Universidad Nacional Jose Faustino Sanchez Carrion

LOS MEDIOS DE CULTIVOS EN MICROBIOLOGIA

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su
crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material
alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los
microorganismos es el Cultivo. Se han preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una
serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuado,
as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los
nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo

contaminante.
La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en composicin a
los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una
infusin de extractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros ingredientes.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se lica
completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas
excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen
en l.

La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias
provocan su licuacin.
En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como
hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por
dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar
reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la
sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos
resistentes.
Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la
formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo
Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de
Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Grampositivas).

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PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

Fundamento
El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables
para el crecimiento de los microorganismos. La composicin precisa
depender de la especie que se quiera cultivar, porque las necesidades
nutricionales varan considerablemente. Hay microorganismos muy
poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normales y
microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas sustancias
como vitaminas, suero o sangre para crecer.

Existen medios cuya composicin permite el crecimiento de:

1. un gran nmero de especies (agar nutritivo, caldo ordinario, agar de
Sabouraud),
2. determinados microorganismos (impidiendo el desarrollo de otros), son los
denominados medios selectivos.
3. Otros en cambio, se desarrollan para el estudio de determinadas
pruebas fisiolgicas o test bioqumicos (utilizacin de citratos, acidificacin a
de azcares, etc.).

partir

Los medios de cultivo poseen una serie de componentes:

1.
Indispensables: Entre los primeros se incluye el agua, nutrientes orgnicos (hidratos de
carbono, aminocidos, vitaminas, etc) y nutrientes inorgnicos (P, Fe, N, Mg, S, etc)

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2.
Alternativos: sustancias isosmotizantes (NaCl), agente solidificante (agar-agar), tampones,
indicador de pH, etc.

Durante las prcticas se van a manejar medios de cultivo de composicin muy variada y de tres
tipos diferentes en cuanto a consistencia: medios slidos, semislidos y lquidos. Este ltimo
aspecto es importante a la hora de la preparacin de los mismos. Aunque los medios artificiales o
sintticos se pueden preparar a partir de sus componentes individuales, se pueden adquirir
comercialmente como medios deshidratados a los que solamente hay que aadir la cantidad de
agua necesaria. El fabricante indica la composicin, la caducidad, y la cantidad que debe pesarse
por cada litro a preparar e incluso como debe esterilizarse.

COLORACIONES
Coloracin Simple:
Consiste en hacer actuar sobre la preparacin fijada un solo colorante (Azul de Metileno,
Safranina, Fucsina diluda al 10%, etc).
Tcnica
a) Cubrir la preparacin con el colorante b) Dejar actuar por 1 - 2 minutos c) Lavar con agua
corriente d) Secar con papel absorbente y luego a la llama suave ( sin quemar ) e) Observar con el
condensador arriba y con objetivo de inmersin
Coloracin Doble:
Consiste en hacer actuar 2 colorantes diferentes, con una decoloracin intermedia, sobre una
preparacin fijada. La coloracin doble consta en general de 4 pasos: - Coloracin primaria Adicin de un mordiente, que es una sustancia que aumenta la afinidad o atraccin clula
colorante. La bacteria se tie ms intensamente bajo la accin del mordiente, siendo mucho ms
difcil lavar el colorante posteriormente. Ejemplos de mordientes son algunos cidos, bases, sales
metlicas y solucin yodo-yodurado - Decoloracin - Tincin con colorante de contraste
2.1. Tincin de Gram: es la coloracin ms empleada en bacteriologa por su gran utilidad en la
clasificacin de las bacterias. Descubierta por Christian Gram (1884), mientras desarrollaba una
tincin para bacterias en tejidos, descubri un mtodo de tincin diferencial para las bacterias.
Esta tincin es de gran utilidad ya que permite una clasificacin taxonmica de las bacterias, en
Gram positivas y negativas, que se relaciona adems con otras propiedades morfolgicas
Tcnica

Teir la preparacin ya fijada con Cristal Violeta durante 2 minutos

Eliminar el exceso de colorante y cubrir con Lugol durante 1 minuto (mordiente)
Decolorar rpidamente con Alcohol Acetona
Lavar con agua corriente (en este momento las bacterias Gram positivas estn teidas de
color violeta y las Gram negativas estn decoloradas)
Teir con Fucsina fenicada durante 30 segundos
Lavar con agua corriente
Secar con papel absorbente y luego a la llama suave ( sin quemar )

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Observar con el condensador arriba y con objetivo de inmersin

Las bacterias Gram positivas se tien de color Violeta y las Gram negativas de color Rojo.

