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INOVAES METODOLGICAS NA
CONGELAO DE SMEN BOVINO
KARINA ALBERTI
BOTUCATU SO PAULO
FEVEREIRO 2007
INOVAES METODOLGICAS NA
CONGELAO DE SMEN BOVINO
KARINA ALBERTI
BOTUCATU SO PAULO
FEVEREIRO 2007
Alberti, Karina.
Inovaes metodolgicas na congelao de smen bovino / Karina Alberti.
Botucatu : [s.n.], 2007
Dissertao (mestrado) Universidade Estadual Paulista, Faculdade de
Medicina Veterinria e Zootecnia, Botucatu, 2007.
Orientador: Frederico Ozanam Papa
Assunto CAPES: 50504007
1. Bovino - Reproduo
2. Inseminao artificial
CDD 636.208982
iii
FOLHA DE AVALIAO
Data: 23/12/2007
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr.: Frederico Ozanam Papa
Intituio: FMVZ-UNESP-Botucatu
Assinatura:
Julgamento:
Intituio:FMVZ-USP- Pirassununga
Assinatura:
Julgamento:
Julgamento:
Intituio: FOA-UNESP-Araatuba
Assinatura:
Julgamento:
Intituio: FMVZ-UNESP-Botucatu
Assinatura:
Julgamento:
iv
Um agradecimento especial
vi
AGRADECIMENTOS
vii
As minhas amigas de residncia Camila, Carla e Lindsay, pelo ano
inesquecvel de convvio em que construmos uma slida amizade.
Aos meus colegas integrantes do Centro de Biotecnologia em Reproduo
Animal- CERAN em especial ao Jos Antonio DellAqua Jr., pelas
sugestes e colaborao direta durante todo este trabalho.
todos os colegas de ps graduao pelo convvio e cumplicidade durante
todo o perodo em que estivemos juntos.
As minhas amigas, Juliana, Maril, Brunna, Aline, Cristiane pela famlia
que formamos durante nossa estada em Botucatu.
Aos demais Professores do Departamento de Reproduo Animal e
Radiologia
Veterinria,
pelas
oportunidades
pelas
experincias
viii
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 -
Figura 2 -
Figura 3 -
Figura 4 -
Figura 5 -
Figura 6 -
Figura 7 -
Figura 8 -
Figura 9 -
Figura 10-
x
Figura 11-
Figura 12-
Grfico
das
mdias
velocidade
curvilnea
dos
espermatozides
(m/s),
obtidas
por
anlise
computadorizada dos movimentos de smen congelado
aps tempo de estabilizao de 60, 120, 180 e 240
62
minutos.
Grfico das mdias de retilinearidade dos movimentos
espermticos (m/s), obtidas por anlise computadorizada
dos movimentos de smen congelado aps tempo de
63
estabilizao de 60, 120, 180 e 240 minutos.
Figura 13-
Figura 14-
Figura 15-
Figura 16-
Figura 17-
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1-
Tabela 2-
Tabela 3-
Tabela 4-
Tabela 5-
Tabela 6-
Tabela 7-
55
56
56
57
58
58
59
Tabela 8-
Tabela 9-
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
xiii
SUMRIO
1. INTRODUO ............................................................................................... 1
2. HIPTESES ................................................................................................... 5
3.REVISO DE LITERATURA........................................................................... 7
3.1 CRIOPRESERVAO ESPERMTICA ................................................................ 8
3.2 INTERAES DOS COMPONENTES DOS DILUENTES COM A CLULA ESPERMTICA
...................................................................................................................... 13
3.2.1. Ao Crioprotetora........................................................................... 14
3.2.2. Crioprotetores no penetrantes ....................................................... 15
3.2.3 Crioprotetores penetrantes ............................................................... 21
3.3 PLASMA SEMINAL ...................................................................................... 22
3.4 AVALIAO ESPERMTICA........................................................................... 27
3.4.1. Avaliao computadorizada do smen ............................................ 28
3.4.2.Anlise da integridade de membrana plasmtica ............................. 31
4. OBJETIVOS ................................................................................................. 35
5.MATERIAL E MTODOS.............................................................................. 37
5.1 EXPERIMENTO I: EFEITO DE TRS MEIOS DILUENTES, COM OU SEM A
REMOO DO PLASMA SEMINAL. ........................................................................ 38
5.1.1 Local da Pesquisa e Animais............................................................ 38
5.1.2 Colheita do Smen ........................................................................... 39
5.1.3 Avaliaes do Smen Fresco ........................................................... 39
5.1.4 Procedimento Experimental............................................................. 41
5.1.5 Congelao do Smen ..................................................................... 42
5.1.6 Descongelao do Smen................................................................ 42
5.1.7 Avaliao Computadorizada do Smen........................................... 43
5.1.8 Avaliao da Integridade da Membrana Plasmtica......................... 43
5.1.9 Anlise Estatstica ........................................................................... 45
5.2 EXPERIMENTO II: INFLUNCIA DOS DIFERENTES TEMPOS DE ESTABILIZAO
SOBRE AS VARIVEIS ESPERMTICAS PS-DESCONGELAO. .............................. 46
5.2.1 Local da Pesquisa e Animais............................................................ 46
