Facultad de Ingenieras y

Ingeniera
Arquitectura
Ambiental

ADAPTACION Y SELECCIN MICROBIANA AUTOCTONA EN

MEDIOS DE CULTIVO ENRIQUECIDOS CON BENZO(A)PIRENO
Miguel ngel Palomino Gonzales
Docente: Blgo. Fernando Merino Rafael
RESUMEN
Un nmero creciente de sustancias xenobioticas y compuestos orgnicos
naturales son introducidos en el ambiente, que pueden ser toxicas para los
seres vivos. Los suelos receptores de desechos txicos derivados del
petrleo acumulan hidrocarburos policiclicos aromaticos como el
benzo(a)pireno. Al establecerse estas molculas en el suelo, inicialmente las
poblaciones microbianas disminuyen, y algunas especies se adaptan sobre
todo en las rizosferas de los pastos nativos. El objetivo de este estudio fue
evaluar la respuesta de bacterias y hongos aislados en suelos contaminados
con petrleo a venzo(a)pireno en medio de cultivo y seleccionar y estabilizar
los microorganismos tolerantes. Para ello se realiz el aislamiento,
evaluacin, adaptacin y seleccin de bacterias y hongos nativos de las
rizosferas de los pastos alemn (Echinochloa polystachya) y cabezon
(Paspalum virgatum), en Gleysoles (Endoaquents e Hydraquents)
influenciados por derrames y fugas de petrleo del campo petrolero
localizados en la regin occidental del estado de Tabasco. El mtodo
utilizado fue el conteo de viables de clulas vivas sembradas en cajas Petri.
Cindo cepas de bacterias (CT11, CT16, CT26, CT36 Y AT4) y tres hongos
nativos (Trichoderma spp. Paecilomuces sp. Y Aspergillus sp.) de la rizosfera
del pasto cabezon tuvieron altas tasas de crecimiento y de biomasa, lo que
indican tolerancia y uso del carbono del benzo(a)pireno en la multiplicacin
celular. Las bacterias y hongos poseen potencial para la limpieza de suelos
contaminados con hidrocarburos poliaromaticos.

INTRODUCCION
El benzo(a)pireno (Bap) es un hidrocarburo aromatico policiclico (HAP)
componente del petrleo, con cinco anillos bencnicos y un peso molecular
de 252. de 252. El BaP es considerado por la Agencia de Proteccin
Ambiental como uno de los 16 hidrocarburos aromticos policclicos ms
txicos, cancergenos y mutagnicos, que adems puede ser transformado
a metabolitos como el benzo(a)pireno 7,8 dihidrodiol 9-10, en clulas de
mamferos y en bacterias, y es ms cancergeno que el BaP
El petrleo crudo contiene 20 mg kg-1 de Bap. Los suelos cercanos a
refineras pueden acumular concentraciones cercanas a 8 mg kg-1 de BaP
por la contaminacin con. En estudios realizados por PEMEX (1997) en

Histosoles y Gleysoles de Tabasco, se encontraron concentraciones hasta de

4.22 mg kg-1 de BaP.
El BaP origina diversas interacciones con los microorganismos en el suelo.
Las bacterias y hongos poseen mecanismos de adaptacin fisiolgica,
probablemente de origen gentico, que les permiten usar carbono del BaP
en su multiplicacin celular. Kstner y Mahro (1996) encontraron que
especies de Mycobacterium, Rhodococcus, Gordona y Sphingomonas
paucimobilis utilizan molculas de HaP con cuatro y ms anillos bencnicos.
Los microorganismos degradadores del BaP incorporados en sustratos
minerales han sido utilizados en estudios de laboratorio. Field et al. (1992)
encontraron que el hongo Phanerochaete chrysosporium tuvo un aumento
poblacional significativo a partir de la degradacin de 10 mg L-1 de BaP. La
bacteria S. paucimobilis puede adaptarse a la presencia de BaP y al utilizarlo
para multiplicar se lo redujo en 33 %. Kotterman et al. (1998) reportaron el
crecimiento del hongo Bjerkandera sp. Cepa BOS55 y la degradacin de 20
mg L-1 de BaP en 15 das. Tambin los hongos han crecido en medios de
cultivo con 60 mg kg-1 de BaP.
El objetivo del presente estudio fue evaluar en laboratorio la respuesta de
bacterias y hongos aislados de pastos en suelos contaminados con petrleo
al benzo(a)pireno (BaP) en medio de cultivo, y seleccionar y estabilizar las
bacterias y hongos tolerantes al BaP.