Tincin diferencial
Las tinciones diferenciales se utilizan ampliamente en microbiologa; consisten en la aplicacin de
dos colorantes que contrastan en su intensidad o color y un paso intermedio que provoca una
respuesta diferente entre microorganismos distintos o entre determinadas clulas dentro de una
poblacin. La diferenciacin puede ser provocada por un agente qumico o fsico, permitiendo
observar dos tipos de respuestas diferentes a la tincin en una misma muestra. Las dos tinciones
diferenciales ms utilizadas en bacteriologa son la tincin de gram y la tincin de cido alcohol
resistencia.
Tincin de Gram Esta tincin diferencial fue propuesta por el medico dans Christian Gram(1884)
(TORTORA et al., 2007) que examinando tejido pulmonar de enfermos fallecidos por neumona
observ que la bacteria Streptococcus pneumoniae, presente en los pulmones, retena el colorante
conocido como marrn Bismark(sustituido posteriormente por el cristal violeta),mientras que el
tejido pulmonar no era capaz de retener el colorante.
Tinciones supra vitales
Las tinciones supravitales, son aquellas que se realizan sobre las clulas o tejidos vivos. Pero que
estn aislado del organismo del que pertenecen.

LOS MEDIOS DE CULTIVOS

Los ms comunes son los siguientes:
Agar nutritivo: Este medio es bastante bueno para el cultivo de grmenes que no
presentan exigencias particulares. No es diferencial.
Agar sangre: Es un medio enriquecido que se utiliza adems para la investigacin de
los diversos tipos de hemlisis(, gamma ). Se utiliza para el crecimiento de
estreptococos. Para la preparacin del agar sangre se puede utilizar el agar nutritivo
enriquecido con cloruro sdico o un preparado enriquecido con otras sustancias como
Columbia o el tripticase de soja. La adicin de sangre a un medio de cultivo no
proporciona las sustancias que estn en el interior de los hemates, pero s puede
aadir factores inhibidores del crecimiento bacteriano presentes en el suero. Este es
un inconveniente que puede solucionarse calentando la sangre para romper los
eritrocitos y para que se destruyan las sustancias inhibidoras, que son termolbiles.La
sangre utilizada como aditivo a estos medios suele ser sangre de carnero diluida al 5%,
pero en algunas ocasiones es necesario utilizar sangre de otras especies (caballo,
conejo, humana), pues facilitan las reacciones hemolticas o contienen determinados
factores de enriquecimiento o no poseen sustancias inhibidoras del crecimiento de
determinados grmenes. Agar chocolate: El agar chocolate se obtiene calentando la
sangre antes de adicionarla al medio base. Por esta razn el agar chocolate contiene
hemoglobina, que aporta al medio un importante elemento para el crecimiento: el
factor X o hemina termoestable. El agar chocolate es un medio destinado
principalmente al aislamiento de Neisserias (gonococos ymeningococos) y
Haemophilus, pero en l pueden crecer muchos otros microorganismos exigentes. El