5.2.2 Colheita de Smen .......................................................................... 46
5.2.3 Avaliaes do Smen Fresco .......................................................... 46
5.2.4 Procedimentos Experimentais ......................................................... 47
5.2.5 Congelao do Smen .................................................................... 47
5.2.6 Descongelao do Smen................................................................ 48
5.2.7 Avaliao do Smen Ps - Descongelao...................................... 48
5.2.8.Anlise Estatstica ............................................................................ 50
5. 3 EXPERIMENTO III: EFEITO DE DOIS MEIOS DILUENTES E DA CENTRIFUGAO
SOBRE A FERTILIDADE DE VACAS INSEMINADAS EM TEMPO FIXO............................ 52
5.3.1 Local da Pesquisa e Animais............................................................ 52
5.3.2 Colheita do Smen ........................................................................... 52
5.3.3 Procedimentos Experimentais .......................................................... 52
5.3.4 Analises Estatsticas......................................................................... 54
6. RESULTADOS ............................................................................................. 55
xiv
6.1. EXPERIMENTO I EFEITOS DO MEIO DILUENTE E DA REMOO DO PLASMA
SEMINAL NA CONGELABILIDADE DO SMEN BOVINO.............................................. 56
6.1.1. Efeito dos meios diluentes............................................................... 56
6.1.2 Efeito da remoo do plasma seminal.............................................. 60
6.2. EXPERIMENTO II - INFLUNCIA DOS DIFERENTES TEMPOS DE ESTABILIZAO
SOBRE AS VARIVEIS ESPERMTICAS PS-DESCONGELAO. .............................. 65
6.3. EXPERIMENTO III: EFEITO DE DOIS MEIOS DILUENTES E DA CENTRIFUGAO
SOBRE A FERTILIDADE DE VACAS INSEMINADAS EM TEMPO FIXO............................ 73
7. DISCUSSO ................................................................................................ 75
7.1. EXPERIMENTO I: EFEITOS DO MEIO DILUENTE E DA REMOO DO PLASMA
SEMINAL NA CONGELABILIDADE DO SMEN BOVINO.............................................. 76
7.1.1. Efeito dos meios diluentes............................................................... 76
7.1.2 Efeito da remoo do plasma seminal.............................................. 79
7.2. EXPERIMENTO II: INFLUNCIA DE DIFERENTES TEMPOS DE ESTABILIZAO
SOBRE AS VARIVEIS ESPERMTICAS PS-DESCONGELAO. .............................. 82
7.3. EXPERIMENTO III: EFEITO DE DOIS MEIOS DILUENTES E DA CENTRIFUGAO
SOBRE A FERTILIDADE DE VACAS INSEMINADAS EM TEMPO FIXO............................ 85
8. CONCLUSES ............................................................................................ 87
9. REFERNCIAS ............................................................................................ 89
10. ANEXOS................................................................................................... 114
10.1 AJUSTE DO HTMA IVOS 10 PARA A REALIZAO DAS
ANLISES DE SMEN BOVINO. ............................................................... 115
10.2 FRMULAS DOS DILUENTES UTILIZADOS NA PESQUISA ........... 116
10.3 PREPARO DAS SONDAS FLUORESCENTES.................................. 119
xv
RESUMO
Alberti, K. Inovaes metodolgicas na congelao de smen bovino.
Botucatu, 2007. 120 p. Dissertao (Mestrado em Reproduo Animal)Universidade Estadual Paulista UNESP, Campus de Botucatu - Faculdade de
Medicina Veterinria e Zootecnia.
Dentre as biotecnologias de reproduo que visam acelerar os ganhos genticos e
econmicos dos rebanhos, a congelao de smen desponta como uma das
principais. O smen congelado bovino utilizado em larga escala h anos e no
houve grandes evolues nas tcnicas de congelao visando minimizar os efeitos
deletrios do processo nos espermatozides, colaborando ativamente para o
incremento da fertilidade dos rebanhos. Neste trabalho props inovaes nas tcnicas
de congelao utilizando uma nova formulao de meio diluente, a introduo da
centrifugao para a remoo do plasma seminal pr-congelao e a determinao do
tempo ideal de estabilizao do smen. Foram realizados trs experimentos; o
primeiro testou o efeito de trs diferentes meios diluentes, com ou sem a remoo do
plasma seminal, no ejaculado de 40 touros diferentes. Nos resultados exibidos o
diluente M20 foi superior (p<0,01) aos demais diluentes na maioria das variveis
pesquisadas a remoo do plasma seminal melhorou (p<0,01) os ndices de
congelabilidade do smen. Outro experimento foi a verificao dos tempos de 60, 120,
180 e 240 min. de refrigerao do smen a 5C. O tempo de 180 minutos foi o
considerado o melhor para a congelabilidade aps a verificao dos resultados. No
teste de fertilidade foram inseminados 418 vacas e o grupo que foi inseminado com
smen congelado com M20 sem plasma seminal obteve uma tendncia de
superioridade (0,05<p<0,10) aos demais grupos. Com os resultados dos experimentos
concluiu-se que as inovaes propostas por este estudo incrementam os ndices de
congelabilidade do smen bovino.
xvi
ABSTRACT
Alberti, K.
