Prctica 5

CINTICA ENZIMTICA: DETERMINACIN ESPECTOFOTOMTRICA DE

LA CONSTANTE DE MICHAELIS-MENTEN DE LA PAPANA

1. Objetivo
Se pretende calcular la constante de Michaelis-Menten (KM), la constante
cataltica (kcat) y la velocidad mxima inicial (Vmax) de la reaccin de proteolisis
de un sustrato especfico (N-benzoil-arginina-p-nitroanilida, BAPNA) catalizada
por la protena papana.
2. Fundamento terico
2.1. Actividad enzimtica
Los enzimas son protenas altamente especializadas que catalizan
numerosas reacciones en los sistemas biolgicos. Una propiedad importante es
su especificidad a la hora de reaccionar con sustratos, acelerando
determinadas reacciones qumicas en disolucin.
En general, un enzima proporciona el ambiente en que una reaccin
determinada es, energticamente, ms favorable. El rasgo distintivo de una
reaccin catalizada enzimticamente es que ocurre en un lugar especfico del
enzima, el sitio activo. La molcula fijada en el sitio activo y sobre la que acta
el enzima se denomina sustrato. El complejo enzima-sustrato formado es de
vital importancia para definir el comportamiento cintico de las reacciones
catalizadas. Una reaccin enzimtica sencilla puede formularse como sigue:
E+S

k1
k-1

ES

k2
k-2

E+P

[1]

donde E, S y P representan enzima, sustrato y producto, respectivamente. ES y

EP son complejos del enzima con el sustrato y con el producto.
La funcin del catalizador es aumentar la velocidad de una reaccin
reduciendo la energa de activacin de la misma, Ea. Los catalizadores no
modifican los equilibrios de la reaccin ni se consumen durante el proceso.
En esta prctica se estudia la cintica de ruptura del enlace peptdico de
la molcula N-benzoil-arginina-p-nitroanilida (BAPNA) catalizada por la
papana, una protena de peso molecular 23.400 g/mol (ver Esquema 1).
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Esquema 1

Esta protena pertenece al grupo de enzimas tiol-proteasas, ya que en el

sitio activo se encuentra un grupo sulfhidrilo (-SH). La papana se encuentra en
el extracto de la papaya y tiene varios usos comerciales. Por ejemplo, en la
industria de la cerveza hidroliza protenas que provocan su turbidez. Tambin
es usada para evitar el endurecimiento de la carne, mediante la hidrlisis de
enlaces peptdicos del colgeno de los tejidos conectivos, la elastina y la
actomiosina. Finalmente, tambin se usa en la limpieza de lentes de contacto,
eliminando los depsitos proteicos.
La interaccin especfica con el sustrato (BAPNA) se produce a travs
del residuo de fenilalanina. La hidrlisis de este enlace peptdico genera entre
otros productos de reaccin, la p-nitroanilina, de color amarillo, lo que permite
seguir espectofotomtricamente el progreso de la reaccin mediante la medida
de la velocidad de formacin de este producto. Con este objeto se mide el
aumento de absorbancia de la disolucin con el tiempo, a la longitud de onda
de mxima absorcin de la p-nitroanilina ( max=400 nm, coeficiente de extincin
molar,
= 1.0810-4 M-1cm-1) para distintas concentraciones iniciales de
BAPNA. La concentracin de producto se obtiene aplicando la ley de LambertBeer (A=lc).
2.2. Velocidad de reaccin. Cintica de Michaelis-Menten
La velocidad de una reaccin cualquiera viene determinada por la
concentracin de reactivo/s y por una constante de velocidad, k, y expresada
por una ley de velocidad. Por ejemplo para una reaccin unimolecular o de
primer orden, S
P, la cantidad de S que ha reaccionado por unidad de
tiempo viene dado por la siguiente expresin:
V =

d [S ] d [P ]
=
= k [S ]
dt
dt

[2]

donde k, tiene unidades de s-1 y S de moll-1. As pues, la concentracin de

sustrato, [S], afecta a la velocidad de una reaccin catalizada por un enzima.
No obstante, el estudio del efecto de [S] en una reaccin enzimtica no es
simple. Este tipo de comportamiento cintico es explicado por la teora de
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Michaelis y Menten, que postula que el enzima se combina con el sustrato en

un paso reversible rpido, para dar el complejo ES, segn se muestra en la
reaccin [4].
k1
k2
E + S
ES
E + P
[4]
k-1
La reaccin de esta forma alcanza rpidamente un estado estacionario en el
que [ES] permanece aproximadamente constante con el tiempo. El complejo
ES se descompone seguidamente en un segundo paso ms lento que limita la
velocidad de la reaccin global dando el enzima libre E y el producto de
reaccin P. Por tanto la ley de velocidad para la reaccin global viene
determinada por la etapa ms lenta, segn indica la ecuacin [5]:

V = k 2 [ES ]

[5]

donde V se determina por la descomposicin de ES. Bajo las condiciones de

estado estacionario ([ES]=cte) la velocidad del proceso se mantiene constante
en los primeros estadios de la reaccin y coincide con la velocidad inicial, Vo.
Experimentalmente Vo puede determinarse calculando la pendiente de la
representacin de [P] frente al tiempo (ecuacin [2]).
Adems, a medida que la concentracin inicial de S aumenta,
desplazando el equilibrio hacia la formacin de ES, tambin lo hace Vo hasta
alcanzar un valor constante. Este valor final se denomina velocidad mxima,
Vmax. Esto se observar cuando prcticamente todo el enzima est formando
complejo ES y la concentracin de E libre sea extremadamente pequea
([ES]=[Et], donde Et es la concentracin total de enzima utilizada). En estas
condiciones, el enzima est saturado por el sustrato, de forma que un aumento
adicional en la [S] ya no tiene efecto sobre la velocidad inicial del proceso. De
esta manera, se puede definir que Vmax = k2[Et], la cual vara de un enzima a
otro, y donde k2 se define de manera general como kcat, una constante de
velocidad de primer orden que se denomina nmero de recambio.
Utilizando la aproximacin del estado estacionario, se obtiene la Ecuacin de
Michaelis-Menten:

