben are o form rotund i consisten lipicioas [225].
n cadrul acestei culturi manifestarea fenotipic a genelor Rf/ASC este tempoar-specific i
are implicaini directe la nivelul aparatului reproductor, din aceste considerente am convenit s
studiem variabilitatea morfologic la dou faze de dezvoltare: butonizare etap n care se
activeaz o serie de gene florale i nflorire cnd toate organele vegetale ajung la o maturitate
deplin.
3.1. Analiza unor parametri cantitativi
Talia nalt, un aspect legat de productivitatea plantelor [29] este generat de o serie de
caractere dominante, iar talia joas de cele n stare recesiv [225]. Investigaiile referitoare la
parametrul dat, la faza de dezvoltare E 4 au scos n eviden faptul, c cele mai mari valori
posed genotipurile hibride, cu o medie de 0,7 metri n raport cu cele materne de 0,51 metri i
cele paterne ale cror valoare medie este de 0,33 metri. Dintre hibrizi cele mai mari valori le
dein: Drofa F1; LC 40 ASC PET1 LC Raus Rf-0,82 metri i LC 40 ASC PET1 Xenia Rf-0,78
0,9
0,8
0,8
0,7
0,7
0,6
0,3
VIR 740 Rf
VIR 700 Rf
VIR 681 Rf
Drofa Rf
Valentino Rf
Xenia Rf
LC 39 Rf
LC 41 Rf
LC 41 Rf (I2)
LC 43 Rf
LC 43 Rf (I2)
LC od1295 Rf
VIR 116 A
ASC RIG
VIR 116 A
ASC PET1
VIR 101A
ASC RIG
Valentino
ASC PET1
Drofa ASC
PET1
Xenia ASC
PET1
LC 391A ASC
PET1
LC SW38
ASC PET1
LC 42 ASC
PET1
LC 40 ASC
PET1
LC od1295 Rf (I2)
LC 4 Rf
0,1
0,1
LC 7 Rf
0,2
0,2
LC 7 Rf (I2)
0,3
0,4
LC 637 Rf
0,4
0,5
LC Raus Rf
0,5
LC Raus Rf (I2)
0,6
LC Cium Rf
nlimea n metri
nlimea n metri
metri, iar cele mai mici valori din cadrul acestui grup le posed Sumbred 254 (fig. 3.1).
Fig. 3.1. nlimea tulpinii la liniile materne i paterne la faza de butonizare.

Valorile maxime ale liniilor materne sunt apropiate de cele hibride la: VIR 116 A ASC RIG-0,74
metri; LC 40 ASC PET1-0,61 metri i Drofa ASC PET1-0,58 metri contrar liniilor paterne ale
cror valori maxime sunt de: 0,67 metri la Drofa Rf i 0,62 metri la VIR 681 Rf.
n ceea ce privete numrul de frunze, trstur care se motenete dup tipul dominanei
complete [61] sau supradominanei [213], la faza de dezvoltare E 4, n cadrul formelor
investigate a relevat faptul, c genotipurile hibride dein valorile medii de 22,45; materne-21,55
42
i cele paterne-19,45. Indicii maximi ai hibrizilor au fost destini la: Drofa F1-26,9; Sambred
254-23,4 i LC 40 ASC PET1 Xenia Rf-22,11 cu un minim de 20,3 la LC SW 38 ASC PET1
Drofa Rf. LC 40 ASC PET1 i Valentino ASC PET1 dein valorile maxime ntre liniile materne,
iar Drofa Rf i LC Raus Rf (I2) printre cele paterne (cu o valore de 26,5; 23,5 i respectiv 23,1;
22,1).
Suprafaa foliar, un indice legat direct de aparatul fotosintetic, la faza de dezvoltare E 4 a
relevat superioritatea genotipurilor genotipurilor hibride cu o medie a acestei valori de 0,31 m2
fa de liniile materne 0,19 m2 i cele paterne 0,13 m2. Dintre hibrizi rezultate maxime au fost
atestate la urmtorii indivizi: Valentino F1-0,41 m2; Drofa F1-0,4 m2 i Xenia F1-0,39 m2. Cea
mai mic valoare n cadrul acestui grup a fost remarcat la: LC SW 38 ASC PET1 Drofa Rf0,115 m2. Dintre liniile materne cele mai bune valori le-au artat: LC 40 ASC PET1 cu o
suprafa foliara de 0,31 m2 ca i valoarea medie a genotipurilor hibride i VIR 116 A ASC RIG0,3 m2[164]. Genotipurile paterne au nregistrat valori maxime la: LC Raus Rf (I2)-0,22 m2 i LC
Raus Rf-0,21 m2. Valoarea minim de 0,091 m2 s-a remarcat la LC od 1295 Rf (fig. 3.2).
0,3
Suprafaa foliar n metr. ptr.
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
VIR 740 Rf
VIR 700 Rf
VIR 681 Rf
Drofa Rf
Valentino Rf
Xenia Rf
LC 39 Rf
LC 41 Rf
LC 41 Rf (I2)
LC 43 Rf
LC 43 Rf (I2)
LC od1295 Rf
LC od1295 Rf (I2)
LC 7 Rf
LC 7 Rf (I2)
LC 637 Rf
LC Raus Rf
LC 4 Rf
VIR 116 A
ASC RIG
VIR 116 A
ASC PET1
VIR 101A
ASC RIG
Valentino
ASC PET1
Drofa ASC
PET1
Xenia ASC
PET1
LC 391A ASC
PET1
LC SW38
ASC PET1
LC 42 ASC
PET1
LC 40 ASC
PET1
LC Raus Rf (I2)
LC Cium Rf
Suprafaa foliar n met. ptr.
0,4
0,35
Fig. 3.2. Suprafaa foliar la liniile materne i paterne la faza de butonizare.

Analiznd rezultatele obinute putem concluziona c la faza butonului floral (E 4) studiul
unor parametri morfologici a evideniat superioritatea genotipurilor hibride, urmate de liniile
homozigote purttoare a genelor ASC.
Examinarea nlimii tulpinii la faza de dezvoltare F 3 a confirmat aceiai legitate
succesional ca i la faza de butonizare. Astfel cotele maxime au fost atinse la genotipurile
hibride: Drofa F1-1,6 metri; Valentino F1-1,56 metri urmate de liniile materne: 1,26 metri la
Drofa ASC PET1; 1,13 metri la LC 40 ASC PET1 [164]. Cele mai irelevante valori au fost
remarcate la liniile restauratoare de fertilitate: VIR 740 Rf 0,52 metri. Totodat o nlime mic
a liniilor parentale este un factor optim, fiindc, de regul acestea mai puin sracesc solul n
substanele minerale, rezist la temperaturi mai sczute i n general au o perioad vegetativ mai
scurt [202].
43
Analiza numrului de frunze la nflorire, drept un indice variabil genotipic [29], de obicei
cuprins ntre limitele 1240 [25], a semnalat faptul c, printre formele parentale, liniile materne
au cele mai mari valori medii ale parametrului n cauz. Acestea au fost evideniate datorit
urmtorilor indivizi: LC 40 ASC PET125,94; Drofa ASC PET125,9 i Valentino ASC PET1
25,2, iar cele paterne: Drofa Rf23,8; Valentino Rf22,3 i LC Raus Rf (I2)22,3. Valorile
minime ale primului grup sunt de 21,5 la LC SW38 ASC PET1, 21,7 la LC 42 ASC PET1 i VIR
116 A ASC RIG, n timp ce la grupul doi acestea au atins cotele de 19,4 la VIR 700 Rf i 19,5 la
30
30
25
25
Numrul de frunze
20
15
10
20
15
10
5
VIR 740 Rf
VIR 700 Rf
VIR 681 Rf
Drofa Rf
Valentino Rf
Xenia Rf
LC 39 Rf
LC 41 Rf
LC 41 Rf (I2)
LC 43 Rf
LC 43 Rf (I2)
LC od1295 Rf
LC od1295 Rf (I2)
LC 7 Rf
LC 7 Rf (I2)
LC 637 Rf
LC Raus Rf
LC Raus Rf (I2)
VIR 116 A
ASC RIG
VIR 116 A
ASC PET1
VIR 101A
ASC RIG
Valentino
ASC PET1
Drofa ASC
PET1
Xenia ASC
PET1
LC 391A ASC
PET1
LC SW38
ASC PET1
LC 42 ASC
PET1
LC 40 ASC
PET1
LC 4 Rf
LC Cium Rf
Numrul de frunze
LC 7 Rf (fig. 3.3).
Fig. 3.3. Numrul de frunze la liniile materne i paterne la faza de nflorit.

Suprafaa foliar la faza de dezvoltare F 3 a artat superioritatea liniilor materne cu media
de 0,32 m2, comparativ cu cele paterne a cror medie este de 0,23 m2. Din totalul de linii materne
valoarea maximal de 0,52 m2 a fost depistat la: LC 42 ASC PET1, iar n cazul celor paterne
maxima a nregistrato LC Raus Rf (I2) 0,36 m2. Din totalul de linii androsterile cei mai mici
indici au fost remarcai la LC 391A ASC PET1 i LC SW38 ASC PET1. Printre liniile
restauratoare de fertilitate cele mai irelevante valori au fost observate la LC od1295 Rf, VIR740
Rf i LC 39 Rf.
n urma analizei rezultatelor morfologice obinute la dou fazele de dezvoltare,
(butonizarea i nfloritul), printre liniile parentale a fost evideniat superioritatea liniilor materne
fa de cele paterne [164]. Aceleai rezultate n cadrul cercetrilor anterioare au fost obinute de
Cpn A. n 2006 [29] i Levichi A. n 2008 [142].
Caracteristica unor indici ai seminei
Masa a 1000 de semine contrar celorlali parametri morfologici a relevat cele mai mari
valori la liniile materne cu o medie de 50 grame, urmat de genotipurile hibride - 49,5 grame i
cele paterne - 31 grame. n ce privete liniile ASC, valorile maxime de: 80 grame, 58 grame, 52
grame i 51 grame au fost remarcate la: Drofa ASC PET1, Valentino ASC PET1, VIR 116 A ASC
44
PET1 i VIR 116 A ASC RIG. La genotipurile paterne mrimile maxime (n grame) au fost
nregistrate la: Xenia Rf 61, Drofa Rf 61 i LC 7 Rf (I2) 42.
Analog parametrului lungimea seminelor a confirmat aceeai legitate. Astfel, cele mai
mari valori medii le-au avut liniile materne 10,41 mm. urmate de genotipurile hibride 10,22 mm.
i cele paterne 9,76 mm. Maximul liniilor materne de 11,8 mm., 10,8 mm., 10,6 mm. i 10,53
mm. sa conturat la: Drofa ASC PET1, Valentino ASC PET1, LC 40 ASC PET1 inclusiv VIR116
A ASC RIG (fig. 3.4). Valorile maximale ale liniilor paterne au fost atinse la: Drofa Rf12,98
mm., Xenia Rf11,69 mm., LC Raus Rf10,65 mm. i LC Cium Rf10,52 mm. Lungimea
seminelor este un caracter dependent de soi i variaz ntre 8 i 25 mm. [225]. Datele noastre
14
16
12
14
lungimea seminelor n mm
10
8
6
4
2
12
10
8
6
4
2
VIR740 Rf
VIR700 Rf
VIR681 Rf
Drofa Rf
Valentino Rf
LC39 Rf
Xenia Rf
LC41 Rf
LC41 Rf (I2)
LC43 Rf
LC43 Rf (I2)
Lcod1295Rf
Lcod1295 Rf(I2)
LC7 Rf
LC7 Rf (I2)
L 637 Rf
LC Raus Rf
LC Raus Rf(I2)
VIR116 A
ASC RIG
VIR116 A
ASC PET1
VIR101A ASC
RIG
Valentino
ASC PET1
Drofa ASC
PET1
Xenia ASC
PET1
LC391A ASC
PET1
LCSW38
ASC PET1
LC42 ASC
PET1
LC40 ASC
PET1
LC4 Rf
LC Cium Rf
lungimea seminelor n mm
obinute n cadrul actualelor cercetri sunt ncadrate n intervalul descris anterior.
Fig. 3.4. Parametrul lungimea seminelor n mm. la liniile: materne i paterne.

Analiza limii seminelor a relevat o legitate fireasc de repartiie a valorilor medii: 5,13 la
formele hibride, 4,85 mm la liniile materne i 4,39 mm la cele paterne. Maximul acestui
parametru la formele materne a fost atins de: Drofa ASC PET1 i LC 391A ASC PET1, iar n
cadrul grupului doi la: Xenia Rf 6,58 mm., LC 7 Rf (I2) 6,1 mm. i Drofa Rf 5,19 mm. Cele
mai nesemnificative valori printre liniile materne leau prezentat VIR 101A ASC RIG 4 mm.,
precum i LC SW38 ASC PET1 4,2 mm. Printre genotipurile restauratoare de fertilitate cele
mai mici cote au fost observate la LC Cium Rf 3,34 i LC 39 Rf 3,35 mm.
Perioada vegetativ nu a nregistrat diferene majore ntre grupele cercetate. Prin cea mai
mic perioad vegetativ s-au remarcat genotippurile hibride cu o valoare medie de 86,12 zile,
urmate de liniile materne - 87,9 zile i cele paterne - 92,05 zile.
Studiul regresional la diferite genotipuri de floarea soarelui
Regresiile pun n eviden relaia de legtur dintre dou (regresii liniare) sau mai multe
variabile (regresii spaiale).
45
Regresii liniare analizeaz dou variabile a i b avnd ca produs final o reprezentare

grafic sub form de ecuaie liniar f(x)=ax+b. Cele mai bune regresii liniare au fost nregiistrate
la genotipurile hibride cu un coeficient de determinare (indic msura n care dreapta
aproximeaz norul de puncte) r2 mediu de 0,4. Iar cele mai slabe regresii lineare le-au artat
liniile materne i paterne indicnd un coeficient de determinare r2 de 0,26 i 0,23.
Printre perechile de parametri cele mai bune valori ai regresiei liniare le-a nregistrat
perechea: masa seminei / limea seminei cu media coeficientului de determinare r2 pentru
genotipurile paterne, materne i hibride de 0,67; urmat de perechea masa seminei / lungimea
seminei avnd media r2 de 0,62 i perechea nlime / numr frunze la faza de dezvoltare F 3 cu
media lui r2 de 0,4 (Tabelul 3.1).
Tabelul 3.1. Studiul regresional al diferitor perechi de variabile la liniile materne, paterne i
genotipurile hibride
Faza E 4
Linii
pater.
Linii
mat.
Gen.
hibr.
r2
F-Stat.
r2
F-Stat.
r2
F-Stat.
Faza F 3
H/Nr.
Frunz.
H/Sup.
Fol.
Nr.Fr./Su
p. Fol.
H/Nr.
Frunz.
H/Sup.
Fol.
Nr.Fr./Su
p. Fol.
0,047
0,9
0,169
1,63
0,233
1,82
0,039
0,74
0,091
0,8
0,03
0,19
0,14
2,98
0,028
0,23
0,34
3,18
0,17
3,74
0,638
14,13
0,4
3,96
0,2
4,66
0,03
0,3
0,22
1,74
0,29
7,52
0,02
0,18
0,694
13,61
infl.
/% fl.
Fruct.
M./
lung.
sem.
M./ l.
sem.
lung./
l.
sem.
r2
med
iu
0,05
1
0,01
0,08
0,53
20,54
0,54
9,59
0,791
22,82
0,7
42,8
0,71
20,03
0,6
9,37
0,19
4,2
0,19
1,9
0,745
17,6
0,23
8,9
0,26
5,42
0,4
7,43
Printre genotipurile hibride regresii lineare semnificative au fost conturate la urmtoarele

perechi de variabile: masa seminei / lungimea seminei r2=0,79, n acest caz doar o singur
valoare se afl la limita intervalului de confiden de 95%, restul valorilor sunt cuprinse n acest
interval; lungimea seminei/limea seminei r2=0,74, n cazul dat o valoare se afl n intervalul
de predicie de 95% i una la limita intervalului de confiden de 95%, restul valorilor sunt
cuprinse n acest interval i numr frunze/suprafaa foliar la faza de dezvoltare F 3 r2=0,69,
dou valori se afl n intervalul de predicie de 95% i restul n intervalul de confiden de 95%
(Figura 3.5).
La liniile materne cele mai bune regresii liniare au nregistrat urmtoarele perechi de
parametri: masa seminei / limea seminei cu un coeficient de determinare r2 de 0,71, n cazul
dat 50% din valori au intrat n intervalul de confiden, restul n intervalul depredicie; i
nlime / numr frunze la faza de dezvoltare F 3 cu un coeficient de determinare r2 de 0,63, la
aceast pereche de parametri 30% din puncte aparin intervalului de predicie, restul celui de
confiden. Cele mai nesemnificative regresii au fost observate la urmtoarea pereche de
parametri: numr frunze / suprafaa foliar la faza de dezvoltare F 3.
46
Perechea liniilor paterne: masa seminei / limea seminei s-a evideniat printr-un
coeficient de determinare maximal r2 de 0,7 care este identic cu cel nregistrat la liniile materne,
n situaia dat 55% din valori aparin intervalului de predicie i 45% - celui de confiden; iar
perechea masa seminei / lungimea seminei a conturat un coeficient de determinare r2 de 0,53
unde 60% din valori sunt cuprinse n intervalul de predicie i doar 40% n cel de confiden.
Suprafata foliara metri patrati
D:\Nr fru Supr Fol INFL\hibrizi.xls

Rank 1 Eqn 8160 Line(a,b) Robust None
r^2=0.69411351 DF Adj r^2=0.57175891 FitStdErr=0.088802915 Fstat=13.615119
a=-1.1393138
b=0.067029332
0.9
0.9
0.8
0.8
0.7
0.7
0.6
0.6
0.5
0.5
0.4
0.4
0.3
0.3
0.2
0.2
0.1
20
24
28
Suprafata foliara metri patrati
Dreapta de reprezentare
Intervalul de confiden
Intervalul de predicie
0.1
Numar frunze faza F 4
Fig. 3.5. Regresii liniare ale parametrilor: numr frunze/suprafaa foliar de la

genotipurile hibride, programa Table curve 2D [284].
Una dintre cele mai bune metode de analiz a interdependenei dintre dou serii de
parametri sunt reprezentate de corelaii (relaia de legtur reciproc dintre dou sau mai multe
iruri de variabile).
Corelaii ale parametrilor morfologici la liniile paterne
Liniile paterne s-au evideniat printr-o corelaie foarte bun a urmtorilor parametri:
suprafaa foliar faza E 4 / suprafaa foliar faza F 3 cu un indice de corelare de 0,954 urmat de
masa / limea seminelor avnd un indice de 0,83.
Corelaii moderate au fost nregistrate la parametrii: masa seminei / lungimea seminei 0,73 i nlimea faza E 4 / inflorescenei cu un indice corelativ de 0,59.
Corelaii acceptabile ntr-un numr total de 14, dintre care cele mai bune valori au fost
atestai la parametrii: numr frunze faza E 4 / suprafaa foliar faza E 4 - 0,38 i nlimea faza
E 4 / nlime faza F 3 - 0,29.
Corelaii slabe cu un numr total de 21 i negative - 19.
Corelaii ale parametrilor morfologici la liniile materne
Examinarea liniilor materne a profilat un numr total de 6 corelaii foarte bune, dintre care
cele mai mari valori le-au atins urmtoarele perechi de parametri: suprafaa foliar faza E 4 /
suprafaa foliar faza F 3 - 0,94 i numr frunze faza E 4 / numr frunze faza F 3 - 0,85.
47
Corelaii moderate cu un numr total de 9 au atins cota maxim la: masa / lungimea
seminei - 0,73 i nlime faza F 3 / lungimea seminei - 0,7.
Corelaii acceptabile nregistrate la: numr frunze faza E 4 / lungimea seminei - 0,49 i la
numr frunze faza F 3 / limea seminei - 0,42.
Corelaii slabe i negative cu un numr total de 32.
Corelarea parametrilor morfologici la genotipurile hibride
Investigarea grupului de genotipuri hibride a permis s evideniem 9 corelaii foarte bune:
masa / lungimea seminei - 0,88; supraf. foliar faza E 4 / supraf. foliar faza F 3 - 0,88 etc.
Corelaii moderate cu un total de 22, dintre care cele mai semnificative: nlimea faza F 3
/ lungimea seminei - 0,72 i suprafaa foliar faza E 4/numr frunze faza F 3.
Dintre corelaiile acceptabile cele mai sugestive au fost nregistrate la perechile: nlime
faza F 3 / suprafaa foliar faza F 3 - 0,47 i suprafaa foliar faza F 3 / masa seminelor - 0,47.
Corelaiile slabe i negative nu au depit numrul total de 20 (Tabelul 3.2).
Tabelul 3.2. Corelaii ale unor parametri morfologici la genotipurile hibride
Nr.
Frunz
e faza
E3
Sup.
Fol.
(m2)
faza
E3
0,483
0,483
H. (m.)
faza F4
Nr.
Frunze
faza F
4
Sup.
Fol.
(m2)
faza
F4
Diam.
Imfl.
(cm.)
% de
flori
fructif.
Per.
Veg.
(zile)
Masa.
1000
sem.
(gr.)
Lung.
Sem.
(mm.)
Lim
.
Sem.
(mm.)
0,174
0,282
-0,064
0,046
0,820
0,053
0,313
0,232
0,465
0,543
0,588
0,536
0,669
0,579
0,180
0,533
0,664
0,440
0,702
0,817
0,174
0,588
0,625
0,714
0,881
-0,132
0,526
0,542
0,551
0,502
0,562
0,282
0,536
0,625
0,630
0,474
0,333
0,430
-0,045
0,810
0,724
0,701
0,064
0,046
0,669
0,714
0,630
0,833
-0,351
0,236
0,459
0,721
0,644
0,754
0,579
0,881
0,474
0,833
-0,392
0,220
0,704
0,460
0,371
0,552
0,820
0,180
-0,132
0,333
-0,351
-0,392
0,114
-0,242
0,189
0,372
0,287
0,053
0,533
0,526
0,430
0,236
0,220
0,114
0,131
0,092
0,262
0,231
0,313
0,664
0,542
-0,045
0,459
0,704
-0,242
0,131
0,011
0,217
0,398
0,232
0,440
0,551
0,810
0,721
0,460
0,189
0,092
0,011
0,889
0,780
0,465
0,702
0,502
0,724
0,644
0,371
0,372
0,262
0,217
0,889
0,863
0,543
0,817
0,562
0,701
0,754
0,552
0,287
0,231
0,398
0,780
0,863
H.
(m.)
faza
E3
H. (m.) faza
E3
Nr. Frunze
faza E3
Sup. Fol.
(m2) faza
E3
H. (m.) faza
F4
Nr. Frunze
faza F4
Sup. Fol.
(m2) faza
F4
Diam. Imfl.
(cm.)
% de flori
fructif.
Per. Veg.
(zile)
Masa. 1000
sem. (gr.)
Lung. Sem.
(mm.)
Lim.
Sem. (mm.)
Corelaie foarte bun (0,75-1)

Corelaie moderat (0,5-0,75)
Corelaie acceptabil (0,25-0,5)
Corelaie slab (0-0,25)
Corelaie negativ
48
3.2. Evaluarea autocompatibilitii polenului

Pe parcursul evoluiei, n scopul sporirii variabilitii genetice i asigurrii unui spectru mai
larg de genotipuri pentru selecia natural, plantele hermafrodite au dezvoltat sisteme moleculare
complexe de evitare a autofecundrii prin asigurarea autoincompatibilitii (AIC) polenului.
AIC se manifest la nivel de gametofit i sporofit [136, 247], fiind determinat de alelele
locusului S (self-incompatibility). Utilizarea formelor mutante a relevat modelul bipartit al
locusului S cu gene distincte, care regleaz nsuirile pistilului i ale polenului [72]. S-a
constatat, c polenul strin germineaz pe stigmate mult mai repede, are o vitez sporit de
naintare prin stil, realiznd fecundarea ntr-un timp de aproximativ dou ori mai scurt
comparativ cu propriul polen [228]. Analiza evenimentelor moleculare i a proceselor
biochimice care regleaz reacia de autoincompatibilitate la plantele din familiile Brassicaceae,
Solanaceae, Rosaceae, Scrophulariaceae i Campanulaceae au pus n eviden interaciuni de
tip ligand-receptor [136, 228, 247]. Astfel, la Brassica incompatibilitatea polen - pistil este
mediat de receptorii protein kinazici [203], la Papaveraceae - de ionii de calciu din citosol [68]
iar la Gramineae - de thioredoxin [143]. De asemenea s-a consatatat, c glycoproteinele cu
activitate ribonucleazic (S-ARNase) controleaz reacia de rspuns a fenomenului AIC la
majoritatea plantelor dicotiledonate studiate [176].
Formele salbatice din genul Helianthus se caracterizeaz printr-o autocompatibilitate nul
(AC) a polenului, iar floarea-soarelui de cultur - prin autoincompatibilitate sporofitic variabil
[88], determinat de un sistem genetic complex, coordonat de un numr necunoscut de loci
[219]. S-a constatat att prezen unui locus S multialelic [59], ct i existena a doi loci S
multialelici care determin AIC [182]. n cadrul ncrucirilor interspecifice intervin rearanjri
ale diferitor segmente cromosomale care pot forma duplicaii sau genotipuri hemizigote dup
locusul S [24, 194]. Mutaiile alelelor AIC detrmin pierderea funciei (loss-of-function),
cauznd astfel autocompatibilitatea polenului [88, 178]. De exemplu, mutaiile genelor S de la
Brassica afecteaz formarea complexului proteic receptor-ligand, ceea ce duce la pierderea
nsuirilor de inhibiie a germinrii polenului [178].
Interesul pentru investigarea AC/AIC la floarea-soarelui a aprut nc n anii 60 ai
secolului trecut [151]. Actualmente aceast problem constituie un aspect important al
programelor de ameliorare [60], ntruct recolta hibrizilor comerciali, este determinat att de
factori genetici i fiziologici care influieneaz numrul i densitatea florilor, orientarea
stigmatului i aglutinarea polenului [169], ct i de frecvena polinizatorilor, redus din cauza
unor factori climatici. Astfel, ne-am propus drept scop determinarea gradului de
49
autocompatibilitate al polenului la diverse linii restauratoare de fertilitate i la hibrizii F1 de

floarea-soarelui.
Floarea-soarelui reprezint o plant alogam, entomofil. Staminele se dezvolt i ajung la
maturitate naintea stigmatului, astfel polenul fiind pus n libertate cu mult nainte ca acesta s fie
receptiv. Mai trziu, cnd stigmatul se matureaz i devine lipicios, anterele sunt deja goale. O
astfel de floare pentru a fi polenizat are nevoie de polenul pus n libertate de o floare mai tnr
din propriul calatidiu sau din alte calatidii prin polenizare mediat de insecte.
n timpul maturrii, stigmatul se alungete i este mpins n afara anterelor concrescute i
dac fecundarea nu are loc cu polenul altei flori vrful stigmatului se bifurc i se rsucete mult
spre exterior (Figura 3.6).
Stigmat
Pubescen
Polen
Antere
concrescute
Corol
Fig. 3.6. Imagine i prezentare schematic a unei flori tubulare.

