Universidad De San Carlos De Guatemala

Facultad De Agronoma
Laboratorio De Bioqumica
Jornada: Matutina 11:00-1:00
Auxiliar De Laboratorio: Gladys Arvalo
Grupo: # 2
INFORME

DE PROTENAS

INTRODUCCIN
Empezaremos por tener en claro que la bioqumica es la qumica de la clula viva.
Se estar estudiando en clase y laboratorio a las biomolculas; que son
compuestos parte de la clula y son componentes estructurales de las sustancias
disueltas en el citoplasma. Ahora nos centraremos en una de las biomolculas
ms importantes en los organismos: Las protenas.
El termino protena proviene del vocablo griego proteicos, que significa primero o
de nivel primario. Las protenas son un grupo de biopolmeros construidos de
aminocidos; estos aminocidos son la unidad monmera de las protenas y estn
unidos por enlaces amido.
Primeramente, los aminocidos son molculas orgnicas que poseen por lo
menos un grupo carboxilo y un grupo amino, en clase se tomaran un grupo selecto
de los aminocidos:20 molculas diferentes, cada una con una estructura qumica
distinta. La combinacin de aminocidos tan diversos en las protenas da lugar a
un nivel de dificultad molecular y de diversidad estructural. La composicin y
secuencia de aminocidos caractersticos de cada protena es lo que le permite
plegarse en un arreglo tridimensional preciso para que lleve a cabo la funcin
bioqumica para la cual fue diseada. Las protenas, como un grupo de
biomolculas, desempean una gran variedad de funciones como: soporte
mecnico a las clulas y a los organismos, y esto lo pueden llevar a cabo por la
enorme posibilidad de combinaciones en la composicin y secuencia de
aminocidos.
En el laboratorio de bioqumica, se estudiaron a las protenas en relacin a lo
agronmico, realizando diferentes pruebas cuantitativas y cualitativas de esta
biomolcula a un rgano vegetal asignado donde para estas pruebas se
seleccion a la (Semilla).

La semilla de garbanzo, fue nuestra herramienta de trabajo en todas las prcticas

realizadas, esta fue previamente preparada, secndola, molindola y tamizndola
antes de realizarle los anlisis qumicos.
En el siguiente informe se describir y explicara las pruebas analticas realizadas a
la muestra de garbanzo, como: las extracciones salinas y acuosas efectuadas
para las pruebas de presencia de protenas con la tcnica de precipitacin de
protenas y biuret, seguidamente se realizaron en las hidrolisis (alcalina y acuosa)
mediante la utilizacin de varios reactivos la identificacin de los diferentes
aminocidos: aromticos, fenlicos, thioaminoacidos y el grupo mirasol,
finalizando con la realizacin de las pruebas de caracterizacin de aminocidos
con reactivos, cromatografa en capa fina donde como adsorbente se utiliz
silicagel y la espectrofotometra donde medimos la tramitansia y calculamos la
absorbancia.

OBJETIVOS
Objetivo General

Obtencin de la capacidad para la aplicacin de pruebas cualitativas y

cuantitativas realizadas en el laboratorio, identificando
protenas y
aminocidos a una muestra vegetal (semilla de garbanzo).

Objetivos Especficos

Realizacin de extracciones de protenas; salina y acuosa a la muestra

vegetal, aplicando las pruebas de deteccin de protenas, como:
precipitacin proteica y Biuret.

Elaboracin de la hidrolisis acida y alcalina de protenas a la muestra

vegetal, determinando mediante pruebas de reactivos la presencia o
ausencia de diferentes aminocidos como: aromticos, fenlicos,
thioaminoacidos y presencia de histidina (grupo mirasol).

Empleo de tcnicas como cromatografa en capa fina y espectrofotometra

para realizar los anlisis cualitativos y cuantitativos de aminocidos en la
muestra vegetal.