Methodological innovations in bovine semen freezing.
Botucatu, 2007. 120 p. Dissertation (Master Science in Animal Reproduction)
Paulista State University UNESP Botucatu, So Paulo, Brazil School of
Veterinary Medicine and Animal Science
Semen freezing is considered as one of the main reproduction biotechnologies
that aim to accelerate genetic and economical gains of herds. Frozen bovine
semen has been used in large scale for years and there were not great
evolutions in freezing techniques to minimize the deleterious effects of the
process in spermatozoa, actively contributing for the increase in herds fertility.
Innovations in freezing techniques were proposed in this work by using a new
formulation of the extenders, introducing centrifugation for the removal of prefreezing seminal plasma and determining the appropriate time for semen
cooled. Three experiments were carried out: 1) the effect of three different
extenders was tested, with or without the removal of seminal plasma, in the
ejaculate of 40 different bulls; results showed that the extender M20 was
superior (p<0,01) in relation to the other extenders in most of variables studied.
The removal of the seminal plasma improved (P<0,01) semen freezability
indexes. 2) verification of 60, 120, 180 and 240 min. times for semen cooling at
5C; after results, the time of 180 minutes was considered the most appropriate
for freezability. 3) fertility test: 418 cows were inseminated and the group with
frozen semen with M20 without seminal plasma obtained a superiority tendency
(0,05<p<0,10) in relation to the other groups. The results of the experiments
concluded that the innovations proposed in this work increase freezability
indexes of bovine semen.
Keywords: bulls, extenders, seminal plasma, cooled rates, freezability, fertility.
1. Introduo
Introduo - 2
1. INTRODUO
fertilizao
in
vitro
(FIV)
tornou-se
mais
acessvel
Introduo - 3
Introduo - 4
curvas
de
resfriamento
ou
tempo
de
equilbrio
5oC,
e a interferncia do meio
diluente, comparando os resultados obtidos com TRIS-gema (TG), Glicinagema (GG) e M20, sobre a criopreservao dos espermatozides bovinos; e a
capacidade fecundante dos espermatozides criopreservados com as novas
metodologias, pelo teste de fertilidade por IA. As variveis espermticas foram
mensuradas
por
anlise
computadorizada
dos
movimentos
dos
2. Hipteses
Hipteses - 6
2. HIPTESES
3.Reviso de Literatura
Reviso de Literatura - 8
3. REVISO DE LITERATURA
3.1 Criopreservao espermtica
No sculo XVIII um monge, professor de cincias naturais da
Universidade de Pavia, Lzaro Spalanzani, inseminou artificialmente uma
cadela e 62 dias depois constatou o nascimento de trs filhotes saudveis,
sendo o primeiro relato cientifico de IA em animais, que constituiu um marco
inicial de um novo ramo das cincias mdicas, em 1784 (Mies Filho, 1982).
No h como desvincular o avano das tcnicas de manipulao do
smen
com
as
necessidades
atingidas
pelo
desenvolvimento
dos
Reviso de Literatura - 9
somente foi viabilizada em 1949 na Inglaterra, por Polge, Smith e Parkes, que
congelaram com sucesso, smen de galo em meio diluente contendo glicerol,
descobrindo as propriedades criopreservantes desta substncia. O Glicerol
ento foi testado em smen bovino e a tcnica de criopreservao foi realizada
com sucesso aps aproximadamente uma dcada de experincias mal
sucedidas. A partir desse momento houve um avano significativo na aplicao
da IA e na comercializao de smen congelado para ser utilizado na tcnica
(Foote, et al., 2002). Atualmente, existem poucas amostras de smen
congeladas a mais de 50 anos; portanto no se conhece o tempo de viabilidade
destas clulas, porm, estima-se que as clulas em N2 lquido permaneam
viveis por mais de 3000 anos, desde que no haja mudanas bruscas de
temperaturas a 196oC (Yoshida, 2000).
O Brasil foi um dos primeiros pases a aplicar a congelao de smen
em bovino, tendo recebido a visita de Polge em agosto de 1953, a convite do
extinto Departamento Nacional de Produo Animal. Mies Filho e Augusto
Rosa, em 1954, publicaram o resultado de 54,2% de fertilidade, obtido na
primeira inseminao, usando smen congelado (Mies Filho, 1987).