n cazul cnd stigmatele ajung la maturitate cele dou bifurcaii din vrf, ating anterele
florilor vecine, realizndu-se astfel autopolenizarea.
Studiul
autocompatibilitii
liniilor
restauratoare
de
fertilitate.
Investigarea
autofertilitii a dousprezece linii Rf a pus in eviden valori care au variat n limite largi, ceea
ce a permis clasificarea genotipurilor n trei grupe n funcie de gradul de autocompatibilitate a
polenului: I (mai mic de
Tabelul 3.3. Gradul de autocompatibilitate al polenului

la diferite linii Rf
25%), II (25-50%) i III

(mai mare de 50%),
(Tabelul 3.3).
Datele prezentate
n tabel indic un grad
mediu
de
autocompatibilitate
cu
valori cuprinse ntre 2536
pentru
ase
Genotipul
Rf
VIR 681
LC Od 1295
Drofa
LC 43
Valentino
LC Raus
VIR 558
Xenia
LC 39
LC 41
LC Cium
LC 7
AC, %
9,29 0,45
9,36 0,90
16,13 0,58
21,21 1,19
26,30 2,33
27,05 1,51
27,93 1,83
28,15 1,79
29,49 1,44
36,05 1,39
58,70 1,65
62,00 3,28
50
Nivelul de productivitate a polenului

abundent
mediu
sczut
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
genotipuri: LC 41 Rf, Valentino Rf, LC Raus Rf, VIR 558 Rf, Xenia Rf, LC 39 Rf i doar n
cazul a dou genotipuri: LC Cium Rf i LC 7 Rf au fost constatate valori mai mari ale acestui
indice: 57,8 - 62,0%.
Se cunoate c gradul de autopolenizare este mult influenat i de condiiile de mediu din
timpul nfloritului. Datele fenologice nregistrate n perioada de nflorire a liniilor Rf au
demonstrat o uniformitate a parametrilor morfologici n cadrul liniei i o difereniere dup gradul
de pigmentaie al anterelor i capacitatea de producere a polenului n funcie de genotip. Vizual,
cantitatea de polen eliberat a fost apreciat pentru majoritatea liniilor ca abundent, i doar n
cteva cazuri coninutul mai sczut de polen este corelat cu grade de autocompatibilitate reduse,
aa cum este la VIR 681 Rf i Od 1295 Rf. n acelai timp a fost relevat un singur caz (LC 41
Rf), cnd nivelului sczut al cantitii de polen i corespunde o valoare medie a autofertilitii,
(Figura 3.7 i Tabelul 3.4).
A
B
C
Fig. 3.7 Modalitatea de apreciere a capacitii de formare a polenului.
Nivel abundent (A), mediu (B) i sczut (C).
Aceste date indic asupra faptului, c genele care determin abundena polenului nu
manifest o aciune special sau o interaciune cu genele care determin autoincompatibilitatea
polenului.
Studiul autocompatibilitii genotipurilor hibride (F1). Evaluarea comparativ a
nivelului de autocompatibilitate a liniilor parentale i hibride a relevat variaia acestui caracter n
funcie de baza ereditar a materialului biologic, (Tabelul 3.4).
Tabelul 3.4. Autocompatibilitatea polenului la diferite genitipui de floarea-soarelui
Hibrizi F1
Drofa ASC Drofa Rf
Drofa ASC LC Raus Rf
Drofa ASC LC 7 Rf
Drofa ASC LC od1295 Rf
Drofa ASC LC 43 Rf
Drofa ASC VIR 681 Rf
LC 40 ASC Xenia Rf
Xenia ASC Xenia Rf
Valentino ASC Valentino Rf
LC 40 ASC LC Raus Rf
Autocompatibilitatea
Pentru hibrizi F1 Pentru liniile Rf
50,66 0,87
33,92 1,08
22,71 2,00
21,92 1,30
24,80 1,13
44,96 0,69
30,40 1,59
68,34 1,58
22,62 1,20
25,46 1,42
16,13 0,58
27,05 1,51
62,00 3,28
9,36 0,90
21,21 1,19
9,29 0,45
28,15 1,79
28,15 1,79
26,30 2,33
27,05 1,51
51
Linii
restauratoare
Drofa Rf LC
Raus Rf
LC 7 Rf
Od 1295 Rf
LC 43 Rf
VIR 681 Rf
Xenia Rf
Xenia Rf
Valentino Rf
Raus Rf
Conform valorilor nregistrate, din cei ase hibrizi de generaia nti rezultai prin
ncruciarea diferitor linii Rf cu una i aceeai linie ASC, cinci au valori superioare nivelului de
AC al liniei paterne. Cele mai semnificative diferene au fost constatate la combinaiile cu VIR
681 Rf, LC od1295 Rf i Drofa Rf, gradul de AC fiind mai mare fa de cel al formei paterne de
2-5 ori. Linia LC 7 Rf n combinaie cu aceiai form matern determin reducerea gradului de
autocompatibilitate de cca 3 ori. Aceste date conduc la concluzia c citoplasma steril nu are o
influen evident asupra nsuirii de autocompatibilitate. Pe de alt parte, analiza altor dou
combinaii hibride care au n comun una i aceeai Linie Rf: LC 40 ASC x Xenia Rf i Xenia ASC
x Xenia Rf au fost relevate valori egale ale F1 cu cele ale formei paterne (LC 40 ASC x Xenia
Rf) sau o sporire de dou ori, asa cum este cazul hibridului omologat Xenia F1. Aceste fluctuaii
de
valori
evideniaz
complexitatea
determinismului
genetic
al
fenomenului
de
autocompatibilitate a polenului la floarea-soarelui. Astfel, conform observaiilor efectuate se

impune necesitatea determinrii gradul de autocompatibilitate pentru fiecare hibrid n parte,
chiar dac la unii dintre acetea anumite linii parentale sunt comune sau posed grade de
autocompatibilitate asemntoare.
Este imoprtant de menionat, c doi din hibrizii omologai Drofa i Xenia au cel mai nalt
grad de autiocompatibilitate (50,66% i 68,34% respectiv) n comparaie cu hibrizii
experimentali i chiar cu liniie lor paterne, demonstrnd o corelare pozitiv dintre productivitate
i autocompatibilitate, (Figura 3.8).
80
%
60
Rf
40
F1
20
0
Valentino
Xenia
Drofa
Fig. 3.8 Variaia autofertilitii polenului la genotipurile hibride (F1) omologate.

O posibil cauz a nivelului mai sczut al AC la hibridul Valentino similar cu cel al liniei
paterne poate fi condiiile climaterice din ultima perioad de timp, n special precipitaiile i
temperaturile medii atipice care au influenat negativ ntr-o msur mai mare aceast combinaie
hibrid, a crei perioad vegetativ este mai indelungat.
Doi din hibrizii omologai Drofa i Xenia au cel mai nalt grad de autiocompatibilitate
(50,66% i 68,34% respectiv) n comparaie cu hibrizii experimentali i chiar cu linile lor paterne
[51].
52
3.3. concluzii la capitolul 3

Astfel, liniile i hibrizii de floarea-soarelui investigate s-au remarcat printr-o perioada
vegetativ scurt, de aproximativ 81-98 zile, prezentnd n ontogenez valori caracteristice n
funcie de genotip ale nlimii, numrului de frunze, suprafeei foliare, diametrului
inflorescenei, flori fructificate (%), masa i diametrul seminelor etc. Variaia indicilor
morfologici a pus n eviden dependene corelative, cele mai semnificative fiind constatate n
cazul perechilor de caractere: masa seminei / lungimea seminei (r = 0,88), numr frunze F4 /
suprafaa foliar F4 (r = 0,83) la genotipurile heterozigote i masa seminei / diametrul seminei
(r = 0,83) pentru liniile paterne. De asemenea, genotipurile analizate au variat considerabil dup
nlimea plantelor, n cazul liniilor materne (0,64-1,26 m), paterne (0,52-1,09 m) i hibrizi F1
(1,22-1,6m). Liniile paterne, n procesul creterii i dezvoltrii, s-au caracterizat prin
uniformitatea indicilor morfologici n cadrul liniei, ns gradul de pigmentaie al anterelor i
capacitatea de producere a polenului o variat la diferite genotipuri Rf.
Evaluarea gradului de autocompatibilitate a polenului la dousprezece linii Rf i zece
genotipuri hibride a permis clasificarea acestora n trei grupe, cu valori: I (mai mici de 25%), II
(25-50%) i III (mai mari de 50%). Astfel, ase linii paterne: LC41; Valentino; LC Raus;
VIR558; Xenia; LC39 formeaz grupul doi, cu un nivel de 25-50% autocompati-bilitate i doar
n cazul a dou genotipuri: LC Cium i LC7 au fost constatate valori mai mari ale acestui indice
de 57,8 i 62,0% respectiv. Gradul de AC la diferite combinaii hibride a relevat o dependen n
funcie de baza ereditar a materialului biologic. Investigarea acestui parametru prin ncruciarea
diferitor linii Rf cu una i aceeai linie ASC n unele cazuri relev o cretere, iar n alte o scdere
a acestui caracter fapt care indic lipsa unui rol determinant al citoplasmei sterile n manifestarea
autocompatibilitii polenului.
53
4. PARTICULARITI DE INTERACIUNE A PRODUILOR DE EXPRESIE LA

GENELE ASC Rf
Studiul proteinelor implicate n manifesttarea fenotipic a ASC-ului i n restaurarea
fertilitii polenului poate ntruchipa diverse metodologii i forme ale cercetrii. Dedoarece,
nimic nu este cunoscut despre proteinele restauratoare de fertilitate de la floarea-soarelui, mai
nti de toate a fost decis de a efectua un studiu bioinformaional al tuturor sistemelor ASC-Rf.
4.1. Identificarea proteinelor codificate de genele sistemului ASC-Rf
Odat cu descoperirea structurii ADNului [238] biologia molecular a cunoscut o
dezvoltare exponenial. Apariia unui volum mare de cunotine noi, impune pe de o parte
necesitatea structurrii acesteia n subdomenii de cercetare, iar pe de alt dicteaz utilizrea
unor tehnologii de studiu i analiz mai performante. Dilema informaional este rezolvat cu
ajutorul bazelor de date (BD), care reprezint adevrate depozite de informaii ce atrag anual
un numr mare de cercettori.
Eficiena unei BD este determinat de cantitatea informaiei stocate i de prezena
programelor informaionale, ce tind s uureze att accesul, ct i analiza datelor. Cele mai
utilizate BD (din cadrul biologiei moleculare) sunt: The National Center for Biotechnology
Information (NCBI) [281], DNA Data Bank of Japan (DDBJ) [274], DNA Data Bank [283],
Gene Bank Database [280], Expert Protein Analysis System (expasy) [277] etc. Actualmente
NCBI, care a fost fondat n 1988 ca o subdiviziune a bibliotecii naionale de medicin din
Statele Unite ale Americii, reprezint cel mai mare rezervor de informaii cu aplicaii largi n
medicin, genetic i farmaceutic.
Utilizarea tehnologiilor compiuterizate n analiza sistemelor ASCRf la plante poate scoate
n eviden o serie de modaliti noi de interaciune a plasmo cariogenelor. Totodat, n baza
similaritudinii dintre diverse sisteme ASCRf, poate fi mai bine neleas interaciunea nucleu
citoplasm la floareasoarelui.
n cadrul prezentelor cercetri am selectat din baza de date NCBI dou grupuri mari de
proteine, asociate cu androsterilitatea citoplasmatic i restaurarea fertilitii (genele
restauratoare de fertilitate).
Astfel, au fost identificate douzeci i patru de proteine rspunztoare de manifestarea
fenotipic a androsterilitii citoplasmatice, cu o lungime cuprins ntre 67 (ORF 60 de la
Brassica oleracea) i 402 aminoacizi (proteina ASC de la Petunia axillaris) de la treisprezece
specii diferite de plante (Tabelul 4.1 i 4.3).
54
Talelul 4.1. Proteinele codificate de genele ASC

Numrul
de acces
[281]
Prote
in
AAN38288
ORF 77
AAN38287
ORF 355
AAA75457
ORF b
AAA75458
ORF c
CAA39429
ORFH52
2
AAB01584
ORF 98
AAB01583
ORF 209
AAB01585
ORF239
AAZ76183
ORF 456
BAB16712
orfBF1
BAB16713
orfBF2
Triticum
aestivum
BAA82046
ORF25
Brassica
juncea
ABO86586
ORF 108
1905379B
ORF 158
ABW97713
ORF 224
ACE00235
ACE00234
ORF 60
ORF 67
ACC69175
ORF 138
Brassica
rapa
ABI51268
CMS 96
ORF222
Raphanus
sativus
P68514
ORF 138
Specie
Zea mays
ASC S
Helianthus
annuus ASC
PET1
Phaseolus
vulgaris
Capsicum
annuum
Daucus
carota
Brassica
napus
Brassica
oleracea
Secvena
mfasfdsmmaflisfvfrvpfffclaflisfvfrcikshiywcrylslqiemprplltfwvlggkksglagffhcvf
medimstirillplrkqitgyfdkpslslnrdstneflstflktyiedihdfhfidedpidrgesslsldkknttyyeadasde
emditdgiegiiggtnrghngggdgealfiqisrllmeyikyyilnithtydamlseipwwiadsilkllwlvcihyilrfnpl
iymgnrfdiiykvlgsvgaglkslipqsivaifmqvstrhfderhrkylygffnilvyygiglvvryyitphlipdlgffrlqvlt
hlcdenagasvpaapplpqrragarfptillppepneppqsgvgrsattppepktstaclevvkallngaargctgs
wctgiwdelknccspssccdewid
mpqldkftyffrftilpiftmllgrflgtgcpgistlltlfflivtllliyrmrvskrkkssflffvililiyvlctfsrsffifmlagmpsafv
wkvssesgdatslpplessssseslatfraeiaaeneaeiftpirnletqdyynlppqnnpgeyevlvreef
mpqldkftyftqffwsclfdlrrtlffclfiflilvarsvfmeqitpykgrsisgpnaqsilplpggsgddpnrkkvpvskdtat
aavsllrqlvleilarardpslreglhnpttqawnraittaiqeqsghysistlgaiqgtialagelvfsreqspfflrvlqlvre
rys
Mpqldkftyftqffwsclfdlrrtlffclfiflilvarsvfmeqitpykgrsisgpnaqsilplpggsgddpnrkkvpvskdtat
aavsllrqlvleilarardpslreglhnpttqawnraittaiqeqsghysistlgaiqgtialagelvfsreqspfflrvlqlvre
rys
mdhfsrgchpvlpmslainkvantnktssqrtiqahyrrnfktlvlrepkhsfkggipdegtlgepptptivhvrsildlt
ncpsyllyvldspslsq
mkkklmmkdrilrgffftlllcmlkngmyslvsdfdlytilawwiptfymddvgassqsslppaepqapeplppaep
qapdlshtllddntrraelderagfhfvglseekkekvllaqvqieraiekallsdgysrdelsqrskrdeirgflfyrngkl
lsikkyesyveevkfgthrsqpyqdlihaisdsylflkkvkkikrwerg
mflpfnpqkifgrlsstlsrkiivrisivvvsvftigylfclvfgidlslifgnqlvrsfrvllsrllgwevpvlvffvgleldsslhmq
dpaggqpaanpaaeqpsnvpsggstskgtwwkkwipcftpqteegghsvsppeptrnwvldvdlpredpset
idtlrrkcaiiiqsfcqnnarddltfddiaqrlvletkgttigatredfqrllgelqnpaesdvylrvlkalekhpr
mpkspmyfwlnkpaisdksffigrarsgtttftcnftmnfidygtlftfsfylgisigifagrffersevlqelenfqlekiklkt
eaelqflcrehlrmneelqlpvpdgtsmhisdflgkaflvdetvrerilgltqiymdlknngate
mpqldkftyftqffwsclflftfyiaicndgdgllgisrilklrnqllshqennirskdpnsledilrkgfstgvsymysslfev
sqwcnavdllgkrrripliscfgeisgsrgmernifyliskssystssnpgwgitcrnditlihvphgqgsigf
mpqldkftyftqffwsclflftfyiaiwndgdgllgisrilklrnqllshqennirskdpnsledilrkgfstgvsymysslfev
sqwcnavdllgkrrripliscfgeisgsrgmernifyliskssystssnpgwgitcrnditlihvprgqrsfdnlytpmsyll
npnywvnewitgmdkkvldetcfeknreqpprtsshkknnqsprpplsvlldpffnsknek
mrflstdmkdrnmlfaaipsicasspkkisiyneemivarcfigflifsrkslgktfketldgriesiqeellqffnpnevip
eesneqqrllrislricstvveslptarcapkcektvqallcrnlnvksatllnatssrrirlqddivtgfhfsvserfvsgstfk
astidlireglivlrkvrvggsi
mntikslsqdieelkkngnlfdvsdqlynnalvsvtealtgtvqrllqhhnvllpenwthaqivqdilgddmtlgnvas
vlsnitqlglasdefhqifniinltgggv
mpqldkftyfsqffwlclffftfyificndgdgvlgisrilklrnqllshrgktiqskdpnsledllrkgfstgvsymyaslfevs
qwckavdllgkrrkitliscfgeisgsrgmernilynisksspsntgrwitcrncrndimlihvvhgqgsik
mpqldkftyfsqffwlclffftfyificndgdgvlgisrilklwnqllshrgktllskgrlgknrssdssrfevsalaahyfiifvv
pklgpvfyiiynffcllglkwgvlgdeichfgvgpdgvappaldlnerpplhllyadvessdsqqarnndmyahlrrv
qeitqklegerdivrrqalldimkwevrslqehfrifrhldrlrdsqrakvneildlfr
mrfcfflyfcqsnwvhkalfsrsifhlffflfplyfpfplffflfplyfpfplffflfplyfpfndr
iefqygwlgvkitiksnvpndevtkkvspiikgeiegkeekkegkgeiegkeekkevengprk
mitffeklstfchnltpteckvsvisffllafllmahiwlswfsnnqhclrtmrhleklkipyefqygwlgvkitiksnvpnd
evtkkvspiikgeiegkeekkegkgeiegkeekkegkgeiegkeekkevengprk
mpqldkftyfsqffwlclffftfyificndgdgvlgisrilklrnqllshwgktiqsklklggkdrtskfgvlafatryflmfvvpk
mrlaiyliyglnfifgikwgllgneifqfgvgpdgvappaldlnerpplhllyadvessdsqqarnadmlahisrvqeitr
dlegehdiarrqalvdimkwev rsldhhfrvf ryldrlrdsk rakvneildl fr
mitffeklstfchnltpteckvsvisffllafllmahiwlswfsnnqhclrtmrhleklkipyefqygwlgvkitiksnvpnd
evtkkvspiikgeiegkeekkegkgeiegkeekkegkgeiegkeekkevengprk
i, patrusprezece proteine restauratoare de fertilitate de la apte specii de plante, cu o

lungime cuprins ntre 506 (produsul de expresie a genei Rf1b de la Oryza sativa) i 794
aminoacizi (la proteina genei Rf1c de la Oryza sativa). Dintre acestea, cinci proteine fac parte din
categoria aldehiddehidrogenazelor (ALDH): produsul de expresie a genei Rf2 i Rf2b de la Zea
mays ASCT; ALDH2a de la Oryza sativa japonica group; ALDH de la Nicotiana tabacum i
ALDH de la Arabidopsis thaliana (Tabelul 4.2 i 4.3).
55
Talelul 4.2. Proteinele codificate de genele Rf

Specie
Numrul
de acces
[281]
Prote
in
AAK58370
ALDH2
NP_0011055
76
ALDH2b
Oryza
sativa
NP_0010480
10
ALDH2a
Oryza
sativa
AB110443
proteina
genei Rf
1
Oryza
sativa
DQ858156
proteina
genei Rf
4
Nicotian
a
tabacum
CAA71003
ALDH
Arabidop
sis
thaliana
NP_564204
ALDH
Zea mays
ASC T
Secvena
marraasslvsrcllarapagappaapsaprrtvpadgmhrllpgvlqrfstaaaveepitpsvhvnytkllingnfvdsasg
ktfptldprtgeviahvaegdaedinravaaarkafdegpwpkmtayersrillrfadliekhndelaaletwdngkpyeqa
aqievpmvarlmryyagwadkihglivpadgphhvqilhepigvagqiipwnfpllmyawkvgpalacgntlvlktaeqtp
lsalyiskllheaglpegvvnvvsgfgptagaalashmdvdkiaftgstdtgkiilelaaksnlktvtlelggkssfiimddadvd
havelahfalffnqgqcccagsrtfvhervydefvekakaralkrvvgdpfrkgveqgpqiddeqfkkilryirygvdggatlvt
ggdrlgdkgfyiqptifsdvqdgmkiaqeeifgpvqsilkfkdlnevikranasqyglaagvftnsldtantltralragtvwvnc
fdvfdaaipfggykmsgmgrekgvdslknylqvkavvtpiknaawl
maatvrraassvlsrflltkpspspasaagnnsallgsgaaalhrfstapasaaaaaeepiqpavevkhtqllingnfvdaa
sgktfptldprtgeviarvaegdsedidravaaarrafdegpwprmtaydrcrvllrfadlierhaeevaaletwdngktlaqa
agaevpmvarcvryyagwadkihglvapadgahhvqvlhepvgvagqiipwnfpllmfawkvgpalacgntvvlktae
qtplsalyvanllheaglpegvlnvvsgfgptagaalsshmgvdklaftgstgtgqivlelaarsnlkpvtlelggkspfivmdd
advdqavelahqavffnqgqcccagsrtfvhervydefvekskaralkrvvgdpfrdgveqgpqidgeqfnkilryvqsgv
dsgatlvaggdrvgdrgfyiqptvfadakdemkiareeifgpvqtilkfsgveevirranatpyglaagvftrsldaantlsralr
agtvwvncydvfdatipfggykmsgvgrekgiyalrnylqtkavvtpiknpawl
maarraassllsrgliarpsaasstgdsailgagsargflpgslhrfsaapaaaataaateepiqppvdvkytkllingnfvda
asgktfatvdprtgdviarvaegdaedvnravaaarrafdegpwprmtayercrvllrfadlieqhadeiaaletwdggktle
qttgtevpmvarymryyggwadkihglvvpadgphhvqvlhepigvagqiipwnfpllmfawkvgpalacgnavvlkta
eqtplsalfvasllheaglpdgvlnvvsgfgptagaalsshmgvdklaftgstgtgkivlelaarsnlkpvtlelggkspfivmd
dadvdqavelahralffnqgqcccagsrtfvhervydefvekararalqrvvgdpfrtgveqgpqidgeqfkkilqyvksgv
dsgatlvaggdragsrgfyiqptvfadvedemkiaqeeifgpvqsilkfstveevvrranatpyglaagvftqrldaantlaral
rvgtvwvntydvfdaavpfggykmsgvgrekgvyslrnylqtkavvtpikdaawl
marraasravgalrsdgsiqgrggraggsgaedarhvfdellrrgrgasiyglnraladvardspaaavsrynrmaragad
evtpdlctygiligcccragrldlgfaalgnvikkgfrvdaiaftpllkglcadkrtsdamdivlrrmtelgcipnvfsynillkglcde
nrsqealellhmmaddrgggsppdvvsyttvingffkegdsdkaystyhemldrgilpdvvtynsiiaalckaqamdkam
evlntmvkngvmpdcmtynsilhgycssgqpkeaigflkkmrsdgvepdvvtysllmdylckngrcmearkifdsmtkr
glkpeittygtllqgyatkgalvemhglldlmvrngihpdhyvfsilicayakqgkvdqamlvfskmrqqglnpnavtygavi
gilcksgrvedamlyfeqmideglspgnivynslihglctcnkweraeelilemldrgiclntiffnsiidshckegrvieseklfe
lmvrigvkpnvityntlingyclagkmdeamkllsgmvsvglkpntvtystlingyckisrmedalvlfkemessgvspdiity
niilqglfqtrrtaaakelyvritesgtqielstyniilhglcknkltddalqmfqnlclmdlkleartfnimidallkvgrndeakdlfv
afssnglvpnywtyrlmaeniigqglleeldqlflsmedngctvdsgmlnfivrellqrgeitragtylsmidekhfsleastaslf
idllsggkyqeyyrflpekyksfieslsc
marraasraagalrsegsiqgrggraggsgggaedarhvfdellrrgipdvfsynillnglcdenrsqealellhimaddggd
cppdvvsystvingffkegdldktystynemldqrispnvvtynsiiaalckaqtvdkamevlttmvksgvmpdcmtynsi
vhgfcssgqpkeaivflkkmrsdgvepdvvtynslmdylckngrctearkifdsmtkrglkpeittygtllqgyatkgalvem
hglldlmvrngihpnhyvfsilvcayakqekveeamlvfskmrqqglnpnavtygavigilcksgrvedamlyfeqmideg
lspgnivynslihglctcnkweraeelilemldrgiclntiffnsiidshckegrvieseklfdlmvrigvkpdiitystlidgyclagk
mdeatkllasmvsvgmkpdcvtystlingyckisrmkdalvlfremessgvspdiityniilqglfqtrrtaaakelyvgitksgr
qlelstyniilhglcknkltddalrmfqnlclmdlkleartfnimidallkvgrndeakdlfvafssnglvpnywtyrlmaeniigq
glleeldqlflsmedngctvdsgmlnfivrellqrgeitragtylsmidekhfsleastaslfidllsggkyqeyhrflpekyksfie
slsc
maarvftsrlsrsltssshllsrgliivdkqkshlgriaayqystaaaieepikpavnvehtklfingqfvdaasgktfptldprtge
viahvaegdaedinravaaarkafdegpwpkmnayerskifvrladliekhndqiatletwdtgkpyeqaakievpmvvr
llryyagwadkihgmtipadgpyhvqtlhepigvagqiipwnfpllmfswkigpalacgntvvlktaeqtplsafyvahllqea
glpegvlniisgfgptagaplcshmdvdklaftgstdtgkailslaaksnlkpvtlelggkspfivcedadidtaveqahfalffn
qgqcccagsrtfvhekvydeflekakaralkrtvgdpfksgteqgpqidskqfdkimnyirsgidsgatletggerlgergyyi
kptvfsnvkddmliaqdeifgpvqsilkfkdvddvirrannsryglaagvftqnidtantltralrvgtvwvncfdtfdatipfggy
kmsghgrekgeyslknylqvkavvtplknpawl
masrrvssllsrsfmsssrsifslrgmnrgaqrysnlaaaventitppvkvehtqlliggrfvdavsgktfptldprngeviaqvs
egdaedvnravaaarkafdegpwpkmtayerskilfrfadliekhndeiaaletwdngkpyeqsaqievpmlarvfryya
gwadkihgmtmpgdgphhvqtlhepigvagqiipwnfpllmlswklgpalacgntvvlktaeqtplsallvgkllheaglpd
gvvnivsgfgatagaaiashmdvdkvaftgstdvgkiilelasksnlkavtlelggkspfivcedadvdqavelahfalffnqg
qcccagsrtfvhervydefvekakaralkrnvgdpfksgieqgpqvdseqfnkilkyikhgveagatlqaggdrlgskgyyi
qptvfsdvkddmliatdeifgpvqtilkfkdldeviarannsryglaagvftqnldtahrlmralrvgtvwincfdvldasipfggy
kmsgigrekgiyslnnylqvkavvtslknpawl
Existena n baza de date a mai multor secvene proteice codificate de genele androsterile,
comparativ cu numrul de proteine restauratoare de fertilitate identificate, poate fi explicat prin
faptul c localizarea, secvenierea i identificarea produilor de expresie a genelor ASC este mult
mai uoar, datorit poziionrii extranucleare. Dintre toate proteinele analizate (ASC i Rf) din
cadrul aceleiai specii doar n patru cazuri a fost identificat existena n paralel a secvenelor
proteice att pentru genele ASC, ct i pentru restauratorii lor de fertilitate: Petuniiia spp.,
Brassica napus, Oryza sativa (cu un numr maxim de proteine restauratoare de fertilitate) i
Raphanus sativus (Tabelul 4.3).
56
Prot
ein
AAA96602
protein
ASC
402 aa
AAM52340
protein
a genei
Rf
PPR59
1
AAM52339
protein
a genei
Rf
PPR59
2
AAB41354
ORF
222
ACJ70132
protein
a genei
Rfo
BAA18902
ORF
79
Brassica napus
Oryza sativa
Raphanus sativus
Rf
ASC
Rf
A
S
C
Rf
AS
C
Rf
Petunia
ASC
Specie
Talelul 4.3. Proteinele sistemului ASCRf