RESULTADOS
1. Preparacin de muestras vegetales para anlisis qumico secado, molido y
tamizado de muestras vegetales:
Cuadro No.1
Semilla Garbanzo
Cantidad de semilla utilizada para la
obtencin de harina
Peso semilla hmeda
Sobre 1
Sobre 2
Peso semilla seca
Porcentaje de humedad
Molienda
% perdida en molienda
Tamizado
% perdida en tamizado
Fuente:Pruebas realizadas por el grupo
bioqumica.

Resultados
456.1 gramos
456.1 gramos
212.67 gramos
238.44 gramos
451.119
1.09%
445.25 gramos
1.29%
133.40
70.04%
en la practica 5 de laboratorio de

Porcentaje de humedad (semilla)

= 1.09% en semilla seca.

= 1.29%

= 70.04%

Total de harina obtenida: 133.40 gramos.

2. Extraccin y estudio cualitativo de protenas en muestras vegetales
Resultados de la Prueba de Precipitacin proteica

Cuadro No. 2
Muestra analizada
Extracto acuoso

Metal utilizado
Acetato de plomo

Dictamen
positivo

Extracto salino

Acetato de plomo

Positivo

Peptona

Acetato de plomo

Positivo

Albumina

Acetato de plomo

positivo

Casena

Acetato de plomo

Positivo

Gelatina

Acetato de plomo

positivo

Fuente:Pruebas realizadas por el grupo en la practica 3 de laboratorio de

bioqumica.
Resultados de la Prueba de Biuret
Cuadro No. 3
Muestra analizada
Coloracin obtenida
Dictamen
Extracto acuoso
Violeta claro
positivo
Extracto salino
Violeta fuerte
positivo
Peptona
Violeta fuerte
positivo
Albumina
Violeta claro
positivo
Casena
Azul
positivo
gelatina
Violeta claro
positivo
Fuente:Pruebas realizadas por el grupo en la practica 3 de laboratorio de
bioqumica.
3. Estudio de aminocidos de muestras vegetales
Cuadro No.4
Muestras
analizar

Pruebas
Ninhidrina Xantoproteica Million

Sulfuro

Bromo

Hidrolizado
acuoso bsico

Positivo

Positivo

Negativa Negativa

Negativa

Hidrolizado
acuoso cido

Positivo

Positivo

Negativa Positivo

Negativa

Hidrolizado
salino bsico

Positivo

Positivo

Negativa Negativa

Negativa

Hidrolizado
salino acido

Positiva

Positiva

Negativa Positivo

Negativa

Fuente:Pruebas realizadas por el grupo en la practica 4 de laboratorio de

bioqumica.
Cuadro No.5
Pruebas cualitativas de aminocidos aplicadas a soluciones patrones.
Solucin
Patrn
Lisina
Triptfano
Tirosina
Leucina
Histidina
Cistena
Fenilalanina

Ninhidrina
Positiva
Positiva
Positiva
Positiva
Positiva
Positiva
Positiva

Pruebas
Xantoproteica
-Positiva
Positiva
---Positiva

Million
--Positiva
-----

Sulfuro
-----Positiva
--

Bromo
----Positiva
---

Fuente:Pruebas realizadas por el grupo en la practica 4 de laboratorio de

bioqumica.
4. Estudio de aminocidos,
espectrofotometra.

cromatografa

de

aminocidos

Espectrofotometra de Protenas.

Cuadro No.8
No Tubo
Muestra
.
Primario Primaria
1

Tubo
Secundari
o

9. 5 ml
NaSO4+
F
0.5
albumina.
9. 5 ml
NaSO4+ G
0.5 Sol X.

