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MANUAL DE LABORATORIO
DE BIOQUMICA
Profesores:
Dr. Miguel Basanta
Bioanalista:
Asistentes de Laboratorio
Secretaria:
TSU. Yurimn Nuez
HORARIO
Das: LUNES a VIERNES
Hora: 9:00 a.m. a 12:00m
Lugar: Laboratorio de Bioqumica
CONTENIDO
PRCTICA 1:
ESTUDIO DE LAS PROPIEDADES INICAS DE LOS AMINOCIDOS. MTODOS DE
TITULACIN DE LOS GRUPOS FUNCIONALES ................................................................... 3
PRCTICA 2:
SALADO" (SALTING OUT) DE PROTENAS, SU APLICACIN EN LA SEPARACIN
Y DETERMINACIN DE ALBMINA Y GLOBULINAS EN SUERO O PLASMA
SANGUNEO. ......................................................................................................................... 19
PRCTICA 3:
ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA AMILASA SALIVAL............................... 28
PRCTICA 4:
ENZIMOLOGA: ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD DE
L-LACTATO: NAD+ OXIDOREDUCTASA EN MSCULO, HGADO Y CORAZN DE ANIMALES DE
EXPERIMENTACIN ............................................................................................................. 42
PRCTICA 5:
METABOLISMO INTERMEDIARIO. EFECTO DEL AYUNO SOBRE EL CONTENIDO DEL
GLUCGENO HPATICO ..................................................................................................... 47
PRCTICA 6:
METABOLISMO INTERMEDIARIO. EFECTO DE DL-METIONINA Y DL-ETIONINA SOBRE
EL CONTENIDO DE TRIGLICERIDOS Y COLESTEROL EN HGADO DE RATAS .............. 56
OBJETIVOS ESPECFICOS
1. Titular un aminocido con una solucin de hidrxido de sodio.
2. Diferenciar un aminocido bsico, cido y neutro de acuerdo a sus pK.
3. Aplicar la ecuacin Henderson-Hasselbalch a los sistemas amortiguadores
fisiolgicos.
4. Explicar la funcin amortiguadora que poseen las protenas.
5. Definir las propiedades qumicas de los aminocidos.
6. Reconocer en los sistemas proteicos, los grupos ionizables responsables de generar
la mxima capacidad amortiguadora tomando como criterio su pK.
7. Analizar el comportamiento de los aminocidos en su pH o punto isoelctrico.
I.
INTRODUCCIN
Todos los aminocidos contienen grupos ionizables que son pares cido-bases
conjugados dbiles conjugados, cada uno con un valor caracterstico de constante de
ionizacin. Esta propiedad cido o base dbiles facilita que los aminocidos puedan ceder o
aceptar protones y as tratar de mantener el pH sin modificaciones significativas (Capacidad
amortiguadora). Dado que en el equilibrio coexisten las formas protonadas con las no
protonadas y debido a que estos grupos actan como amortiguadores, el pH de la solucin
puede calcularse de acuerdo con la ecuacin de Henderson y Hasselbalch (1).
= +
(1)
H3N
OH
H3N
H
pH cido
Carga= +1
COO-
OH
H2N
H
pKa= 2,34
In dipolar
Carga= 0
COO-
pKb= 9,60
H
pH alcalino
Carga= -1
II.
pK1(COOH)
2,34
2,34
2,32
2,36
2,36
2,21
2,63
2,28
1,83
2,83
2,02
2,17
1,99
1,71
2,09
2,19
1,82
2,20
2,18
2,17
+3
pK2(NH )
9,60
9,69
9,62
9,60
9,60
9,15
10,43
9,21
9,13
9,39
8,80
9,13
10,60
10,78
9,82
9,627
9,17
9,11
8,95
9,04
PKr
8,33
3,86
4,25
6,60
10,07
10,79
12,48
MATERIALES
Equipo general:
pH-metro
Bureta de 50 ml
Soporte para bureta
Piceta con agua destilada
Papel secante
Embudo pequeo
Pipeta de 10 ml
Magneto
Agitador magntico
Barra pescadora de magneto
III.
PROCEDIMIENTO
VNaOH 0,5 N
(ml)
pH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
MANUAL PRCTICO DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA
VNaOH 0,5 N
(ml)
pH
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
6
24
25
49
50
IV.
CLCULOS
pH (adimensional)
pH (adimensional)
0,5
1,5
2,5
3,5
4,5
5,5
6,5
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
10
11
12
13
14
15
16
Volumen
pH
Volumen
pH
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
3,500
4,000
4,500
5,000
5,500
6,000
6,500
7,000
7,500
8,000
8,500
9,000
9,500
10,000
10,500
11,000
11,500
12,000
12,500
13,000
13,500
14,000
14,500
15,000
15,500
16,000
16,500
17,000
17,500
18,000
1,815
1,864
1,913
1,964
2,016
2,069
2,123
2,179
2,238
2,298
2,362
2,429
2,501
2,580
2,666
2,765
2,880
3,023
3,217
3,535
5,720
7,909
8,230
8,428
8,575
8,696
8,800
8,892
8,978
9,057
9,133
9,206
9,277
9,347
9,416
9,484
9,552
18,500
19,000
19,500
20,000
20,500
21,000
21,500
22,000
22,500
23,000
23,500
24,000
24,500
25,000
25,500
26,000
26,500
27,000
27,500
28,000
28,500
29,000
29,500
30,000
30,500
31,000
31,500
32,000
32,500
33,000
33,500
34,000
34,500
35,000
35,500
36,000
9,621
9,689
9,758
9,826
9,895
9,963
10,031
10,098
10,166
10,233
10,300
10,367
10,436
10,505
10,576
10,648
10,724
10,803
10,886
10,974
11,066
11,163
11,262
11,360
11,454
11,541
11,620
11,691
11,753
11,809
11,859
11,903
11,944
11,980
12,014
12,045
10
Volumen
pH
Volumen
pH
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
3,500
4,000
4,500
5,000
5,500
6,000
6,500
7,000
7,500
8,000
8,500
9,000
9,500
10,000
10,500
11,000
11,500
12,000
12,500
13,000
13,500
14,000
14,500
15,000
15,500
16,000
16,500
17,000
17,500
1,763
1,808