Numrul
de acces
[281]
Secvena
mlegaksmgagaatiasagaaigignvlsssihsvlgiqitdlhhdvfffvililvfvswilgralwhfhykknpipqrivhgttieilrtlfps
iipmfiaipsfalygysdynssdeqsltfdsytipeddpelgqsrllevdnrvvvpansslrfivtsaavpslgvkgdavpslgvkgda
vpslgvkgdavpgpgrvfqtwtraferlglltvahcagtgtsssgsvvslpqdeiwaalegdpqalpedgqfhavapegnpqalpe
dgqfhavapegnpqalpedgqfhavapegnpqalpedgqfhaiafdpliatrqdawntllvllrrstkiepkanfvtkagedlgidta
dpvrldklvrvlntyiqlaplesgrkvlqnlkatmaewekngrp
mmrisvryclngnpffsffaysiaprhystntcsisvkgnfgvsnefqnvkclddafslfrqmvrtkplpsvasfskllkamvhmkhy
ssvvslfreihklripvhefilsivvnscclmhrtdlgfsvlaihfkkgipynevtfttlirglfaenkvkdavhlfkklvrenicepnevmygt
vmnglckkghtqkafdllrlmeqgstkpntrtytividafckdgmldgatsllnemkqksippdiftystlidalcklsqwenvrtlflemi
hlniypnvctfnsvidglckegkvedaeeimrymiekgvdpdvitynmiidgyglrgqvdrareifdsminksiepdiisynilingya
rqkkideamqvcreisqkglkpsivtcnvllhglfelgrtksaqnffdemlsaghipdlythctllggyfknglveeamshfhklerrre
dtniqiytavidglckngkldkahatfeklpliglhpdvitytamisgycqeglldeakdmlrkmedngcladnrtynvivrgflrsnkv
semkafleeiagksfsfeaatvellmdiiaedpsitrkmhwiklhia
mmriavryclngnpffsffaysiaprhystntcsisvkgnfgvsnefenvkclddafslfrqmvttkplpsavsfskllkalvhmkhys
svvsifreihklripvdafalstvvnscclmhrtdlgfsvlaihfkkgipynevtfttlirglfaenkvkdavhlfkklvrenicepdevmygt
vmdglckkghtqkafdllrlmeqgitkpdtciynividafckdgmldgatsllnemkqknippdiitytslidglgklsqwekvrtlflemi
hlniypdvctfnsvidglckegkvedaeeimtymiekgvepneitynvvmdgyclrgqmgrarrifdsmidkgiepdiisytaling
yvekkkmdkamqlfreisqnglkpsivtcsvllrglfevgrtecakiffdemqaaghipnlythctllggyfknglveeamshfhklerr
redtniqiytavinglckngkldkahatfeklpliglhpdvitytamisgycqeglldeakdmlrkmedngclpdnrtynvivrgffrssk
vsemkaflkeiagksfsfeaatvellmdiiaedpsllnmipefhrdnkk
mpqldkftyfsqffwlclffftfyificndgdgvlgisrilklrnqllshwgktiqsklklggkdrtskfgvlafatryflmfvvpkmrlaiyliygl
nfifgikwgllgneifqfgvgpdgvappaldlnerpplhllyadvessdsqqarnadmlahisrvqeitrdlegehdiarrqalvdimk
wevrsldhhfrvfryldrlrdskrakvneildlfr
mlarvcrfessssvpaarlfctrsirhtlakkssgkaggfggerlklqsgfheikglddaidlfgymvrsrplpcvidfckllgvvvrmerp
dvvislhrkmemrripcniysftilikcfcscsklpfalstfgkitklgfhpslvtfstllhglcvedrvsealhffhqickpnviafttlmnglcr
egrvveavalldrmvedglqpnqitygtivdgmckmgdtvsalnllrkmeevsrikpnvviysaiidglwkdgrqtdaqnlfsemq
ekgispnlftyncmingfcssgrwseaqrllremferkmspdvvtfsvlinalvkegkffeaeelynemlprgiipntitynsmidgfs
kqnrldaaermfylmatkgcspdvitfsilidgycgakrvddgmkllhemsrrglvantityttlihgfcqlgnlnaaldllqemissgvc
pnvvtcntlldglcnngklkdalemfkvmqkskmdldashpfndvepdvqtynilicglinegkfseaeelyeemphrglvpdtity
nsvidglckqsrldeatqmfdsmgskgfspdvvtfttlingyckvgrvgdglevfcemgrrgivanaityrtlihgfcqvgningaldif
qemissgvypdtitirnmltglwskeelkravqcl
manlvrwlfsttrgtnglpyfifgvvvggallfallkyqaplydpalmekiidhnikaghpievdyswwgtsirvvfpk
marraasravgalrsdgsiqgrggraggsgaedarhvfdellrrgrgasiyglnraladvardspaaavsrynrmaragadevtpd
lctygiligcccragrldlgfaalgnvikkgfrvdaiaftpllkglcadkrtsdamdivlrrmtelgcipnvfsynillkglcdenrsqealellh
mmaddrgggsppdvvsyttvingffkegdsdkaystyhemldrgilpdvvtynsiiaalckaqamdkamevlntmvkngvmp
dcmtynsilhgycssgqpkeaigflkkmrsdgvepdvvtysllmdylckngrcmearkifdsmtkrglkpeittygtllqgyatkgal
vemhglldlmvrngihpdhyvfsilicayanqgkvdqamlvfskmrqqglnpnavtygavigilcksgrvedamlyfeqmidegl
spgnivynslihglctcnkweraeelilemldrgiclntiffnsiidshckegrvieseklfelmvrigvkpnvityntlingyclagkmde
amkllsgmvsvglkpntvtystlingyckisrmedalvlfkemessgvspdiityniilqglfqtrrtaaakelyvritesgtqielstyniil
hglcknkltddalqmfqnlclmdlkleartfnimidallkvgrndeakdlfvafssnglvpnywtyrlmaeniigqglleeldqlflsme
dngctvdsgmlnfivrellqrgeitragtylsmidekhfsleastaslfidllsggkyqeyyrflpekyksfieslsc
marrvaarararaggvprsegtiqdrarvgsggaedaldvfdellrrgigapirslngaladvardnpaaavsrfnrmaragasmv
tptvhtygiligcccsagrldlgfaalghvvkkgfrvepiifnpllkglcadkrtddamdivlrgmtelgcvpnvfshtiilkglchenrsqe
alellhmmaddgggclpnvvsystvtdgllkggdpdkayatyremldrrilpnvvtyssiiaalckgqamdkamevhdrmvkng
vtpncftytslvhgfcssgqlteaikflekmcsngvepnvvtyssfmdylckngrctearkifysmvkrglkpdittyssllhgyaiegal
vemhglfdlmvqsdmqpdhyvfntliyasakqgkvdeamlvfskmrhqglkpncvtyntlingyckitrmenalalfqemvsng
vspnfitynimlqglfrtgrtgtakefyvqiiksgkkdlieqglleelddlflsmedndcstvstpac
marraasrvragavgalrsegstqgrggrtggsgaedarhvfdellrrgrgasiyglncaladvarhspaaavsrynrmaragade
vtpnlctygilmgscccagrldlgfaalgnvikkgfivdaiaftpmlkglcadkrtsdamdivlrrmtqlgcipnvfsynillkglcddnrs
qealellqmmpddggdcppdvvsyttvingffkegdldkaygtyhemldrgilpnvvtyssiiaalckaqamdkamevltsmvk
ngvmpncrtynsivhgycssgqpkeaigflkkmhsdgvepdvvtynslmdylckngrctearkmfdsmtkrglkpeittygtllqg
yatkgalvemhglldlmvrngihpnhyvfsilicayakqgkvdqamlvfskmrqqglnpdtvtygtvigilcksgrvedamryfeq
miderlspgnivynslihslcifdkwdkakelilemldrgicldtiffnsiidshckegrvieseklfdlmvrigvkpdiitystlidgyclagk
mdeatkllasmvsvgmkpdcvtyntlingyckisrmedalvlfremessgvspdiityniilqglfqtrrtaaakelyvgitesgtqlels
tyniilhglcknnltdealrmfqnlcltdlqletrtfnimigallkvgrndeakdlfaalsanglvpdvrtyslmaenlieqglleelddlflsm
eengctansrmlnsivrkllqrgditragtylfmidekhfsleastaslfldllsggkyqeyhrflpekyksfieslsc
ABC42330
protein
a genei
Rf1a
ABC42331
protein
a genei
Rf1b
BAD13711
protein
a genei
Rf1c
BAB21870
ORF
125
mitffeklstfchnltpteckvsvisffllayllmahiwlswfsnnqhclrtmrhleklkipyefqygwlgvkitiksnvpndevtkkvspiik
geiegkeekkegkgeiegkeekkevengprk
protein
a genei
orf687
mlarvcgfkcssspaesaarlfctrsirdtlakasgesceagfggeslklqsgfheikgledaidlfsdmlrsrplpsvvdfcklmgvv
vrmerpdlvislyqkmerkqircdiysfnilikcfcscsklpfalstfgkitklglhpdvvtfttllhglcvedrvsealdffhqmfettcrpnv
vtfttlmnglcregriveavalldrmmedglqptqitygtivdgmckkgdtvsalnllrkmeevshiipnvviysaiidslckdgrhsda
qnlftemqekgifpdlftynsmivgfcssgrwsdaeqllqemlerkispdvvtynalinafvkegkffeaeelydemlprgiipntitys
smidgfckqnrldaaehmfylmatkgcspnlitfntlidgycgakriddgmellhemtetglvadtttyntlihgfylvgdlnaaldllqe
missglcpdivtcdtlldglcdngklkdalemfkvmqkskkdldashpfngvepdvqtynilisglinegkfleaeelyeemphrgiv
pdtityssmidglckqsrldeatqmfdsmgsksfspnvvtfttlingyckagrvddglelfcemgrrgivanaityitlicgfrkvgning
aldifqemissgvypdtitirnmltglwskeelkravamleklqmsmdlsfgg
CAD61285
57
4.2. Caracteristica proteinelor asociate cu ASC i Rf

Uurina integrarrii studiului bioinformaional n cercetarea proteinelor codificate de
genele ASC i Rf, precum i stabilirea corelaiilor dintre indicii biochimici i grupurile cercetate,
reprezint una dintre condiiile de baz, care determin aplicabilitatea (implementarea) practic a
acestuia.
Analiza proteinelor ASC
Un aspect important legat de studiul proteic l reprezint masa molecular. Rezultatele
obinute n urma analizei parametrului dat au relevat c toate proteinele ASC au o mas
molecular mic, cu limitele inferioare de 7,12 kDa, 8,63 kDa la (ORF 67 i ORF 60 de la
Brassica oleraceea), iar cele superioare de 26,66 kDa, 43,8 kDa la (orfBF2 Daucus carotta i
proteina ASC de la Petunia axillaris) Tabelul 4.4. La Helianthus annuus ASC PET1 proteina
asociat cu androsterilitatea citoplasmatic are o mas molecular apropiat de valorile medii ale
acestui grup: 19,5 kDa.
Talelul 4.4. Masa molecular i punctul izoelectric a proteinelor ASC
Specie
Protein
Masa molecular kDa
Punctul izoelectric
Zea mays ASCS
ORF 77
ORF 355
ORF b
ORF c
ORFH 522
ORF 98
ORF 209
ORF 239
ORF 456
orfBF1
orfBF2
ORF 25
9,1
40,0
19,12
19,59
19,59
10,9
24,32
26,73
17,49
18,11
26,66
21,65
9,67
5,49
5,73
9,87
9,87
9,58
9,01
6,64
5,66
9,12
9,34
9,77
ORF 108
ORF 158
ORF 222
ORF 224
ORF 60
ORF 67
ORF 138
CMS96ORF222
ORF 138
ORF 125
ORF 79
11,82
18,18
25,94
26,21
8,63
7,12
16,01
25,94
16,01
14,58
8,92
4,82
9,78
9,5
9,12
9,36
7,39
8,88
9,5
8,88
9,1
9,3
Protein ASC 402 aa
43,8
19,85
5,4
8,36
Helianthus annuus ASC PET1

Phaseolus vulgaris
Capsicum annuum
Daucus carota
Triticum aestivum
Brassica juncea
Brassica napus
Brassica oleracea
Brassica rapa
Raphanus sativus
Oryza sativa
Petunia axillaris
MEDIA
Analiza punctului izoelectric la produii de expresie a genelor ASC a semnalat o fluctuaie

a acestui parametru cuprins n intervalul pH-ului de 6,599,11. Extremele minime ale pH-ului
(4,82 i 5,4) pentru atingerea punctului izoelectric au fost observate la proteinele (ORF 108 de la
Brassica junceea i proteina ASC de la Petunia axilaris). Maxima valorilor pH-ului de 9,67; 9,77
58
i 9,87 a fost urmrit la proteinele: ORF 77 de la Zea mays; ORF 25 de la Triticum aestivum i
produsul de expresie a genei orfH522 de la Helianthus annus. n consecin valorile medii ale
punctului izoelectric sunt atinse la un pH relativ alcalin - 8,36 (Tabelul 4.4).
Studiul detaliat al hidrofobicitii proteinelor a artat c, la grupul ASC predomin catenele
hidrofobe cu o valoare medie de 50%. Valorile maxime de 66% i 63% au fost nregistrate la
proteina ORF67 de la Zea mays i respectiv la ORF 79 de la Oryza sativa. Catenele hidrofile cu
o valoare medie de 23% au un maxim de 33% la (ORFBF1 i ORFBF2) de la Daucus carota i
32% la ORF 108 de la Brassica junceea. Proteina ASC de la floarea-soarelui are indicele
hidrofob i hidrofil apropiat de valorile medii ale celorlalte proteine androsterile.
Analiza complexului proteic din cadrul grupului ASC a sugerat faptul c, potenialul
electrostatic e puin deplasat n favoarea sarcinilor pozitive, cu o valoare medie de 11% fa de
9% ale celor negative. Maximile sarcinilor negative (22%, 15% i 14%) predomin la proteinele
ORF 67, ORF 138 de la Brassica oleraceea i la produsul de expresie a genei orf 209 de la
Phaseolus vulgaris (Figura 4.1).
B
Fig. 4.1. Potenialul electrostatic la A: ORF 209 de la Phasseolus vulgaris; B: ORF 138 de la
Brasica oleraceea, modelat cu [278].
Rou nor de elecroni; albastru deficit de electroni. Not: desenele reprezint o continitate.
Totodat, studiul regiunilor proteice cu o ncrctur pozitiv, a scos n eveden nite

valori maximale a acestor sarcini electrice (22% i 17%) tot la proteinele ORF 67 de la Brassica
oleraceea i ORF 138 de la (Raphanus sativus i Brassica oleraceea).
ncrctura electrostatic la produsul de expresie a genei orfH522 de la Helianthus annuus
arat c aceasta este aproape n totalitate compus din sarcinii pozitive (Figura 4.2).
Fig. 4.2. Potenialul electrostatic la ORFH522 de la Helianthus annuus, modelat cu [278].

Rou nor de elecroni; albastru deficit de electroni.
59
Frecvena aminoacizilor n baza eantionului compus din 24 de proteine androsterile

denot faptul c, n majoritatea cazurilor predomin leucina. La Brassica oleraceea i Raphanus
sativus glutamina i lizina posed o pondere maximal, iar triptofanul (0,91,8%) la toate
proteinele analizate are un procentaj minimal (Tabelul 4.5).
Talelul 4.5. Frecvena aminoacizilor i structura secundar a proteinelor ASC
Specie
Zea mays ASCS
Helianthus annuus ASC PET1
Phaseolus vulgaris
Capsicum annuum
Daucus carota
Triticum aestivum
Brassica juncea
Brassica napus
Brassica oleracea
Brassica rapa
Raphanus sativus
Oryza sativa
Petunia axillaris
MEDIA
Fregvena aa
Protein
ORF 77
ORF 355
ORF b
ORF c
ORFH 522
ORF 98
ORF 209
ORF 239
ORF 456
orfBF1
orfBF2
ORF 25
ORF 108
ORF 158
ORF 222
ORF 224
ORF 60
ORF 67
ORF 138
CMS96ORF 222
ORF 138
ORF 125
ORF 79
prot. ASC 402 aa
Struct. Secund.
maxim
minim
helix
struc.
Phe; Leu
Leu; Iso
Leu; Phe
Leu; Ser
Leu; Ser
Leu; Ser
Leu; Lys
Leu; Ser
Leu; Phe
Ser; Leu
Ser; Leu
Ser; Leu
Leu; Asp
Leu; Ser
Leu; Phe
Leu; Phe
Phe; Leu
Glu; Lys
Glu; Lys
Leu; Phe
Glu; Lys
Lys; Glu
Leu; Gly
Ala; Leu
Asp; Thr
Trp; Glu
Trp; Cys
Cys; His
Cys; His
Cys; Met
Cys; Asp
Met; Tyr
Trp; His
Ala; His
Ala; His
His; Tyr
Trp; Pro
Ala; His
Cys; Trp
Cys, Trp
Ala; Asp
Asp; Phe
Asp; Ala
Cys; Trp
Asp; Ala
Asp; Gln
Glu; His
Cys; Met
0
3
4
5
5
3
8
6
4
3
4
9
5
3
4
5
0
0
2
4
2
1
2
7
3,7
3
8
6
2
2
3
6
6
5
5
9
8
0
6
4
6
6
2
6
4
6
6
5
19
5,54
Un alt criteriu de studiu important l reprezint analiza structurii spaiale a proteinelor,

care este n strns interdependen cu funcia acestora. Rezultatele obinute au nregistrat o
predominan de structuri n majoritatea cazurilor (Figura 4.3):
helix
structur
Fig. 4.3. Reprezentarea spaial a proteinei ASC de la Petunia axillaris, modelat cu [285].
O majorare a helixurilor a fost ntlnit doar la un grup mic de proteine: la produsul de
expresie a genei orfH522 de la Helianthus annuus, la proteinele ORF 209 de la Phaseolus
vulgaris i ORF 108 de la Brassica junceea, iar un numr egal de helixuri i structuri a fost
60
observat la proteinele ORF 98, ORF 239 de la Phaseolus vulgaris i ORF 222 de la Brassica
rapa i Brassica napus.
Analiza proteinelor Rf
Studiul masei moleculare la proteinele restauratoare de fertilitate a artat c, acestea posed
nite indici ridicai ale parametrului n cauz. Cele mai mici valori de 55,37 kDa i 58,1 kDa leau nregistrat produii de expresie a genelor Rf1b de la Oryza sativa i ALDH de la Arabidobsis
thaliana. Abaterea maximal pozitiv, a fost observat la produii de expresie a genelor Rf1c i
Rf1 de la Oryza sativa i la proteina restauratoare de fertilitatte de la Raphanus sativus cu nite
indici de 87,7 kDa, 87,6 kDa i 76,5 kDa (Tabelul 4.6).
Pentru atingerea punctului izoelectric investigarea compiuterizat a demonstrat c,
proteinele ar trebui s posede n majoritatea cazurilor un pH de 6,87, ceea ce reprezint cu 1,49
uniti mai puin fa de valorile medii ale proteinelor ASC. Extremele minime ale pH-ului au
fost consemnate la produii de expresie a genelor orf687 de la Raphanus sativus i Rf1a de la
Oryza sativa (5,23 i 6,25). Maxima valorilor de 8,36 i 8,22 a fost observat la produii de
expresie a genelor RfPPR591 de la Petunia hybrida i Rf1b de la Oryza sativa (Tabelul 4.6).
Talelul 4.6. Masa molecular i punctul izoelectric a proteinelor resauratoare de fertilitate
Specie
Protein
Masa molecular, kDa
Punctul izoelectric
Zea mays ASCT
ALDH2
ALDH2b
ALDH
ALDH
ALDH2a
proteina genei Rf1
proteina genei Rf4
proteina genei Rf1a
proteina genei Rf1b
proteina genei Rf1c
proteina genei RfPPR591
proteina genei Rfo
59,46
58,59
59,33
58,15
58,9
87,61
76,06
87,6
55,37
87,77
67,23
67,07
74,48
7,27
6,54
7,26
7,24
6,5
6,35
5,76
6,25
8,22
6,43
8,36
7,62
7,19
69,58
6,87
Nicotiana tabacum
Arabidopsis thaliana
Oryza sativa
Petunia x hybrida
Brassica napus
MEDIA
Studiul detaliat al hidrofobicitii a relevat c, la fel ca i n cazul proteinelor ASC, la cele

restauratoare de fertilitate predomin capetele hidrofobe cu o valoare medie de 51% fa de cele
hidrofile cu o valoare de 23%. n cazul catenelor hidrofobe abaterile maximale pozitive de la
medie de 7% i 6% au fost nregistrate la ALDH de la Oryza sativa i la ALDH2B de la Zea
mays. Referitor la capetele hidrofile maxima acestora predomin la produii de expresie a
genelor Rf4, Rf1a, Rf1b, Rf1c de la Oryza sativa cu valori de 20% i la proteina genei RfPPR591
de la Petunia hybrida cu o valoare de 25% (Tabelul 4.7).
61
Talelul 4.7. Hidrofobicitatea i sarcina electric a proteinelor Rf

Specie
Protein
Zea mays ASCT
ALDH2
ALDH2b
ALDH
ALDH
ALDH2a
proteina genei Rf1
proteina genei Rf4
proteina genei Rf1a
proteina genei Rf1b
proteina genei Rf1c
proteina genei Rfo
Nicotiana tabacum
Oryza sativa
Petunia x hybrida
Brassica napus
MEDIA
Hidrofobicitatea
Sarcina electric
hidrofob
hidrofil
neutr
negativ
pozitiv
neutr
56%
57%
52%
54%
58%
50%
49%
50%
51%
49%
48%
48%
50%
51%
19%
20%
23%
21%
19%
25%
26%
25%
25%
25%
25%
24%
25%
23%
24%
22%
24%
23%
22%
24%
24%
24%
23%
24%
26%
27%
23%
23%
10%
10%
11%
10%
10%
11%
12%
11%
10%
11%
11%
12%
11%
10%
10%
9%
10%
10%
9,9%
11%
10%
10%
11%
11%
12%
12%
11%
10%
78%
79%
78%
78%
79%
77%
77%
77%
78%
77%
76%
75%
78%
77%
Analiza potenialului electrostatic al proteinelor restauratoare de fertilitate indic un

echilibru ntre sarcinile pozitive i cele negative, media acestora are un indice de 10%. Astfel,
prezena ntro msur ridicat a sarcinilor pozitive i negative, ar putea fi un argument n
favoarea complexitii structurale i funcionale a acestor biomolecule. Numrul maxim de
sarcini negative (13%) a fost observat la produsul de expresie a genei orf687 de la Raphanus
sativus (Figura 4.4) i la produii de expresie a genelor Rf4 de la Oryza sativa i RfPPR592 de la
Petunia hybrida.
Fig. 4.4. Potenialul electrostatic la produsul de expresie a genei orf687 de la Raphanus sativus,
modelat cu [278].
Rou nor de elecroni; albastru deficit de electroni. Not: desenele reprezint o continitate de la stnga la dreapta.
Iar, maxima sarcinilor pozitive de 12% a fost obinut la produii de expresie a genelor
RfPPR591 (Figura 3.5) i RfPPR592 de la Petunia hybrida.
Studiul frecvenei aminoacizilor n baza eantionului compus din cele 14 proteine
restauratoare de fertilitate a permis diferenierea acestora n dou grupuri mari. n primul sunt
incluse aldehiddehidrogenazele unde dintre toi aminoacizi procentajul maximal l posed
alanina, care la rndul su induce un indice hidrofobic mai mare ntregii proteine. La restul
proteinelor, ca i n cazul grupului ASC, predomin leucina. Cea mai mic frecven a fost
observat la aminoacizii: cisteina i triptofan (Tabelul 4.8).
Analiza structurii spaiale a produilor de expresie a genelor Rf a permis divizarea acestora
n trei grupuri mari. n primul, sunt incluse proteinele genelor Rf1, Rf1a, Rf1b i Rf1c de la Oryza
62
sativa, produsul de expresie a genei Rf2b de la Zea mays ASC T, proteinele RfPPR591 i
RfPPR592 de la Petunia hybrida i aldehiddehidrogenaza de la Arabidobsis thaliana unde o
predominan major o au helixurile (Figura 4.5).
helix
helix
structur
structur
A
B
Fig. 4.5. A: ALDH Arabidobsis thaliana i B: produsul de expresie a genei RfPPR591 de la
Petunia hybrida, modelat cu [285].
n al doilea grup intr produsul de expresie a genei Rf2 de la Zea mays cu citoplasm de tip
T i la aldehiddehidrogenazele de la Oryza sativa i Nicotiana tabacum (Figura 4.6), n care au
fost remarcate proporii egale de helixuri i structuri.
structur
helix
helix
structur
A
B
Fig. 4.6. A: ALDH de la Oryza sativa i B: RF2 de la Zea mays, restaurator pentru ASC T,
modelat cu [285].
Iar, n al treilea grup este inclus doar produsul de expresie a genei Rfo de la Brassica
napus, unde o predominan major o au structurile.
Talelul 4.8.Frecvena aminoacizilor i structura secundar a proteinelor Rf
Specie
Protein
Zea mays ASCT
ALDH2
ALDH2b
ALDH
ALDH
ALDH2a
proteina genei Rf1
proteina genei Rf4
proteina genei Rf1a
proteina genei Rf1b
proteina genei Rf1c
proteina genei Rfo
Nicotiana tabacum
Oryza sativa
Petunia x hybrida
Brassica napus
MEDIA
Fregvena
Struct. secund.
maxim
minim
helix
struct.
Ala; Leu
Ala; Val
Ala; Gly
Ala; Gly
Ala; Val
Leu; Gly
Leu; Gly
Leu; Gly
Leu; Gly
Leu; Gly
Leu; Iso
Leu; Lys
Leu; Gly
Cys; Trp
Cys; Trp
Cys; Trp
Cys; Trp
Cys; Trp
Trp; His
Trp; His
Try; His
His; Glu
Trp; His
Trp; Glu
Trp; Glu
Trp; His
16
19
18
20
20
29
29
34
20
35
16
20
21
22,85
16
14
18
17
20
24
17
24
13
22
14
16
33
19,42
63
Generaliznd datele obinulte n urma analizei a 24 de proteine androsterile i 14 proteine

restauratoare de fertilitate, noi am remarcat o serie de deosebiri [50, 163] i unele asemnri ntre
cele dou grupuri studiate (Figura 4.7).
PROTEINE ASC
PROTEINELE Rf
Predomin catenele hidrofobe

Echilibru ntre sarcinile electrice pozitive i cele negative
Mas molecular mic (7,12-43,8 kDa)
Mas molecular mare (55,37-87,3 kDa)
Punctulul izoelectric la un pH mai alcalin
Punctulul izoelectric la un pH mai acid
Predomin leucina
Predomin leucina
La ALDH predomin Alanina
Predomin structurile
Predomin helixurile
Fig. 4.7. Deosebiri i asemnri ntre proteinele ambelor grupe studiate.