Concentraci
Muestra
ml
Tramitancia Absorbancia n de Protena
Secundaria Muestra
(mg/ml)
Albumina

4 ml

99

0.00436480

1.00

4 ml

97

0.01322826

3.03

9. 5 ml
NaSO4+
H
S. Salina
4 ml
94
0.02687214 6.16
0.5
S.
Salina
9. 5 ml
NaSO4+
I
S. Acuosa 4 ml
97.5
0.01099538 2.52
0.5
S.
Acuosa.
Fuente:Pruebas realizadas por el grupo en la practica 5 de laboratorio de
bioqumica.
Cromatografa en capa fina de aminocidos.
a) Valores Experimentales Rf.
Cuadro No.6
Dist.
Dist. Fase
No. Muestras
Muestra
Mvil (cm)
(cm)
1
Triptfano 9.85
6.5

Rf
Muestras
0.659898

Cistena

9.85

0.7

0.071066

Hisitidina

9.85

1.4

0.142132

Coloracin
Amarillo
Purpura/
Rojizo
Purpura/
Rojizo
Amarillo

Tirosina

9.85

Acuoso
Acido
9.85
Garbanzo

4.7

4.55

0.477157

0.461929

Purpura/
Rojizo

Purpura/
Salino
Rojizo
8
9.85
4.60
0.467005
Acido
Garbanzo
Fuente:Pruebas realizadas por el grupo en la practica 5 de laboratorio de
bioqumica.
b) Valores tericos de Rf de algunos aminocidos.
Cuadro No.7
Aminocido
Triptfano
Cistena

D.
Muestra D. Fase Mvil Rf
(cm)
(cm)
6.5
9.85
0.659898
0.7
9.85
0.071066

color
Amarillo
Violeta

Histidina
1.4
9.85
0.142132
Rojo
Tirosina
4.7
9.85
0.477157
Amarillo
. Fuente:Pruebas realizadas por el grupo en la practica 5 de laboratorio de
bioqumica
c) Valores

Experimentales

Rf.

DISCUSIN DE RESULTADOS
1. Seleccin del material vegetal a trabajar en el laboratorio
Las semillas tienen cierto contenido de humedad, por lo cual al pesarlas cuando
no se le ha realizado ningn secado, en comparacin con las que ya se les ha
realizado el secado pesan menos ya que se ha suprimido la cantidad de humedad
que estas tenan.
Para esta tcnica del secado se utiliz el mtodo de secado al horno, que es una
tcnica de secado artificial, esta es mucho ms rpida, que una tcnica de secado
natural ya que no hay descomposicin de constituyentes por lo cual es una tcnica
muy recomendable pero mucho ms tardada para la eliminacin total del agua.

2. Preparacin de muestras vegetales para anlisis qumico secado, molido y

tamizado de muestras vegetales

Durante el proceso de molienda es de suma importancia contar con el proceso de

secado, puesto lo que se pretende con dicha tcnica es la obtencin de pequeas
fracciones del rgano ya homogenizado para la posterior evaluacin de los
compuestos qumicos con los que el rgano de la planta cuente. Es as como se
logr obtener 133.40 gramos de harina tras el proceso de molienda y tamizado,
como tambin un porcentaje de humedad del 1.09% en semilla seca el cual fue
eliminado mediante secado artificial, en donde dicho porcentaje fue la diferencia
de peso de la semilla sin haber sido sometida al proceso de secado, menos el
peso de la semilla seca, con el resultado siendo dividido nuevamente por el peso
de semilla seca.
Durante el secado artificial no se debe de exceder una temperatura mayor a los
60C (8) puesto de no ser as las biomolculas se desnaturalizan,
descomponindose de esta manera importantes compuestos de objeto de
evaluacin, para las consiguientes prcticas de protenas y aminocidos.