1,853
1,900
1,949
1,998
2,049
2,102
2,157
2,215
2,276
2,341
2,410
2,486
2,571
2,667
2,781
2,922
3,114
3,431
5,612
7,800
8,123
8,322
8,472
8,595
8,701
8,797
8,886
8,970
9,050
9,129
9,208
9,286
9,365
9,446
18,000
18,500
19,000
19,500
20,000
20,500
21,000
21,500
22,000
22,500
23,000
23,500
24,000
24,500
25,000
25,500
26,000
26,500
27,000
27,500
28,000
28,500
29,000
29,500
30,000
30,500
31,000
31,500
32,000
32,500
33,000
33,500
34,000
34,500
35,000
35,500
36,000
9,529
9,614
9,701
9,790
9,879
9,969
10,057
10,143
10,227
10,308
10,386
10,463
10,537
10,611
10,684
10,757
10,831
10,905
10,981
11,059
11,138
11,219
11,301
11,382
11,461
11,537
11,608
11,673
11,733
11,787
11,837
11,882
11,923
11,960
11,994
12,026
12,055
11
Volumen
pH
Volumen
pH
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
3,500
4,000
4,500
5,000
5,500
6,000
6,500
7,000
7,500
8,000
8,500
9,000
9,500
10,000
10,500
11,000
11,500
12,000
1,799
1,846
1,895
1,944
1,995
2,047
2,100
2,155
2,212
2,272
2,335
2,401
2,473
2,550
2,636
2,734
2,849
2,991
3,185
3,502
5,744
7,991
8,315
8,516
8,668
12,500
13,000
13,500
14,000
14,500
15,000
15,500
16,000
16,500
17,000
17,500
18,000
18,500
19,000
19,500
20,000
20,500
21,000
21,500
22,000
22,500
23,000
23,500
24,000
8,792
8,901
9,001
9,093
9,182
9,269
9,356
9,444
9,536
9,635
9,742
9,864
10,010
10,195
10,455
10,826
11,182
11,414
11,569
11,683
11,772
11,844
11,905
11,957
12
Volumen
pH
Volumen
pH
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
3,500
4,000
4,500
5,000
5,500
6,000
6,500
7,000
7,500
8,000
8,500
9,000
9,500
10,000
10,500
11,000
11,500
12,000
12,500
13,000
13,500
14,000
14,500
15,000
15,500
16,000
16,500
17,000
17,500
18,000
1,635
1,673
1,712
1,752
1,794
1,836
1,881
1,927
1,976
2,027
2,082
2,141
2,205
2,276
2,355
2,447
2,555
2,692
2,878
3,181
3,963
4,754
5,069
5,268
5,419
5,543
5,652
5,751
5,843
5,932
6,019
6,106
6,194
6,286
6,384
6,492
6,613
18,500
19,000
19,500
20,000
20,500
21,000
21,500
22,000
22,500
23,000
23,500
24,000
24,500
25,000
25,500
26,000
26,500
27,000
27,500
28,000
28,500
29,000
29,500
30,000
30,500
31,000
31,500
32,000
32,500
33,000
33,500
34,000
34,500
35,000
35,500
36,000
6,758
6,941
7,194
7,550
7,906
8,159
8,342
8,486
8,608
8,715
8,813
8,905
8,994
9,080
9,167
9,255
9,347
9,446
9,553
9,676
9,823
10,010
10,279
10,683
11,072
11,313
11,472
11,588
11,679
11,752
11,815
11,868
11,915
11,956
11,994
12,027
13
Volumen
pH
Volumen
pH
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
3,500
4,000
4,500
5,000
5,500
6,000
6,500
7,000
7,500
8,000
8,500
9,000
9,500
10,000
10,500
11,000
11,500
12,000
12,500
13,000
13,500
14,000
14,500
15,000
15,500
16,000
16,500
17,000
17,500
18,000
1,639
1,677
1,716
1,756
1,798
1,841
1,885
1,932
1,981
2,032
2,087
2,146
2,211
2,282
2,361
2,453
2,562
2,699
2,887
3,200
5,135
7,081
7,405
7,606
7,757
7,882
7,990
8,089
8,181
8,269
8,355
8,440
8,527
8,617
8,711
8,813
8,925
18,500
19,000
19,500
20,000
20,500
21,000
21,500
22,000
22,500
23,000
23,500
24,000
24,500
25,000
25,500
26,000
26,500
27,000
27,500
28,000
28,500
29,000
29,500
30,000
30,500
31,000
31,500
32,000
32,500
33,000
33,500
34,000
34,500
35,000
35,500
36,000
9,052
9,199
9,370
9,559
9,748
9,918
10,063
10,188
10,298
10,397
10,488
10,573
10,654
10,733
10,810
10,886
10,962
11,038
11,115
11,192
11,270
11,347
11,423
11,497
11,567
11,633
11,694
11,750
11,802
11,849
11,892
11,931
11,967
12,001
12,032
12,060
14
Volumen
pH
Volumen
pH
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
3,500
4,000
4,500
5,000
5,500
6,000
6,500
7,000
7,500
8,000
8,500
9,000
9,500
10,000
10,500
11,000
11,500
12,000
12,500
13,000
13,500
14,000
14,500
15,000
15,500
16,000
16,500
17,000
17,500
18,000
1,740
1,783
1,827
1,872
1,918
1,965
2,013
2,063
2,114
2,168
2,224
2,282
2,344
2,409
2,479
2,553
2,634
2,720
2,813
2,912
3,014
3,118
3,221
3,320
3,415
3,506
3,593
3,677
3,759
3,841
3,922
4,005
4,090
4,180
4,277
4,385
4,508
18,500
19,000
19,500
20,000
20,500
21,000
21,500
22,000
22,500
23,000
23,500
24,000
24,500
25,000
25,500
26,000
26,500
27,000
27,500
28,000
28,500
29,000
29,500
30,000
30,500
31,000
31,500
32,000
32,500
33,000
33,500
34,000
34,500
35,000
35,500
36,000
4,658
4,858
5,182
6,951
8,721
9,046
9,246
9,397
9,522
9,630
9,729
9,821
9,908
9,994
10,079
10,166
10,255
10,348
10,449
10,558
10,680
10,818
10,972
11,134
11,289
11,424
11,536
11,629
11,707
11,773
11,830
11,880
11,925
11,964
12,000
12,033
15
Volumen
pH
Volumen
pH
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
3,500
4,000
4,500
5,000
5,500
6,000
6,500
7,000
7,500
8,000
8,500
9,000
9,500
10,000
10,500
11,000
11,500
12,000
1,889
1,944
2,000
2,057
2,115
2,174
2,233
2,295
2,357
2,422
2,490
2,561
2,636
2,718
2,807
2,908
3,026
3,171
3,366
3,686
6,134
8,587
8,912
9,112
9,263
12,500
13,000
13,500
14,000
14,500
15,000
15,500
16,000
16,500
17,000
17,500
18,000
18,500
19,000
19,500
20,000
20,500
21,000
21,500
22,000
22,500
23,000
23,500
24,000
9,388
9,497
9,596
9,688
9,776
9,863
9,949
10,036
10,126
10,222
10,326