Vo =

Vmax [ S ]
Km + [S ]

[6]

La expresin [6] puede transformarse en la Ecuacin de Lineweaver-Burk, la

cual es ms til para la determinacin de Km y Vmax. Esto se lleva a cabo
tomando la inversa de la ecuacin de Michaelis-Menten:

Km
1
1
=
+
Vo Vmax [ S ] Vmax

[7]

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Los parmetros cinticos kcat y Km son tiles para el estudio y

comparacin de los diversos enzimas a travs de su eficiencia cataltica. La
eficiencia cataltica se define como la relacin entre ambos (kcat/Km).
3. Material y reactivos
-

3 matraces aforados de 25 ml
1 matraz aforado de 100 ml
1 erlenmeyer de 100 ml
2 vasos de precipitado de 50 ml
1 embudo
10 tubos de ensayo y gradilla
1 mortero
1 agitador magntico
1 tijeras
parafilm (de uso comn)
Pipetas de 10, 5 y 1 ml
Espectrofotmetro y cubetas
pH metro
Latex de papaya (papana)
N -benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida (BAPNA)
Dimetilsulfoxido (DMSO)
Fosfato monobsico y dibsico de potasio

4. Procedimiento experimental
4.1. Preparacin de disoluciones
- Disolucin 1. Se preparan 100 ml de tampn fosfato 0.1 M a pH 6.0
mezclando 1.19 g de H2KPO4 y 0.214 g de HK2PO4. Se enrasa y se mide el
pH final de la disolucin.
- Disolucin 2. Se pesan 0.5 g de latex de papaya y se divide finamente usando
un mortero. Se adicionan 25 ml de la disolucin tampn de pH 6.0,
previamente medidos en un matraz aforado, a un vaso de precipitado con el
reactivo molido. Agitar la mezcla durante 30 minutos. A continuacin se filtra
2-3 veces, hasta que se elimina la turbidez de la disolucin y se observa que
no queda slido retenido en el papel de filtro.
A continuacin la disolucin obtenida se diluye a la mitad utilizando la
disolucin tampn. Se mide la absorbancia a = 325 nm, cuyo valor debe
estar entorno a 0.7. En dichas condiciones la concentracin de papana
disuelta corresponder aproximadamente a 1.2 mg/l (clculo realizado
mediante el Mtodo de Biuret).
- Disolucin 3. 25 ml de una disolucin de BAPNA 0.015 M en DMSO.

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4.2. Preparacin de mezclas de reaccin. Medidas espectrofotomtricas.

- Se toma en un tubo de ensayo 5 ml de disolucin patrn de BAPNA 0.015 M.
Tambin se preparan por diluciones sucesivas a partir de la disolucin 3, 5 ml
de disoluciones de las siguientes concentraciones: 0.012, 0.009, 0.006 y 0.003
M (disoluciones 4-7, respectivamente).
- Se selecciona una = 400 nm en el espectrofotmetro. Se introducen 2.5 ml
de la disolucin tampn (disolucin 1) en la celda y se aaden 0.5 ml de
disolucin de BAPNA 0.003 M. Se mezcla homogneamente tapando la celda
con un trozo de parafilm. Finalmente, se ajusta a cero el valor de absorbancia.
En otra celda, se sustituye la disolucin tampn por 2.5 ml de disolucin de
papana y se adicionan 0.5 ml de sustrato BAPNA mezclando la muestra de
reaccin como se ha descrito anteriormente. A continuacin se registra la
variacin de absorbancia observada con el tiempo, anotando su valor en
intervalos de 10 s durante un total de 6 minutos.
El proceso se repite en orden creciente de concentraciones para el resto de
disoluciones de BAPNA (disoluciones 6 a 3).
5. Resultados
- Calcular la velocidad inicial de reaccin, Vo, para cada concentracin de
sustrato utilizada, representando los valores de absorbancia frente a tiempo
(Se recomienda la utilizacin de Excel). Expresar la velocidad de formacin de
producto (p-nitroanilina) en unidades de absorbancias-1 y moll-1s-1.
- Confeccionar una tabla con Vo, 1/Vo, [BAPNA] y 1/[BAPNA].
- Representar Vo frente a [BAPNA] y la ecuacin de Lineweaver-Burk a partir de
1/Vo vs 1/[S] (ecuacin [7]). Calcular Vmax, KM y kcat de la reaccin enzimtica.
6. Cuestiones
6.1. Indique si la dependencia de Vo con la concentracin de sustrato sigue la
cintica propuesta por Michaelis-Menten. Cul sera el mecanismo
cintico especfico de reaccin?.
6.2. El valor de KM para la hidrlisis de BAPNA catalizada por la tripsina es de
9.410-2 M y la kcat de 0.611 s-1. Compare los resultados obtenidos para el
caso de la papana. Explique y razone las posibles diferencias observadas.
Qu enzima presenta una mayor eficiencia cataltica(1)?.

(1)

Eficiencia cataltica = kcat/KM

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