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agar chocolate puede convertirse quizs en uno de los medios ms enriquecidos si
aadimos una mezcla de factores de crecimiento no contenidas en la sangre. Estas
mezclas, denominadas de forma diferente segn las casas comerciales (Polivitex,
Isovitalex, etc.) contienen ms de una docena de compuestos que confieren a este
medio unas cualidades nutritivas extraordinarias. Por adicin de uno o varios
antibiticos pueden lograrse medios inhibidores o selectivos para el crecimiento de
determinados microorganismos. Un ejemplo clsico es el Thayer-Martin, utilizado para
el aislamiento del gonococo y que no es otra cosa que un agar chocolate enriquecido
al cual se ha aadido unamezcla de tres antibiticos especficos que impedirn el
crecimiento del resto de la flora acompaante. Agar MacConkey: Es un medio utilizado
para el aislamiento e identificacin de enterobacterias. Es un medio inhibidor de los
grmenes Gram positivos por su contenido en cristal violeta y selectivo para
enterobacterias por su contenido en sales biliares. En su composicin lleva un azcar
(lactosa) y un indicador (rojo de metilo) que lo convierten en un medio diferencial. Los
grmenes que fermenten la lactosa producen una acidificacin del medio que hacen
aparecer de color rojo fuerte a las colonias resultantes. Las colonias lactosa negativas
sern incoloras, apareciendo del mismo color que el medio subyacente (naranja).
Agar C.L.E.D.: El medio C.L.E.D. (Cistina Lactosa Electrlito Deficiente) est
recomendado para el recuento e identificacin presuntiva de los microorganismos de
las vas urinarias. Su bajo contenido en electrolitos evita la invasin de los cultivos por
Proteus.La presencia de lactosa en su composicin le confiere el carcter de medio
diferencial, aunque la interpretacin sea diferente al anterior medio por la
incorporacin de otro indicador: el azul de bromotimol. Las colonias lactosa positivas
aparecern de color amarillo y las lactosa negativas lo harn con un color verdoso,
blanco o azulado.
Agar S.S.:El agar SS es un medio selectivo empleado para el aislamiento de
Salmonella y Shigella a partir de muestras fecales. El medio contiene sales biliares y
verde brillante para impedir el crecimiento de coliformes y grmenes Gram positivos.
La presencia de lactosa y rojo de metilo nos permiten diferenciar las colonias que
fermentan la lactosa (rosas o rojas) de las que no lo hacen (incoloras).Las especies de
Salmonella y Shigella no fermentan nunca la lactosa por lo que este medio es
excelente para descartar todas las colonias que no cumplan este requisito. El agar SS
es doblemente diferencial, porque adems de indicarnos el comportamiento de los
grmenes con relacin a la lactosa, nos muestra los grmenes que son capaces de
producir cido sulfhdrico, que se manifiesta como un precipitado de color negro en el
centro de la colonia. As, una colonia incolora y con un punto negro central es
sospechosa de Salmonella, y ser exclusivamente a estas colonias a quienes se hagan
las pruebas bioqumicas confirmatorias de esta especie. El agar SS es un medio muy
inhibidor que a veces impide incluso el crecimiento de ciertas especies de Salmonella y
sobre todo de Shigella. Por esta razn debe utilizarse siempre junto con otro medio
menos inhibidor como el Hektoen.
Agar Hektoen :Es un medio ms diferencial y menos selectivo que el agar SS. Se
utiliza para facilitar el aislamiento de las enterobacterias. La presencia de tres
azcares (lactosa, sacarosa y salicilina ) permiten ampliar el poder diferencial de este
medio. Este medio es capaz de detectar los grmenes formadores de SH2, igual que el
SS. Las cualidades del agar Hektoen se deben a su riqueza en peptonas y azcares,
que neutralizan el efecto inhibidor de las sales biliares respecto a ciertos grmenes de

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cultivo delicado (Shigella en particular).El crecimiento de Salmonella es excelente,
igual que el de Shigella, obtenindose colonias ms numerosas y voluminosas que en
los medios selectivos usuales. La inhibicin tiene lugar, esencialmente, sobre E. coli y
en menor medida sobre Proteus y Citrobacter. Hay que sealar que el vibrin colrico
crece bien en este medio.
C.P.S. ID3. :Medio cromognico desarrollado por Biomerieux, que permite la
identificacin de E. coli, P. mirabilisy E. faecalis, con la simple visualizacin del cambio
de color de la colonia sobre el medio (rojo burdeos, azulo marrn). La identificacin
solo requiere la adicin de un reactivo para confirmar o descartar la especie
sospechada. Otros microorganismos diferentes requieren los sistemas de identificacin
habituales (API, p. ej) Granada, Islam o New GBS: Medios utilizados para deteccin de
Streptococcus agalactiae, mediante la utilizacin de un sustrato cromognico
especfico de este microorganismo.
Agar Mueller-Hinton: Es el medio universalmente aceptado para la realizacin de los
antibiogramas o pruebas de sensibilidada los antimicrobianos. A l nos referiremos
ms ampliamente en el captulo correspondiente