10,441
10,573
10,728
10,913
11,119
11,315
11,477
11,604
11,704
11,786
11,855
11,913
11,964
16
Volumen
pH
Volumen
pH
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
3,500
4,000
4,500
5,000
5,500
6,000
6,500
7,000
7,500
8,000
8,500
9,000
9,500
10,000
10,500
11,000
11,500
12,000
12,500
13,000
13,500
14,000
14,500
15,000
15,500
16,000
16,500
17,000
17,500
18,000
1,839
1,889
1,940
1,992
2,046
2,100
2,155
2,212
2,270
2,331
2,394
2,460
2,529
2,603
2,683
2,769
2,865
2,972
3,092
3,224
3,366
3,508
3,644
3,769
3,883
3,987
4,083
4,174
4,261
4,346
4,430
4,515
4,603
4,694
4,792
4,900
5,025
18,500
19,000
19,500
20,000
20,500
21,000
21,500
22,000
22,500
23,000
23,500
24,000
24,500
25,000
25,500
26,000
26,500
27,000
27,500
28,000
28,500
29,000
29,500
30,000
30,500
31,000
31,500
32,000
32,500
33,000
33,500
34,000
34,500
35,000
35,500
36,000
5,175
5,376
5,699
7,185
8,670
8,994
9,194
9,345
9,470
9,579
9,677
9,769
9,857
9,943
10,029
10,115
10,205
10,299
10,400
10,511
10,635
10,777
10,938
11,109
11,273
11,414
11,529
11,624
11,703
11,770
11,828
11,879
11,923
11,963
11,999
12,032
17
V.
EJERCICIOS
18
OBJETIVOS ESPECFICOS
1. Diferenciar plasma y suero sanguneo con relacin a su contenido de protenas
plasmticas.
2. Separar las protenas totales del suero humano por el mtodo de precipitacin
salina.
3. Separar selectivamente la albumina de la protenas totales con el uso de solventes
orgnicos.
4. Construir una grfica de tendencia para protenas totales con el reactivo de Biuret.
5. Construir una grfica de tendencia para albumina con el reactivo Verde de
Bromocresol (BCG).
6. Determinar por el mtodo grfico las cantidades de protenas totales, de albumina y
de las globulinas presentes en un muestra de suero de un paciente.
7. Relacionar la cantidad de protena total, de albmina y de globulinas con respecto al
rango normal o al valor patolgico y deducir el estado de salud del paciente.
I. INTRODUCCIN
Las protenas estn constituidas por cadenas polipeptdicas. Un polipptido puede
adoptar > 1050 conformaciones distintas, el plegado de la conformacin apropiada es
fundamental para que cumpla su funcin biolgica. Los esqueletos polipeptdicos estn
conformados por aminocidos, unidos por una conexin comn, el enlace peptdico.
Las protenas se caracterizan por ser multidisociables, por poseer grupos qumicos
disociables en la cadena lateral de los aminocidos que la constituyen, grupos carboxilos
(carboxiterminal) y aminos (aminoterminal) del enlace peptdico. Obtiene su forma ms
estable (de menor energa libre) cuando orienta todas sus partes hidrofbicas hacia el interior
de la protena, es decir, cadenas laterales neutras, no ionizables o apolares y hacia la parte
externa las cadenas laterales ionizables y polares, que es soluble en agua (regin hidroflica).
Por la estructura peptdica y la presencia de determinados grupos (grupos R), las
protenas pueden reaccionar con una variedad de agentes qumicos originndose productos
coloreados. Estas reacciones son la base para la determinacin cuantitativa y cualitativa de
las protenas.
19
20
Abs
II. MATERIALES
Equipo general:
Bao de Mara a 50 C
Espectrofotmetro
Porta pipeta
Centrfuga clnica
Gradilla de acero inoxidable
Lpiz graso.
21
Suero humano
Patrn de protenas 8 mg/ml
Cloruro de sodio 0,9%
ter dietlico
Sulfato de sodio a 23%
III. PROCEDIMIENTO
A) SEPARACIN DE PROTEINAS
A.1 Mzclese bien por inversin repetida en un tubo de ensayo 0.5ml de suero ms 9,5 ml de
Na2SO4 al 23% (no agitar para evitar la formacin de espuma).
A.2 Retire inmediatamente 2 ml para determinar protenas totales. Rotule como tubo N 1
(Solucin X1)
A.3 Retire 4 ml en un tubo de centrfuga, aada 2 ml de ter, pese bien y agtese
vigorosamente. Destape con cuidado, ya que el ter con las protenas y con el calor de la
mano forma mucha espuma, pudiendo derramarse la suspensin.
A.4 Centrifguese a 1.500 r.p.m. por 10 minutos.
A.5 Con una pipeta volumtrica de 2 ml y con el tubo de centrfuga inclinado, extraiga el
lquido claro de la capa inferior (un volumen no menor de 2 ml), enrase y lleve a un tubo
de ensayo rotulado como No. 2 (Solucin X2). Al sacar la pipeta tenga cuidado de no
absorber con ella globulinas precipitadas.
A.6 Utilice los tubos 1 y 2 para la determinacin cuantitativa de protenas totales y de
albmina basado en la reaccin de Biuret.
22
A
B
B) CUANTIFICACION DE PROTEINAS.
B.1) Determinacin de protenas totales por el mtodo de Biuret
B.1.1 Tome 6 tubos de ensayos, identifquelos y adicione las cantidades segn
corresponda, tal como se muestra en la tabla 3.
Tabla 3. Disposicin de los reactivos para realizar la cuantificacin de las protenas
totales
TUBOS
4
----1 ml
MUESTRA
(Mpt)
0,1 ml
-----
BLANCO
(B)
-------
Suero
Standard
de
protenas
8mg/ml
NaCl, 0.9 %
Reactivo 1
----0,25 ml
----0,50 ml
-----0,75 ml
0,75 ml
3ml
0,5 ml
3ml
0,25 ml
3ml
----3ml
----3ml
1 ml
3 ml
B.1.2 Despus de aadir las sustancias mzclese bien por inversin el contenido de
cada tubo evitando la formacin de espuma.