Atualmente, as biotecnologias como IA, transferncia de embries e
fertilizao in vitro, so fundamentais para o aumento da competitividade do
pecuarista no campo do agronegcio; nelas o smen congelado est presente
de forma importante. O potencial para a utilizao destas biotcnicas grande,
porm, o investimento para algumas delas pode ser alto. A IA a mais prtica
e econmica biotecnologia da reproduo, seu conhecimento de fcil acesso
e com isso possvel a obteno de um grande nmero de profissionais
qualificados para aplic-la (Gonzalez, 2004). Todavia a aplicabilidade das
biotcnicas restringida pela falta de instruo dos funcionrios e pelo
desinteresse dos pecuaristas que relutam em investir nas tecnologias aplicadas
a seus rebanhos. Esses aspectos colaboram para que o Brasil, segundo a
ASBIA (2004), insemine ao ano apenas 6% das fmeas bovinas em idade
reprodutiva, ndice muito baixo comparado a outros pases com tradies
pecuaristas do mundo.
Reviso de Literatura - 10
Reviso de Literatura - 11
entre
espcies.
susceptibilidade
aos
danos
da
refrigerao
est
Reviso de Literatura - 12
congelao de smen bovino (Bicudo et al., 1993; Thun et al., 2002; Foote et
al., 2002).
Preocupados em modificar a tcnica de congelao devido as
dificuldades encontradas nos trpicos em manter refrigeradores estveis a 5oC
por longos perodos, Sahni e Mohan (1988) congelaram smen de bovinos e
bubalinos com diluidor TG, glicerolizao e envasamento temperatura
ambiente. Uma parte das palhetas foi resfriada de 5 a 7oC em 4 a 6 horas e
outra em 2 horas. No houve, entre os grupos, diferenas na motilidade
espermtica ps-descongelao, concluindo-se que o rpido resfriamento a
5oC reflete em facilidade e reduo do tempo operacional do processo de
criopreservao espermtica. Papa et al. (2000) congelaram smen bovino
com diluente GG em diferentes tempos de estabilizao espermtica a 5oC:
60,120,180,240 minutos. Os resultados obtidos no diferiram quanto a
motilidade, vigor e reteno acrossomal, nos diferentes tempos estudados.
O resfriamento leva a clula a um estado de quiescncia, reduzindo o
metabolismo e proporcionando uma diminuio nos gastos energticos e na
produo de catablitos txicos, contribuindo para a preservao celular. Da
mesma maneira que a congelao pode diminuir ou paralisar algumas reaes
bioqumicas celulares, ela pode tambm, acelerar outras, levando a danos ou
mesmo morte celular (Watson, 1995; Holt, 2000).
A congelao das clulas ocorrem entre as temperaturas de 0 a -40oC,
e nesta faixa que podem ocorrer os principais danos as clulas espermticas
(Wolfe & Bryant, 2001). O ponto de solidificao da gua a 0oC, enquanto o
de uma soluo determinado por sua concentrao de solutos (Mazur, 1984).
A gua o componente exclusivo dos cristais de gelo intracelulares, os sais
existentes nas solues se restringem poro fluida do meio. (Amman e
Pickett, 1987). Proporcionalmente cristalizao da gua ocorre a saturao
dos solutos, tornando o meio hipertnico (Mazur, 1977).
Em um processo de criopreservao, onde a clula congelada
rapidamente, no existe tempo hbil para que ela se desidrate e mantenha o
equilbrio osmtico, o que a torna altamente refrigerada, possibilitando a
Reviso de Literatura - 13
Reviso de Literatura - 14
3.2.1. Ao Crioprotetora
As clulas espermticas necessitam, para sobreviver ao processo de
congelao e descongelao, de um ou mais agentes crioprotetores que so
classificados como no penetrantes ou extra celulares e agentes crioprotetores
penetrantes ou intracelulares (Mazur, 1980). O mecanismo de ao dos
agentes
crioprotetores
no
penetrantes
baseia-se
na
proteo
dos
Reviso de Literatura - 15
Reviso de Literatura - 16
Reviso de Literatura - 17
meio
TG,
obtiveram
resultados
que
mostraram efeitos
extrato
de
soja,
Reviso de Literatura - 18
3.2.2.2. Aucares
Os acares desempenham importantes papeis no meio diluente de
congelao, atuando como substrato para a produo de energia pelos
espermatozides,
na
manuteno
da
presso
osmtica
do
diluente,
Reviso de Literatura - 19
Reviso de Literatura - 20
3.2.2.3. Glicina
A adio do aminocido glicina em meios diluentes de smen foi
utilizada inicialmente, para a preservao de espermatozides de ourio-domar (Tyler & Rothschild, 1951), justificado pelo aumento da motilidade e da
capacidade de fertilizao. Posteriormente, a glicina foi empregada como
protetora de membranas em smen bovino (Flipse & Almquist, 1956).
O efeito benfico da glicina na sobrevivncia espermtica resultado
da quelao de metais pesados. A frutlise e a produo de acido ltico so
diminudas quando utilizados diluentes contendo glicina, reduzindo a taxa de
metabolismo ou promovendo mudana no processo glicoltico. A proteo
contra o choque trmico pode ser atribuda ao aminocido (Tyler & Rothschild,
1951; Flipse & Almquist, 1956; Aisen et al., 1990). A glicina possui uma
excelente capacidade tamponante, mantendo o pH entre 5 e 7, ideal para
estocagem de smen diludo (Albright et al., 1958).