Prin urmare, masele moleculare ale proteinelor restauratoare de fertilitate sunt net
superioate fa de cele ASC. Fiind dat faptul c o mas molecular ridicat este asociat cu un
numr mare de aminoacizi ce implic o posibilitate mai nalt de existen a mai multor domene
proteice n cadrul aceleiai proteine, putem intui o structuralitate i funcionalitate complex a
produilor de expresie Rf.
Totodat, proteinele androsterile, dei, posed dimensiuni mai mici au nregistrat o
predominan de structuri opozabil proteinelor restauratoare de fertilitate cu dimensiuni mai
mari, unde prevaleaz helixurile. Acest fenomen poate fi explicat prin faptul c, o structur
biologic complicat, dac ar fi format din subuniti foarte complexe, ea ar avea un numr
foarte mare de probabiliti de interaciune dintre subuniti, ce la un moment dat ar duce la
interconfruntarea dintre ele.
Punctul izoelectric are o importan deosebit n ceea ce privete studiul funcionalitii
proteinelor datorat modificrilor pH-ului [110]. n cazul proteinelor restauratoare de fertilitate
acesta este obinut la un pH mai acid (6,87) fa de cele ASC (8,36). Potenialul electrostatic
i repartizarea spaial a sarcinilor influeneaz proprietile fizicochimice ale proteinelor,
precum i interaciunile dintre ele [181]. Iar, studiul combinat al punctului izoelectric i al
potenialului electrostatic la valori neutre ale pHului, a scos n eviden dou subgrupuri de
proteine ASC. n primul, sunt incluse acelea care au ca trstur esenial scderea sarcinilor
pozitive odat cu creterea pHului: ORF 79 de la Oryza sativa Ind. Gr.; ORF 77 de la Zea mays
ASCS; orfBF1, orfBF2 de la Daucus carota; protein ASC a genei orf 60 de la Brassica
oleracea var. capitata; ORFc i produsul de expresie a genei orfH522 de la Helianthus annuus
ASCPET1; ORF98 de la Phaseolus vulgaris; ORF25 de la Triticum aestivum; ORF 158, ORF
64
222 de la Brassica napus. Iar al doilea subgrup proteic se caracterizeaz prin faptul c, sporirea
pHului coreleaz puternic cu creterea sarcinilor negative: proteina ASC de 402 aa de la Petunia
axillaris subsp. parodii; ORF108 de la Brassica juncea; Proteina ASC de la Capsicum annuum,
ORF355 de la Zea mays ASCS.
Hidrofobicitatea proteinelor are un rol deosebit n ceea ce privete stabilitatea structural a
acestora, iar interaciunile hidrofobe ntre aminoacizi reprezint motorul esenial privind
conformarea proteinelor n starea lor nativ [45]. Analiza complexelor ASC i Rf a scos n
eviden o predominan a catenelor hidofobe corelat cu frecvena nalt a leucinei care este un
aminoacid alifatic hibrofob.
4.3. Localizarea celular a proteinelor asociate cu ASC i Rf
Un aspect important legat de studiul proteinelor reprezint analiza domenelor/motivelor
proteice (DP/MT). Domenul proteic ntruchipeaz o parte din secvena proteic, care poate
evolua, funciona i exista independent de restul proteinei, iar MT este mai degrab un aspect
care ine de structura primara a proteinei.
Rezultatele obinute cu ajutorul programei Phobius [275] au evideniat cele mai elocvente
deosebiri ntre grupurile studiate. Astfel, majoritatea proteinelor rspunztoare pentru
manifestarea fenotipic a ASC-ului, au motive noncitoplasmatice, transmembranare i
citoplasmatice. Excepie de la regul fac parte proteinele ASC: ORF 108 de la Brassica juncea;
ORF 67 de la Brassica oleracea; ORF 98 i ORF 209 de la Phaseolus sp. i ORF 25 de la
Triticum aestivum cu motive strict citoplasmatice ca i toate proteinele restauratoare de
fertilitate (Tabelul 4.9).
Tabelul 4.9. Localizarea celular a proteinelor sistemului ASCRf [275]
Specie
Petunia axillaris
Petunia x hybrida
Brassica napus
Brassica napus
Oryza sativa
Oryza sativa
Raphanus sativus
Raphanus sativus
Protein
ASC 402 aa
Rf-PPR591
Rf-PPR592
ORF222
Rfo
ORF 79
Rf1a
Rf1b
Rf1c
ORF 125
Rf ORF687
Motive ale proteinelor ASC-Rf (aminoacizi)

Noncitoplasmatic
Transmembranar
Citoplasmatic
38-46, 112-402
28-89
1-19
1-23
47-67; 88-111
7-27; 90-108
20-38
24-44
68-87
1-591
1-591
1-6; 109-222
1-667
39-79
1-791
1-506
1-794
45-125
1-687
Proteinele ASC (ORF77 de la porumb; ORFc i ORFH522 de la floarea soarelui; ORF 60,
ORF 138 de la Brassica oleraceea; ORF 158 de la Brassica napus; ORF 138 de la Raphanus
sativus; ORF BF1, ORF BF2 de la Daucus carota; proteina ASC de la Capsicum annuum;
65
i ORF 79 de la Oryza sativa) au cte un

singur
motiv
transmembranar.
Dintre
acestea proteina ORFH522 de la floareasoarelui are partea N-terminal format

din 23 aminoacizi, incluznd un motiv
proteic noncitoplasmatic cu un potenial
electrostatic
echilibrat
ntre
sarcinile
pozitive i cele negative. Partea central a

acesteia,
constituit
aminoacizi
conine
din
24-41
un
de
Fig. 4.8. Modelul ipotetic al distribuiei spaialei a
motiv
Fig. 4.8. Modelul ipotetic al distribuiei spaialei a
transmembranar, iar captul C-terminal

este orientat n citoplasm (Figura 4.8).
ORFH522.
MN- Motiv Noncitoplasmatic; MT- Motiv Transmembranar;
MC- Motiv Citoplasmatic
4.4. Modele de interaciune nucleu citoplasm la diverse specii de plante

Pentru o nelegere mai profund a sistemelor ASC-Rf, noi am decis s efectum un studiu
integrat al acestora cu ajutorul tehnicilor compiuterizate, fapt ce ar permite evidenierea anumitor
legiti privind fenomenele de androsterilitate citoplasmatic i restaurarea fertilitii n
conjunctura interaciunii nucleu citoplasm.
Androsterilitatea citoplasmatic la plantele de Petunia sp. este asociat cu apariia unui nou
cadru de citire pcf (Figura 4.9), care determin sinteza unei proteine (ASC) de 25 kDa. Gena
androsterilitii se cotranscrie cu genele mitocondriale nad3 (NADH dehidrogenaza subunitatea
3) i rps12 (subunitatea mic a unei proteine ribozomale S12) i afecteaz expresarea acestora
prin destabilizarea produilor de expresie a genelor nad3 i rps12 de catre un domen proteic
retroviral aspartil proteaza (acest domen este implicat n deteriorarea conformaiei native a
proteinei prin distrugerea legturilor peptidice) i identificat n cercetrile noastre n secvena
proteic PCF.
Fig. 4.9. Diferene ale genomului mitocondrial la plantele sterile i fertile de petunie [76].
Prezena genelor restauratoare de fertilitate Rf-PPR592 afecteaz abundena transcriptului
policistronic pcf/nad3/rps12. Prin urmare, la genotipurile restauratoare a fost nregistrat o
deleie la captul 5` cu 121 de nucleotide naintea codonului start al genei pcf. Probabil c,
66
aceast deleie perturb ataarea ribozomilor i formarea complexului de iniiere a translaiei de

pe ARN-ului policistronic. n felul acesta, coninutul proteinei de 25 kDa asociate cu
androsterilitatea citoplasmatic (codificate de interiorul S-pcf locusului) este redus substanial ca
urmare a implicrii domenelor proteice de tipul chaperonin family puse n eviden pe ntreaga
suprafaa la produsul de expresie a genei Rf-PPR592 (Figura 4.10). Aceste domene particip n
defurarea foldingului proteic [58], sau pot fi implicate n organizarea molecular a
proteinelor i a concentraiei acestora n citosol, pot facilita transportul prin membrane sau sunt
sintetizate ca reacie de rspuns la diferii factori de stres [55]. Domenul proteic de tip
chaperonin family posed numeroase ci de aciune implicate n procesele metabolice, i este
format din mai multe subdomenii. Studiul bioinformaional atest n interiorul acestui DP
(domen prooteic) un alt subdomen proteic denumit: Radical SAM superfamily. Acesta
particip n procesele de metilare, izomerizare i poate funciona ca ajuttor al conformrii
proteinelor n starea lor nativ.
Fig. 4.10. Domenii existente n cadrul proteinei PPR 592.

Cpn60_TCP1 Chaperonin family i Radical SAM superfamily.
Probabil, unul dintre efectele produsului de expresie a genelor Rf ar fi asociat cu

destabilizarea funcional sau cantitativ a transcriptului ASC, iar un alt efect este determinat de
mecanismele ajuttoare ale expresrii genelor mitocondriale nad3 i rps12.
Un alt tip de interaciune nucleu citoplasm a fost identificat la Brassica napus. Se
cunoate c la plantele de Brassica androsterilitatea citoplasmatic este corelat cu apariia a
67
dou cadre de citire noi (Figura 4.11): orf222 situat n amonte de gena nad5c i orf139 n avalul
acestei gene. Investigarea bioinformaional a genelor ASC nu a pus n eviden existena vre-o
unui domen proteic.
Fig. 4.11. Apariia a dou cadre de citire (orf222 i orf139) la Brassica napus [22].
Analiza mecanismului de restaurare a androfertilitii polenului la Brassica napus relev
faptul c, ARNul mesager al genei orf139 este prezent n extractul de antere, spre deosebire de
proteina ORF139 care nu a fost depistat la nivelul butonilor florali. Astfel, genele restauratoare
de fertilitate acioneaz la nivel de ARN i mpiedic translarea genelor ASC n protein. De
asemenea s-a consatat c prezena proteinei resaturatoare de fertilitate este asociat cu
micorarea coninutului transcriptului ASC orf222/nad5c/orf139. Acest lucru este comfirmat i
de studiile noastre compiuterizate care atest la nivelul proteinei restauratoare de fertilitate
prezena unui motiv de recunoatere a ARN-ului (Figura 4.12).
Fig. 4.12. Domenii existente n cadrul produsului de expresie a genei Rfn.

RRM_1 RNA recognition motif.
n acest mod, autorii ajung la concluzia c activitatea genei Rfn se realizeaz printr-o serie
de procese care sunt implicate n destabilizarea cantitativ sau calitativ a transcriptului
orf222/nad5c/orf139, iar motivul proteic RNA recognition motif identificat cu ajutorul
studiului bioinformatic determin recunoaterea ARNului genelor mitocondriale asociate cu
ASC.
La Raphanus sativus androsterilitatea citoplasmatic este determinat de apariia la nivelul
genomului mitocondrial a unui cadru de citire nou: orf125 situat ntre secveiele trnfM i atp8.
Studiul compiuterizat al proteinei ORF125 nu a relevat existena vre-o unui domen proteic.
n ceea ce privete produsul de expresie a genei restauratoare de fertilitate orf687, aceasta
codific o protein cu 16 repetri a cte 35 de aminoacizi ce poart un motiv numit
pentatricopeptid. Totodat proteina restauratoare ar putea aciona direct sau indirect att la
nivelul ARN-ului genei orf125 n captul 5, ct i la nivel de protein.
68
Analiza
bioinformaional, nici n cazul proteinei ORF 687 nu a identificat domene proteice. Din acest
cauz, noi am convenit s analizm gradul de similaritudine dintre aceast protein i celelalte
proteine restauratoare de fertilitate luate n studiu. Rezultatele au artat o asemnare mare ntre
produii de expresie a genlor Rf de la Raphanus sativus i Brassica napus (Figura 4.13).
Fig. 4.13. Arborele filogenetic la produii de expresie a genelor Rf.

1Rf2a i 2Rf2b (Zea mays); 3PPR591 i 4PPR592 (Petunia x hybrida); 5Rf (Brassica napus); 6ALDH 2a, 7
Rf1, 8Rf1a, 9Rf1b, 10Rf1c i 11Rf4 (Oryza sativa); 12 Rf (Raphanus sativus); 13ALDH (Nicotiana
tabacum); 14ALDH (Arabidopsis thaliana) programul [276].
ntruct studiul compiuterizat al proteinei Rfn a demonstrat existena unui motiv: RNA
recognition motif i analiza clusterian indic o asemnare mare dintre aceasta i produsul de
expresie a genei orf687, putem presupune c, i n cadrul sistemului dat exist acelai mecanism
restaurator ca i la Brassica napus. Prin urmare proteina restauratoare de fertilitate avnd
motivul pentatricopeptid format n interior exclusiv din catene hidrofilice sugereaz un sait
ARN - int implicat n destabilizarea transcriptului ASC.
Analiza sistemului ASCRf de la Oryza sativa a relevat faptul c, plantele androsterile
prezint un cadru de citire nou: orf 79 situat naintea genei atp6, iar transcriptul mitocondrial
atp6 nu e editat eficient, din cauza apariiei aa numitei gene B-atp6 translat ntr-un polipeptid
alterat. O cantitate mare a acestuia, are un efect toxic i cauzeaz apariia ASC-ului datorit
competiionrii cu proteina normal ATP6.
Genele Rf1a i Rf1b care restaureaz fertilitatea polenului, reprezint componentele unui
cluster de gene cu motive pentatricopeptidice. n cazul dat, ambele proteine RF1A i RF1B au
aciune mitocondrial i produc deleii la nivelul ARNului mitocondrial (RF1A) sau degradeaz
transcriptul atp6orf79 (RF1B). Concomitent a mai fost observat i faptul c produsul de
69
expresie a genei Rf1a mai are un rol adiional ajuttor n expresarea genei mitocondriale atp6
independent de prima funcie. Cu ajutorul tehnicilor bioinformaionale noi am depistat un domen
proteic la produsul de expresie a genei Rf1a asemntor cu ATP sinthase. Astfel, se poate
presupune c expresia genelor restauratoare de fertilitate crete suficient de mult cantitatea de
protein normal fa de polipeptidul alterat (codificat de gena androsterilitii) i destabilizeaz
expresia genei ASC la nivel de ARN, ceea ce
determin restraurarea androfertilitii
citolasmatice.
O alt modalitate de restaurare a fertilitii citoplasmatice a fost constatat la Zea mays cu
citoplasma de tip T. Sterilitatea polenului datorat proteinei mitocondriale URF 13 apare ca
urmare a expresrii genei ASC situat ntre locusul atp6 i atp4. Proteina URF 13 prezent n
toate esuturile vegetative are un efect citotoxic resimit doar la nivelul florilor mascule. La
momentul de fa, nu exist secvena proteinei ASC n baza de date, ceea ce face imposibil
determinarea vre-o unui DP la nivelul acestui polipeptid. Totodat, datele din literatur
demonstreaz c incapacitatea mitocondriei de a furniza energie destul n prezena genelor
androsterile determin intensificarea glicolizei, genernd cantiti nsemnate de acid piruvic, care
n urma fermentaiei alcoolice se transform n acetaldehid ce dup un anumit prag devine
toxic. Fermentaia alcoolic se realizeaz n 2 etape: prima decarboxilarea piruvatului la
acetaldehid, i a doua etap reducerea acetaldehidei pe de o parte la etanol, reacie n prezena
alcool dehidrogenazei ADH 9, iar pe de alt parte la acetat n prezena aldehiddehidrogenazei
(produsul de expresie a genei Rf2).
Astfel, n cadrul acestui sistem, gena Rf2 (ce expreseaz o aldehiddehidrogenaz) este un
restaurator neobinuit care mai curnd compenseaz defectele metabolice cauzate de proteina
toxic URF 13 i acioneaz conjugat cu gena Rf1. La Zea mays aldehiddehidrogenazele sunt de
dou tipuri RF2A i RF2B. Primul poate oxida aldehide cu lanul mai mare de 10 atomi de carbon,
inclusiv cele aromatice, iar al doilea oxideaz aldehide cu lan mai scurt de 10 atomi de carbon.
Ambele proteine restauratoare intesc mitocondria i sunt produii de expresie a genelor Rf2a i
Rf2.
La Zea mays cu citoplasma de tip S expresia proteinelor ORF 77 i ORF 355 la nivelul
butonilor florali induc androsterilitatea corelat cu apoptoza celular. Printre efectele asociate cu
apoptoza, n cadrul acestui sistem a fost observat elimiarea citocromului C din mitocondrie n
citosol i degradarea ADNului nuclear n fragmente mai mici. Cu ajutorul studiului
bioinformaional noi am indentificat
mai multe domenii n cazul proteinei ORF 355
rspunztoare de androsterilitatea citoplasmatic. Primul prezint un grad nalt de similaritate cu

Cytocrom_B_C, iar al doilea domen numit Major Facilitator Superfamily reprezint un
70
polipeptid membranar, cu rol de a transpora cantitti mici de solveni diferii, ca urmare a

modificrilor chimiosmotice (Figura 4.14). Astfel, n comformitate cu datele din literatur i
bazndune pe studiul efectuat, putem presupune c proteina ORF 355 care reprezint un
polipeptid membranar ar putea s indeplineasc rolul unei pompe alterate (ce ar facilita
eliminarea citocromului C din mitocondrie n citoplasm). Numrul mare ale acestora ar putea
distruge integritatea mitocondrial i ar media declaarea proceselor apoptozice.
Fig. 4.14. Domenii existente n cadrul proteinei ORF 355.

MFS_1 Major Facilitator Superfamily.
Mecanismul de restaurare demonstreaz c, pe de o parte microsporii restaurai prezint o

deleie de 9 nucleotide n cadrul transcriptului ASC la captul 5-prim. Iar pe de alt parte, gena
Rf3 activeaz expresia unor serii largi de gene antiapoptozice (nlturnd manifestarea fenotipic
a ASC-ului): VDAC2 (voltagedependent anion channel protein) ce la organismele animale
poate inhiba desfurarea apoptozei, BI1 (Baxinhibitor), cystatin II i AdoMetDC
(adenosylmethionine decarboxylase) cheia esenial n sinteza poliaminei care joac un rol
important n diviziunea celular i n efectul de antisenescen. n cazul de fa, deoarece
mecanismul restaurator este declanat prin dou ci diferite (una implicat n procesul de
translaie, iar alta determinat de expresia genelor antiapoptozice) putem presupune existena a
dou posibiliti n ceea ce privete numrul genelor restaurfatoare de fertilitate: prezena unei
gene cu efect pleiotrop, sau a mai multor care ar forma un cluster de gene.
Androsterilitatea citoplasmatic la Helianthus annuus similar altor specii este corelat cu
apariia unor polipeptide noi, himere, codificate de mitocondrii. Analiza comparativ dintre
liniile fertile i cele androsterile a artat c, la indivizii normali gena atpA codific F1-ATPsintaza i are un transcript de 1,9 kb fa de 3 kb la liniile sterile, deoarece noul cadru de lectur
orfH522 este transcris cu aceast gen. Produsul de expresie ASC este o protein de aproximativ
15 kDa, care provoac degenerarea esutului tapetal pn n stadiul de Profaza 2, iar expresarea
proteinei ASC este asociat cu expulzarea citocromului c n citosol ca i n cazul porubului cu
citoplasm de tip S.
Prezena genelor restauratoare duc la scderea cantitii de transcript ASC prin
poliadenilarea structurii atpA-orfH522, astfel nct ARN-aza2 degradeaz substratul dat.
71
Totodat, genele Rf, pe lng aciunea sa la nivel de ARN contracareaz efectele produsului
de expresie orfH522 deja expresat, deoarece proteina acesteia este totui prezent (n cantiti
mai mici) la hibrizii restaurai. n acest sens, devine evident faptul c locusul restaurator de la
floareasoarelui, avnd mai multe mecanisme de aciune este complex i ar putea fi format din
mai multe gene (Figura 4.15).
Efectele locusului
restaurator
Poliadenileaz transcriptul atpA
orfH522
Contracareaz efectele proteinei ASC

deja expresate
Fig. 4.15. Manifestarea locusului restaurator de la Helianthus annuus.

Astfel, aplicarea programelor Protein Workbench 5.0.1. i Phobius a pus n eviden
motive transmembranare i citoplasmatice, domene proteice (DP)
Major Facilitator
Superfamily, Retroviral aspartil proteaza DP etc. pentru proteinele ASC i motive citoplasmatice
de genul RRM_1 RNA recognition motif sau domene proteice de tip ALDH Aldehyde
Dehydrogenase pentru cele asociate cu Rf. n baza acestor date pot fi relevate anumite principii
generale de interaciune a componentelor sistemelor ASC-Rf (Figura 4.16).
Gena
AS C
Protein amembranar
ARN
MP CITOPLASMATIC
Destabilizeaz
alte proteine
mitocondriale
Destabilizeaz
transcriptul
mitocondrial
asociat cu ASC
Toxin
MP RNA recognition
motif
DP Retroviral
aspartil proteaza
Destabilizeaz
proteina ASC
Compenseaz
defectele
metabolice
cauzate de
proteina ASC
Protein membranar
MT NONCITOPLASMATIC,
TRANSMEMBRANAR i
CITOPLASMATIC
Perturb integritatea
mitocondriei (expulz. cit.
C n citosol)
DP Major Facilitator
Superfamily
Activeaz genele
antiapoptozice
DP ALDH
adiional
adiional
Gena
Rf
adiional
ARN
Protein amembranar; MP-CITOPLASMATIC
Fig. 4.16. Mecanismul general de interaciune dintre componentele sistemului ASC-Rf [167].
De asemenea instrumentele bioinformatice utilizate n investigarea sistemelor ASC-Rf
(arbore filogenetic, DP, MP, structur spaial etc.) a pus n eviden asemnri a diferitor
sisteme. De exemplu, clusterizarea filogenetic a proteinelor asociate cu restaurarea fertilitii
demonstreaz un grad mare de
asemnare ntre sistemele descrise la
72
Brassica napus i
Raphanus sativus, iar analiza DP indic o similaritate n manifestarea fiziologic a sistemului

ASC-Rf de la porumb de tip T cu cel de la Oryza sativa (Boro II) la care proteina citoplasmatic
cu efect citotoxic este destabilizat postranscripional.
Spre deosebire de sistemul ASC-Rf la porumbul cu citoplasma Texas cel cu citoplasma de
tip S se aseamn mult cu floarea-soarelui PET1 att la nivel structural, ct i funcional:
localizare transmembranar, perturbarea integritii mitocondriale asociat cu expulzarea
citocromului C i a altor semnale apoptotice,
destabilizarea transcripilor ASC i efecte
pleiotropice asupra genelor specifice microsporogenezei. Comparativ cu plantele de porumb, la

care lipsesc informaii privind modul de degradare a transcriptului ASC, n cazul florii-soarelui sa constatat, c micorarea coninutului stoichiometric al cotranscriptului atpA-orfH522 se
datoreaz poliadenilrii, marcndu-l astfel ca substrat - inta pentru ARN-aza2. Aceste procese
molecular-biochimice se realizeaz prin formarea unui complex degradosom din polinucleotidfosforilaza i ARN-aza.
Secvena de aminoacizi complet a proteinelor cu funcie de polinucleotid-fosforilaz este
cunoscut doar la cteva plante (Arabidopsis thaliana -AK117900, Pisum sativum AAC50039.1 i Oriza sativa - BAF20896.1). ntruct aceast enzim reprezint unul din
componentele cheie al irului de evenimente fiziologice de restaurare a fertilitii am decis de a o
analiza in silico.
4.5. Elaborarea modelului ipotetic al enzimei polinucleotid-fosforilaza
Studiul polinucleotid-fosforilazei la plantele model i al EST-urilor (Expressed Sequence
Tags) de la floarea-soarelui a relevat patru secvene cu asemnare maximal:
>gi|DY912504.1|
GAGTCCCTCACTCCTACTCCACCACCATCGTATTCCTCCCGCCACCACAGAGGGTCCCTTAATCTCATTTAGCCAAATGCATTGCA
ACCACCAGCTTCCATGGAGGACCGTACACTCACTTCACACATCCAACAGCCACCAGACACCACAAACCCTACTTCCGCCTTACAA
AACCTCATTCCACACCTTCTATTTGCACTTTTCTTTCACCGAGAAGATTAACCACAAATCGCTTCACAATTAGGGCTCTAAATCGTG
ATGACGTCACTGGTTCTGAGAAAGAAGCTAAGCCGTTTTTTCCTAACCTCCATACGGTTAAGATTCCAGTCGGAGATAGATTTATA
ACTGTTGAAACTGGTCAAATAGGAAGACAAGCTAGTGGATCTGTTGTTGTAAGAGATGGAGAGACTATTGTCTACACGACAGTTT
GTATGTCTGATGTTCCAAGCGAACCTTCTGACTTTTTTTCCAATGTCTGTACATTATCAAGAGCGTTTTTCAGCAGCTGGTAGAACT
AGTGGAGGATTTTTTAAGCGGGAGGGAAGGACGAAGGACCATGAGGTACTTATTTGTAGACTAATTGATAGGCCATTGCGACCAA
CCATGCTCAAGGGATTCTACCATGAAACTCAAATACTGTCTTGGGTTTTGAGTTATGATGGTTTGCACTCCCCAGATTCTCTGGCT
GTTACAGCTGCTGGAATTGCAGTAGCTCTTTCCGAAGTGCCAAATACAAACACTGTAGCAGGAGTTAGAATTGGTTTAATTGGTG
ATAAGTTTGTTGTGAACCCAACAACCATGGAAATGGGAGATTCAAAACTGGATTTGTTTGTAGCAGGCTCAGAAACCGGGATATT
AATG
>gi|GE494064.1|
TGGTGATAGTTTGTTGTGAACCAACAACCATGGAAATGGAAGATTCAAAACTGGATTTGTTGTTAGCAGGCTCAGAAACCGGGAT
ATTAATGATAGAGGGGTACTGTGACTTTCTTCCTGAAGAGAAGTTGCTTGAAGCGATAGAAGTTGGCCAGGATGCTGTAAGAGCC
ATATGCAAAGAGGTGGACAATTTGGTAAAAATTTGCGGGAAACCGAAAATGCTTGATTCGATCAAGTTACCGCCACCTGAGCTGT
ATAAGCATGTAGAAGAAATTGCTGGTGATGTGTTAGTTGATGTTCTACAAATAAAAAACAAAGTACCAAGAAGAAAAGCACTCTC
TTTATTAGAGGAAAAAGTTCTAAGTATACTTACCGAGGAGGGTTACGTCAGCAAAAGTGAAAGTTGTGTCGGTGCTGAAATAACT
CCAGACATGTTGGAGGATGAAGATGAAGAGGAAGAAGTTGTTGTTGATGGTGAATATGATGAAGGCGATGTCCAAATAAAGCCG
GTATTTAAAAAACCGACTCCCACGTTTTACTCAGAGGTAGATGTGAAATTGGTGTTCAAAAGTGTTAGTTCCAAATACCTGCGAA
ACCGAATAGTGAAGGGAGGGAAAAGAAGTGATGGTAGAACTTCAGAGGAGATACGCGTTATTGATGCAGAATGTGGGCTACTTC
CTAGAGTACACGGGAGTGCCCTTTTCACGCGTGGGGAAACACAGGCGTTGGCAGTGGTTACCTTGGTGATAAACAATGGCA
73
>gi|EL415574.1|
TTTTCCGTAACCGTGCGAATTAATTCCGAAGTCATGGGTCTCTGATGGTTCAACATCAATGGCAACTGTATGTGGAGGGAGCATGG
CTTTAATGGATGCTGGCATCCCTTTGAAAGATCACGTTGCTGGTCTGTCAGTCGGCCTCGTTACTGAAGTTGACCCATCAACCGGC
AATGTTGACCAGTACCGTATATTAACCGACATTTTGGGTCTAGAAGATCATCTAGGGGACATGGATTTCAAAATAGCCGGAACAC
GAAACGGGATTACTGCAATTCAGTTAGATATAAAACCTGCTGGAATTCCTCTCGACATTATTTGCGAGTCACTAGAACCCGCGTAT
AAAGGTCGACTTCAAATACTTGAACGTATGGAGCAAGAAATAAATTCAGCTCGCACTCAGGATGGAAGAAATTCTCCTCGGTTAG
TTACCTTAAAATATAGCAACGATGATTTACGTCGACTGATTGGACCACTTGGTGCCTTGAAGACTAAAATCGAAGAAGAGACAGG
TGCTCGTATGTCCGTGAGTGACGGAACACTAACTATAGTTGCTAAGAATCAATCGGTAATGGAGAAAGTGCAAGAAAGGGTTGAT
TTAATAATTGGGCGAGCAATTGAAGTAGGAGGTGTTTACAAAGGCATTGTAACATCAATAAAAGAATATGGGGCTTTCGTGGAGT
TTAACGGTGGCCAACACGGCCTCTTACATGTTTCTGAATTGTCACATGAACCGGTGTCCAGAACTTCAGACCTGATTTCAGTTGGT
CAACAGTTATCGTTTATGTGTATCGGGCAAGATCTTCGCGGTAACAAAA
>gi|EL443928.1|
CTTGGCCGGGGGATGTAAGTATGGCATCAGTTTGCGGGGGATGCCTTGCGTTACAAGACGCTGGAGTACCACTAAAGAGCTCTAT
TGCGGGTATAGCAATGGGCATGGTTCTTGACACAAAGGAATTTGGGGGAGACGGGACCCCACTTATTTTATCTGACATCACTGGT
TCTGAGGATGCTTCTGGAGATATGGACTTTAAGGTTGCTGGGAATGATGATGGGGTAACGGCATTCCAGATGGATATAAAGGTAG
CAGGAATTACATTGTCAACAATGAAGCATGCTTTATTGCAAGCAAAGGAAGGGCGAAAACGTATTCTTGCTGAGATGTTAAAATG
CTCACCTCCTCCATCAAAGCAGCTTTCTAAGTACGCTCCACTTATTCTTGTTATGAGGGTTAAACCTGATAAAGTTAACAAAATTA
TTGGTTCTGGGGGTAAAAAGGTCAAGAGCATTGTTGAAGAGACTGGTGTGGAATCTATTGAAACTCAAGATAATGGAACGGTCAA
AATAACATCAAGAGATTTGGCAAGCTTAGAAAAGACTAAAGCGATTATTAGTAACTTGACAATGGTTCCAATTGTTGGTGATATA
TACAGGAATTGTAAAATTACATCTATTGTTCCGTATGGAGTTTTTGTTGAGATAGTTCCAGGCCGAGAGGGGCTCTGTCACATCAG
TGAGTTGAGTCCAGATCGGTTGTCAAAACCAGAAGATGCTTTCAAGGTTGGAGACCTTGTTGATGTTAAACTAATTGAGATCAAT
GAGAAAGGACAACTTCGATTAAGCCGAANAGCACTGCTTCCAGATCAGGGTACTGATA
i n baza acestor EST-uri, utiliznd programa CAP3 i un translator (ADN-ARN-protein)

s-a modelat 80% din enzima polinucleotid-fosforilaza de la floarea-soarelui (Figura 4.18).
>Contig1
ESLTPTPPPSYSSRHHRGSLNLIPNALQPPASMEDRTLTSHIQQPPDTTNPTSALQNLIPHLLFALFFHRED
PQIASQLGLIVMTSLVLRKKLSRFFLTSIRLRFQSEIDLLLKLVKEDKLVDLLLEMERLLSTRQFVCLMFQ
ANLLTFFPMSVHYQERFSAAGRTSGGFFKREGRTKDHEVLICRLIDRPLRPTMLKGFYHETQILSWVLSY
DGLHSPDSLAVTAAGIAVALSEVPNTNTVAGVRIGLIGDKFVVNPTTMEMEDSKLDLLVAGSETGILMI
EGYCDFLPEEKLLEAIEVGQDAVRAICKEVDNLVKICGKPKMLDSIKLPPPELYKHVEEIAGDVLVDVL
QIKNKVPRRKALSLLEEKVLSILTEEGYVSKSESCVGAEITPDMLEDEDEEEEVVVDGEYDEGDVQIKPV
FKKPTPTFYSEVDVKLVFKSVSSKYLRNRIVKGGKRSDGRTSEEIRVIDAECGLLPRVHGSALFTRGETQ
ALAVVTLVINNG
Fig. 4.18. Enzima polinucleotid fosforilaza de la floarea-soarelui.