B.1.3 Incube a 50 C en el bao de temperatura constante durante 10 min. Deje
enfriar.
B.1.4 Leer la absorbancia (abs) a 640 nm.
B.1.5 Registre los valores las absorbancias en la tabla 4, obtenidas de los tubos
elaborados en el paso 4.
MANUAL PRCTICO DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA
23
LECTURAS (abs)
mg de protenas
B.1.8 A partir del valor de absorbancia obtenido con el tubo Mpt, trace una paralela al
eje X hasta que intercepte la recta obtenida al graficar los patrones;
posteriormente trace una paralela al eje Y hasta interceptar el eje X; lea los mg de
protena que corresponde a su muestra.
B.1.9 Calcule la cantidad de mg de protenas totales presentes en su muestra de
suero.
24
4
---0,04ml
Muestra
(Malb)
0,03
----
Blanco
(B)
-------
Suero
Patrn de
albumina
4g/dl
NaCl 0,9%
Reactivo 2
---0,01ml
---0,02ml
---0,03ml
0,99ml
3ml
0,98ml
3ml
0,97ml
3ml
0,96ml
3ml
0,97ml
3ml
1ml
3ml
B.2.2 Despus de aadir las sustancias mzclese bien por inversin el contenido
de cada tubo evitando la formacin de espuma.
B.2.3 Leer la absorbancia (abs) a 600 nm.
B.2.4 Registre los valores las absorbancias en la tabla N4, obtenidas de los tubos
elaborados en el paso 3 de la parte B.
B.2.5 Calcule la cantidad de mg de protenas que contiene cada patrn, tomando
como referencia el clculo tpico que se muestra a continuacin:
40 g --------------1000ml
Xg-----------------0,01 ml
X= 0,0004 g de albumina
0,0004 g de protena X 1000mg/1g= 0,4 mg de albumina
Tabla 6. Valores obtenidos por cada tubo preparado en el paso B.2.1
TUBOS
1
2
3
4
5
6
7
Malbmina
LECTURAS (abs)
mg de protenas
V(ml)
0,300
0,580
0,830
1,100
1,400
1,700
1,960
0,40
0,80
1,20
1,60
2,00
2,40
2,80
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,03
25
0,2
0,4
0,6
0,8
1,2
1,4
1,6
1,8
B.2.7 A partir del valor de absorbancia obtenido en el tubo M alb, trace una paralela
al eje X hasta que intercepte la recta obtenida al graficar los patrones,
posteriormente trace una paralela al eje Y hasta interceptar el eje X; lea los
mg de albumina que le corresponde a su muestra.
B.2.8 Calcule la cantidad de mg de albumina presentes en su muestra de suero.
B.3) Determinacin de globulinas sricas
B.3.1 Determine por diferencia entre el valor de protenas totales y la cantidad de
albumina el valor de globulina
B.3.2 Calcule la relacin albumina/globulinas (A/G).
B.3.3 Analice los resultados obtenidos, explique la importancia de determinar estos
parmetros clnicos e indique patologas asociadas de un valor alterado.
Protenas totales:
Adultos: 5,5 8,0 g/dl (55 80 g/l)
Recin Nacidos (RN): 4,6 -7,0 g/dl (46 70 g/l)
26
V. BIBLIOGRAFA RECOMENDADA
Baynes J., Dominiczak M. 2011. Bioqumica Mdica. 3era. Ed., Editorial Mosby Elsevier. 6:
59-71.
Dufour R., Lott J., Gretch D., y Seeff L. 2005. Gua de laboratorio para screening, diagnstico
y monitoreo de la lesin heptica. Acta de bioquim. Cln. latinoam. 30(3): 359-76.
Graw A., Murphy M., Srivastava R., Cowam R. y OReilly D. 2013. Bioqumica clnica. 5a Ed.
Edit. ELSEVIER. 2:50-53.
Hernry J., Davey F., Herman C., Mcpherson R., Pincus M., Thrette G. y Woods G. 2005. El
laboratorio en el diagnstico clnico. 20a Ed. Edit. MARBAN LIBROS. 13: 249-262.
Kennellly P., Murray R., Bender D., Rodwell V. y Weil A. 2000. Harper. bioqumica ilustrada.
28a Ed. Edit. Mc Graw Hill. 5:31-42.
Rothschild M. y Ortiz M. 1988. Serum albumin. Hepat. 8:385-401.
Wester D., Bignell A. y Atwood E. 1974. A study of the interaction of bromocresol green with
isolated serum globulin fractions. Clin. Chem. Ac. 53:109-115.
27
OBJETIVOS ESPECFICOS
1. Definir el Km y Vmx.
2. Describir la funcin biolgica de la amilasa y su importancia biomdica.
3. Describir cmo vara la actividad enzimtica en funcin de la concentracin de sustrato
y concentracin de enzima.
4. Describir el efecto del pH, temperatura sobre la actividad de la amilasa.
5. Determinar la actividad de la amilasa a pH 3, 5, 7, 9 y 11 bajo concentraciones
saturantes de sustrato.
6. Determinar la actividad de la amilasa a temperaturas de 0, 37, 40 y 50 C bajo
concentraciones saturantes de sustrato.
7. Determinar el efecto de la acarbosa, el cido sulfrico y cloruro de sodio sobre la
actividad de la enzima amilasa bajo concentraciones saturantes de sustrato.
8. Elaborar las grficas de la actividad enzimtica en funcin de la concentracin de
sustrato, variacin de pH, variacin de temperatura y variacin en presencia de
inhibidores.
I.
INTRODUCCIN
Las enzimas son catalizadores biolgicos que se encargan de realizar todas las
transformaciones energticas que ocurren en un organismo, modificando la velocidad de las
reacciones qumicas, ms no el equilibrio final. Para la transformacin de un gran nmero de
molculas de sustrato se requieren, por lo general, pequeas cantidades de enzima.
Las enzimas son protenas caracterizadas por su gran actividad y especificidad, ya
que catalizan un nmero pequeo de reacciones y en algunos casos tan solo una reaccin.
Las enzimas funcionan bajo condiciones muy definidas de pH, temperatura, concentracin de
sustrato y cofactores, siendo muy susceptibles a los cambios de cualquiera de estos
parmetros.
Las enzimas se clasifican de acuerdo al tipo de reaccin que catalizan como xidoreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas y ligasas o sintetasas.