Agar Tripticase de soja: Es un medio utilizado para el crecimiento de grmenes

exigentes, como Brucella, Neisseria o Streptococcus. Es un medio muy enriquecido,
pero no es diferencial. Caldo tioglicolato con resazurina: Es un medio recomendado
para controles de esterilidad. Permite el cultivo de aerobios, anaerobiosy
microaerfilos. Tiene un bajo potencial redox que, al aumentar, se manifiesta por un
color rosa del medio.
Agar Chapman: Es un medio selectivo para el aislamiento de estafilococos. Su
elevado contenido en cloruro sdico permite la inhibicin de la mayora de los otros
grmenes. La presencia de manitol y rojo fenol convierten a este medio en diferencial:
as se puede identificar presuntivamente el Staphylococcus aureus, ya que estegrmen
crece bien en medios salados y fermenta el manitol (colonias amarillas).
Agar Baird-Parker: Permite el crecimiento de estafilococos coagulasa positivos, a la
vez que los diferencia del resto.
Medio de Loeffler: Es un medio especfico para el cultivo de Corynebacterium
difteriae.
Agar Desoxicolato Citrato Lactosa Sucrosa (DCLS): Similar al agar SS. Es un
medio diferencial e inhibidor a la vez.
Agar Kligler: Medio especfico para pruebas de identificacin de enterobacterias.
Aunque de l hablaremos conms detenimiento en el captulo de pruebas de
identificacin bacteriana, podemos ir adelantando que se tratade un medio diferencial
que permite conocer el comportamiento del microorganismo ante dos azcares
(glucosa y lactosa), investigar la formacin de gas y comprobar si el microorganismo
puede producir sulfatoferroso a partir del tiosulfato sdico.
Agar Levine EMB (Eosina azul de metileno): Se utiliza para aislamiento de
enterobacterias, pues impide el crecimiento de Gram positivos y diferencia muy bien a
E. coli, cuyas colonias adquieren un color negruzco con un brillo metlico

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caracterstico. Caldo selenito-F: Se utiliza exclusivamente para enriquecimiento de
Salmonellas.
Agar Cetrimida. Agar King: Permiten el crecimiento de Pseudomonas, inhibiendo
Gram positivos y la mayora de enterobacterias.El segundo pone adems de manifiesto
la pigmentacin fluorescente de Pseudomonas bajo luz UV.
Agar Schaedler: Es un medio con sangre y vitamina K muy adaptado para el cultivo
de anaerobios.
Agar Gardnerella: Agar con sangre humana ms una mezcla de antibiticos que
permiten la observacin de colonias betahemolticas caractersticas de Gardnerella
vaginalis
Campylosel: Se utiliza para el aislamiento de Campylobacter intestinales creciendo a
42 C en microaerofilia.
Agar BCYE (Buffer Charcoal Yeast Extract): Se utiliza para el aislamiento de
bacterias del gnero Legionella
Lwenstein-Jensen: Este medio se utiliza para el cultivo de Mycobacterium
tuberculosis. Contiene verde malaquita parainhibir parcialmente el crecimiento de
otras bacterias. El huevo se utiliza como sustancia de enriquecimiento.

BIBLIOGRAFIA

http://perso.wanadoo.es/sergioram1/medios_de_cultivo.htm
https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-demicrobiologia/indice/preparacion-de-medios-de-cultivo
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm
http://microbiologia3bequipo5.blogspot.pe/2014/10/metodos-y-tecnicas-de-tincion.html

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