3. Extraccin y estudio cualitativo de protenas en muestras vegetales

La extraccin proteica se basa en el estudio de las protenas individuales, por
medio de mtodos de separacin de protenas; en la cual se aprovechan las
propiedades de estas mismas tales como la carga, tamao, solubilidad, estructura
y composicin ya que por medio de procesos biolgicos, fsicos y qumicos con
estas propiedades podemos detectar las protenas que se presentan en la muestra
vegetal (Walstra 2005). En esta ocasin se ha realizado una extraccin acuosa y
salina de protenas con el objetivo de obtener el mximo porcentaje de protenas
presentes en muestras vegetales de garbanzo (Cicer arietinum). La extraccin de
protenas se realiza aprovechando la solubilidad de stas en diferentes
compuestos, es vlido decir que para esta muestra las posibles protenas
extradas son globulares, como albuminas, ya que ste grupo de protenas son
solubles en agua. Adems de la extraccin acuosa, se realiz una extraccin
salina, con esta extraccin se pudo haber solubilizado las protenas como gelatina
y peptona las cuales se disuelven bien en solucin salina. Con esta extraccin se
logra aumentar la cantidad de protena solubilizada que se conoce como efecto
salling-in.
En esta prctica se hacen los dos tipos de extraccin para garantizar el mximo
porcentaje de protenas solubilizadas, es decir, las protenas que no se extraen
con medio acuoso son extradas con medio salino y viceversa.
Independientemente del tipo de extraccin en estas muestras, en definitiva, se
espera que las protenas sean globulares ya que a diferencia de las fibrosas stas
solubilizan en soluciones acuosas y salinas. Haciendo referencia a lo anterior, de

hecho el garbanzo es rico en contenido protenico con alrededor de 28.9 % de

cada 100 gramos y entre estas protenas se encuentran la tiamina, riboflavina,
niacina que son de composicin conjugada y adems de estructura globular
(Cozzone, 2002).
Una vez que se tuvo los extractos acuoso y salino se procedi a realizar unas
pruebas de caracterizacin cualitativa para determinar y comprobar la existencia
de protenas.
El mtodo de precipitacin proteica por medio de metales pesados se basa en
que las sales de que poseen los metales pesado precipitan las protenas porque el
ion del metal pesado muy probablemente se combina con la forma aninica de la
protena, ya que la protena en el lado alcalino de su punto isoelctrico existe
como ion negativo y eso al combinarse con el ion del metal formara proteinatos, lo
cual se pudo observar en este experimento ya que todas las muestras analizadas
presentaron un precipitado de color Blanco unos con ms intensidad que otros
pero esto debido a la concentracin de protenas que vara de una sustancia a
otra.
REACCION DE BIURET (REACCION DE FEHLING) Es la formacin de
compuestos coloreados de violeta de las protenas en medio fuerte alcalino de las
sales de Cu la reaccin empleada mediante ROONH2 , R CS NH2 (9)

Ejemplo de reactivo biuret en albumina (10)

En esta reaccin de destruyen los enlaces amidos liberando aminocidos, cuando
este enlace de una protena o pptido entra en contacto con este reactivo forma
una coloracin violeta o azul lo cual nos hace saber que la prueba es positiva.
Como se pudo observar en todas las muestras analizadas dieron positivas ya que
todas presentaban una concentracin de protenas en su interior, la intensidad del
color puede variar debido a la concentracin de protenas en la sustancia
analizada pero la ms leve variacin de color indica la presencia de protenas.