Modelat cu ajutorul programei CAP 3 [40] n baza EST-urilor (DY912504.1; GE494064.1; EL415574.1 i
EL443928.1).
Proteina nou format (n baza analizei BLAST) indic o similaritudine cu alte

polinucleotid-fosfataze: 78% - Ricinus communis, 77% - Spinacia oleracea, 75% - Pisum
sativum i 72% - Arabidopsis thaliana, fapt care confirm veridicitatea rezultatelor obinute.
Prin utilizarea programelor Protein Workbench 5.0.1. i Swiss Pdb Viewer ver. 4.0.1. s-a
constatat, c masele moleculare ale proteinelor restauratoare de fertilitate au valori superioare
comparativ cu cele ale proteinelor ASC, sugernd un nivel structural i funcional mult mai
complex. Aceast afirmaie este justificat i de valorile diferite ale parametrilor biochimici ai
proteinelor analizate: punctul izoelectric, potenialul electrostatic, caracterul hidrofob, frecvena
aminoacizilor, structura spaial. Cele mai semnificative diferene caracteristice grupului
74
investigat au fost constatate la nivelul structurii spaiale i punctului izoelectric (PI), care a
indicat valori medii de 8,36, predominarea structurilor i a aminoacidului leucina pentru
proteinele asociate cu ASC spre deosebire de cele implicate n restaurarea fertilitii caracterizate
prin -helixuri, coninut nalt n alanina i 6,87 PI. Analiza spaial a celor dou grupuri de
proteine investigate remarc o localizare citoplasmatic pentru produii de expresie a genelor Rf
i membranar pentru majoritatea proteinelor asociate cu ASC.
Reieind din datele bioinformatice putem considera, c androsterilitatea citoplasmatic este
determinat de sinteza unor proteine mitocondriale n majoritatea cazurilor cu un motiv
transmembranar i domene implicate n transportul transmembranar al substanelor, ceea ce
duce la destabilizarea integritii membranei mitocondriale, afectndu-i funcia. n alte cazuri,
androsterilitatea citoplasmatic ar putea fi rezultatul proteinelor cu DP de tip Retroviral aspartil
proteaza care degradeaz unele componente proteice de baz ale metabolismului energetic sau
al celor citoplasmatice cu rol citotoxic. Iar localizarea citoplasmatic a produilor de expresie a
genelor nucleare Rf cu motive implicate n recunoaterea ARN-ului genelor ASC denot faptul, c
efectul de restaurare a fertilitii polenului este realizat prin modificri postranscripionale
specifice a precursorului ASC n funcie de sistemul nucleu - citoplasm. La alte plante (orez,
porumb, tutun etc.), genele restauratoare de fertilitate pot avea i rol adiional prin prezena unor
domene proteice de tip ALDH Aldehyde Dehydrogenase, care regleaz coninutul celular al
aldehidei acetice, astfel exercitnd un efect compensator al funciei mitocondriale alterate.
75
5. IDENTIFICAREA PREZENEI GENELOR Rf LA DIVERSE GENOTIPURI DE

FLOAREA-SOARELUI
Dezvoltarea tehnicilor de analiza molecular cu un nivel nalt de rezoluie faciliteaz
elaborarea unor markeri moleculari de perspectiv n analizele de rutin, menite s identifice
eficient amprenta genetic a plantelor de cultur, oferind siguran i calitate n realizarea
procedurilor de certificare a soiurilor i liniilor noi, precum i selecia n mas a caracterelor
importante economic, n stadiile de ameliorare timpurii (MAS - Marker Assisted Selection).
5.1. Polimorfismul molecular la genotipurile ASC, Rf i F1 n baza analizei RAPD
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) reprezint o tehnic de screening primar al
materialului iniial [242] n elaborarea markerilor moleculari, care pot fi utilizai n selecia
anumitor caractere de interes. Astfel, analiza profilelor generate de trei primeri decameri
(OPG10, OPI16 i OPH15) n scopul identificrii unor poteniali markeri RAPD asociai cu
caracterul Rf i pronosticrii celor mai favorabile combinaii hibride dintre diverse linii cultivate
n Republica Moldova, a pus n eviden o heterogenitate molecular (15-27 per primer)
specific de genotip.
5.1.1. Diversitatea genetic evalut n baza primerilor RAPD-OPG 10
Prima pereche de primeri a prezentat un numr maximal de 27 benzi, cu o lungime
cuprins ntre 150 pb i 1900 pb. Dintre acestea apte ampliconi cu dimensiunea de 250, 300,
490, 590, 730, 880 i 900 pb sunt specifice tuturor grupelor de cercetare (ASC, Rf i F1), iar 20
sunt polimorfe.
n cadrul liniilor restauratoare de fertilitate, media ampliconilor constituie 14 uniti urmat
de genotipurile hibride cu valoari de 13 i 12 la cele materne. Un numr considerabil sczut de
ampliconi atestat la genotipurile hibride ar putea fi explicat prin faptul c, majoritatea regiunilor
amplificate de acest primer prezint un caracter de tip codominant [49]. Dintre toate benzile
analizate, doar patru (490 pb, 590 pb, 880 pb i 900 pb) au fost caracterizate printr-o intensitate
ridicat a fluorescenei, sugernd cantiti considerabile ale produsului de amplificare (Figura
5.1). Ampliconul de 380 pb manifest o prezen total la probele liniilor materne i o
selectivitate genotipic la formele paterne i hibride deoarece, acesta nu a fost observat la Xenia
F1, Valentino F1, Xenia Rf i LC Cium Rf.
O particularitate deosebit pe parcursul analizelor a fost determinat de apariia a dou
benzi specifice doar la probele liniilor Rf (Tabelul 5.1.).
76
Pb
2000
1000
900
800
700
600
500
400
350
300
250
200
3
Rf
680
pb
8 9
CMS
10
11
12 13
14
15
16
F1
17
18
19
M
700
..pb
510
pb
600
..pb
13
11 12
9 10
14 15
16 17
18 19
500
..pb
Fig. 5.1. Produii de amplificare cu primerii RAPD-OPG 10 n gel de agaroz de 1,5% i

analiza densitometric a benzilor de 510 pb i 680 pb.
M-marker; Rf: 1-Xenia; 2-Drofa; 3-Valentino; 4-LC Raus; 5-LC 4; 6-LC Cium; ASC: 7-Xenia; 8-Drofa; 9Valentino; 10-LC 40; 11-SW 38; 12-VIR 101 PET 1; 13- VIR 116 PET 1; F1: 14- Xenia; 15- Drofa; 16Valentino; 17-LC Raus Rf x LC 40 CMS; 18-Drofa ASC x LC 43 Rf; 19-Drofa ASC x VIR 681 Rf.
Astfel, spectrul de 510 i 680 pb manifest o prezen constant la toate probele formelor
restauratoare luate n studiu. Analiza densitometric a acestor benzi (mai ales n cazul spectrului
de 680) relev o intensitate a fluorescenei mai mare la LC Cium Rf, Xenia Rf, Valentino Rf
urmat de LC 4 Rf, Drofa Rf i LC Raus Rf.
Totodat, n cazul primelor trei genotipuri a fost remarcat un grad mai nalt de
autofertilitate (LC Cium Rf 64 %; Xenia Rf 28,15 % i Valentino Rf 26,3 %), restaurare a
androfertilitii i abundent a polenului comparativ cu ultimele trei clase de indivizi (LC 4 Rf,
Drofa Rf i LC Raus Rf).
De asemenea, se poate de evideniat i faptul c, n cazul combinaiei hibride Xenia (vezi
5.3) a fost evideniat prezena a dou gene Rf implicate n restaurarea androfertilitii polenului.
Astfel, se poate de presupus c, dac ampliconul de 680 pb amplific un fragment al genei Rf,
atunci ar fi logic i o intensitate a acestei benzi la liniile paterne de Xenia.
77
250
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
150
300
+
+
+
+
+
+
350
490
+
+
+
+
+
+
380
510
+
+
+
+
+
+
400
590
+
+
+
+
+
+
440
680
+
+
450
700
730
750
800
880
900
950
1050
1400
+
+
+
1200
1550
1600
1700
1800
1900
RAPDOPG10
Nr. Benzi
Tabel 5.1. Rezultatele amplificrii cu primerii RAPD-OPG10 la genotipurile Rf, ASC i F1

Benzi atestate
Primer
Linii restauratoare
Xenia
Drofa
Valentino
Raus Rf
4 Rf
Cium Rf
12
Xenia
Drofa
Valentino
40ASC
SW38
VIR 101
VIR 116
13
14
19
16
14
+
+
+
+
+
+
+
12
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Lini androsterile
+
+
+
+
+
+
13
13
13
11
12
12
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Genotipuri hibride
Xenia
Drofa
Valentino
Raus Rf x
LC 40 ASC
Drofa ASCx
LC 43 Rf
Drofa ASC
x VIR 681Rf
13
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
11
13
15
13
12
+
+
5.1.2. Diversitatea genetic evalut n baza primerilor RAPD-OPI 16

Analiza produselor RAPD cu primerii OPI 16 a pus n eviden o serie de profiluri
electroforetice att n ceea ce privete dimensiunea ampliconilor, ct i dup intensitatea
fluorescentei. Un exemplu al acestor profiluri cu o mobilitate electroforetic cuprins ntre 320 i
2000 pb (i ntrun numr total de 19 benzi) este reprezentat n (Figura 5.2.).
Examinarea diversitii genetice n baza acestui primer, relev faptul c, media
fragmentelor amlificate n cazul probelor liniilor paterne o constituie 11 uniti, la cele hibride
8 i n cadrul genotipurilor materne aceast valoare nu va depi pragul de 7 uniti. Nici o
diferen semnificativ nu a fost identificat n cadrul benzilor de 350 pb, 500 pb, 790 pb i 880
pb. Rezultate similare au fost observate i n cazul benzii de 1600 pb cu unele excepii (Drofa F1
i Valentino F1). Banda de 590 pb este caracteristic doar probelor genotipurilor parentale, iar
cea de 600 pb a fost evideniat doar la cele hibride.
78
Pb
2000
1000
900
800
700
600
500
400
350
300
250
3
Rf
8 9
CMS
10
11
12
13
F1
14
15
16
17
18
450
pb
550
pb
500
pb
450
pb
M
19
10
11
14
12 13
15
16
17
18
19
Fig. 5.2. Produii de amplificare cu primerii RAPD-OPI 16 n gel de agaroz de 1,5% i

analiza densitometric a benzilor de 450 pb i 550 pb.
M-marker; Rf: 1-Xenia; 2-Drofa; 3-Valentino; 4-LC Raus; 5-LC 4; 6-LC Cium; ASC: 7-Xenia; 8-Drofa; 9Valentino; 10-LC 40; 11-SW 38; 12-VIR 101 PET 1; 13- VIR 116 PET 1; F1: 14- Xenia; 15- Drofa; 16Valentino; 17-LC Raus Rf x LC 40 CMS; 18-Drofa ASC x LC 43 Rf; 19-Drofa ASC x VIR 681 Rf.
Primerii dai prezint un grad polimorf de cca. 70% (Tabelul 5.2).
Drofa ASCx LC 43 Rf
Drofa ASC x VIR 681Rf
79
450
350
320
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
600
1000
1100
1250
1450
1500
1600
1800
1700
+
500
12
5
7
8
7
9
550
Xenia
Drofa
Valentino
Raus Rf x LC 40ASC
590
7
5
7
8
9
6
7
790
Xenia
Drofa
Valentino
40ASC
SW38
VIR 101
VIR 116
880
13
11
10
11
10
10
Linii restauratoare
+ + +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ +
Lini androsterile
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ +
Genotipuri hibride
+ +
+
+
+
+
+
+ + +
+ +
+ + +
950
Xenia
Drofa
Valentino
Raus Rf
4 Rf
Cium Rf
Benzi atestate
2000
Primer RAPD-OPI 16
Nr. Benzi
Tabel 5.2. Rezultatele amplificrii cu primerii RAPD-OPI 16 la genotipurile Rf, ASC i F1
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Ca i n cazul primei perechi de primeri utilizai, RAPD-OPI 16 manifest o specificitate

genotipic. Astfel, benzile de 450 pb i 550 pb au fost evideniate doar la probele formelor
restauratoare de fertilitate. Investigarea densitometric a acestotra relev o intensitate a
fluorescenei mai ridicat la Xenia Rf, Valentino Rf i Drofa Rf urmat de LC 4 Rf, LC Raus Rf i
LC Cium Rf.
5.1.3. Diversitatea genetic evalut n baza primerilor RAPD-OPH 15
Analiza produselor amplificrii a ADN-ului genomic cu primerii RAPD-OPH 15 la cele
trei grupe de cercetere luate n studiu, a pus n eviden un numr total de 15 ampliconi.
Majoritatea benzilor au o lungime mic (ntre 125 i 1300 pb) i doar n cazul a patru benzi,
conform mobilitii electroforetice, au fost evideniate valori medii ale maselor moleculare
(1700, 1800, 1900 i 2000 pb). n acelai timp, comparativ cu primii doi primeri luai n studiu
primerii RAPD-OPH 15 au fost caracterizai print-un grad sczut al polimorfismului genetic.
ns, pentru aceast pereche au fost evideniate o serie de ampliconi specifici (Tabelul 5.3 i
Figura 5.3.) n ceea ce privete masele lor moleculare (nemaintlnite la primele dou perechi de
primeri). Valoarea medie a benzilor identificate pe fiecare genotip n parte a variat n limite
relativ constante (10,6/10,8 benzi).
Pb
2000
1000
800
700
500
400
300
200
150
Rf
ASC
10
11
12
13
14
15
F1
16
17
18
19
Fig. 5.3. Produii de amplificare cu primerii RAPD-OPH 15 n gel de agaroz de 1,5% .

M-marker; Rf: 1-Xenia; 2-Drofa; 3-Valentino; 4-LC Raus; 5-LC 4; 6-LC Cium; ASC: 7-Xenia; 8-Drofa;
9-Valentino; 10-LC 40; 11-SW 38; 12-VIR 101 PET 1; 13- VIR 116 PET 1; F1: 14- Xenia; 15- Drofa; 16Valentino; 17-LC Raus Rf x LC 40 CMS; 18-Drofa ASC x LC 43 Rf; 19-Drofa ASC x VIR 681 Rf.
Pentru grupul genotipurilor restauratoare de fertilitate, la liniile Raus Rf i 4 Rf au fost

evideniate benzi specifice de 900 pb i 2000 pb. De asemenea, analiza ampliconilor de 125, 350,
410, 425, 590, 880, 1000, 1200 i 1300 pb a manifestat o prezen total la formele materne,
paterne i la genotipurile hibride. Ampliconii de 1800 i 1900 pb au fost mai des ntlnii la
formele materne i cele hibride luate n studiu (Tabelul 3.3).
80
590
425
410
350
125
500
880
900
1000
1200
1300
1700
1800
1900
Benzi atestate
2000
Primer RAPD-OPH 15
Nr. Benzi
Tabel 5.3. Rezultatele amplificrii cu primerii RAPD-OPH 15 la genotipurile Rf, ASC i F1
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Genotipuri hibride
+
+
+ +
+ + +
+ + +
+
+
+ +
+
+
+ +
+
+
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Linii restauratoare
Xenia
Drofa
Valentino
Raus Rf
4 Rf
Cium Rf
11
9
10
12
12
9
Xenia
Drofa
Valentino
40ASC
SW38
VIR 101
VIR 116
11
11
12
11
11
11
9
Xenia
Drofa
Valentino
11
10
10
11
11
11
Raus Rf x LC 40ASC
Drofa ASCx LC 43 Rf
Drofa ASC x VIR 681Rf
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Lini androsterile
+ + + +
+
+
+ +
+
+
+ +
+
+
+ +
+
+
+ +
+
+
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Utilizarea formelor parentale genetic apropiate are ca efect diminuarea germoplasmei cu

repercusiuni agroeconomice. Din aceste considerente, selectarea eficient a liniilor parentale n
ameliorarea la heterozis pe baza estimrii distanei genetice, reprezint un avantaj incontestabil.
Astfel, conform dendrogramelor obinute, combinaiile ASC/Rf dintre: Valentino/Cium;
VIR116/Cium; LC40/Xenia; LC40/LCRaus ar permite obinerea unor hibrizi de perspectiv,
(Figura 5.4.).
Xenia Rf
Drofa Rf
Valentino Rf
LC Raus Rf
LC 4 Rf
LC Cium Rf
Xenia ASC
LC 40 ASC
LC SW 38 ASC
VIR 101 ASC
Valentino ASC
VIR 116 ASC
Drofa ASC
Xenia F1
Valentino F1
Drofa ASC
LC 43 Rf
Drofa ASC
VIR 681Rf
Drofa F1
LC 40 ASC
LC Raus Rf
Fig. 5.4. Dendrograma liniilor parentale i a hibrizilor n baza profilurilor RAPD.

construit dup formula lui Nei i Li citat de [188] cu ajutorul programei STATISTICA 7.
81
Aceste concluzii sunt n acord cu datele fenotipice care demonstreaz o superioritate n

valorile indicilor asociai cu productivitatea la hibrizii experimentali n raport cu media formelor
parentale i n comparaie cu hibrizii omologai (Figura 5.5.).
100
80
Diametrul inflorescenei
60
Masa la 1000 de semine
40
20
Raus Rf
LC 40 CMS x
Xenia Rf
LC 40 CMS x
Valentino F1
Drofa F1
-2 0
Xenia F1
Fig. 5.5. Valoarea indicilor asociai cu productivitatea la hibrizii comerciali i

experimentali fa de media formelor parentale, %.
Diversitatea genetic constatat att ntre liniile Rf i ASC (OPG10510, OPG10680, OPI16450
i OPI16550), ct i la nivel de genotip prin ampliconi specifici (OPG101550, OPG101900, OPI161800
i OPI161000) ntr-un numr mai mare la liniile paterne Drofa, Valentino, LC Raus, LC4 i
materne LC SW38, VIR101; VIR 116 poate servi ca baz n identificarea preliminar a unor
regiuni specifice asociate cu caracterul de interes, care ulterior pot fi convertite n markeri de
screening. Tendina continu de identificare a markerilor lincai cu genele Rf obiectiv al
diferitor programe de ameliorare a culturii florii-soarelui la etapa actual, este determinat de
lipsa informaiei privind secvena acestor gene. Au fost elaborai diferii markeri moleculari
(RAPD, RFLP, AFLP, CAPS, SSR) n regiuni mai mult sau mai puin apropiate de locusul
restaurator de fertilitate, dintre care, unii pot fi utilizai cu succes n distingerea formelor Rf.
5.2. Screening-ul prezenei genelor Rf
Un grad nalt de heterozigoie n baza formelor citoplasmic androsterile este asigurat prin
utilizarea liniilor paterne cu gene Rf n stare dominant, care se obin n rezultatul inbreedingului repetat, urmat de analiz i selecie dup fenotip. Aceste etape pot fi micorate considerabil
n timp, prin screening-ul molecular al plantelor cu primeri asociai locusului Rf, care permit
discriminarea strii alelice homo- heterozigot, dominant/recesiv cu mult nainte de perioada
reproductiv. Un astfel de primer este CAPS H13 elaborat n baza oligomerului OPH13_337 i
cartat la o distan de 7,7 cM de Rf1 [122]. Astfel, profilul CAPS al celor patrusprezece linii
paterne analizate, prin ampliconul de 308 pb i dou produse de digestie cu HinfI (101 i 207pb)
82
indic asupra prezenei n genom a alelelor n stare homozigot dominant - Rf1Rf1. Acela
amplicon de 308 pb se obine i n cazul a nou linii materne, ns prezena unui site adiional de
digestie rezult n trei fragmente (42, 101 i 165 pb), relevnd starea homozigot recesiv rf1rf1,(Figura 5.6.).
0,5-
0,3-
9 A 0,3-
0,2-
Xenia
Drofa
Rf1 rf1
Rf1Rf1
Rf1Rf1
rf1 rf1
rf1 rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
Rf1Rf1
Rf1Rf1
rf1 rf1
rf1 rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
0,5-
Rf1Rf1
Rf1Rf1
rf1rf1
rf1rf1
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 M,
Kb
0,50,3-
Valentino
Fig. 5.6. Ampliconul de 308 pb generat de primerii CAPS H13 (A) i produii de digestie
enzimatic (HinfI) la hibrizi i liniile parentale (B).
M-Marker, ASC: 1- LC40; 2- LC42, 3- LC SW38; 4- LC 391A; 5- VIR 101A; 6- VIR 116A; 7- Xenia; 8- Drofa
i 9- Valentino; linii Rf: 10- Xenia; 11- Drofa; 12- Valentino; 13- LC 4; 14- LC Cium; 15- LC Raus; 16- RW
637; 17- LC 7; 18- LC Od1295; 19- LC 43; 20-LC 41; 21-LC 39; 22- VIR558; 23- VIR 681; F1: 24- Xenia;
25- Drofa; 26- Valentino; 27- Sumbred 254; 28- LC 40 ASCxLC Raus Rf; 29- Drofa ASCxLC Raus Rf; 30Xenia ASCxLC 637Rf; 31- Drofa ASCxLC 637 Rf; 32- Drofa ASCxLC 7 Rf; 33- Drofa ASCxLC od1295 Rf;
34- Xenia ASCxLC 43 Rf; 35- Drofa ASCxLC 43 Rf; 36- LC SW 38 ASCxLC 39 Rf; 37- Drofa ASCxLC 39 Rf;
38- LC 40 ASCxXenia Rf i 39- Drofa ASCxDrofa Rf.
Aceste date corespund cu analiza fenotipic a formelor parentale, la care s-a constatat doar
3% plante fertile n cazul liniilor ASC i un numr foarte mic de plante sterile (impuriti
mecanice) n cazul unor linii Rf, ceea ce denot un grad nalt de puritate genetic a liniilor
studiate. Mai mult ca att, starea homozigot dominant a genelor Rf la liniile paterne este
confirmat i de lipsa unei segregri fenotipice: 1119 plante fertile (F) : 14 plante sterile (S) n
cazul hibrizilor F1 [166], iar cele patru produse de digestie molecular a demonstrat prezena
ambelor alele dominant i recesiv n stare heterozigot Rf1rf1.
5.3. Motenirea genelor Rf
Analiza numrului i tipului de interaciune a genelor Rf n ASC PET1, prin utilizarea
fenotipurilor I1-I3, F1, F2 i BC1 a relevat cele mai simple mecanisme de restaurare a
androfertilitii la diferite combinaii hibride, de ex. Valentino, Drofa, Sumbred 254 etc. Astfel,
segregarea fenotipurilor fertile:sterile n generaia F2 att al descendenilor unei singure plante
(Tabelul 5.1.) ct i cel total remarcat prin valorile 315 F : S 99 la Valentino i 180 F : S 64 la
Drofa indic un raport teoretic de 3:1 [52], demonstrnd implicarea unei singure gene Rf n
restaurarea fertilitii polenului. Aceast constatare rezult i din ncrucirile analizatoare
repetate ale hibrizilor de prima generaie cu formele sterile care au prezentat un raport teoretic
de 1:1.
83
Studiul combinaiei hibride Xenia a manifestat o ereditate mai complex a caracterului

cercetat. Raportul de segregare fenotipic de 15 F : S 1 indic prezena a dou gene Rf nealele
dominante la liniile paterne, concluzie susinut i de raportul de 3:1 al plantelor fertile i sterile
din generaia BC1 (Tabelul 5.4.).
Tabelul 5.4. Segregarea fenotipic dup caracterul restaurrii androferilitii n diferite populaii
Generaia
Numrul
de plante
- (P)
I3(P)
F1
F2
BC1
212
100
292
150
125
- (P)
I1(P)
F1
F2
BC1
215
110
288
130
132
- (P)
I1(P)
F1
F2
BC1
185
96
258
150
144
Segregare
Raportul
teoretic
F:S
Combinaia hibrid Valentino
200 : 12
100 : 0
290 : 2
3:1
115 : 35
1:1
65 : 60
Combinaia hibrid Drofa
215 : 0
110 : 0
282 : 6
3:1
96 : 34
1:1
64 : 68
Combinaia hibrid Xenia
185 : 0
96 : 0
254 : 4
15:1
75 : 7
3:1
112 : 32
Valoarea
2
0,22
0,20
0,09
0,12
0,73
0,59
2 0,05 = 3,84
Profilul molecular al combinaiilor hibride Drofa i Valentino generat de markerul

codominant CAPSH13 este n acord cu datele din cmp, prezentnd un raport de segregare
mendelian de 1Rf1Rf1 : 2Rf1rf1 : 1rf1rf1 n F2 i de 1Rf1rf1: 1rf1rf1 n BC1 (Figura 5.7.).
Drofa F2
0,2-
rf1rf1
Rf1 rf1
Rf1Rf1
Rf1rf1
rf1rf1
rf1rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
rf1rf1
rf1rf1
Rf1 rf1
Rf1Rf1
Rf1 rf1
Rf1rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
rf1rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
rf1rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
rf1rf1
Rf1 rf1
rf1rf1
Rf1 rf1
rf1rf1
rf1rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
rf1rf1
rf1rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
rf1rf1
rf1rf1
rf1rf1
Rf1 rf1
rf1rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
rf1rf1
rf1rf1
rf1rf1
Rf1 rf1
rf1rf1
Rf1 rf1
rf1rf1
rf1rf1
0,1-
0,1M
Valentino BC1
Rf1 rf1
rf1rf1
0,2-
Rf1Rf1
rf1rf1
Drofa BC1
Rf1 rf1
Rf1Rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
rf1rf1
Rf1Rf1
rf1rf1
Rf1Rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
rf1rf1
Rf1Rf1
Rf1 rf1
Rf1Rf1
Rf1 rf1
rf1rf1
Rf1 rf1
Rf1Rf1
0,1-
Rf1 rf1
Rf1 rf1
0,20,1-
0,2-
0,2-
Rf1Rf1
rf1rf1
Valentino F2
Rf1 rf1
rf1rf1
rf1rf1
Rf1Rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
rf1rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
rf1rf1
rf1rf1
Rf1Rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
Rf1Rf1
Rf1Rf1
Rf1 rf1
Rf1Rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
0,20,1-
0,1-
Fig. 5.7. Produii de digestie enzimatic (HinfI) la F2 i BC1.

n cazul formelor hibride Xenia, analiza CAPS a prezentat segregarea doar pentru gena Rf1.
Raportul genotipic de 7Rf1Rf1 : 16Rf1rf1 : 11rf1rf1 n F2 i de 9Rf1rf1 : 8 rf1rf1 n BC1 indic
84
rezultatul teoretic de 1:2:1 i respectiv 1:1 pentru o singur gen (Figura 5.8. i Tabelul 5.5.),
care reieind din datele fenotipice (dou clase de indivizi - cu productivitate normal a polenului
i complet sterili) acioneaz dominant dup tipul polimeriei necumulative.
Xenia F2
rf1rf1
Rf1Rf1
Rf1 rf1
rf1rf1
Rf1 rf1
Rf1Rf1
rf1rf1
rf1rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
Rf1Rf1
rf1rf1
Rf1 rf1
rf1rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
Rf1Rf1
Rf1 rf1
rf1rf1
rf1rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
Rf1Rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
rf1rf1
Rf1 rf1
Rf1Rf1
rf1rf1
Rf1Rf1
Rf1 rf1
0,1M,
Kb
0,20,1M,
Kb
Rf1 rf1
rf1rf1
Xenia F2
0,2-
Xenia BC1
0,2-
Rf1 rf1
Rf1 rf1
rf1rf1
rf1rf1
rf1rf1
rf1rf1
rf1rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
rf1rf1
rf1rf1
Rf1 rf1
Rf1 rf1
rf1rf1
Fig. 5.8. Produii de digestie enzimatic

(HinfI) la Xenia F2 i BC1.
Rf1 rf1
Rf1 rf1
0,1M,
Kb
Astfel, pentru restaurarea fertilitii polenului la hibrizii Xenia este suficient doar prezena
unei singure gene dominante n stare homo- sau heterozigot. Prin urmare, screening-ul
molecular efectuat ntr-o etap de dezvoltare mult mai timpurie (n cazul nostru faza de plantul)
dect cea de nflorire faciliteaz i asigur relevana studiilor de motenire a genelor de interes.
Tabelul 5.5. Analiza CAPS la combinaiile hibride de Drofa, Valentinoi Xenia cu markerul
CAPS H 13 lincat de gena Rf1
Genotipul i
diverse
generaii
Numrul
de indivizi
Genot. Comf. analizei CAPS

RfRf
Rfrf
rfrf
Raportul
theoretic
ateptat
valoarea
2
combinaia hibrid Drofa

F2
BC1
34
17
17
10
8
9
combinaia hibrid Valentino
F2
BC1
34
17
F2
BC1
34
17
Utilizarea
altor
18
7
9
8
combinaia hibrid Xenia
16
9
11
8
1:2:1
1:1
0,53 (2 DF)
0,06 (1 DF)
1:2:1
1:1
0,35 (2 DF)
0,06 (1 DF)
1:2:1
1:1
Not: DF- gradul de libertate; 2 0,05 = 5,99 (2 DF) i 2 0,05 = 3,84 (1 DF)
primeri,
precum
cei
lincai
cu
gena
1,06 (2 DF)
0,06 (1 DF)
Rf4
(F
5`-
AAGATCCCATCAAACCACCA-3` i R 5`-GGTCCACCTTGCGAAGATAA-5`) de la floareasoarelui [56] restaurator pentru ASC-GIG 2 i a celor lincai cu gena Rfm1 (F 5`ATCATCCAACTTAAAGAACC` R5`-ACTCGATCGCGCCACTGAA-5`) de la orz [159]
aparent nu a evideniat careva legiti.
Astfel, la genotipurile Valentino ASC, VIR 101 A ASC PET 1, LC 40 ASC, LC 42 ASC, LC
SW 38 ASC, Xenia ASC, Drofa ASC, LC 4 Rf, LC Cium Rf, LC Raus Rf i LC 40 ASC x LC
Raus Rf a fost atestat prezena unor benzi nespecifice n cazul markerilor lincai cu gena Rf4
85
restaurator pentru ASC-GIG2 i a celor lincai cu gena Rfm1 (de la orz) pentru genotipurile LC
40 ASC, LC SW 38 ASC, Valentino ASC i Valentino F1 (Figura 5.9.).
Fig. 5.9. Produii de amplificare cu primerii STS 10 B1

Gel A: Rf4 M-Marker; 1-Valentino ASC; 2-VIR 101 A ASC; 3-LC 40 ASC; 4-LC 42 ASC; 5-LC SW 38 ASC; 6Xenia ASC; 7-Drofa ASC; 8-LC 4 Rf; 9-LC Cium Rf; 10-LC Raus Rf; 11-LC 40 ASC x LC Raus Rf;
i Gel B: 1-LC 40 ASC; 2- Sumbred 254; 3- Xenia ASC; 4- Drofa ASC; 5-LC SW 38 ASC; 6-Valentino ASC;
7-LC 39 Rf i 8-Valentino F1.
5.4. Testarea prezenei la genotipurile de floarea-soarelui (PET-1) a markerilor

lincai cu genele Rf3 (porumb ASC-S)
n contextul informaiilor existente privind implicarea mai multor gene Rf n restaurarea
fertilitii la floarea - soarelui la care nc nu se cunoate secvena nucleotidic i a datelor
bioinformatice obinute n aceast lucrare ce au evideniat asemnri ntre sistemul ASC PET1Rf1 i ASC S Rf3 de la porumb, am fost motivai s testm prezena n genotipurile studiate a
unor regiuni marker asociat cu restaurare de fertilitate identice cu cele depistate la porumb.
Astfel, primerul dominant SCARE12M7 [254] lincai cu gena Rf3 de la porumb (la o distan de
1,8 centimorganide) au dat rezultate pozitive prin fragmentul de 170 pb specific la toate formele
restauratoare i hibride de floarea-soarelui luate n analiz (Figura 5.10).
0,3-
0,3-
0,1Kb
0,1Kb
Fig. 5.10. Produii de amplificare cu primerii E 12M7.