La velocidad de una reaccin enzimtica se puede expresar en funcin de la
concentracin del reactante transformado o del producto obtenido con respecto al tiempo,
luego de restar los valores debidos a cualquier transformacin no enzimtica.
28
29
Hgado/Vescula
biliar
Intestino delgado
Intestino grueso
II. MATERIALES
Equipos generales:
Gradillas
Pipetas
Tubos de ensayos
Beakers
Bao termosttico (0, 37, 40 y 60 C.)
Espectrofotmetro.
30
Reactivos:
III.
PROCEDIMIENTO
BUFFER
pH 7,2
(ml)
INCUBACIN
Por 5 min
Enzima
(ml)
Tiempo de
Reaccin
(min)
LUGOL
(ml)
AGUA
(ml)
37C
0,5
6,5
1,5
37C
0,5
6,0
2,0
37C
0,5
5,5
2,5
37C
0,5
5,0
3,0
37C
0,5
4,5
ABSORBANCIA
A 600 nm
31
B.2
Rotule como control 1 (C1), control 2 (C2), control 3 (C3), control 4 (C4) y
control 5 (C5) y preprelos as como se muestra en el siguiente cuadro:
CONTROLES
Sustrato
(ml)
BUFFER
pH7,2
(ml)
INCUBACIN
Por 5 min
LUGOL
(ml)
Tiempo
De
reaccin(min)
AGUA
(ml)
C1
C2
C3
C4
C5
1
1,5
2,0
2,5
3,0
1
1
1
1
1
37C
37C
37C
37C
37C
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
7
6,5
6,0
5,5
5,0
ABSORBANCIA
A 600 nm
B.3
Construya una grfica de tendencia de la absorbancia (Abs) vs cantidad de
mmoles de almidn total (CT), usando los valores obtenidos con los controles (vease
fig. 9).
Grfica de tendencia del almidn en funcin de la absorbancia
5
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
0,5
1,5
2,5
B.4 Calcule la cantidad de mmoles metabolizados del sustrato (CS) por diferencia entre la
cantidad de mmoles totales (CT) correspondiente a cada controles C1, C2, C3, C4 y C5 y la
cantidad de mmoles no metabolizados (CN).
a) CS (mmoles metabolizados)= CT (mmoles totales) - CN (mmoles remanentes o No metabolizados)
b) Vo = Cs/TR (mmol metabolizados/min)
32
CN
(mmoles/l)
CS
(mmol/l)
Vo
(CS/TR)
1/Cs
1/Vo
1
1,5
2,0
2,5
3,0
B.4
0,5
1
1,5
2
Concentracin de sustrato, Cs (mmol/l)
2,5
33
1/Vo
2
1,5
1
0,5
0
-0,4
-0,2
0,2
0,4
0,6
0,8
1,2
1/Cs
-1/Km
BUFFER
pH 7,2
(ml)
INCUBACIN
por 5min
Enzima
(ml)
TR
(min)
LUGOL
(ml)
AGUA
(ml)
1
1
1
1
1
1
1
1
37C
37C
37C
37C
0,2
0,4
0,6
0,8
2min
2min
2min
2min
1
1
1
1
6,8
6,6
6,4
6,2
LECTURA DE LA
ABSORBANCIA A
600 nm
BUFFERpH 7,2
(ml)
1
INCUBACINPor 5
min
37C
LUGOL
(ml)
1
TR
(min)
2
Agua
(ml)
7
LECTURA
DE
LA
ABSORBANCIA A 600 nm
34
CT
(mmol/l)
CN
(mmol/l)
Cs
(mmol/l)
E
(ml)
Vo
(mmol/min)
0,2
0,4
0,6
0,8
14
12
10
8
E4
E3
E2
E1
2
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
35
BUFFER
(1ml)
INCUBACIN
por 5min
Enzima
(ml)
TR
(min)
LUGOL
(ml)
AGUA
(ml)
1
1
1
1
1
1 ml pH 3
1ml pH 5
1 ml pH 7,2
1ml pH 8,0
1ml pH 11,0
37C
37C
37C
37C
37C
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
2
2
2
2
2
1
1
1
1
1
6,5
6,5
6,5
6,5
6.5
LECTURA DE LA
ABSORBANCIA A
600 nm
BUFFER
1 (ml)
pH 5
pH 7,2
pH 8,0
pH 11,0
INCUBACIN
Por 5 min
37C
37C
37C
37C
LUGOL
(ml)
1
1
1
1
TR
(min)
2
2
2
2
AGUA
(ml)
7
7
7
7
LECTURA
DE
LA
ABSORBANCIA A 600 nm
D.3
Calcule CS por diferencia de CT (correspondientes a los controles) y CN(almidn
no hidrolizado)
a) CS (mmoles metabolizados) = CT - CN
b) Vo (mmol metabolizado/min)= Cs/TR
D.4
S(ml)
CN
(mmol/l)
CS
(mmol/l)
pH
(ml)
Vo
(mmol
metabolizado/min)
3
4
5
7
11
36
6
5
4
3
2
1
0
0
3
4
5
6
7
8
9
Solucin amortiguadora, pH (adimensional)
10
11
12
BUFFER
pH 7,2(ml)
INCUBACIN
por 5 min
E
(ml)
TR
(min)
LUGOL
(ml)
AGUA
(ml)
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
0C
37C
40C
50C
0,5 ml
0,5 ml
0,5 ml
0,5 ml
2
2
2
2
1ml
1ml
1ml
1ml
6,5 ml
6,5 ml
6,5 ml
6,5 ml
LECTURA DE LA
ABSORBANCIA A
600 nm
E.2
Prepare los controles incubando a la temperatura que corresponda segn el
siguiente cuadro:
Sustrato
(ml)
1
1
1
1
BUFFER
pH
7,2
(ml)
1
1
1
1
INCUBACIN
Por 5 min
LUGOL
(ml)
TR
(min)
AGUA
(ml)
0C
37C
40C
50C
1
1
1
1
2
2
2
2
7
7
7
7
LECTURA DE LA ABSORBANCIA A
600 nm
37
E.3
Calcule CS por diferencia de CT (correspondientes a los controles) y los CN,
utilice la ecuacin sealada en la seccin D paso 3.