4. Estudio de aminocidos de muestras vegetales

Para poder realizar la identificacin de aminocidos en las soluciones de extracto
de protenas primero se realiz la hidrlisis salina y acuosa, en medios cido y
bsico. Esto con el fin de que por medio de la presin y alta temperatura se
lograra la ruptura de los enlaces peptdico existente entre los aminocidos de las
protenas. Ya que con ese propsito se realiza el proceso de hidrlisis, puesto que
es un proceso de rompimiento del enlace peptdico con lo que se producen
aminocidos libres al realizar las diferentes pruebas con los reactivos indicados,
se obtuvieron soluciones patrn es positivas, como era de esperarse. La
Ninhidrina al reaccionar con lisina, triptfano, tirosina, leucina, histidina y cistena,
y tambin en los hidrolizados y los resultados de todas las muestras presentaron
una coloracin azul-violeta-rosa, No todas las protenas reaccionaron con igual
intensidad, seguramente la diferencia de concentracin colorimtrica ha debido ser
por la cantidad de aminocidos presente en cada muestra analizada, es de
esperar que no todas las protenas contengan el mismo porcentaje de enlaces
peptdico en su estructura, y por ende, la cantidad que reacciona es menor lo cual
se refleja de forma cualitativa en la reaccin llevada cabo, el que se haya
presentado un cambio en el color nos da la pauta a pensar que en el hidrolizado
haba seguramente presencia de -aminocidos y con pH bajos. De hecho, todas
las protenas tienen por lo menos un -aminocido en su estructura. Pues como
cita Wharton (1978)La Ninhidrina es un poderoso agente reactivo comn para
visualizar las bandas de separacin de aminocidos por cromatografa o
electroforesis. Reacciona con todos los aminocidos alfa cuyo pH se encuentra
entre 4 y 8, dando una coloracin que vara de azul a violeta intenso. Con la
prueba Xantoproteica los hidrolizados tanto acosos como el salino, el triptfano, la
tirosina y la fenilalamina dieron el color naranja-amarillo esperado y dado que la
tonalidad de los colores era bastante intensa podemos decir que en solucin haba
una gran cantidad de aminocidos disueltos y, por ende, cabra decir que estos
aminocidos contienen grupos nitro aromtico. El color amarillo-naranja que se
apreci confirma que en esa muestra hay aminocidos que contienen anillos en su
estructura y que al reaccionar formaron algn compuesto nitrado dada la influencia
de reactividad del cido ntrico que se utiliz. De hecho, de los veinte aminocidos
esenciales nicamente la Fenilalamina, el triptfano y la tirosina contiene anillos
bencnicos en su estructura por lo que es permitido decir que en esas muestras
haba tales aminocidos presentes. Esta prueba sirve para caracterizar
aminocidos bencnicos. En esta prueba se produce la nitracin del anillo
bencnico presente en los aminocidos de tirosina y triptfano, obtenindose
nitrocompuestos de color amarillo, que se vuelven anaranjados en medio
fuertemente alcalino (formacin del cido pirmicoo trinitrofenol) Con el reactivo
milln la tirosina dio resultado positivo, comprobado en el compuesto rojizo que se
form luego de la reaccin; resultado esperado ya que contiene radicales

hidroxibenceno en su estructura molecular y los hidrolizados dieron negativo, con

esto se determin que seguramente en ellos no se encuentran radicales
hidroxibenceno. Al calentar la solucin se obtuvo un cambio en la coloracin rojo
ladrillo ya que las sustancias se disolvieron dejando como resultado prueba
positiva para reaccin de aminocidos. La prueba de bromo, que se realiz con la
histidina, se form el producto azul-violeta que se esperaba; ya que se logr la
ruptura de los grupos imidazol contiene la histidina y en los hidrolizados
nuevamente fueron negativos ya que posiblemente el garbanzo no posee grupos
imidazol o en el proceso de hidrolisis no hubo ruptura de estos mismos; Para
completar el anlisis de las pruebas patrn, se hizo la prueba de sulfuro con el
triptfano cuya formacin de un precipitado grisceo de su producto indica un
resultado positivo, y para los hidrolizados dieron unicamente los hidrolizados
cidos tanto salino como acuoso. Ahora bien, respecto a las pruebas realizadas a
los hidrolizados acuosos y salinos, los resultados obtenidos que indican en el
cuadro 2. En donde se observa que todas las muestras de los hidrolizados
contenan cierto porcentaje de aminocidos, aunque muy bajo. La diferencia de la
coloracin en comparacin con los patrones seguramente radica en la cantidad de
aminocidos que contiene cada muestra.
5. Estudio de aminocidos,
espectrofotometra.

cromatografa

de

aminocidos

a. Cromatografa.
La cromatografa es una tcnica que permite la separacin de molculas
diferentes presentes en una misma muestra. El mtodo est basado en la
circulacin de una fase mvil (que arrastra a la mezcla de compuestos a separar),
a travs de una fase estacionaria. Dependiendo de la afinidad relativa que por
ambas fases tengan los distintos compuestos presentes en la mezcla resultar su
separacin. (12)
Las muestras de triptfano, Cistena, Histidina y Tirosina presentaron Rfs de
0.659898 0.071066 0.142132 y 0.477157 respectivamente; Las muestras
restantes (soluciones Acuosas y Salinas acidas de la semillas de garbanzo),
presentaron un Rf de 4.55 y 4.60 mostrando dos fases claramente visibles que
coincidan con las distancias de Tirosina, estos resultados se deben a que las
semillas pueden poseer este grupo de aminoacidos, aunque por posible
contaminacin en la muestra y por no realizar debidamente el procedimiento
necesario, el resultado puede estar errneo ya que en la prueba de Millon dieron
negativas, pero segn lo investigado que por cada 100 g de garbanzo se obtiene
710 mg de tirosina.