A: M- Marker; Linii Rf: 1- Xenia; 2- Drofa; 3- Valentino; 4- LC4; 5- Cium; 6- Raus; 7- RW 637; 8- LC7; 9- LC
Od 1295; 10- LC 43; 11- LC 41; 12- LC 39; 13- VIR 558; 14- VIR 681 i B: genotipuri F1. 1- Xenia; 2- Drofa;
3- Valentino; 4- Sumbred 254; 5- LC 40 ASCLC Raus Rf; 6- Drofa ASCLC Raus Rf; 7- Xenia ASC LC 637
Rf; 8- Drofa ASC LC 637 Rf; 9- Drofa ASC LC 7 Rf; 10- Drofa ASC LC Od1295 Rf; 11- Xenia ASC LC
43 Rf; 12- Drofa ASC LC 43 Rf; 13- LC SW 38 ASC LC 39 Rf; 14- Drofa ASC LC 39 Rf.
Aceste rezultate, de asemenea sugereaz o asemnare la nivelul genelor restauratoare de

fertilitate care formeaz sistemele ASC PET1- Rf1 i ASC S Rf3.
Astfel, n baza analizei RAPD formele paterne Drofa, Valentino, Raus; LC4 i materne
SW38, VIR101, VIR116 s-au evideniat printr-un nivel nalt al diversitii genetice - criteriu
86
important n formarea combinaiilor hibride de perspectiv. Au fost identificai ampliconi RAPD

(OPG 10510, OPG 10680, OPI 16450 i OPI 16550) specifici liniilor restauratoare, care ulterior pot
fi utilizai n elaborarea markerilor moleculari linchai cu caracterul restaurator de fertilitate.
Segregarea fenotipic (analiza hibridologic) i genetic (CAPS-HinfI) a relevat un
mecanism complex de restaurare a fertilitii polenului asigurat de prezena unei singure gene
dominante Rf (hibrizi F1 Drofa, Valentino, Sumbred 254 etc.) sau dou i mai multe gene cu
aciune polimer necumulativ (combinaia hibrid Xenia). De asemenea a fost identificat
prezena i starea alelic a genei Rf1 la 14 linii fertile (Rf1Rf1), 9 linii ASC (rf1rf1) i 16
genotipurile hibride (Rf1rf1). Posibilitatea unui screening molecular la o etap de dezvoltare mult
mai timpurie (n cazul nostru faza de plantul) dect cea de nflorire faciliteaz i asigur
relevana studiilor de motenire a genelor de interes.
Totodat a fost identificat markerul molecular lincat cu gena Rf3 de la porumb la
genotipurile restauratoare i hibride de floarea-soarelui. Efectuarea acestui ultim pas, a fost
dictat de similitudinile gsite n urma studiului bioinformaional dintre sistemul ASC-Rf de la
floarea-soarelui (ASC-PET1) i porumb (ASC-S).
87
6. ASPECTE PRIVIND EXPRESIA GENELOR ASOCIATE CU CARACTERUL

RESTAURATOR DE FERTILITATE LA FLOAREA-SOARELUI
Succesiunea evenimentelor n realizarea programelor morfogenetice poate fi elucidat prin
analiza profilurilor de expresie a genelor ce variaz specific n funcie de etapa dezvoltrii ca
rspuns la aciunea stimulilor interni i externi. Un nivel nalt al activitii celor mai multe gene
se observ n dou faze ale dezvoltrii reproductive: butonizare i nflorire.
6.1. Polimorfismul proteinelor sumare uor solubile din frunzele formelor parentale
i hibride
SDS - electroforeza proteinelor uor solubile izolate din frunzele genotipurilor investigate
la faza de butonizare i nflorire a relevat un profil proteic din cca. 35 de benzi cu un interval de
mase moleculare relative de 9 - 200 kDa. Dintre acestea 13 polipeptide (14,3; 16,4; 17,3; 22,2;
35,9; 36,6; 38,5; 42,5; 57,4; 76,7; 104,6; 148,4 i 200,3 kDa) sunt comune tuturor genotipurilor
analizate la ambele faze de cretere i dezvoltare, iar celelalte au prezentat polimorfism de
prezena/ absena i cantitativ n funcie de genotip, caracterul restaurator de fertilitate,
androsterilitate i etapa ontogenetic. Astfel, fraciile de 14,9; 68,0 i 181,3 kDa prezente la
toate liniile ASC n faza de butonizare, dispar la faza de nflorire, iar cele cu Mr 85,6 i 94,6 scad
n intensitatea colorantului (Figura 6.1).
Fig. 6.1. Spectrul proteinelor uor solubile din frunzele liniilor ASC la faza de butonizare (b) i
inflorire (f).
M-marker, kDa; 1-LC 40 ASC; 2-LC 42 ASC; 3-LC 38 ASC; 4-LC 391A ASC
88
Specificitatea genotipic la formele adrosterile a fost relevat prin componenii cu Mr

115,5 kDa (LC42, butonizare), 33,9 kDa (LC40 i LC391A, ambele faze) i 27,4 kDa (LC42
butonizare, LC40 ambele faze).
Compararea spectrelor liniilor ASC cu cele ale formelor Rf a evideniat aceleai zone
majore caracteristice fazei de dezvoltare. n acelai timp, s-au constatat i unele particulariti,
de exemplu polipeptidele cu Mr de 35,9; 63,4 i 109,9 kDa depistate la butonizare, scad din
intensitate la etapa de nflorire, iar cel de 87,5 kDa nu se identific, fapt care demonstreaz
asocierea acestora cu funcii specifice proceselor din faza de butonizare (Figura 6.2).
kDa:
200_
116_
97-
90,0
66_
55_
45_
38,5
36_
29_
24_
27,0
20_
17,3
14,2_
6,5_
M 1b 2b
3b 4b 5b
6b
7b
1f
2f
3f
4f
5f
6f
Fig. 6.2. Spectrul proteinelor uor solubile din frunzele liniilor Rf la faza de Butonizare (b) i
nflorire (f).
M- marker, kDa; 1-LC 4 Rf ; 2-LC Cium Rf ; 3-LC Raus Rf; 4-LC 637 Rf; 5-LC 7 Rf; 6-LC od 1295 Rf; 7-LC 41 Rf.
Liniile Rf se deosebesc ntre ele dup anumii componeni, aa ca cel cu Mr de 181,3 kDa
prezent la cinci forme paterne (LC4, LC Cium, LC7, LC Od 1295, LC41) din apte studiate, iar
cel de 115,6 kDa este identificat doar la patru genotipuri fertile LC4, LC Cium, LC Raus i
RW637.
Paternul electroforetic al combinaiilor hibride se deosebete de cel al liniilor parentale
printr-un coninut relativ mai nalt al majoritii benzilor, ns similar acestora au prezentat i
unele caracteristici ce au inclus fracia de 37,2 kDa pentru doi din cei trei hibrizi analizai (Xenia
i Drofa). De asemenea, dou polipeptide specifice fazei de butonizare: 44,7 i 181,3 kDa nu au
fost atestate la faza de nflorire, iar alte dou de 90,0 i 94,6 kDa se micoreaz semnificativ
(Figura 6.3.).
89
200_
116_
97_
kDa:
90,0
66_
55_
38,5
36_
29_
24_
27,0
20_
17,3
14,2_
6,5_
Fig. 6.3. Spectrul proteinelor uor solubile din frunzele familiilor la faza de inflorire.
M-marker, kDa; 1- Xenia Rf; 2- Xenia ASC; 3- Xenia F1; 4- Drofa ASC; 5- Drofa Rf; 6- Drofa F1; 7- Valentino
ASC; 8- Valentino Rf; 9- Valentino F1.
6.2. Studiul polimorfismului proteic la flori

Analiza proteinelor din esutul floral are o importan deosebit sub aspect genetic,
deoarece reprezint cel mai fidel mod de
evideniere a particularitilor
expresia
genelor
sistemului
legate de
ASC-Rf
proteice
colectate
din
90,0
66_
55_
45_
interaciunea componentelor acestui sistem.

Probele
kDa:
200_
116_
97-
38,5
36_
organele
29_
generative ale formelor Rf i hibride la trei
27,0
24_
faze ale dezvoltrii gametofitului mascul:

20_
profaza II; tetrade i spor tnr a prezentat
17,3
aspecte distinctive n special n funcie de

14,2_
fazele microsporogenezei.
6,5_
Astfel n pattern-ul obinut la faza de

spor
tnr
se
evideniaz
un
ir
Fig. 6.4. Spectrul proteinelor uor solubile

din florile tubulare de floarea-soarelui la trei
faze de dezvoltare.
de
componeni: 33,8; 96,0 i 115,6 kDa, care
M-marker kDa; LC 7 Rf: 1- Profaza II; 2-Tetrade; 3Spor tnr i Valentino F1: 4- Profaza II; 5-Tetrade;
6-Spor tnr.
lipsesc la profaza II i terade (Figura 6.4.).
Unele polipeptide variaz n intensitate, de exemplu, cel de 81,5 kDa are o intensitate mai
90
pronunat n stadiul de tetrade. Profilul de 48 benzi a fost aproape omogen la genotipurile

investigate, cu excepia unor fracii (14,6, 28,8, 33,8, 36,6, 39,0, 40,4, 115,6, 90,0, 96,0 kDa).
Este important de menionat, c linia LC7 Rf conine polipeptidul de 90,0 kDa n toate stadiile
dezvoltrii florale spre deosebire de genotipul heterozigot Valentino la care acesta se observ
doar n stadiul de spor tnr.
6.3. Analiza proteinelor sumare din polen
Polenul analizat a pus n eviden spectre de 38 - 40 fracii cu Mr variat de la 9,2 pn la
181,3 kDa i un nivel mediu de heterogenitate n funcie de genotipul homo- sau heterozigot
(Figura
6.5.).
Componentul
polipeptidic de 44,7 kDa este

identificat numai n polenul a trei
linii Rf: Xenia; LC4 i LC637 din
200_
116_
97_
66_
55_
45_
nou investigate, inclusiv formele
36_
hibride. O alt fracie de 85,6 kDa,
29_
de
24_
asemenea,
particularitate
indic
genotipic
o
prin
20_
prezena sa la toate formele Rf cu

excepia probelor de polen ale
plantelor LC4 Rf i LC 637 Rf. i
n
cadrul
hibrizilor
F1
sunt
diferene n proteom, de ex.

polipeptida cu Mr de 94,6 kDa
este prezent la Drofa i absent
14,2_
6,5_
10
11 12
Fig. 6.5. Spectrul proteinelor uor solubile din polenul

de floarea-soarelui.
M-marker, kDa; 1-Xenia Rf; 2-Xenia F1; 3-Drofa Rf; 4-Drofa F1;
5-Valentino F1; 6-LC 4 Rf; 7-LC Cium Rf; 8-LC Raus Rf; 9-LC
637 Rf; 10-LC 7 Rf; 11-LC 43 Rf; 12-LC 39 Rf.
la Xenia i Valentino, iar componentul de 81,5 kDa relevat anterior la sporul tnr de Valentino
F1 lipsete n polenul matur.
Generaliznd datele obinute, constatm c polimorfismul extractului proteic sumar izolat
din frunze, flori i polen
dezvoltare, ct i de
reflect procesele biochimice specifice att de esut i etap de
particularitile de interaciune a genelor implicate n manifestarea
androsterilitii i restaurrii fertilitii polenului la hibrizii F1.Este important faptul, c toi

hibrizii i unele linii paterne conin componentul polipeptidic cu Mr de 90,0 kDa absent la liniile
materne. Aceast polipeptid ar putea fi polinucleotid-fosforilaza (analizat n silico n 4.5) protein solubil, homotrimer conservativ a complexului de degradare a ARN mesager din
mitocondrii, ce apare n electroforeza denaturant ca un fragment de cca. 90 kDa [2, 237].
91
Un alt component cu Mr de 17,3 kDa, prezent de asemenea la toate genotipurile cercetate

ar putea reprezenta enzima ARN-aza2, descris n literatur [249] cu aceeai masa molecular
relativ n SDS-PAGE.
Studiul comparativ dintre formele ASC i Rf ai altor produi de expresie dintre care i
componenii cu Mr de 27 kDa i 38,5 kDa relevai la liniile restauratoare de fertilitate, sugereaz
activitatea unor gene antiapoptotice Bax inhibitor i AdoMetDC cu o mas relativ similar [115,
279, 281]. Un aspect care trebuie de menionat este i faptul, c compusul cu Mr 27 kDa prezint
o intensitate maxim n faza de nflorire spre deosebire de cel cu Mr de 38,5 kDa care nu variaz
cantitativ (cu excepia liniilor LC 637 Rf i LC Raus Rf la butonizare).
6.4. Mecanismul de aciune a genelor de restaurare a fertilitii polenului
Sistemele de restaurare a fertilitaii sunt de dou tipuri: sporofitice unde se restaureaz
fertilitatea n esuturile sporofitice sau n alte esuturi, nainte de meioz i gametofitice cnd
restaurarea fertilitii la nivelul microsporilor sau la nivelul gruncioarelor de polen are loc dup
meioz [98]. Astfel, investigarea tipului de sistem restaurator (sporofitic sau gametofitic) va
permite elucidarea aspectelor de expresie temporal a genelor restauratare de fertilitate.
Prin urmare, ipoteza de lucru era determinat de faptul c, dac o plant hibrid cu genele
restauratoare n stare heterozigot (Rfrf) va produce 100% polen fertil, adic produsul genei (Rf)
i manifest aciunea asupra mitocondriilor din esutul sporogen nainte de meioz i are loc
repartizarea mitocondriilor din 2n n n, n, n i n (gruncioare de polen) cu simptomul
androsterilitii deja supresat, atunci mecanismul restaurrii va fi sporofitic (Figura 6.6).
B
Fig. 6.6. Expresia temporal la sistemele sporofitice (A) i gametofitice (B).
Iar dac, planta hibrid (Rfrf) va produce doar 50% polen fertil (cnd sinteza produsului
genei (Rf) are loc dup meioz i el este capabil s neutralizeze simptomul androsterilitii doar
la nivelul sporului n care gena restauratoare se afl n stare dominant) sistemul de restaurare va
92
fi cel gametofitic, cum este cazul porumbului cu citoplasm de tip S restaurant cu ajutorul
genelor (Rf3) n stare heterozigot ce produceau doar 50% pollen viabil [109].
Analiza microscopic a polenului a permis s constatm o identitate morfologic i
structural a sporilor de la toate genotipurile hibride i liniile fertile. Gruncioarele de polen a
tuturor genotipurilor aveau form sferoidal cu exina spinifer puternic accentuat. Dup
jumtate de or toi sporii analizai ntre 500 i 1000 de la toate genotipurile incluse n cercetare
aveau o coloraie brun-deschis cu eccepia exinei (Figura 6.7).
3
2
1
Fig. 6.7. Gruncioate de polen colorate dup 0,5 ore cu sol. de I2 n KI de 1% (x120).
1- Xenia F1, 2- Drofa F1, 3- Valentino F1.
Doar dup o or att corpul sporifer ct i exina spinifer prezenta o coloraie brun-nchis
ce demonstra faptul c polenul cercetat era n stare viabil 100% (Figura 6.8 i Tabelul 6.1).
3
2
1
Fig. 6.8. Gruncioare de polen colorate dup o or cu sol. de I2 n KI de 1% (x120).
1- Valentino F1, 2- LC4Rf, 3- S 254 F1.
93
Indexul
genotipului
Xenia F1
Drofa F1
Valentino F1
S 254 F1
Xenia Rf
Drofa Rf
LC 4 Rf
LC Cium Rf
LC Raus Rf
LC 637 Rf
LC 7 Rf
analizai
dup
0,5 ore
798
973
783
904
479
874
1056
746
693
938
739
Tabel 6.1 Numrul de microspori analizai

Microspori
colorai
colorai
analizai
din Nr. total
din Nr. total
dup
1 or
n % 1 or
1 or
0,5 ore
n % 0,5 ore
796
99,74
857
857
100
970
99,69
636
636
100
782
99,87
734
734
100
903
99,88
683
683
100
479
100
753
753
100
874
100
843
843
100
1055
99,9
825
825
100
746
100
646
646
100
692
99,85
589
589
100
938
100
953
953
100
739
100
865
865
100
Astfel, a fost evideniat faptul c, la hibrizii de generaia unu de floarea-soarelui tot

polenul era fertil n proporie de 100% [165].
Fracionarea electroforetic a extractelor de proteine uor solubile din polen, frunze i flori
la formele sterile i fertile a pus n eviden profile heterogene de expresie temporal-spaial a
genelor asociate cu
manifestarea andosterilitii i restaurarea fertilitii. Un nivel nalt i
difereniat al activitii de expresie a genelor se observ n fazele micro - i macrosporegenezei.

Componentul polipeptidic cu Mr de 90,0 kDa asociat cu expresia genelor restauratoare de
fertilitate, conform datelor din literatur ar putea fi polinucleotid-fosforilaza - protein solubil,
Cu privire la expresia temporal a genelor restauratoare de fertilitate putem afirma c
acestea supreseaz sindromul androsterilitii n esuturile sporofitice nainte de meioz,
deoarece tot polenul s-a dovedit a fi viabil n proporie de 100%.
94
CONCLUZII GENERALE
1. Prin analize bioinformatice a fost evideniat localizarea citoplasmatic a produilor de
expresie a genelor Rf i membranar a celor androsterile (proteina ORFH522 are primii 23 aa (Nterminal) n interiorul mitocondriei, urmtorii 17 n spaiu intermembranar, iar partea Cterminal orientat n citoplasm).
2. Proteinele asociate cu ASC la diverse specii de plante prezint domene proteice (Retroviral
aspartil proteaza, Major Facilitator Superfamily etc.), demonstrnd implicarea acestora n
apoptoza celular, iar cele asociate cu restaurarea fertilitii motive/domene proteice de
recunoatere/aciune la nivel de ARN (RNA recognition motif, Radical SAM Superfamily etc.),
informaii care a permis elaborarea unui mecanism ipotetic de interaciune a componentelor
sistemului ASC-Rf la plante.
3. A fost modelat in silico enzima polinucleotid-fosforilaza de la floarea-soarelui implicat n
poliadenilarea transcriptului atpA-orfH522 care ulterior este digerat de ARN-aze, astfel fiind
asigurat restaurarea fertilitii polenului.
4. Au fost evideniate trsturi similare de interaciune nucleu citoplasm n cadrul sistemului
ASC-Rf de la floarea-soarelui (PET1) i cel de la porumb (ASC-S). De asemenea, markerul
molecular lincat cu gena Rf3 de la porumb (ASC-S) a fost identificat n genomul formelor
restauratoare de fertilitate i hibride de floarea-soarelui.
5. Formele paterne Drofa, Valentino, Raus; LC4 i materne SW38, VIR101, VIR116 s-au
evideniat printr-un nivel nalt al diversitii genetice criteriu important n formarea
combinaiilor hibride de perspectiv. Au fost identificai ampliconi RAPD (OPG 10510, OPG
10680, OPI 16450 i OPI 16550) specifici liniilor restauratoare care, ulterior, pot fi utilizai n
elaborarea markerilor moleculari linchai cu caracterul restaurator de fertilitate.
6. Segregarea fenotipic (analiza hibridologic) i genetic (CAPS-HinfI) a relevat un
mecanism complex de restaurare a fertilitii polenului asigurat de prezena unei singure gene
dominante Rf (hibrizi F1 Drofa, Valentino, Sumbred 254 etc.) sau dou i mai multe gene cu
aciune polimer necumulativ (combinaia hibrid Xenia).
7. A fost identificat prezena i starea alelic a genei Rf1 la 14 linii fertile (Rf1Rf1), 9 linii ASC
(rf1rf1) i 16 genotipurile hibride (Rf1rf1). Posibilitatea unui screening molecular la o etap de
dezvoltare mult mai timpurie (n cazul nostru faza de plantul) dect cea de nflorire faciliteaz i
asigur relevana studiilor de motenire a genelor de interes.
8. Fracionarea electroforetic a extractelor de proteine uor solubile din polen, frunze i flori la
formele sterile i fertile a pus n eviden profile heterogene de expresie temporal-spaial a
95
genelor asociate cu
manifestarea andosterilitii i restaurarea fertilitii. Un nivel nalt i
difereniat al activitii de expresie a genelor se observ n fazele micro - i macrosporegenezei.

Componentul polipeptidic cu Mr de 90,0 kDa asociat cu expresia genelor restauratoare de
fertilitate, conform datelor din literatur ar putea fi polinucleotid-fosforilaza protein solubil,
Recomandari practice:
1. n baza analizei hibridologice, CAPS i a datelor morfologice, liniile homozigote dup gena
Rf1: LC4; LC39; LC41; LC43; LC Cium i LC Raus sunt recomandate pentru elaborarea noilor
genotipuri hibride.
2. Hibrizii creai Drofa ASC LC Raus Rf i Drofa ASC VIR 681 Rf sunt recomandai n
procesul de ameliorare, deoarece prezint un indice nalt de autocompatibilitate a polenului
caracter agroeconomic important.
96
BIBLIOGRAFIE
1.
Abad A.R., Mehrtens B.J., Mackenzie S.A. Specific expression inreproductive tissues and
fate of amitochondrial sterility associated protein in cytoplasmic male-sterile bean. Plant Cell,
1995, vol. 7, p. 271285.
2.
Abrams A., Mcnamarat P. Polynucleotide Phosphorylase in Isolated Bacterial Cell
Membranes. The Journal of Biol. Chemistry, 1962, vol. 237, nr. 1, p. 170-175.
3.
Ahoka H. Cytoplasmic male Sterile in Barley. Theoret. Appl. Genet., 1980, vol. 57, p.
193-202.
4.
Akagi H. et al. A unique sequence located downstream from the rice mitochondrial atp6
may cause male sterility. Curr. Genet., 1994, vol. 25, nr. 1, p. 5258.
5.
Akagi H. et al. Positional cloning of the rice Rf-1 gene, a restorer of BT-type cytoplasmic
male sterility that encodes a mitochondria-targeting PPR protein. Theor. Appl. Genet., 2004, vol.
108, p. 14491457.
6.
Alba E. Primi rezultai di una ricerca di geni restoratori della fertilitata pollinic in
girasol (H.annuus L.). Ann. Fac. Agr. Bary., 1976, vol. 28, p. 510-518.
7.
Alberts B. et al. Molcular biology of the Cell, 4th. Ed., Garland Science, New-York, 2002,
1616 p.
8.
Altmann R. Die Elementar organismen. Veil and Company, Leipzig (1890); citat de SAPP
J. Symbiosis in evolution: an origin story. Endocytobiosis and Cell Res., 1990, vol. 7, p. 5-36.
9.
Bahl P.N., Maan S.S. Chromosomial location of male fertility restoring gene in six lines of
common wheat. Crop. Sci., 1973, vol. 13, p. 317-320.

10.
Bailey-Serres J. et al. Nuclear-mitochondrial interaction in cytoplasmic male sterile
sorghum. Theor. Appl. Genet., 1986, vol. 73, p. 252-260.

11.
Balk, J., Leaver C.J., The PET1-CMS mitochondrial mutation in sunflower is associated
with premature programmed cell Death and cytochrome c release. Plant Cell, 2001, vol. 13, p.
18031818.
12.
Bellaoui M. et al. The restorer Rfo gene acts posttranslationaly on the stability of the
ORF138 Ogura CMSassociated protein in reproductive tissues of rapeseed cybrids. Plant Mol.
Biol., 1999, vol. 40, p. 893902.
13.
Bentolila S. et al. A pentatricopeptide repeat-containing gene restores fertility to
cytoplasmic male-sterile plants. Plant Biology, 2002, vol. 99, p. 10887-10892.

14.
Bereterbide A. et al. Restoration of stamen development and production of functional
pollen in an aloplasmic CMS tobacco line by ectopic expression of the Arabidopsis thaliana
SUPERMAN gene. Plant J., 2002, vol. 29, p. 607615.
97
15.
Bland M.M. et al. The tobacco mitochondrial ATPase subunit 9 gene is closely linked to an
open reading frame; Mol Gen. Genet., 1986, vol. 204, p. 8-16.
16.
Bonhomme S. et al. A 2.5 kb NcoI fragment of Ogura radish mitochondrial-DNA is
correlated with cytoplasmic male sterility in Brassica cybrids. Curr. Genet., 1991, vol. 19, p.
121127.
17.
Bonnett H.T., Kofer W., Hakansson G., Glimelius K. Mitochondrial involvement in petal
and stamen development studied by sexual and somatic hybridizations of Nicotiana species.
Plant Sci., 1991, vol. 80, p. 119130.
18.
Braun C.J. et al. Cytoplasmic male sterility; in Plant gene research : cell organelles (ed.) R
G Herman (Wein: Springer Verlag), 1992, p. 219-245.