E.4
S
(ml)
1
CN (mmo/l)
CS (mmol/l)
Temperatura
(C)
Vo
(mmol metabolizado/ min)
0
37
40
50
E.5
6
5
4
3
2
1
0
0
10
20
30
40
50
60
38
Sustrato
(ml)
0,5
1
1,5
0,5
1
1,5
0,5
1
1,5
Buffer
(ml)
INCUBACIN
por 5 min
INHIBIDOR
( ml)
37C
37C
37C
ACARBOSA
ACARBOSA
ACARBOSA
H2HSO4,
H2HSO4,
H2HSO4,
NaCl
NaCl
NaCl
Enzima
(ml)
TR
(min)
LUGOL
(ml)
0,5
2 min
2 min
2 min
2 min
2 min
2 min
2 min
2 min
2 min
0,5
0,5
AGUA
(ml)
LECTURA
DE ABS A
600 nm
6,0
5,5
5,0
6,0
5,5
5,0
6,0
5,5
5,0
BUFFER
(ml)
SUSTANCIA
(ml)
INCUBACIN
Por 5 min
LUGOL
(ml)
TR (min)
AGUA
(ml)
ACARBOSA
37C
2 min
H2SO4
37C
2 min
NaCl
37C
2 min
6,0
5,5
5,0
6,0
5,5
5,0
6,0
5,5
5,0
0,5
1
1,5
0,5
1
1,5
0,5
1
1,5
ABS a 600
nm
F.3 Calcule CS por diferencia entre CT (correspondientes a los controles) y CN, utilice la
ecuacin sealada en la seccin D paso 3.
F.4 Complete el siguiente cuadro
Sustrato
(ml)
0,5
1,0
1,5
CT
CN
SUSTANCIA
CS (mmol/l)
Vo
(mmol
metabolizado/min)
Acarbosa
H2SO4
NaCl
Acarbosa
H2SO4
NaCl
Acarbosa
H2SO4
NaCl
39
NaCl
H2SO4
1,5
ACARBOSA
0,5
0
0
0,5
1,5
2,5
3,5
1/Vo
1,5
NaCl
H2SO4
ACARBOSA
0,5
0
-2
-1
0
-0,5
1/CS
40
F.7 A partir de cada recta obtenida, prolnguela hasta conseguir un punto de corte en el
eje X. Analice el Km y Vmax obtenido (Puntos de corte con los ejes X y Y
respectivamente, como se indica en la Figura 11) y explique la accin ejercida por
cada sustancia X sobre la velocidad de la reaccin e indique el tipo de inhibidor.
IV.
BIBLIOGRAFA RECOMENDADA
Baynes J., Dominiczak M. 2011. Bioqumica Mdica. 3era. Ed., Editorial Mosby Elsevier.
6:59-71.
Murray R., Bender D., Botham K., Kennelly P., Rodwell V. y Weil P. 2000. Bioqumica
ilustrada. 28va. Ed. Editorial McGraw-Hill. 8:62-83.
41
OBJETIVOS ES PECFICOS
1.- Describir el mecanismo de accin del sistema Enzima-Coenzima.
2.- Describir el concepto de Isoenzima
3.- Interpretar un diagrama de flujo
4.- Extraer una enzima y una coenzima tisular
5.- Diferenciar mtodo de extraccin para una enzima y para una coenzima
6.- Describir el mecanismo de accin del Azul de Metileno.
7.- Describir el papel del aceite en los tubos de reaccin.
8.- Interpretar la actividad enzimtica en distintos extractos tisulares.
I.
INTRODUCCIN
Todas las enzimas conocidas son protenas, muchas de ellas contienen grupos no
proteicos (carbohidratos y lpidos). Es por eso que se les puede clasificar en protenas
simples o conjugadas.
La enzima conjugada activa es denominada holoenzima, su grupo no proteico puede
ser coenzima o un grupo prosttico, y su parte proteica se denomina Apoenzima. Las
diferencias entre la Apoenzima y la coenzima se pueden tabular de la siguiente forma:
Naturaleza
Termolbil
Dializable
Peso molecular
Apoenzima
Proteica
S
No
Alto
Coenzima
No proteica
No
S
Bajo
42
Las Isoenzima son mltiples formas moleculares de una misma enzima que catalizan
la misma reaccin global.
Un buen ejemplo de Isoenzima es la L-lactato: NAD+ xido-reductasa (LDH) utiliza
L-lactato y NAD+, como sustrato y coenzima, respectivamente. Est formada por cuatro
cadenas polipeptdicas, su PM de 134.000 Dalton. Electroforticamente, se diferencian cinco
fracciones moleculares, con Km especficos para cada sustrato.
Las fracciones moleculares extradas del msculo esqueltico, contienen
predominantemente, fraccin M, las del miocardio, fraccin H. Existen adems, agregados
en diferentes combinaciones: M4, M3H, M2H2, MH3 y H4 en estos mismos tejidos y en
hgado. La variedad M4 y M3H, predomina en los tejidos con capacidad glucoltica
(msculo esqueltico blanco y tejidos embrionarios). La MH3 y H4, predominan en
tejidos con actividad aerbica (Corazn).
Las concentraciones bajas de oxgeno en los tejidos, estimulan la formacin de
lactato, a partir de glucosa, formando parte del ciclo de Cori. La nicotinadenindinucletido
(NAD+), es una coenzima de gran importancia en las reacciones metablicas de xidoreduccin, y es la que acta junto con la Lactato NAD+ Oxido-reductasa.
Su mecanismo de reaccin puede ser expresado:
COOH
NAD+
NADH+ H+
C=O
HO - C - H
CH3
COO-
Lactato
CH3
Piruvato
43
II.
MATERIALES
Material general:
Hielo
Balanza basculante
Frascos de centrfuga
Membranas de dilisis
Gradilla para pipeta (1)
Bao de Mara a 37C (4)
Reactivos:
Material Biolgico:
III.
PROCEDIMIENTO
44
A.3 Hacer un corte en la regin anterior del cuello (paquete vsculo-nervioso), dejar
desangrar (con el objeto de eliminar la LDH y lactato presentes en eritrocitos y
plasma).
A.4 Extraer rpidamente el corazn, hgado y msculo del animal de experimentacin.
A.5 Determinar el peso del tejido y registrarlo (con el objeto de obtener un parmetro de
peso como referencia).
A.6 Seguir el esquema (ver fig. 17) para la obtencin y separacin de la enzima (LDH) y la
coenzima (NADH+H+).
Agregarle 10 ml de buffer fosfato NaCl 0,9% por gramo de tejido
Homogeneizar en fro (Omnimixer), 10 min
Enfriar
Sobrenadante
Descartar
(centrifugado)
Descartar
(centrifugado)
Dializar 24 h
contra agua dest.