b. Espectrofotometra.
Las leyes de la absorcin de energa radiante hacen referencia a las relaciones
existentes entre la magnitud de la absorcin de energa radiante y la cantidad de
la sustancia absorbente. (13).
En base al fundamento anterior se dice que por medio de la espectrofotometra se
puede determinar la concentracin de protenas debido a la absorbancia y
transmitancia que estas tienen de la energa radiante incidente sobre ellas.
Obteniendo la transmitancia de cada sustancia se pudo calcular la absorbancia, y
as poder conocer la concentracin de protenas contenidas en ellas. Las
concentraciones obtenidas fueron 3.56 mg/ml en el extracto acuoso y 4.62 mg/ml
en el extracto salino, por lo tanto, si hay presencia de protenas en los extractos de
la muestra vegetal, se afirma el resultado obtenido en las pruebas de metales
pesados y en el resultado obtenido en la prueba de Biuret por segunda vez. Se
puede decir que las protenas se diluyen ms en el extracto acuoso que en el
extracto salino, ya que las altas concentraciones de sales contenidas en la
solucin tienden a precipitar a las protenas, tal fenmeno se conoce como
salting-out y por esto se observa una menor concentracin en el extracto
acuoso que en el extracto salino.

CONCLUSIONES

Los dos tipos de extraccin acuosa y salina en la muestra vegetal de

garbanzo, se realizaron para garantizar el mximo porcentaje de protenas
solubilizadas, esto quiere decir, las protenas que no se extraen con el
medio acuoso son extradas con el medio salino y viceversa. Del tipo de
extraccin en esta muestra en definitiva se espera que las protenas sean
globulares pues a diferencia de las fibrosas stas solubilizan en soluciones
acuosas y salina. Antes de continuar con las siguientes pruebas, debemos
identificar la presencia de protenas; la prueba realizada a nuestra muestra
mostro positivo indicndonos la presencia de esta biomolcula.

Con los aminocidos libres obtenidos por los hidrolizados de protenas,

aplicamoslas pruebas de caracterizacin cualitativa de aminocidos, Al
saber primeramente que tenemos protenas con las pruebas de
precipitacin proteica o biuret, se realizara la prueba de aminocidos,
sabiendo que hay aminocidos aromticos, fenlicos, thioaminoacidos, el
grupo imidazol, entre otros. Las pruebas positivas a nuestra muestra fueron
las de: Xantoproteica (aromticos), Sulfuro (thioaminoacidos) y Bromo
(Histidina).

Las dos tcnicas utilizadas en el laboratorio (cromatografa y

espectrofotometra) fueron muy tiles en la identificacin de las clases de
aminocidos. La parte de la cromatografa es un anlisis cualitativo, para
esta tcnica fue utilizada la cromatografa en capa fina, usando como
adsorbente el silicagel, luego se calcularon las rf. la espectrofotometra es
un anlisis cuantitativo de los aminocidos aplicada a la muestra vegetal
designada. En el espectrofotmetro se midieron las transmitancias y luego
se calcularon con despejes las absorbancias de las muestras.

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13. Facultad de Agronoma, Laboratorio de bioqumica; PRCTICA No. 5
ESTUDIO DE AMINOCIDOS, CROMATOGRAFA DE AMINOCIDOS Y
ESPECTROFOTOMETRA; Guatemala, Guatemala; USAC, Facultad de
Agronoma; fecha desconocida; 19p.