19.
Braun C.J., Levings III C.J. Nucleotide sequence of the F1-ATPase alpha-subunit gene
from maize mitochondria. Plant Physiol., 1985, vol. 79, p. 571-577.

20.
Braun C.J., Siedow J.N., LEVINGS C.S. Funga1 Toxins Bind to the Mitochondria and
Escherichia coli URF13 Protein in Maize. The Plant Cell, 1990, vol. 2, p.153-161.
21.
Brown G.G. et al. The radish Rfo restorer gene of Ogura cytoplasmic male sterility encodes
a protein with multiple PPR. Plant J., 2003, vol. 35, p. 262272.
22.
Brown G.G. Unique aspects of cytoplasmic male sterility and fertility restoration in
Brassica napus. J. Hered., 1999, vol. 90, p. 351356.

23.
Buchert J.G. The stage of the genome-plasmon interaction in the restoration of fertility to
cytoplasmicaly pollen-sterile maize. Genetics, 1961, vol 47, p. 1436-1440.

24.
Burke J.M. et al. Comparative mapping and rapid karyotypic evolution in the genus
Helianthus. Genetics, 2004, vol. 167, p. 449457.

25.
Burzo I. i col. Fiziologia plantelor de cultur. Chiinu, 1999, vol. 2, p. 208335.
26.
Camp R.G., Kuhlemeier C. Aldehyde dehydrogenase in tobacco pollen. Plant Mol. Biol.,
1997, vol. 35, nr. 3, p. 355-365.

27.
Canal L. et al. A transcriptional alteration on the atp9 gene is associated with a sunflower
male-sterile cytoplasm. Theor. Appl. Genet., 2001, vol. 102, p 1185-1189.

28.
Carpousis A.J. The Escherichia Coli RNA Degradosome: Structure, Function and
Relationship In Other Ribonucleolytic Multienzyme Complexes. Biochem. Soc. Trans., 2002,

vol. 30, nr. 2, p. 150155.
29. Cpn A. Aspecte geneticomoleculare ale heterozisului la floareasoarelui (Helianthus
annuus L). Tez de doctor n tiine biologice, Chiinu, 2006, 121p.
30.
Chase C. Expression of CMS unique and flanking mitochondrial DNA sequences in
Phaseolus vulgaris L. Genet., 1994, vol. 25, p. 245-251.

98
31.
Chen Z. et al. A chloroplast DNA deletion located in RNA polymerase genes rpo C2 in
CMS lines of sorghum. Mol. Gen. Genet. 1993, vol. 236, p. 251-259.
32.
Cheng E.H. et al. VDAC2 inhibits BAK activation and mitochondrial apoptosis. Science,
2003, vol. 301, p. 513517.

33.
Chepurnaya A.L., Sherstyuk S.V., Tikhomirov V.T. CMS-Rf system for sunflower
breeding. HELIA, 2003, vol. 26, nr. 38, p. 59-66.

34.
Christov M. Study on the wild species from genus Helianthus with a view of their use in
sunflower breeding. Ph. D. thesis, Sofia, 1990, 208 p.

35.
Conlei C.A., Parthasarathz M.V., Hanson M.R. Effects of the Petunia cytoplasmic male
sterile (CMS) cytoplasm on the development of sterile and fertility restored P.parodii anthers.
Am. J. Bot., 1994, vol. 81, p. 630640.
36.
Conley C.S, Hanson M.R. How do alterations in plant mitochondrial genomes disrupt
pollen development? J. Bioenerg Biomembr., 1995, vol. 27, p. 447457.

37.
Covello P.S., Gray M.V. RNA editing in plant mitochondria. Nature, 1989, vol. 341, p.
662-666.
38.
Cui X., Wise R.P., Schnable P.S. The rf2 nuclear restorer gene of male sterile Tcytoplasm
maize. Science, 1996, vol. 272, p. 13341336.

39.
Dawson A .J et al. Locations of the genes for cytochrome oxidase subunit I and I,
apocytochrome b, alpha-subunit of the F1-ATPase and ribosomal genes on the mitochondrial

genome of maize. Curr. Genet., 1986b, vol. 10, p. 561-564.
40.
Dawson A.J. et al. Novel recombinations in the maize mitochondrial genome produce a
unique transcript. unit in the T male sterile cytoplasm; Cell, 1986a, vol. 44, p. 439449.
41.
Dewey R.E. et al. A 13 - kilodalton maize mitochondrial protein in E. coli confers
sensitivity to Bipolaris maydis toxin. Science, 1988, vol. 239, p. 293-295.

42.
Dewey R.E. et al. A mitochondrial protein associated with cytoplasmic male sterility in the
T cytoplasm of maize. Proc. Nat l. Acad. Sci. USA, 1987, vol. 84, p. 5374-5378.
43.
Dewey R.E., Levings C.S., Timothy D.H. Novel recombinations in the maize
mitochondrial genome produce a unique transcriptional unit in the Texas male-sterile cytoplasm.
Plant Cell, 1986, vol. 44, p. 439449.
44.
Dill C.L. et al. Rf8 and Rf* mediate unique T-urf13-transcript accumulation, revealing a
conserved motif associated with RNA processing and restoration of pollen fertility in Tcytoplasm maize. Genetics, 1997, vol. 147, p. 13671379.
45.
Dill K.A. Theory for the folding and stability of globular proteins. Biochemistry, 1985, vol.
24, nr. 6, p 15011509.

99
46.
Dominquez E.N., Fick E.N. Fertility restoration of male sterile cytoplasmic in wild
sunflower. Crop. Sci., 1975, vol. 15, nr.5, p.724-726.

47.
Doyle J.J., Doyle J.L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 1990, vol. 12, p.
1315.
48.
Duca M. Aspecte genetice i fiziologice ale sistemului ASC-Rf la Helianthus annuus L.
Autoref. tez de doctor habilitat in biologie, Chisinau, 1998, 240 p.

49.
Duca M. i col. Motenirea ampliconilor ADN la diverse genotipuri de floarea-soarelui.
Buletinul Academiei de tiine a Moldovei. 2006, vol. 299, nr. 2, p. 58-65.

50.
Duca M., Port A., Midoni A. Analiza comparativ a produilor de expresie a genelor
restauratoare de fertilitate. n: Conferina internaional a tinerilor cercettori, ediia VI, 6-7

noiembrie. Chiinu, 2008, p. 30.
51.
Duca M., Port A., Midoni A., Anisimova I. Studiul autocompatibilitii polenului la unele
genotipuri de floarea-soarelui (Helianthus annuus L.). n: Buletinul Academiei de Stiinte a

Moldovei. Stiinele Vieii. 2009, nr. 3(309), p. 68-74.
52.
Duca M., Port A., Midoni A., Anisimova I., Rotaru Tudor. Motenirea genelor Rf la
diverse genotipuri de floarea-soarelui. n: Studia Universitatis. Seria Stiinte ale naturii, 2010, nr.
1 (31), p. 5-9.
53.
Duca M., Savca E., Port A. Fiziologia vegetala. Tehnici speciale de laborator. Chisinau:
2001, 173 p.
54.
Ehrenhofer-Murray A. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair.
Eur. J. Biochem., 2004, vol. 271, nr. 12, p. 23352349.

55.
Ellis R.J., van der Vies S.M. "Molecular chaperones". Annu. Rev. Biochem., 1991, vol. 60,
p. 32147.
56.
Feng J., Jan C., Introgression and molecular tagging of Rf4, a new male fertility restoration
gene from wild sunflower Helianthus maximiliani L. Theor. Appl.Genet., 2008, vol. 117, p.241
249.
57.
Feng J., Vick B.A., Lee M.K., Zhang H., Jan C.C. Construction of BAC and BIBAC
libraries from sunflower and identication of X W linkage group-speci c clones by overgo

hybridization. Theor. Appl. Genet., 2006, vol. 113, p. 23-32.
58.
Fenton W.A., Horwich A.L. Chaperoninmediated protein folding: fate of substrate
polypeptide. Q. Rev. Biophys., 2003, vol. 36 nr. 2, p. 22956.

59.
Fernandez-Martinez J., Knowles P.F. Inheritance of selfincompatibility in wild sunflower.
In: Proc. 8th Int Sunflower Conf. Minneapolis, Int Sunflower Assoc, Paris, 1978, p. 484489.
100
60.
Fick G.N. Breeding and genetics. Sunflower science and biotechnology, Agronomy,
1978, vol.19, p. 279338.

61.
Fick G.N. Selection for self-fertility and oil pecentage in development of sunflower
hybrids. In: Proc 8th Int Sunflower Conf. Int Sunflower Assoc., Paris, 1978, p. 418422.
62.
Fick G.N., Zimmer D.E. Fertility restoration in sunflower., Crop. Sci., 1974, vol. 14, nr. 4,
p. 603-604.
63.
Finnegan P.M., Brown G.G. Transcriptional and post-transcriptional regulation of RNA
levels in maize mitochondria. Plant Cell, 1990, vol. 2, p. 71-83.

64.
Fisk D.G. Walker M.B., Barkan A. Molecular cloning of the maize gene crp1 reveals
similarity between regulators of mitochondrial and chloroplast gene expression. EMBO J., 1999.
vol. 18, p. 26212630
65.
Fladung M. Transformation of deploid and tetraploid potato clones with rol C gene of
Agrobacterium rhizogenes and characterization of transgenic plants. Plant Breeding, 1990, vol.
104, p. 295-304.
66.
Flavell R. A model for the mechanism of cytoplasmic male sterility in plants, with special
reference to maize. Plant Sci. Lett., 1974, vol. 3, p. 259263.

67.
Forde B.G. et al. Variation in mitochondrial translation products associated with male-
sterile cytoplasms in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, vol. 75, p. 38413845.
68.
Franklin-Tong V.E. et al. The self-incompatibility response in Papaver rhoeas is mediated
by cytosolic free calcium. Plant J, 1993, vol. 4, p. 163177.

69.
Fujle M. et al. Studies on the behavior of organelles and their nucleoids in the root apical
meristem of Ambidopsis tbaliana (L.). Col. Planta, 1993, vol. 189, p. 443-452.
70.
Gagliardi D., Leaver C.J. Polyadenylation accelerates the degradation of the mitochondrial
mRNA associated with CMS in sunflower. EMBO J., 1999, vol. 18, p. 37573766.
71.
Gengenbach B.G. et al. Mitochondrial-DNA variation in maize plants regenerated during
tissue-culture selection. Theor. Appl. Genet., 1981, vol. 59, p. 161167.

72.
Golz, J.F., Clarke A.E., Newbigin E. Mutational approaches to the study of self-
incompatibility: revisiting the pollen-part mutants. Ann. Bot., 2000, vol. 85, p. 95103.
73.
Grelon M. et al. Ogura cytoplasmic male-sterility (CMS)-associated orf138 is translated
into a mitochondrial membrane polypeptide in male-sterile Brassica cybrids. Mol. Gen. Genet.,
1994, vol. 243, p. 540547.
74.
Gulyas G. et al. Analiz of fertility restoration by using cytoplasmic male-sterile Red Pepper
(Capsicum annuum L.) Lines. Breeding Science, 2006, vol. 56, p. 331-334.
101
75.
Gutierres S. et al. Lack of mitochondrial and nuclear-encoded subunits of complex I and
alteration of the respiratory chain in Nicotiana sylvestris mitochondrial deletion mutants. Proc.
Natl. Acad.Sci. USA, 1997, vol. 94, p. 34363441.
76.
Hanson M.R. et al. Mitochondrial gene organization and expression in petunia male fertile
and sterile plants. American genetic association, 1999, vol. 90, p. 362368.
77.
Hanson M.R. Plant mitochondrial mutations and male sterility. Annu. Rev. Genet., 1991,
vol. 25, p. 461-486.

78.
Hanson M.R., Bentolila S. Interactions of mitochondrial and nuclear genes that affect male
gametophite development. The plant Cell., 2004, vol. 16, p. 154169.

79.
Hanson M.R., Conde M.F. Functioning and variation of cytoplasmic genomes: lessons
from cytoplasmic-nuclear interactions affecting male fertility in plants., Int. Rev. Cytol., 1985,
vol. 94, p. 214267.
80.
He S. et al. A cytoplasmic male sterility-associated mitochondrial protein causes pollen
disruption in trans. tobacco. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, vol. 93, p. 1176311768.
81.
He S., Lyznik A., Mackenzie S. Pollen Fertility Restoration by Nuclear Gene Fr in CMS
Bean: Nuclear-Directed Alteration of a Mitochondrial Population. Genetics, 1995, vol. 139, p.

955-962.
82.
Hedgcoth C. Et al. A chimeric open reading frame associated with CMS in aloplasmic
wheat with Triticum timopheevi mitochondria is present in several Triticum and Aegilops
species, barley, and rye. Curr. Genet., 2002, vol. 41, p. 357365.
83.
Heisel R. et al. The cytochrome oxidase subunit III genes in Oenothera mitoch. are
transcribed from identical promoter sequences; EMBO J., 1987, vol. 6, p. 29-34.
84.
Heiser C.B. Registration of Indiana-I CMS sunflower germplasm. Crop. Sci., 1982, vol. 22,
p. 1089.
85.
Hernhdez L.F., GREEN P.B. Transductions for the expression of structural pattern:
Analysis in sunflower. Plant Cell, 1993, vol. 5, p. 17251738.

86.
Hernold M. et al. Male sterility induction in transgenic tobacco plants with non-edited atp9
mitochondrial gene from wheat. In Book of poster abstracts XIII th Eucarpia Congress, 1992. p.
85-86.
87.
Hiesel R., Brennicke A. Overlaping reading frames in Oenothera mitochondria. FEBS Let.,
1985, vol. 193, p. 164-163.

88.
Hiscock S.J., Mcinnis S.M. Pollen recognition and rejection during the sporophytic self-
incompatibility response: Brassica and beyond. Trends Plant Sci, 2003, vol. 8, p. 606613.
102
89.
Holec S. et al. Relaxed transcription in Arabidopsis mitochondria is counterbalanced by
RNA stability control mediated by polyadenylation and polynucleotide phosphorylase. Mol. Cell
Biol., 2006, vol. 26, nr.7, p.2869-2876.
90.
Horn R. et al. CMS-associated 16 kDa protein encoded by orfH522 in the PET1 cytoplasm
is also present. Plant Mol. Biol. 1996, vol. 30. p. 523-538.

91.
Horn R. et al. Molecular mapping of the Rf1 gene restoring pollen fertility in PET1-based
F1 hybrids in sunflower. Theor. Appl. Genet., 2003, vol. 106, p. 599-606.

92.
Horn R. Molecular diversity of male sterility inducing and male-fertile cytoplasms in the
genus Helianthus. Theor. Appl. Genet., 2002, vol. 104, p. 562-570.

93.
Horner H.T. A comparative light- and electron-microscopic study of microsporogenesis in
male-fertile and cytoplasmic male-sterile sunflower (Helianthus annuus). Am. J. Bot., 1977, vol.
64, p. 745-759.
94.
Howard W., Kempken F. Cell-type specific loss of atp 6 RNA editing in CMS Sorgum
bicolor. Proc. Natl. Sci. USA, 1997, vol. 94, p. 11090-11095.

95.
Hsu Y-T., Youle R.J. Bax in Murine Thymus Is a Soluble Monomeric Protein That
Displays Differential Detergent-induced Conformations. The Journal of Biological Chemistry,

1998, vol. 273, nr. 17, p. 10777-10783.
96.
Hu J. Et al. Integration of trap markers onto a sunflower SSR marker linkage map constr.
from 92 recombinant inbred lines. HELIA, 2007, vol. 30, nr. 46, p. 25-36.
97.
Ignjatovic-Micic D. et al. Identification of sterile cytoplasm (CMS) in maize by using
specific mt DNA primers. Genetika, 2006, vol. 38, nr. 3, p. 227233.

98. Ispas I. Aspecte moleculare privind citoplasma androsteril PET1 de la floarea-soareui.
Institutul de Genetic Bucuresti, 2002, p. 21.
99.
Iwabuchi M. et al. Identification and expression of Kosena radish (Raphanus sativus. L. cv.
Kosena) homologue of the ogura radish CMS-associated gene, ORF138. Plant Mol. Biol., 1999,
vol. 39, p. 183-188.
100.
Iwabuchi M., Kyozuka J. Shimamoto K. Processing followed by complete editing of an
altered mitochondrial atp6 RNA restores fertility of cytoplasmic male sterile rice. EMBO J.,
1993, vol. 12, p. 14371446.
101.
James O. Et al. Comparisons Among Two Fertile and Three Male-Sterile Mitochondrial
Genomes of Maize. Genetics, 2007, vol. 177, p. 11731192.

102.
Jan C.C. Cytoplasmic male sterility in two wild Helianthus annuus L. Accessions and
their fertility restoration. Northern Crop Science Laboratory, 1994 (nu e corect) 2000, vol. 40, p.
1535-1538.
103
103.
Jan C.C., Vick B.A. Inheritance and alelic relationships of fertility restoration genes for
seven new sources of male-sterile cytoplasm in sunflower. Plant Breeding., 2007. vol.126, p.
213-217.
104.
Jan C.C., Vick B.A., Miller J.F. Construction of an RFLP linkage map for Cultivated
sunflower. Theor. Appl. Genet., 1998, vol. 96, p. 15-22.

105.
Janska H. et al. Stoichiometric shifts in the common bean mitochondrial genome lead to
male sterility and spontaneous reversion to fertility. Plant Cell., 1998, vol. 10, p.11631180.
106.
Jing R., Li X., Yi P., Zhu Z. Mapping fertility-restoring genes of rice WA cytoplasmic
male sterility using SSLP markers. Bot. Bull. Acad. Sin., 2001. vol. 42, p. 167-171.
107.
Jung C. et al. DNA markers closely linked to nematode resistance genes in sugar beet
(Betavulgaris L.) mapped using chromosome additions and translocations originating from wild
beets for the Procumbentes section. Mol. Gen. Genet., 1992, vol. 232, p. 271-278.
108.
Kadowaki K.I., Suzuki T. A chimeric gene containing the 5` portion of atp 6 is associated
with cytoplasmic male sterility of rice.Mol. Gen. Genet., 1990, vol. 224, p. 10-16.
109.
Kamps T.L., Chase C.D. RFLP mapping of the maize gametophytic restorer-of-fertility
locus (rf3) and aberrant pollen transmission of the nonrestoring rf3 alele. Theor. Appl. Genet.,
1997, vol. 95, p. 525-531.
110.
Kantardjieff K.A., Rupp B. Protein isoelectric point as a predictor for increased
crystalization screening efficiency. BIOINFORMATICS, 2004, vol. 20, no. 14, p. 21622168.
111.
Kaspi C.I., Siedow J.N. Cross-linking of the cms-T Maize Mitochondrial Pore-forming
Protein URF13 by N,N-Dicyclohexylcarbodiimide and Its Effect on URF13 Sensitivity to

Fungal Toxins. The Journal of Biological Chemistry. 1993, vol. 268, nr. 8, p. 5828-5833.
112.
Kazama T., Toriyama K. A pentatricopeptide repeat containing gene that promotes the
processing of aberrant atp6 RNA of cytoplasmic male-sterile rice. FEBS Lett., 2003, vol. 544, p.
99102.
113.
Kazama T., Toriyama K. Genetic evolution of Rf1 locus for the fertility restorer gene of
BT-type CMS rice. In- Rice is life: scientific perspectives for the 21st century. Proceeding of the
World Rice Research Conference held in Tokyo and Japan. International Rice Research Institute,
2005, p. 170-171.
114.
Keita Y. et al. Genetic and molecular analysis of the restoration of fertility (Rf) genes for
Ogura male-sterility from a Japanese wild radish (Raphanus sativus var. hortensis f.
raphanistroides Makino). Euphytica, 2008, vol. 164, p. 395404.
115.
Kim H-R. et al. Bax inhibitor 1 regulates ER-stress-induced ROS accumulation through
the regulation of cytochrome P450 2E1. Journal of Cell Science, 2009, vol. 122, p. 1126-1133.
104
116.
Kinman M.L. New developments in the USDA and state experiment station sunflower
breeding proghrams. Proc.Fourth Int. Sunflower Conference. U.S.A., Memphis Tennessee, 1970,
p. 181-183.
117.
Kinoshita T. Genetic relationship between pollen fertility restoring genes and
cytoplasmic factors in the male sterile mutants of sugar beets. Japan. J. Breed., 1977, vol. 27,
nr.l, p. 19-27.
118.
Knowles P.F. Morphology and anatomy. In Sunflower Science and Technology,
Agronomy, 1978, nr. 19, p. 5587.

119.
Kohler R.H. et al. Cytoplasmic male sterility in sunflower is correlated with the co
transcription of a new open reading frame with the atpA gene. Mol. Gen. Genet., 1991, vol. 227,
nr. 3, p. 369376.
120.
Koizuka N. et al. Genetic characterization of a pentatricopeptide repeat protein gene,
orf687, that restores fertility in the cytoplasmic male-sterile kosena radish. Plant J., 2003, vol.
34, p. 407415.
121.
Kubo T. et al. The complete nucleotide sequence of the mitochondrial genome of sugar
beet (Beta vulgaris L.) reveals a novel gene for tRNA(Cys)(GCA). Nucleic Acids Res., 2000,
vol. 28, p. 25712576.
122.
Kusterer B., Horn R., Friedt W. Molecular mapping of the fertility restoration locus Rf1
in sunflower and development of diagnostic markers for the restorer gene. Euphytica, 2005, vol.
143, p. 35-42.
123.
Kusterer B., Prufe M., Lazarescu E., Horn R. Mapping of the restorer gene Rf1 in
sunflower (Helianthus annuus L.). Helia, 2002, vol. 25, p. 41-46.

124.
Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature, 1978, vol. 227, p.680-685.

125.
Lam E., Kato N., Lawton M. Programmed cell death, mitochondria and the plant
hypersensitive response. Nature, 2001, vol. 411, p. 848853.

126.
Lamb J.R., Tugendreich S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: To TPR or
not to TPR? Trends Biochem. Sci., 1995, vol. 20, p. 257259.

127.
Landgren M. et al. Aloplasmic male-sterile Brassica lines containing B. tournefortii
mitochondria express an ORF 39 of the atp6 gene and a 32 kDa protein. Plant Mol. Biol., 1996,
vol. 32, p. 879890.
128.
Lanying W., Christine D.C. Pleiotropic effects of a nuclear restorer-of-fertility locus on
mitochondrial transcripts in male-fertile and S male-sterile maize. Curr. Genet., 1999, vol. 35, p.
521-526.
105
129.
Laser K.D., Lersten N.R. Anatomy and cytology of microsporogenesis in cytoplasmic
male-sterile angiosperms. Bot. Rev., 1972, vol. 38, p. 425454.

130.
Laveau J.H., Schneider C., Berville A. Microsporogenesis abortion in cytoplasmic male
sterile plants from H. pefiolaris or H. petiolaris falax crossed by sunflower (Helianthus annuus).
Ann. Bot., 1989, vol. 64, p. 137-148.
131.
Laver H.K. et al. Mitochondrial genome organization and expression associated with
cytoplasmic male sterility in sunflower. Plant J., 1991, vol. 1, nr. 2, p. 185193.
132.
Lawen A, Apoptosis-an introduction. Bioessays, 2003, vol. 25, p. 888-896.
133.
Leclercq P. La sterilite male cytoplasmique du turnesol. I Premiers etude sur la
restauration de la fertilite. Ann. Amelior. PL., 1971, vol. 21, nr.l, p. 45-54.
134.
Leclercq P. Une sterilite male utilisable pour la production d'hybrides simples de
tournesol. Ann. Amelior. Pl., 1966, vol. 18, p. 307-315.

135.
Lee S.L.J., Warmke H.E. Organelle size and number in fertile and Tqtoplasmic male
sterile corn. Am. J. Bot., 1979, vol. 66, p. 141-148.

136.
Lee, H.S., Huang S.S., Kao T. S-proteins control rejection of incompatible pollen in
Petunia inflata. Nature, 1994, vol. 367, p. 550563.

137.
Lefebvre A., Scala R., Pfeifer . Double stranded RNA associated with the 447
cytoplasmic male sterility in Vicia faba is packaged together with it replicase in cytoplasmic
membraneous vesicles. Plant. Mol. Biol., 1990, vol. 14, p. 477-490.
138.
Leino M. et al. Brassica napus lines with rearranged Arabidopsis mitochondria display
CMS and a range of developmental aberrations. Theor. Appl. Genet., 2003, vol. 106, p. 1156
1163.
139.
Leipner J., Horn R. Nuclear and cytoplasmic differences in the mitochondrial respiration
and protein expression of CMS and maintainer lines of sunflower. Euphytica, 2002, vol. 123, p.
411419.
140.
Levings III C.S. Thoughts on Cytoplasmic Male Sterility in cms-T Maize. 1993, The
Plant Cell, vol. 5, p. 1285-1290.

141.
Levings III C.S., Brown G.G. Molecular biology of the plant mitochondria. Cell, 1989,
vol. 56, p. 171179.

142.
Levitchi A. Estimarea heterozisului la floareasoarelui (Helianthus annuus L.) n baza
algoritmilor informationali. Tez de doctor n tiine biologice, Chiinu, 2008, 136p.

143.
Li X. et al. Self-incompatibility in the grasses: evolutionary relationship of the S gene
from Phalaris coerulescens to homologous sequences in other grasses. Plant Mol. Biol., 1997,
vol. 34, p. 223232.
106
144.
Li X.Q. et al. Restorer genes for different forms of Brassica cytoplasmic male sterility
map to a single nuclear locus that modifies transcripts of several mitochondrial genes. Proc Natl
Acad Sci USA, 1998, vol. 95, p. 1002310037.
145.
Lindahl R., Petersen D.R. Lipid aldehyde oxidation as a physiological role for class 3
aldehyde dehydrogenases. Biochem. Pharmacol., 1991, vol. 41, p. 15831587.

146.
Linke B., Nothnagel T., Borner T. Flower development in carrot CMS plants:
Mitochondria affect the expression of MADS box genes homologous to GLOBOSA and
DEFICIENS. Plant J., 2003, vol. 34, p. 2737.
147.
Liu F. et al. Mitochondrial aldehyde dehydrogenase activity is required for male fertility
in maize. Plant Cell, 2001, vol. 13, nr. 5, p. 10631078.

148.
Liu F., Schnable P. Functional Specialization of Maize Mitochondrial Aldehyde
Dehydrogenases. Plant Physiol., 2002, vol. 130, p. 16571674.

149.
Livini C. et al. Genetic diversity of maize inbred lines within and among heterotic groups
revealed by RFLP. Theor. Appl. Genet., 1992, vol. 84, p. 17-25.

150.
Lonsdale D.M. et al. The physical map and organization of the mitochondrial genome
from fertile cytoplasm of maize. Nuc. Acids Res., 1984, vol. 12, p. 9249-9261.
151.
Luciano A., Kinman M.L., Smith J.D. Heritability of self-incompatibility in the
sunflower (Helianthus annuus). Crop. Sci., 1965, vol. 5, p.529532.

152.
Mackenzie S.A. et al. Mitochondrial DNA rearrangement associated with fertility
restoration and cytoplasmic reversion to fertility in cytoplasmic male-sterile Phaseolus vulgaris

L. Proc Natl Acad Sci USA, 1988, vol. 85, p. 27142717.
153.
Mackenzie S.A., Chase C.D. Fertility restoration is associated with loss of a portion of
the mitochondrial genome in cytoplasmic male-sterile common bean. Plant Cell, 1990, vol. 2, p.
905912.
154.
Mackenzie S.A., Mcintosh L. Higher plant mitochondria. Plant Cell, 1999, vol. 11, p.
571585.
155.
Makaroff C.A, Apel I.J., Palmer J.D. The atp6 coding region has been disrupted and a
novel reading frame generated in the mitochondrial genome of cytoplasmic male-sterile radish.
J. Biol. Chem., 1989, vol. 264, p. 11706-11713.
156.
Manthey G.M. et al. The Saccharomyces cerevisiae PET309 protein is embedded in the
mitoch. inner membrane. Eur. J. Biochem., 1998, vol. 255, p. 156161.

157.
Manthey G.M., Mcewen J.E. The product of the nuclear gene PET309 is required for
translation of mature mRNA and stability of intron containing RNAs derived from mitochondrial
COXI locus of Saccharomyces cerevisiae. EMBO J., 1995, vol. 14, p. 40314043.
107
158.
Mariani C. et al. Induction of male sterility in plants by a chimeric ribonuclease gene;
Nature (London), 1990, vol. 347, p. 737-741.