(enzima dializada)
Sobrenadante
guardar
(coenzima)
Guardar
(enzima sin
dializar)
1
2
----2
1
3
2
--2
2
2
1
1
3
2
--2
2
1
1
4
--2
--2
1
3
5
2
--2
--1
3
6
--2
2
--1
3
7
----2
2
1
3
TUBOS
1) Control de coenzima con enzima sin dializar
2) Control de reaccin con enzima dializada
MANUAL PRCTICO DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA
45
IV. EJERCICIOS
1.- Cmo aplicara usted el hecho que, el Azul de Metileno una vez decolorado por accin
Enzimtica recupere nuevamente su color?
2.- En cul o cules de los tubos se observar decoloracin del Azul de Metileno, y por
qu?
3.- Qu resultado pueden tener concentraciones altas de oxgeno sobre la protena
cataltica estudiada?
4.- Qu relacin (es) observ en los resultados de la actividad de la L-lactato NAD+ :
oxido - reductasa del tejido procesado por usted y los resultados obtenidos por sus
compaeros en otros rganos?
5Cul sera el mtodo ideal para separar el complejo Enzima-Coenzima?
V. BIBLIOGRAFA RECOMENDADA
Moreno Y, Jos. 1986. Conceptos Fundamentales de Bioqumica. Vol. I Enzimas. Teora y
problemas. Ed. Espasande 1era Ed.
Murray R., Bender D., Botham K., Kennelly P., Rodwell V. y Weil P. 2000. Bioqumica
ilustrada. 28va. Ed. Editorial McGraw-Hill. 8:62-83.
Orten J. y Neuhaus O. 1984. Bioqumica Humana. 10ma Ed. Panamericana.
MANUAL PRCTICO DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA
46
OBJETIVO GENERAL
Analizar el fundamento y la metodologa de los procesos de aislamiento y
cuantificacin del glucgeno heptico y muscular en ratones alimentados y ayunados.
OBJETIVOS ESPECFICOS
1. Describir un mtodo de extraccin de glucgeno a partir de tejido heptico y
muscular.
2. Explicar qu sucede durante dicha extraccin con las protenas, lpidos e hidratos de
carbono.
3. Cuantificar glucgeno heptico y muscular proveniente de los animales de
experimentacin.
4. Explicar el fundamento de la reaccin de la Antrona.
5. Comparar los resultados obtenidos en animales de experimentacin en ayunas y
alimentados con respecto a los valores de glucgeno en seres humanos.
6. Referir los resultados obtenidos con metabolismo normal y 24 horas despus de
recibir solamente solucin fisiolgica.
7. Describir el papel del glucgeno como reservado energtico en tejido heptico y
muscular.
8. Enumerar otros factores que influyen en la glucogenlisis y gluconeognesis y
explique la accin hormonal.
I.
INTRODUCCIN
47
una concentracin de glucgeno almacenado de hasta 5-7 g por 100 g de tejido en seres
humano. En el msculo esqueltico, el glucgeno se utiliza como combustible glucoltico de
la propia clula, aunque, en este caso, acoplado a las necesidades de su especfica funcin
contrctil. Su papel es muy diferente en el hgado; la glucosa producida en la glucogenlisis
es liberada al lquido extracelular para ayudar a mantener la glicemia, principalmente durante
la fase postabsortiva y ser utilizada por todos los tejidos.
48
49
II.
MATERIALES
Materiales Generales:
Barra decapitadora
Papel Peridico
Capsulas de Petri (4)
Material de ciruga (trado por el
alumno)
Balanza granatoria
Una gradilla con 2 tubos de
centrfuga
graduados
que
contenga 4ml KOH 30%
2 pinzas de madera
2 mecheros + 2 trpodes + 2
recipientes metlicos con agua
hirviendo
Centrifuga Clnica (1)
Espectrofotmetro (2)
Material de vidrio:
Reactivos:
KOH 30%
Etanol 95%
Standard de glucosa (0.2 mg/ml)
Antrona
50
III.
PROCEDIMIENTO
51
SACRIFICAR
DESANGRAR
EXTRAER EL
HGADO Y
MSCULO
ESQUELTICO
PESAR 0,5 GRAMOS DE CADA TIPO DE
TEJIDO
(HEPTICO Y MUSCULAR)
CALENTAR EN AGUA
HIRVIENDO
POR 20 MIN
ENFRIAR
AGREGAR 7 ml de
etanol al 95%
Enfriar
Sobrenadante:
descartar
Precipitado:
Evaporar en alcohol
remanente
Fig. 20 Esquema del aislamiento del glucgeno del tejido heptico y muscular.
52
Mida 0,5 ml S1
Diluya
Con 10 ml
de H2O
Solucin 1 (S1)
Volumen Total: 10 ml
Dx2
Diluya
Con 9,5 ml
de H2O
Solucin 2 (S2)
Volumen Total: 10 ml
Dx1
Solucin 3 (S3)
Volumen Total: 6 ml
B.2 Glucgeno obtenido del hgado o del msculo en ratones a los que se les
administr solucin fisiolgica con ayuno, por 48 horas.
Mida 0,5 ml S1 + 2,0 ml de H2O
Diluya
Con 10 ml
de H2O
Solucin 1 (S1)
Volumen Total: 10 ml
Dx2
Solucin 2 (S2)
Volumen Total: 10 ml
A continuacin se rotulan 8 tubos como patrn 1 (P1), patrn 2 (P2), patrn 3 (P3),
patrn 4 (P4), patrn 5 (P5), desconocido ayunado del tejido heptico (Dx1H), desconocido
alimentado del tejido heptico (Dx2H), desconocido ayunado del tejido muscular (Dx3M),
MANUAL PRCTICO DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA
53
desconocido alimentado del tejido muscular (Dx4M) y el blanco (B). Adicione las sustancias
segn se indica en el siguiente cuadro:
VSt(ml)
VH2O (ml)
P1
P2
P3
P4
P5
Dx1H
Dx2H
Dx3M
Dx4M
B
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
----------------------------------------------
2,4
2,3
2,2
2,1
2,0
------------------------2,5
Vantrona (ml)
(ml)
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
Absorbancia
IV.
RESULTADOS
54
Absorbancia, (adimensional)
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
V.
1.
2.
3.
4.
5.
VI.