Bicudo et al. (1993) testaram um meio diluente para a congelao de
smen bovino, composto de citrato de sdio, glicina, glicose, frutose, gema de
ovo e Ovus es Paste (OEP) e observaram uma melhora no vigor espermtico e
no percentual de reteno acrossmica, quando comparado ao TG.
O meio diluidor base de glicina-gema de ovo, apresentou bons
resultados quando utilizado na congelao do smen nas espcies eqina
(Papa et al., 1993), ovina (Gonzalez et al., 1996) e na refrigerao do smen
canino (Lopes, 1997).
Entre as facilidades e os cuidados necessrios encontrados com a
utilizao de cada um dos diluentes, o GG oferece uma grande facilidade de
leitura, tanto para motilidade como para o vigor, pois o campo visual durante a
anlise microscpica se apresenta de forma clara na identificao dos
espermatozides (Chacur, 1996).
Reviso de Literatura - 21
Reviso de Literatura - 22
Todavia,
Reviso de Literatura - 23
Reviso de Literatura - 24
Reviso de Literatura - 25
com
mnimos
danos
estruturais
funcionais
aos
Reviso de Literatura - 26
Reviso de Literatura - 27
Reviso de Literatura - 28
Reviso de Literatura - 29
espermatozides
viveis
obtidas
por
CASA,
tm
sido
altamente
Reviso de Literatura - 30
Reviso de Literatura - 31
a proporo de espermatozides com VSL alto for maior que VCL (Verstegen
et al. 2002).
Alguns fatores podem interferir na anlise correta do smen. Entre eles
observa-se que a concentrao espermtica deve ser reduzida de modo a
permitir a visualizao do campo sem que existam intersees entre as
trajetrias. Quanto maior o nmero de cruzamentos, maior o erro da anlise.
Para adequar a amostra utiliza-se diluidores seminais que devem ser livres de
partculas de tamanho semelhante ao espermatozide analisado, evitando-se
que estas sejam consideradas um espermatozide imvel (Ferreira et al.,
1997).
3.4.2.Anlise da integridade de membrana plasmtica
A integridade da membrana plasmtica uma das variveis mais
estudadas no processo de avaliao das injrias sofridas pela clula durante o
processo de criopreservao (Dell Aqua, 2000), devido ao papel fundamental
da membrana, na sobrevivncia do espermatozide no trato genital da fmea e
na manuteno de sua capacidade fertilizante (Parks & Grahan, 1992).
A importncia de se avaliar a integridade estrutural da clula
espermtica prende-se ao fato de que a funcionalidade do gameta est
diretamente ligada integridade da membrana plasmtica, ou seja, para toda
leso estrutural tem-se uma alterao funcional correspondente (Zuccari,
1998).
O uso de fluorocromos (isolados ou associados), tem promovido uma
boa metodologia de avaliao da integridade de vrios compartimentos
subcelulares, como a funo mitocondrial e a integridade da membrana
plasmtica (Martinez, 2000). As sondas fluorescentes so muito utilizadas, pois
tm a capacidade de se difundir pelas clulas ntegras ou lesadas, mesmo na
presena de algum crioprotetor (Zccari, 1998) e sua utilizao busca avaliar a
integridade e a funo de compartimentos especficos da clula espermtica
(Peterson et al., 1974).
Reviso de Literatura - 32
Reviso de Literatura - 33
de
sondas
fluorescentes
permitem
avaliar
Reviso de Literatura - 34
4. Objetivos
Objetivos - 36
4. OBJETIVOS
1. Testar uma nova metodologia de congelao de smen bovino que
possa contribuir para o avano da biotecnologia nesta espcie,
2. Testar o efeito da centrifugao de amostras de smen antes da
congelao.
3.
Avaliar
viabilidade
espermtica
ps-descongelao,
com
parmetros
espermticos
ps-descongelao,
pela
anlise
5.Material e Mtodos
Material e Mtodos - 38
5. MATERIAL E MTODOS
animais
foram
experimentao.
aprovados
em
exames
androlgicos
prvios
Material e Mtodos - 39
as
amostras
de
smen
foram
avaliadas
antes
do
5.1.3.1 Volume
O volume foi determinado mediante leitura direta na graduao
milimtrica do tubo coletor (15mL), expresso em mililtros (mL).
5.1.3.2 Cor e Aspecto
A colorao e o aspecto dos ejaculados foram avaliados visualmente
e classificados de branco acinzentada a amarelo citrino. O aspecto, que
depende
fundamentalmente
da
concentrao
de espermatozides, foi
Material e Mtodos - 40
5.1.3.3 Turbilhonamento
O turbilhonamento (movimento de massa), foi avaliado pela deposio
de uma gota de smen sobre uma lmina aquecida (37C), observada em
microscpio de luz em aumento de 100 X, sendo o valor classificado,
subjetivamente, em ordem crescente: 0 , + , ++ , +++
Material e Mtodos - 41
diluio,
as
amostras
(240)
foram
envasadas
identificadas
Material e Mtodos - 42
Material e Mtodos - 43
retilinearidade
(STR),
linearidade
(LIN)
percentagem
de
Material e Mtodos - 44
40 EJACULADOS
T
R
I
S
G
L
I
G
2
0
MEIO I
G
L
I
G
G
L
I
G
M
2
0
MEIO I + MEIO II
Centrifugao
T
R
I
S
DILUIO
T
R
I
S
Procedimentos de
congelao
M
2
0
Anlise Computadorizada
Procedimentos de
congelao
Material e Mtodos - 45
Material e Mtodos - 46
experimento I.