159.
Matsuy K. et al. Molecular mapping of a fertility restoration locus (Rfm1) for
cytoplasmic male sterility in barlei. Teor. Appl. Genet., 2001, Vol. 102, p. 477-482.
160.
Meierhoff K. et al. HCF152, an Arabidopsis RNA binding pentatricopeptide repeat
protein involved in the processing of chloroplast psbB-psbT-psbH-petB-petD RNAs. Plant Cell,

2003, vol 15, p. 14801495.
161.
Menassa R., L'Homme Y., Brown G.G. Post-transcriptional and developmental
regulation of a CMS-associated mitochondrial gene region by a nuclear restorer gene. The plant
Journal, 1999, vol. 17, nr. 5, p. 491-499.
162.
Merrien A. Les points techniques du CETIOM: physiologie du tournesol. Paris, Ed.
CETIOM, 1992, 66p.

163.
Midoni A. Analiza comparativ a proteinelor codificate de genele sistemului ASC-Rf. n:
Studia Universitatis. Seria Stiinte ale naturii, 2009a, nr. 6, p. 139-142.

164.
Midoni A. Aspecte comprative ale diferitelor genotipuri de floare-soarelui. n:
Conferina internaional a tinerilor cercettori, ediia V, 9 noiembrie. Chiinu, 2007a, p. 47.

165.
Midoni A. Mecanisme sporofitice si gametofitice de restaurare a fertilitatii. Studia
Universitatis, 2008, nr. 12, p.16-18.

166.
Midoni A. Motenirea genelor Rf n cadrul diferitelor genoipuri de floare-soarelui. n:
Conferina internaional a tinerilor cercettori, ediia V, 9 noiembrie. Chiinu, 2007b, p. 48.

167.
Midoni A. Unele particulriti de interaciune nucleu citoplasm n cadrul sistemelor
ASC-Rf. n: Studia Universitatis. Seria Stiinte ale naturii, 2009b, nr. 6, p. 133-138.
168.
Mili S., Pinol-Roma S. LRP130, a pentatricopeptide motif protein with a noncanonical
RNA-binding domain, is bound in vivo to mitochondrial and nuclear RNAs. Mol. Cell. Biol.,
2003, vol. 23, p. 4972-4982.
169.
Miller J.F., Fick G.N. The genetics of sunflower. In: Schneiter AA (ed) Sunflower
technology and production. Crop. Science Society of America, Madison, 1997, p. 441495.
170.
Miroslav D., Misteli T. Functional architecture in the cell nucleus. Biochem. J., 2001,
vol. 356, p. 297310.

171.
Moneger F., Smart C.J., Leaver C.J. Nuclear restoration of citoplasmic male sterility in
sunflower is associated with the tissuespecific regulation of a novel mitochondrial gene., The
EMBO Journal., 1994, vol. 13, nr. 1, p. 817.
172.
Mounkes L.C, Stewart C.L. Aging and nuclear organization: lamins and progeria".
Current Opinion in Cell Biology, 2004, vol. 16, p. 322327.

108
173.
Murai K. et al. Pistillody, homeotic transformation of stamens into pistil-like structures,
caused by nuclear-cytoplasm interaction in wheat. Plant J., 2002, vol. 29, p. 169181.
174.
Murai K., Tsunewaki K. Genetic analysis on the fertility restoration by Triticum aestivum
cv. Chinese Spring against photoperiod-sensitive cytoplasmic male sterility. Jpn. J. Genet., 1994,
vol. 69, p. 195-202.
175.
Nakazono M. et al. Expression of a gene encoding mitochondrial aldehyde
dehydrogenase in rice increases under submerged conditions. Plant Physiol., October 2000, vol.
124, p. 587598.
176.
Nandi O.I. et al. A combined cladistic analysis of angiosperms using rbcL
andnonmolecular data sets. Ann. Mol. Bot. Garden, 1998, vol. 85, p. 137212.
177. Nandini R., Chikkadevaiah. DNA fingerprinting of sunflower genotypes (Helianthus
annuus L.). HELIA, 2005, vol. 28, nr. 42, p. 9-18.
178.
Nasralah J.B. Recognition and rejection of self in plant reproduction. Science, 2002, vol.
296, p. 305308.
179.
Newton K.J. Plant mitochondrial genomes: organization, expression and variation.
Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 1988, vol. 39, p. 503532.
180.
Nikova V., Vladova R. Wild Nicotiana species as a source of cytoplasmic male sterility
in Nicotiana tabacum. Contrib. Tobacco Res., 2002, vol. 20, p. 301311.

181.
Nishikawa M. et al. Electrical charge on protein regulates its absorption from the rat smal
intestine. Am J. Physiol Gastr. Liver Physiol., 2002, vol. 282, p. 711719.

182.
Olivieri A.M. et al. Self-sterility and incompatibility in sunflower. In: Proc 12th Int .
Sunflower Conf. Int Sunflower Assoc, Paris, 1988, p. 339343.

183.
Orlov P.A., Pyko V.I. Green and albino plant regeneration in anther culture of aloplasmic
wheat lines. Proc. Intern. Congr. Anther and pollen: from biology to biotechnology. SpriglerVerlag, 1999. p. 229236.
184.
Palmer J.D., Shields C.R. Tripartite structure of Brassica campestris mitochondrial
genome; Nature (London), 1984, vol. 307, p. 437-440.

185.
Pring
D.R.,
Van-Tang
H.
Mitochondrial
atp6
transcript
editing
during
microgametogenesis in male-sterile sorghum. Curr. Genet., 2001, vol. 39, p. 371376.

186.
Prioli L.M. et al. The plant mitochondrial open reading frame orf221 encodes a
membrane bound protein. Plant Mol. Biol., 1993, vol. 23, p. 287295.
187.
Pruitt K.D., Hanson M.R. Transcription of the Petunia mitochondrial CMS-associated
Pcf locus in male sterile and fertility-restored lines. Mol Gen. Genet., 1991, vol. 227, p. 348-355.
109
188.
Pvigila D. Genetic diversity (RAPD) in natural Lithuanian populations of common ash
(Fraxinus excelsior L.). Biologija, 2005, nr. 3, p. 4653.

189.
Quetier F. et al. Molecular organization and expression of the mitochondrial genome
of higher plants; in Encyclopedia of Plant Physiology (eds) R Douce and D A Day (Berlin:
Springer-Verlag), 1985, vol. 18, p. 25-36.
190.
Rathburn ., Hedgcoth C. Maize S1 and S2 sequences in wheat mitochondrial DNA;
Plant Sci., 1992, vol. 85, p.151-160.

191.
Reddy P.S., Raju B.T. Inheritance of fertility restoration in sunflower
(Helianthus
anuuus L.). Euphytica, 1977, vol.26, p. 409-412.

192.
Reva V., Ciobanu V., Grigorcea P. Electroforeza proteinelor si polipeptidelor. Chisinau,
1999, 111 p..

193.
Rhoads D.M. et al. URF13, a ligand-gated, pore-forming receptor for T-toxin in the inner
mem brane of cms-T mitochondria. J. Bioenerg. Biomembr., 1995, vol. 27, p. 437445.
194.
Rieseberg L.H. et al. Hybrid speciation accompanied by genomic reorganization in wild
sunflowers. Nature, 1995, vol. 375, p. 313316.

195.
Rottmann W.H. et al. A mitochondrial gene is lost via homologuous recombination
during reversion of cms T maize to fertility; EMBO J., 1987, vol. 6, p. 1541-1546.
196.
Sabar M. et al. ORFB is a subunit of F1FO-ATP synthase: Insight into the basis of
cytoplasmic male sterility in sunflower. EMBO Rep., 2003, vol. 4, p. 16.

197.
Sabar M., De Paepe R., de Kouchkovsky Y. Complex I impairment, respiratory
compensations, and photosynthetic decrease in nuclear and mitochondrial male sterile mutants of
Nicotiana sylvestris. Plant Physiol., 2000, vol. 124, p. 12391249.
198.
Sambrook J., Russell D.W. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 2001, vol. 1, 2222p.

199.
Sarria R. et al. A CMS-associated mitochondrial peptide in common bean is post-
translationaly regulated. Plant Cell, 1998, vol. 10, p. 12171228.

200.
Schmulling T., Schell J., Spena A. Single genes from Agrobacterium rhizogenes
influence plant development; EMBO J., 1988, vol. 7, p. 2621-2629.

201.
Schnable P.S., Wiser P. The molecular basis of cytoplasmic male sterility and fertility
restoration. Trends Plant Sci., 1998, vol. 3, p. 175180.

202.
Schneiter A.A. Production of semidwarf and dwarf sunflower in the northern Great
Plains of the United States. Field Crops Res. 1992, vol. 30, p. 391401.
203.
Schopfer C.R., Nasralah M.E., Nasralah J.B. The male determinant of self-
incompatibility in Brassica. Science, 1999, vol. 286, p. 16971700.

110
204.
Seiler G.T., JAN C.C. New
fertility restoration gene from wild sunflowers for
sunflower JPETj male sterile cytoplasm. Crop Sci., 1994, vol. 34, nr. 6, p. 1526-1529.
205.
Senda M. et al. Genomic organization and sequence analysis of the cytochrome oxidase
subunit II gene from normal and male sterile mitochondria in sugar beet. Curr. Genet., 1991,
vol.19, p. 175-181.
206.
Serieys H. Report on the past activities of the FAO working group 'Identification,
study and utilization in breeding programs of new CMS sources" for the period 1991-1993.
Helia, 1994, vol. 17, nr. 21, p. 93-102.
207.
Serieys H. Identification, study and utilization in breeding programs of new CMS
sources. In.: F.A.O. Progress report of the working group. VII Consultation of European
Cooperative Research Network on Sunflower. Pisa (Italy), 1991, p. ll-13.
208.
Serieys H., Vincourt P. Characterization of some new CMS sources from Helianthus
genus. Helia, 1987, vol. 10, p. 9-13.

209.
Sicullela L., Palmer J. Physical and gene organization of mitochondrial DNA in Fertile
and Male Sterile sunflower. CMS-associated alteration in structure and transcription of the atpA
gene. University of Michigan, 1988, vol. 16. nr. 9, p. 3787-3797.
210.
Singh M. et al. Nuclear genes associated with a single Brassica CMS restorer locus
influence transcripts of three different mitochondrial gene regions. Genetics, 1996, vol. 143, p.
505516.
211.
Singh M., Brown G.G. Suppression of Cytoplasmic Male Sterility by Nuclear Genes
Alters Expression of a Nove1 Mitochondria Gene Region. The Plant Cell, 1991, vol. 3, p. 13491362.
212.
Skibbe D.S. et al. Characterization of the aldehyde dehydrogenase gene families of Zea
mays and Arabidopsis. Plant Mol. Biol., 2002, vol. 48, nr. 56, p. 751764.
213.
Skoric D. Sunflower breeding. J. of Edible Oil Industry, 1988, vol. 25, nr.1, p.190.
214.
Skulachev V.P. Cytochrome c in the apoptotic and antioxidant cascades. FEBS Lett.,
1998, vol. 423, nr. 3, p. 27580.

215.
Sladek N.E. Metabolism of oxazaphosphorines. Pharmacol Ther, 1988, vol. 37, p. 301
355.
216.
Smal I.D., Peeters N. The PPR motif a TPR-related motif prevalent in plant organellar
proteins. Trends Biochem. Sci., 2000, vol. 25, p. 4647.

217.
Smart C.J. et al. Cell-Specific Regulation of Gene Expression in Mitochondria during
Anther Development in Sunflower. The Plant Cell, 1994, vol. 6, p. 811-825.
111
218.
Smith M.B., Palmer R.G., Horner H.T. Microscopy of a cytoplasmic male-sterile soybean
from an interspecific cross between glycine max and g. soja (leguminosae). American Journal of
Botany, 2002, vol. 89, nr. 3, p. 417426.
219.
Sonali D.G. et al. The self-incompatibility locus (S) and quantitative trait loci for self-
pollination and seed dormancy in sunflower. Theor. Appl. Genet. 2005, vol. 111, p. 619629.
220.
Song J., Hedgcoth C. A chimeric
gene (orf256) is expressed as protein only in
cytoplasmic male-sterile lines of wheat. Plant Molecular Biology. 1994, vol. 26, p.535-539.
221.
Srivastava H.K. Nuclear control and mitochondrial transcrip tprocessing with relevance
to cytoplasmic male sterility in higher plants. Current Science, 2000, vol. 79, nr. 2, p. 176-201.
222.
Stern D.B., Palmer J.D. Tripartite mitochondrial genome of spinach: physical structure,
mitochondrial gene mapping and locations of transposed chloroplast chloroplast DNA

sequences. Nucleic Acids Res., 1986, vol. l4, p. 5651-5666.
223.
Tang H.V. et al. Transcript processing internal to a mitochondrial open reading frame is
correlated with fertility restoration in male-sterile sorghum. Plant J., 1996, vol. 10, p.123133.
224.
Tang H.V., Chang R., Pring D.R., Co-segregation of single genes associated with fertilitz
restoration and transcript processing of sorghum mitochondrial orf107 and urf209. Genetics,
1998, vol. 150, p. 383-391
225.
Vasile Siminel. Ameliorarea special a plantelor agricole. Chiinu, 2004, p. 301324.
226.
von Almen J.M. et al. Transfer of methomyl and hmt-toxin sensitivity from T-cytoplasm
maize to tobacco. Mol. Gen. Genet., 1991, vol. 229, p. 405412.

227.
Vrnceanu A.V. et al. Some aspects of the interaction Helianthus annuus L. /Orobanche
cumana Walr. and its implication in sunflower breeding. Ed. Wageningen. Proceeding of a
workshop on biology and control of Orobanche, Netherlands, 1986, p. 181-189.
228.
Vrnceanu A.V. i col. Influena diferiilor factori genetici i de mediu asupra
autocompatibilitii polenului la floarea-soarelui. Genetica, 1979, vol. XLIV, p. 15-28.

229.
Vrnceanu A.V., Stoenescu F.M. Genes for pollen fertility restoration in sunflowers.
Euphytica, 1978, vol. 27, p. 617-627.

230.
Vrnceanu A.V., Stoenescu F.M. Manifestarea heterozisului la hibrizii simpli, triliniari si
dubli de floarea-soarelui. Analele I.C.C.P.T., 1971, vol. 34, p. 2-8.

231.
Vrnceanu A.V., Stoenescu F.M. Studii de lincaje ntre gene ms i diferite gene marker la
floarea soarelui //Ann ICCPT - Fundulea, 1977, -V.XLII, -P.15-21.

232.
Vulpe V. Surse de androsterilitate la floarea soarelui. Anal. I.C.C.P.T., 1972, vol. 38, p.
273-277.
112
233.
Wahleithner J.A., Wolstenholme D.R. Ribosome protein S14 in broad bean
mitochondrial DNA; Nucleic Acids. Res., 1987, vol. 16, p. 6897-6913.

234.
Wang Z. et al. Cytoplasmic Male Sterility of Rice with Boro II Cytoplasm Is Caused by a
Cytotoxic Peptide and Is Restored by Two Related PPR Motif Genes via Distinct Modes of
mRNA Silencing. Plant Cell, 2006, vol. 18, nr. 3, p. 676687.
235.
Ward B.L., Anderson R.S., Bendich A.J. The mitochondrial genome is large and variable
in a family of plants (Cucurbitaceae). Cell, 1981, vol. 25, p. 793-803.

236.
Warmke H.E., Lee S. Pollen abortion in T cytoplasmic male-sterile corn (Zea mays): A
suggested mechanism. Science, 1978, vol. 200, p. 561-563.

237.
Waters M.F., Mclennan A.G., CARR N.G. Purification and Activity Gel Analysis of
Polynucleotide Phosphorylase from the Cyanobacterium Nostoc sp. MAC. Journal of General
Microbiology, 1989, vol.135, p. 2045-2054.
238.
Watson J.D., Crick F.H.C. Molecular structure of nucleic acids. Nature. 1953, vol. 171, p.
737-738.
239.
Wen L.Y., Chase C.D. Mitochondrial gene expression in developing male gametophytes
of malefertile and S malesterile maize. Sex Plant Reprod., 1999, vol. 11, p. 323330.
240.
Whelan E.D.P. CMS in Helianthus giganteus L. X H. Annuus L. Interspecific hibrids.
Crop. Science, 1981, vol. 21, p. 855-858.

241.
Whelan E.D.P., Dedio W. Registration of sunflower germplasm compositae crosses
CMG1, CMG2, CMG3. Crop Science, 1980, vol. 20, 832 p.

242.
Williams J.G.K. et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful
as genetic markers. Nucl. Acid Res., 1990, vol. 18, p. 6531-6535.

243.
Wise R.P. et al. Urf13-T of T-cytoplasm maize mitochondria encodes a 13 kd
polypeptide. Plant Mol. Biol., 1987, vol. 9, p. 121126.

244.
Wise R.P., Dill C.L., Schnable P.S. Mutator-Induced
Mutations of the rjl Nuclear
Fertility Restorer of T-Cytoplasm Maize Alter the Accumulation of T-urjl3 Mitochondrial

Transcript. Genetics, 1996, vol. 143, p. 13831394..
245.
Wissinger B. et al. The NADH-dehydrogenase subunit 5 gene in Oenothera mitochondria
contains two introns and is cotranscribed with the 5S rRNA gene. Mol. Gen. Genet., 1988, vol.
212, p. 56-65.
246.
Xiao H., Zhang F., Zheng Y. The 5' stemloop and its role in mRNA stability in maize S
cytoplasmic male sterility. Plant J. 2006, vol. 47, nr. 6, p. 864872.

247.
Xue Y.B., Carpenter R., Dickinson H.G., COEN E.S. Origin of alelic diversity in
Antirrhinum S locus RNases. Plant Cell, 1996, vol. 8, p. 805814.

113
248.
Yasumoto K. et al. Genetic and molecular analysis of the restoration of fertility (Rf)
genes for Ogura malesterility from a Japanese wild radish (Raphanus sativus var. hortensis f.
Raphanistroides Makino). Euphytica, 2008, vol. 164, p. 395404.
249.
Yen Y., Green P.J. Identification and Properties of the Major Ribonucleases of
Arabidopsis thaliana. Plant Physiol., 1991, vol. 97, p. 1487-1493.

250.
Young E.G., Hanson M.R. A fused mitochondrial gene associated with cytoplasmic male
sterility is developmentaly regulated. Cell, 1987, vol. 50, nr. 1, p. 4149.

251.
Yu J. et al. Towards a Saturated Molecular Genetic Linkage Map for Cultivated
Sunflower. Crop Sci., 2003, vol. 43, p. 367-387.

252.
Zabala G. et al. The nuclear gene Rf3 affects the expression of the mitochondrial
chimeric sequence R implicated in S-type male sterility in maize. Genetics, 1997, vol. 147, p.
847860.
253.
Zhang J., Stewart J. Identification of Molecular Markers Linked to the Fertility Restorer
Genes for CMS-D8 in Cotton., Crop Sci., 2004, vol. 44, p. 12091217.
254.
Zhang Z. et al. AFLP and PCR-based markers linked to Rf3, a fertility restorer gene for S
cytoplasmic male sterility in maize. Mol. Gen. Genomics, 2006, vol. 276, p. 162169.
255.
Zhang Z. et al. Fertility Restoration Mechanisms in SType Cytoplasmic Male Sterility
of Maize (Zea mays L.) Revealed Through Expression Differences Identified by cDNA
Microarray and Suppression Subtractive Hybridization. Plant Molecular Biology Reporter. 2005,
vol. 23, p. 1738.
256.
.., ..
- . , 1984, . 4, . 5-7.
257.
.. //.
. , 1977, N1, .14-20.

258.
.., ..
.- .:
, . , 1971.
259.
.. . , 1979, . , 414 .
260.
..
, . 1, 1996 . 17-22.
261.
.. .
, 1972, .24, . 18-26.
114
262.
.., ..
Rf\ Rf2 //. . ,

, 1977, -. 60, . 2, . 6-15.
263.
..,
. , . , 2001, 172 .
264.
.. . :
, 1986, 160.
265.
.. . ,
1969, 208.
266.
.., .., ..

. , 2005, 9, . 4, . 499-504.
267.
.., ..
. , 1974, N1, .
29-34.
268.
(H. annuus L.). . ., 1992, -.25, N6, . 451-458.

269.
..
.- .'. . .,
1971,-. 112-155.
270.
.. ,
. . 1998, .1, . 61-64.

Surse web
271.
http://en.wikipedia.org/wiki/Cytoplasmic_male_sterility (vizitat 3.06.2008).
272.
http://www.195.178.207.138/projects/newsite/lections_2008/2008Protein
conformation.pdf (vizitat 18.02.2009).

273.
http://www.clcbio.com (vizitat 11.02.2009).
274.
http://www.ddbj.nig.ac.jp/searchese.html (vizitat 11.02.2009).
275.
http://www.ebi.ac.uk/phobius/ (vizitat 11.02.2009).
276.
http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2 (vizitat 11.02.2009).
277.
http://www.expasy.org/ (vizitat 11.02.2009).
278.
http://www.expasy.org/spdbv/ (vizitat 11.02.2009).
115
279.
http://www.genwaybio.com/product_info.php.products_id=5006&osCsid=7ea2ebff88bdb
9d2918e749fa142eccf (vizitat 11.02.2009).

280.
http://www.life.illinois.edu/zhuang/Genebank98.html (vizitat 11.02.2009).
281.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov (vizitat 11.02.2009).
282.
http://www.pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php (CAP 3) (vizitat 11.02.2009).
283.
http://www.publicsafety.gc.ca/prg/cor/tls/dnaeng.aspx (vizitat 11.02.2009).
284.
http://www.sigmaplot.com/products/tablecurve2d/ (vizitat 11.04.2009).
285.
http://www.swissmodel.expasy.org/woekspace/index.php (vizitat 11.04.2009).
116
Anexa 1
117
DECLARAIA PRIVIND ASUMAREA RSPUNDERII

Subsemnatul, Midoni Andrei, declar pe propria rspundere c materialele prezentate n
teza de doctorat sunt rezultatul propriilor cercetri i realizri tiinifice. Contientizez c, n caz
contrar, urmeaz s suport consecinele, n conformitate cu legislaia n vigoare
Midoni, Andrei
Semntura
29.11.2010
118
CURRICULUM VITAE
Nume, Prenume: MIDONI Andrei
Data i locul naterii: 10.08.1982, or. Norilsk, Federaia Rus
Cetenia: Moldovean
Studii:
2006-2009 Doctorand la Facultatea de Biologie i Pedologie
(specialitatea Genetic), Universitatea de Stat din Moldova;
2001-2005 Univ. Al. I. Cuza, Faculatatea de Biologie, specializarea Ecologie i Protecia
Mediului, jud. Iai, Romnia;
1997-2001 Liceul teoretic Spiru Haret, specialitatea Chimie-Biologie, jud. Bacu,
Romnia.
Domenii de activitate tiiinific:
Genetic, Genetic Molecular, Bioinformatic, Statistic.
Activiti pofesionale:
01.09.2009 - prezent Cercettor la Universitatea Academiei de tiine a Moldovei;
2006-2009 Doctorand la Facultatea de Biologie i Pedologie (specialitatea Genetic).
Participari n proiecte tiintifice naionale i internaionale:
2007-2009 Membru al proiectului Controlul genetic al restaurrii androfertilitii
la
diferite genotipuri de floarea-soarelui cu ASC;

2006 Partipant n cadrul Proiectului Instituional Cercetarea variabilitii la unele plante
de cultur.
Participari la foruri tiinifice internationale:
2007, 2008 Participri la conferinele Internaionale a Tinerilor Cercettori.
Lucrari tiinifice publicate: 11 lucrri tiinifice, dintre care 5 fr coautori, 3 in cadrul
conferinelor internaionale.
Limbi strine:
limba romn: limba matern;
limba englez: scris-vorbit bine;
limba rus: scris-vorbit foarte bine.
Date de contact:
Universitatea Academiei de tiine a Moldovei;
str. Academiei 3/2, MD2028, mun. Chisinau; tel. 738409; Mobil: 069151924;
E-mail: lyon1728@yahoo.com
119

Andrei Midoni Thesis

Enviado por

Dados do documento

Direitos autorais

Formatos disponíveis

Compartilhar este documento

Compartilhar ou incorporar documento

Opções de compartilhamento

Você considera este documento útil?

Este conteúdo é inapropriado?

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

Andrei Midoni Thesis

Enviado por

Direitos autorais:

Formatos disponíveis

ACADEMIA DE TIINE A MOLDOVEI

UNIVERSITATEA DE STAT DIN MOLDOVA

IDENTIFICAREA I EXPRESIA UNOR GENE (Rf) LA

Duca Maria, dr. hab. biol.,

Midoni Andrei, 2010

1.1. Aspecte privind androsterilitatea citoplasmatic

1.1.1. Diversitatea molecular a androsterilitii citoplasmatice (ASC)

1.1.2. Localizarea genelor rspunztoare de ASC

1.1.3. Structura genelor androsterilitii citoplasmatice

1.1.4. Efectele induse de genele ASC

1.2. Analiza genetico-molecular a genelor restauratoare de fertilitate

1.2.1. Diversitatea genelor restauratoare de fertilitate (Rf)

1.2.2. Localizarea genelor restauratoare de fertilitate

1.2.3. Structura genelor restauratoare de fertilitate

1.2.4. Rolul genelor Rf n normalizarea proceselor biologice n F1

1.3. Aspeste generale privind sistemele ASC-Rf

1.3.1. Diversitatea sistemelor ASC-Rf

1.3.2. Interaciunea la diferite nivele a componentelor sistemului ASC-Rf

1.4. Concluzii la capitolul 1

2. MATERIALUL I METODELE DE CERCETARE

2.1. Material de cercetare

2.2. Metodele de cercetare

2.2.1. Determinarea indicilor morfo-fiziologici

2.2.2. Izolarea i electroforeza proteinelor

2.2.3. Izolarea i electroforeza ADN-lui

2.2.4. Analiza RAPD

2.2.5. Analiza CAPS

2.2.6. PCR cu primeri specifici

2.2.7. Metode bioinformatice de analiz

2.2.8. Analiza statistic a datelor

2.3. Concluzii la capitolul 2

3. EVALUAREA PARAMETRILOR MORFOLOGICI LA FORMELE STERILE,

3.1. Analiza unor parametri cantitativi

3.2. Evaluarea autocompatibilitii polenului

3.3. concluzii la capitolul 3

4. PARTICULARITI DE INTERACIUNE A PRODUILOR DE EXPRESIE

4.2. Caracteristica proteinelor asociate cu ASC i Rf

4.3. Localizarea celular a proteinelor asociate cu ASC i Rf

4.4. Modele de interaciune nucleu citoplasm la diverse specii de plante

4.5. Elaborarea modelului ipotetic al enzimei polinucleotid-fosforilaza

4.6. Concluzii la capitolul 4

5.1.1. Diversitatea genetic evalut n baza primerilor RAPD-OPG 10

5.1.2. Diversitatea genetic evalut n baza primerilor RAPD-OPI 16

5.1.3. Diversitatea genetic evalut n baza primerilor RAPD-OPH 15

5.2. Screening-ul prezenei genelor Rf

5.3. Motenirea genelor Rf

5.4. Testarea prezenei la genotipurile de floarea-soarelui (PET-1) a markerilor lincai cu

genele Rf3 (porumb ASC-S)

6.3. Analiza proteinelor sumare din polen

6.4. Mecanismul de aciune a genelor de restaurare a fertilitii polenului

6.5. Concluzii la capitolul 6

Rf3- ( ) (Rf F1);

Rf2 depistat n majoritatea liniilor fertile, inclusiv i n genotipurile menintoare de

mecanism ipotetic privind interaciunea componentelor sistemului ASC-Rf la diverse specii de

SUMARUL COMPARTIMENTELOR TEZEI

la diverse specii de plante. De asemenea a fost elaborat un model ipotetic al enzimii

1. SISTEMUL GENETIC ASC-Rf LA PLANTE

1.1. Aspecte privind androsterilitatea citoplasmatic

Diversitatea molecular a androsterilitii citoplasmatice (ASC)

Apariia androsterilitii citoplasmatice poate avea variate cauze:

ASC ce cuprinde o secven de ADN, care codific un produs citotoxic;

n urma expresrii n esutul tapetal a unor ribonucleaze etc.

Ideea de baz, n ceea ce privete apariia androsterilitii citoplasmatice este determinat

androsterilitatea citoplasmatic aprut spontan (din Helianthus annuus L. slbatic)