MATERIALES Y METODOS
La investigacin se realiz en el Laboratorio de Microbiolga de Suelos del
Colegio de Postgraduados en Ciencias Agrcolas, en Montecillo, Estado de
Mxico, y comprendi tres etapas: colecta de rizosferas de vegetacin de
pastos del rea de estudio; evaluacin mIcrobiolgica de las rizosferas; y,
seleccin y estabilizacin de microorganismos en medios de cultivo
enriquecidos con benzo(a)pireno, la cual incluy tres fases sucesivas para
bacterias y dos para hongos.
Actividades de preparacin y materiales utilizados
El material de vidrio fue esterilizado por 5 h en calor seco a 180 C, en
estufa. La esterilizacin de los medios de cultivo, el agua y las puntillas para
la micropipeta se realiz en calor hmedo a 121 C, en olla de presin de
vapor a 1.3 kg cm-2 durante 18 min. En la segunda etapa se utiliz el medio
de cultivo selectivo de carbn combinado modificado (CCM1) para bacterias
fijadoras de N atmosfrico tolerantes a BaP, basado en medio inorgnico
ms BaP. Este medio const de dos soluciones: la solucin 1 fuede K2HPO4,
(0.8 g L-1), NaCl (0.1 g L-1), NaFeEDTA (0.007 g L-1), Na2MoO42H2O (0.25
g L-1), agar y agua destilada, con pH ajustado a 7.0; y la solucin 2 fue de
MgSO47H2O (0.2 g L-1), CaCl2 (0.06 g L-1), biotina y cido paminobenzoico (10 mg L-1), y se adicion 30 mg L-1 de BaP. El medio para
bacterias asimiladoras de N tolerantes a BaP consisti de las dos soluciones
anteriores ms NH4Cl (CCM2). El medio para hongos celulticos, modificado

(HCM) para hongos tolerantes a BaP, se form con nutrimentos inorgnicos

ms BaP. Este medio consisti de (NH4)2SO4 (0.5 g L-1), KH2PO4 (1.0 g L-1),
KCl (0.5 g L-1), MgSO47H2O (0.2 g L-1), CaCl2 (0.1g L-1), agar, agua
destilada y estreptomicina, con adicin de 30 mg kg-1 de BaP (v/v) y pH
ajustado a 6. En la segunda etapa se utilizaron medios de cultivo slidos
En la segunda y tercera fases del estudio de las bacterias y segunda de los
hongos de la tercera etapa se utilizaron los medios de cultivo lquido CCM1 y
HCM, respectivamente.
La solucin estndar de BaP se prepar a una concentracin de 100 mg L-1
en acetona y se aplic durante las diferentes fases. Se utiliz BaP (3,4benzopireno) con un mnimo de 97% de pureza, grado HPLC (Sigma B1760). Esta molcula tiene una solubilidad en agua de 0.003 mg L , punto
de ebullicin de 496 C y estado fsico slido cristalino de color amarillo, y es
soluble en solventes orgnicos como acetona y hexano.

RESULTADOS Y DISCUSIN
La tolerancia de los microorganismos rizosfricos al BaP se evidenci en el
tamao de las poblaciones nativas de la rizosfera de los pastos cabezn y
alemn en suelos contaminados con petrleo. Las poblaciones de bacterias
fijadoras de N, de bacterias asimiladoras de N y de hongos del pasto
cabezn fueron 4, 6 y 52 veces mayores en el suelo con contaminacin
crnica que en el suelo no contaminado; y para el pasto alemn, 4, 19 y 3
veces mayores en el suelo con contaminacin reciente que en el suelo sin
contaminacin (Cuadro 1).
El aumento significativo de las poblaciones microbianas posiblemente est
relacionado con el tiempo de exposicin y de adaptacin de las bacterias y
hongos a los HAP presentes en el suelo recientemente contaminado (Gleysol
histi-dstrico) y en el suelo afectado por derrames crnicos de petrleo
(Gleysol histi-utri-sdico).
Las poblaciones de bacterias fijadoras de N fueron 102 y 103 (Cuadro 1),
comparado con poblaciones de 103 y 104 para Bacterium sp. En muestras
de suelos aledaos a petroqumicas.
El suelo Gleysol histi-eutri-sdico
receptor de contaminacin crnica con petrleo desde 1963, tuvo la mayor
cantidad de microorganismos tolerantes a BaP. Esto es atribuible a que el
alto contenido de cal (datos no presentados) y el surcado han propiciado
condiciones adecuadas para la aireacin y formacin de pH neutro (6.7 a
7.3), as como a los contenidos ricos de N (87 a 98 ppm) y de P (11 a 74
ppm), puesto que ellos favorecen el crecimiento de microorganismos en el
suelo.
La mayora de las cepas de bacterias tolerantes a BaP fue aislada de la
rizosfera del pasto cabezn (16 colonias) y una cantidad menor (ocho
colonias) del pasto alemn. Las 24 cepas aisladas son gram negativas y
mviles. Los 16 hongos tolerantes a BaP son nativos de la rizosfera del
pasto cabezn, y los gneros ms comunes fueron Trichoderma, Penicillium,

Aspergillus y Paecilomyces, y solamente dos especies del gnero

Trichoderma fueron aislados de la rizosfera del pasto alemn. La mayor
diversidad de hongos encontrados en la rizosfera del pasto cabezn es
atribuible al largo periodo de exposicin y adaptacin (desde 1963) al
petrleo crudo.

ANEXOS