Material e Mtodos - 47
Material e Mtodos - 48
Material e Mtodos - 49
EJACULADO
T
R
I
S
M
2
0
T
R
I
S
DILUIO
M
2
0
Amostras Centrifugadas
ENVASE EM PALHETAS
ESTABILIZAO: 1 HORA
2 HORAS
3 HORAS
4 HORAS
PROCEDIMENTOS DE CONGELAO
Anlise Computadorizada
Avaliao integridade de Membrana
Material e Mtodos - 50
5.2.8.Anlise Estatstica
Aps o trmino da fase laboratorial os dados foram analisados por um
fatorial 2 X 2 X 2 X 4 (2 raas X 2 grupos (centrifugado e no centrifugado) X 2
diluidores X 4 tempos de estabilizao), com parcelas subdivididas, num
delineamento inteiramente casualizado. As parcelas principais foram os touros
e as subparcelas as amostras de smen, obtidas de uma colheita por touro,
s quais foram aplicados as combinaes de grupo, diluidor e tempo.
Os resultados foram analisados por meio do programa MIXED do SAS
8.02, usando-se o seguinte modelo estatstico:
Yijklmn = m + ri + tij + dk + cl + sm + (rd)ik + (rc)il + (rs)im + (dc)kl + (ds)km +
(cs)lm + (rdc)ikl + (rds)ikm + (dcs)klm + (rdcs)ijkm + eijklmn
Onde: m= efeito fixo da mdia;
ri = efeito fixo da i-sima raa (i=1,2);
tij = efeito aleatrio do j- simo touro dentro da i-sima raa (j=
1,2,....20) = erro(a)
dk = efeito fixo do k-simo diluente(k=1,2);
cl = efeito fixo do l-simo grupo de centrifugao (l=1,2);
sm = efeito fixo do m-simo tempo de estabilizao;
(rd)ik = efeito fixo da interao entre a i-sima raa e o k-simo
diluente;
(rc)il = efeito fixo da interao entre a i-sima raa e o l-simo grupo de
centrifugao;
(rs)im = efeito fixo da interao entre a i-sima raa e o m-simo tempo
de estabilizao;
(dc)kl = efeito fixo da interao entre o k-simo diluente e o l-simo
grupo de centrifugao;
(ds)km = efeito fixo da interao entre o k-simo diluente e o m-simo
tempo de estabilizao;
(cs)lm = efeito fixo entre o l-simo grupo de centrifugao e o m-simo
tempo de estabilizao;
(rdc)ikl = efeito fixo da interao entre a i-sima raa , o k-simo
diluente e a l- simo grupo de centrifugao;
Material e Mtodos - 51
Material e Mtodos - 52
Material e Mtodos - 53
418
Colocao dispositivo
+ BE
D0
Retirada dispositivo
+ D-Cloprostenol
+eCG
D9
IATF
+
GnRH
D11
Material e Mtodos - 54
Colocao dispositivo
D0
Retirada dispositivo +
eCG
IATF
D9
D11
6. Resultados
Resultados - 56
6. RESULTADOS
6.1. EXPERIMENTO I Efeitos do meio diluente e da remoo do plasma
seminal na congelabilidade do smen bovino.
6.1.1. Efeito dos meios diluentes
Na figura 6 podem ser observados os valores mdios psdescongelao da MT e MP, do smen criopreservado com os trs meios
diluentes. Nos resultados de MT as mdias de M20 (62,37%a) foram superiores
(p<0,01) as apresentadas pelos outros dois diluidores, GG (56,10%b) e TG
(50,55%c). Na MP os resultados obtidos diferiram (p<0,01) entre M20, GG e
TG, sendo respectivamente 47,10%a, 41,41%b e 34,02%c.
70
60
50
a
b
40
30
20
M20
GG
TG
10
0
MT
a,b,c
MP
Resultados - 57
a
120
b
100
a
b
a
m/s
80
M20
GG
TG
60
40
20
0
VCL
a,b,c
STR
LIN
(VCL)
(m/s),
retilinearidade
espermtica
(STR)
(m/s),
Resultados - 58
60
a
b
RAP (%)
50
40
30
20
10
0
M20
GG
TG
a,b
Resultados - 59
40
a
b
IMP (%)
30
20
10
0
M20
GG
TG
a,b
Resultados - 60
TG
GG
M20
Mdias de RPS
CRPS
54,18
59,08
66,18
59,81A
SRPS
46,16
53,13
58,58
52,62B
56,10b
62,37a
Mdias na mesma coluna com letras distintas diferem (p<0,01) pelo teste F.
a,b,c
Mdias na mesma linha com letras distintas diferem (p<0,01) pelo teste de Tukey.