EJERCICIOS
Cul es el fundamento terico de la reaccin de la Antrona?
Por qu se utiliza el factor 0.9 para conversin del valor de glucosa a glucgeno?.
Qu otras sustancias tienen efectos glucogenolticos?.
Qu sucede con el glucgeno del tejido muscular durante el ayuno?.
Cul es la fuente de energa una vez consumido el glucgeno?.
BIBLIOGRAFA RECOMENDADA
Baynes J., Dominiczak M. 2011. Bioqumica Mdica. 3era. Ed., Editorial Mosby Elsevier. 6:
59-71.
Makee T. y Makee J. 2013. Bioqumica las bases moleculares de la vida. 5a Ed. Editorial
McGraw-Hill. Mxico.
Moreno JM., Manzanares J., Daz MC., Benlloch T. Protocolo de diagnstico y seguimiento
de pacientes con glucogenosis de afectacin fundamentalmente heptica. Madrid. 10:
245-287.
Moreno Y. Jos. 1986. Conceptos fundamentales en Bioqumica: Enzimas. Teora y
Problemas. Ed. Espasanda 1ra ed.
Murray R., Granner D., Mores P., Rodwell V.1994. Bioqumica de Harper. 13va Ed. El manual
moderno.
Orten J. y Neuhaus O. 1984. Bioqumica Humana. 10ma Ed. Ed. Panamericana.
55
OBJETIVOS ESPECFICOS
1.
2.
3.
4.
I. INTRODUCCIN
Los principales constituyentes del tejido adiposo son las grasas neutras. Otros tejidos
ricos en lpidos, tales como el cerebro, contienen relativamente pequeas cantidades de
grasa neutras, estos son ms ricos en cerebrsidos, ganglisidos, esfingolpidos y
sulfolpidos. Los fosfolpidos sencillos: fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina,
etc., son componentes estructurales de todas las membranas celulares en todos los tejidos y
difieren del grado de saturacin de los cidos grasos que los constituyen. Presentan adems
caractersticas funcionales en el transporte de las diversas Lipoprotenas presentes en el
plasma, formando una interfase polar-no polar entre el agua del medio y los lpidos
respectivamente.
En condiciones normales existe una movilizacin de cidos grasos desde hgado hacia
los depsitos (tejido adiposo) como material de reserva energtica, condicin esta que
depende del estado nutricional y fisiolgico del individuo. La forma estructural de reserva es
como triacilglicrido en mayor proporcin. El hgado es el principal encargado de sintetizar
fosfolpidos, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, ganglisido, sulfolpidos,
etc., los cuales son constituyentes estructurales de todas las membranas biolgicas.
En caso de administrar DL-Etionina en dosis crecientes a un animal de
experimentacin, se observar un efecto contrario al caso anterior. El ATP al reaccionar con
la Etionina forma S-Adenosil-Etionina, coenzima no reconocida o no funcional en la sntesis
de fosfatidilcolina. Por lo tanto, sta no se sintetiza y los cidos grasos libres hepticos se
acumularn dando origen a un hgado graso. La S adenosil metionina en vez de saturarse de
metilos lo har de grupos etilos, y no podr cumplir con su funcin en la sntesis de
fosfatidilcolina. Por lo tanto, sta no se sintetiza y los cidos grasos libres hepticos se
acumularn dando origen a un hgado graso.
56
II.
MATERIALES GENERALES
3 Ratas machos normales inyectadas con solucin salina isotnica.
57
III.
IV.
REACTIVOS GENERALES
Mezcla de Folch 2000 ml
ter di etlico 1000 ml
Sulfato de sodio anhidro 200 g.
V.
58
VI. PROCEDIMIENTO
A) EXTRACCIN DE LPIDOS POR EL MTODO DE FOLCH
1. Inyectar 3 ml de una solucin salina de DL-Metionina (16,7 mg d DL-Metionina/ml)
intraperitonealmente a un grupo de ratas machos.
2. Inyectar 3 ml de una solucin salina DL-Etionina intraperitonealmente a otro grupo de
ratas machos.
3. Inyectar 3 ml de una solucin salina isotnica intraperitonealmente a un grupo de ratas
machos, que sirve como control.
4. Repetir los pasos (1, 2 y 3) a las 2 , 5 y 7 horas.
5. Sacrificar los animales 24 horas despus de la primera inyeccin por dislocacin
cervical. (consulte el esquema).
6. Extraiga el hgado y obtenga su peso.
7. Hacer el estudio macroscpico: tamao, color, contextura y elasticidad de los hgados.
Registrar cualquier diferencia observada en los mismos.
8. Prepare el reactivo de Folch (Cloroformo: metanol en la proporcin 2:1). Por cada
gramo de hgado utilizar 20 ml de la mezcla.
9. HOMOGENICE el tejido con el 70% del volumen del reactivo de Folch, y utilice el 30%
restante para lavar el homogenizador.
10. Filtre el homogenizado
11. Al filtrado agrguele 20% del volumen de agua destilada, mezcle bien y centrifugue a
1500 rpm durante 10 min.
12. Coloque el remanente, una vez fro en un embudo de separacin y agrguele beaker y
evapore el solvente en Bao de Mara a ebullicin hasta casi sequedad.
13. Coloque el remanente, una vez fro en un embudo de separacin y agrguele una
porcin de ter dietlico, lavar el beaker con 5 ml de ter dietlico y transferirlo al
embudo de decantacin. Agregar 1 ml de agua, agitar y decantar.
14. Transferir la capa acuosa inferior a otro embudo de decantacin y agregar a sta 5 ml
de ter dietlico. Agitar y dejar decantar. Desechar la capa inferior acuosa la capa
etrea mezclarla con el ter dietlico del primer embudo de decantacin y el papel de
filtro con 3 ml de ter etlico.
MANUAL PRCTICO DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA
59
60
VII.
DESANGRAR
EXTRAER EL HGADO
HOMOGENIZAR Y FILTRAR
MEZCLAR BIEN
CENTRIFUGAR POR 10 MIN A 1500 RPM
CAPA SUPERIOR
CAPA INFERIOR
DESCARTAR
EVAPORAR HASTA CASI SEQUEDAD
TRANSFERIR A EMBUDO DE SEPARACIN
AGREGAR TER DIETLICO + 1Ml DE AGUA
AGITAR
CAPA SUPERIOR
CAPA INFERIOR
TRANSFERIR
EMBUDO
CAPA SUPERIOR
CAPA INFERIOR
DESCARTAR
61
62