Resultados - 61
TG
GG
M20
Mdias de RPS
CRPS
38,38
44,00
50,98
44,45A
SRPS
31,95
36,10
43,23
37,09B
41,41b
47,10a
Mdias na mesma coluna com letras distintas diferem (p<0,01) pelo teste F.
a,b,c
Mdias na mesma linha com letras distintas diferem (p<0,01) pelo teste de Tukey.
TG
GG
M20
Mdias de RPS
CRPS
123,98A
92,75A
102,40A
106,37
SRPS
110,00B
90,13A
94,53B
98,22
91,43c
98,46b
A,B
Mdias na mesma coluna com letras distintas diferem (p<0,01) pelo teste F.
a,b,c
Mdias na mesma linha com letras distintas diferem (p<0,01) pelo teste de Tukey.
Resultados - 62
Diluidores
Plasma Seminal
TG
GG
M20
Mdias de RPS
CRPS
78,80B
88,25A
86,13A
84,39
SRPS
82,73A
88,00A
87,18A
85,97
88,12a
86,65a
A,B
Mdias na mesma coluna com letras distintas diferem (p<0,01) pelo teste F.
a,b
Mdias na mesma linha com letras distintas diferem (p<0,01) pelo teste de Tukey.
Resultados - 63
TG
GG
M20
CRPS
58,78B
65,13A
60,70A
58,87
SRPS
59,95
54,85
63,58
64,35a
61,43
Mdias de RPS
61,10b
Mdias na mesma coluna com letras distintas diferem (p<0,01) pelo teste F.
a,b,c
Mdias na mesma linha com letras distintas diferem (p<0,01) pelo teste de Tukey.
Diluidores
Plasma Seminal
TG
GG
M20
Mdias de RPS
CRPS
48,45
50,20
57,60
52,08A
SRPS
40,12
44,10
48,38
44,20B
47,15b
52,98a
Mdias na mesma coluna com letras distintas diferem (p<0,01) pelo teste F.
a,b,c
Mdias na mesma linha com letras distintas diferem (p<0,01) pelo teste de Tukey.
Resultados - 64
TG
GG
M20
Mdias de RPS
CRPS
28,68
28,73
35,65
31,02A
SRPS
25,90
26,38
30,13
27,47B
27,55b
32,88a
Mdias na mesma coluna com letras distintas diferem (p<0,01) pelo teste F.
a,b
Mdias na mesma linha com letras distintas diferem (p<0,01) pelo teste de Tukey.
Resultados - 65
60
MT (%)
55
50
45
40
1
Tempo
=b0+b1*x+b2(1/x)
Figura 10 Valores Mdios de motilidade total (%) ps descongelao
de smen congelado aps tempo de estabilizao 1 (60 min.), 2 (120 min.), 3
(180 min.) e 4 (240 min.).
Resultados - 66
MP (%)
45,00
40,00
35,00
30,00
1
Tempo
=b0+b1*x+b2(1/x)
Figura 11 - Valores Mdios de motilidade progressiva (%) ps
descongelao de smen congelado aps tempo de estabilizao 1 (60 min.),
2 (120 min.), 3 (180 min.) e 4 (240 min.).
Resultados - 67
120
VCL (m/s)
100
80
60
40
20
0
60 min.
120 min.
180 min.
240 min.
Tempo de Estabilizao
Figura
12
Valores
mdios
de
velocidade
curvilnea
dos
Resultados - 68
100
STR (m/s)
80
60
40
20
0
60 min.
120 min.
180 min.
240 min.
Tempo de Estabilizao
Resultados - 69
80
LIN (m/s)
60
40
20
0
60 min.
120 min.
180 min.
240 min.
Tempo de Estabilizao
Resultados - 70
55
RAP (%)
50
45
M20
TRIS
40
35
30
1
Tempo
=b0+b1*x+b2(1/x)
Figura 15 - Valores Mdios de espermatozides com movimentos
rpidos (RAP) (%) ps descongelao de smen congelado aps tempo de
estabilizao 1 (60 min.), 2 (120 min.), 3 (180 min.) e 4 (240 min.).
Resultados - 71
IMP (%)
minutos.
30
29
28
27
26
25
24
23
22
21
20
1
3
Tempo
=b0+b1*x+b2*x2
Figura 16 - Valores Mdios de Integridade de membrana plasmtica
(IMP) (%) ps descongelao de smen congelado aps tempo de
estabilizao 1 (60 min.), 2 (120 min.), 3 (180 min.) e 4 (240 min.).
Resultados - 72
de
linearidade
espermtica
(LIN),
percentagem de
Diluentes MT
MP
VCL
STR
LIN
RAP
IMP
M20
59,04a
47,56a
98,39b
88,90a
64,52a
51,86a
29,23a
TG
45,11b
34,57b
111,35a
85,28b
58,19b
39,42b
23,02b
a,b
nas percentagens de
de
linearidade
espermtica
(LIN),
percentagem
de
MT
C
NC
a,b
MP
VCL
STR
LIN
RAP
IMP
54,35a 43,43a
108,53a
86,55
61,29
48,44a
27,09a
49,80b 38,70b
101,22b
87,62
61,22
42,80b
25,17b
Resultados - 73
70
Fertilidade (%)
60
50
40
30
20
10
0
M20 C
M20 NC
TRIS-gema
Resultados - 74
GL
Valor de X2
Fazenda
3,4035
0,0651
Inseminador
7,4288
0,0594
4,0755
0,1303
(Fazenda)
Tratamento
GL
Valor de X2
TRIS X M20 NC
0,6727
0,4121
TRIS X M20 C
0,0402
0,0444
M20 NC X M20 C
3,3713
0,0663
7. Discusso
Discusso - 76
7. DISCUSSO
das
clulas,
capazes
de
ampliar
viabilidade
dos
que
seja
preservada
capacidade
de
fertilizao
dos
Discusso - 77
Discusso - 78
Discusso - 79
Discusso - 80
convencionalmente,
provavelmente,
pelo
aumento
da
Discusso - 81
Discusso - 82
perodo
de
equilbrio
antes
da
congelao,
so
necessrios
no
Discusso - 83
Discusso - 84
mostrados
na
IMP
traou-se
uma
reta
de
regresso,
Discusso - 85
Discusso - 86
diluente,
quanto
metodologia,
so
importantes
para
Discusso - 87
8. Concluses
Concluses - 88
8. CONCLUSES
plasma
seminal
removido.
9. Referncias
Referncias - 90
9. REFERNCIAS
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K.D.;
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Referncias - 91
Referncias - 92
Referncias - 93
estradiol.
Resmenes
del
cuarto
SIMPOSIO
Referncias - 94
sperm
and
their
relationship
with
in
vitro
fertilization
rate.
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Avaliao
Referncias - 98
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criopreserved
in
bovine
spermatozoa
extended
egg
yolk
and
milk.
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TH
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Referncias - 109
D.;
BARTHELEMY,
C.;
HAMAMAH,
S.;
LANSAC,
J.,
Referncias - 110
Referncias - 111
A.;
DE
LAS
HERAS,M.A.;
PERZ,L.;
MOSES,
D.F.;
Referncias - 112
Referncias - 113
10. Anexos
Anexos - 115
10. Anexo
10.1 AJUSTE DO HTMA IVOS 10 PARA A REALIZAO DAS
ANLISES DE SMEN BOVINO.
CARACTERSTICA
Nmero de pontos examinados
AJUSTE
30
60 pixels
3 pixels
50 pixels
70%
< 40 m/s
< 30 m/s
< 20 m/s
5 pixels
3 pixels
0,24
1,19
0%
100%
No
Magnificao
1,95
Anexos - 116
CONSTITUINTES
3
TRIS
cido Ctrico3
QUANTIDADE
30,28g
17,30g
1000mL/qsp
CONSTITUINTES
Soluo Me
QUANTIDADE
800mL
Gema de ovo
200mL
Volume Final
1000mL
CONSTITUINTES
Soluo Me
Gema de ovo
QUANTIDADE
652mL
200mL
Glicose3
20g
Glicerol3
128mL
Volume Final
1000mL
Anexos - 117
QUANTIDADE
0,6g
Frutose
0,6g
40mL/qsp
QUANTIDADE
1,0g
0,47g
40mL/qsp
Soluo A
CONSTITUINTES
QUANTIDADE
40mL
Soluo B
40mL
Penicilina G Sdica
0,033g
Estreptomicina
100mg
OEP
0,4ml
Gema de Ovo
20mL
Anexos - 118
DILUIDOR M20
CONSTITUINTES
Glicose
QUANTIDADE
14g
Frutose
7g
TRIS
10g
Citrato de Sdio
1,2g
Citrato de potssio
0,5g
Eagle
1,0g
Glicina
2,0g
EDTA
0,2g
Lactose
13g
Amicacina
0,2g
Ac. Ctrico
3,3g
4,0mL
Gema de Ovo
180mL
H2O
750ml
Anexos - 119
CONSTITUINTES
Iodeto de Propdio
Estoque CFDA
Estoque de Formaldedo
QUANTIDADES
10 mg
Soluo Fisiolgica
20 mL
Diacetato de 6-Carboxifluorescena
9,2 mg
Dimetilsulfxido
20 mL
Formalina 40%
1 mL
Soluo Fisiolgica
79 mL
Estoque de Citrato de
Citrato de Sdio
Sdio
Soluo Fisiolgica
3g
100 mL
SOLUO DE TRABALHO
SOLUES
Soluo de Citrato de Sdio 3%
QUANTIDADE
0,96 Ml
Soluo de Formaldedo
10l
10l
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QUANTIDADE
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