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UNIVERSIDAD DE LA REPUBLICA

FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA

INFORME DE LABORATORIO

ESTUDIO DE LAS MODIFICACIONES OXIDATIVAS DE LA


LIPOPROTENA DE BAJA DENSIDAD (LDL):
ANALISIS DE LA OXIDACION DEL COMPONENTE LIPIDICO Y
PROTEICO
Mara Fernanda Coutinho da Silva Tort
CBCC5
CI 4.219.175-6
Grupo C3H1
Docente: Florencia Tomasina

INTRODUCCIN
La insolubilidad de los lpidos en soluciones acuosas, determina que su
transporte se d mediante agregados moleculares formados por protenas,
triacilglicridos, colesterol, y fosfolpidos. (1) Las protenas adems de su
funcin transportadora, median distintos procesos relacionados a la
captacin y el metabolismo tisular de los lpidos a los que se unen.
Se han identificado distintas lipoprotenas separables por ultracentrifugacin
y electroforesis tales como Quilomicrones, VLDL, IDL, LDL y HDL. Las LDL son
lipoprotenas de baja densidad (en el orden de 1,019 a 1,063 g/mL) y tamao
de 19 a 23 nm que se internalizan en las clulas mediante endocitosis
mediada por receptores de tipo apoE/apo B, lo cual es un proceso regulado
en conjunto con el metabolismo del Colesterol para equilibrar la sntesis
endgena con el aporte proveniente de la dieta evitando la acumulacin
intracelular excesiva. Existe un segundo receptor de tipo scavenger que no es
pasible de la anterior regulacin, lo que conduce a la acumulacin de lpidos
en distintos tipos celulares. Las liprotenas LDL sufren procesos de oxidacin
que determinan una mayor afinidad por el segundo tipo de receptor, y a nivel
de los macrfagos se traduce en la formacin de clulas espumosas
relacionadas a la formacin de placas de ateroma.
Entre los componentes estructurales de estas protenas, encontramos por
otra parte antioxidantes tales como tocoferoles, carotenos y ubiquinol-10
que actan como un factor protector, evitando la formacin de radicales
libres que permite la fase de iniciacin de los procesos oxidativos que
incorporan el oxgeno molecular a las insaturaciones de las cadenas de cidos
grasos y promueven el dao oxidativo por lipoperoxidacin.

PROTOCOLO EXPERIMENTAL

Purificacin de LDL
Este proceso fue realizado previamente a la actividad prctica por
ultracentrifugacin de muestras de plasma humano fresco tratado con
Bromuro de potasio.

Dosificacin de LDL
La dosificacin fue realizada mediante un mtodo colorimtrico por la
tcnica de Biuret. Posteriormente se midi la absorbancia a 540 nm. Para
relacionar la concentracin en las muestras problema con la absorbancia
medida, se procedi previamente a la realizacin de una curva de calibracin
con soluciones de protenas usadas como estndares de concentracin
conocida.
Curva de calibracin:

Conc. Protenas (mg/mL)


10
6
5
4
2
1

A
0,201
0,163
0,133
0,103
0,056
0,031

El equipo se calibr previamente con una solucin blanco de buffer fosfato y


reactivo de Biuret.

Para evaluar la dispersin de los datos, se graficaron en la siguiente curva de


Absorbancia vs. Concentracin

Curva de Calibracin LDL


0,25

Absorbancia

0,2

0,15

0,1

0,05

0
0

Concentracin mg/mL

Se observ que se poda mejorar la linealidad de la recta mediante la


eliminacin del ltimo punto, quedando de esta manera;

Curva de Calibracin LDL


0,25

Absorbancia

0,2

0,15

0,1

0,05

0
0

Concentracin mg/mL

A continuacin, se procedi a calcular los parmetros de la recta:


y = 0,0268x
R = 0,996
Se considera aceptable el valor de R2.
De acuerdo a lo expresado por la Ley de Lambert Beer,
A= .l.( )
Siendo, A la absorbancia medida, el coeficiente de absortividad, l el camino
ptico (que en el tipo de celda usada corresponde a 1 cm) y ( ) la
concentracin.
De lo anterior se deduce que este caso
=0,0268 mL/cm.mg

Determinacin de la concentracin de LDL de las dos muestras problemas A y


B:
Muestra A A=0.047
Muestra B A=0.037

Clculo de concentracin

(LDL)=A/

Muestra A (LDL)=1.75 mg/mL


Muestra B (LDL)= 1.38 mg/mL

Oxidacin de LDL
La oxidacin se realiz con Cu(II) mediante la metodologa propuesta por
Batthiany et al (2) a los efectos de evaluar los procesos de lipoperoxidacin y
el seguimiento se hizo de tres maneras diferentes:

1.- Consumo de Oxgeno

El consumo de Oxgeno fue medido mediante un electrodo en un Oxmetro


con una cmara de 4 mL y en agitacin constante.

El aparato se calibr previamente al 100% de O2 mediante el burbujeo de


aire con una pipeta Pasteur. Se consign una temperatura ambiente de 25C,
por lo cual el valor de saturacin corresponde a 258 nmoles O2/mL y a partir
de la misma se calcularon todos los dems valores de concentracin;

Tiempo
(s)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
420
440
460
480
500
520
540
560
580
600
620
640
660
680

%O2
100,7
98,7
98,2
96,7
98,7
99
95,5
92,2
97,1
96,5
94,7
94,4
99
96,7
97,2
97
97
97,2
97,5
98,1
99,1
98,4
98,6
98,2
98,6
98,5
99,4
98,6
99,2
98,1
97,7
97,6
97,5
98,3
99,7

(O2)
(nmoles/mL)
259,8
254,6
253,4
249,5
254,6
255,4
246,4
237,9
250,5
249,0
244,3
243,6
255,4
249,5
250,8
250,3
250,3
250,8
251,6
253,1
255,7
253,9
254,4
253,4
254,4
254,1
256,5
254,4
255,9
253,1
252,1
251,8
251,6
253,6
257,2

700
720
740
760
780
800
820
840
860
880
900
920
940
960
980
1000
1020
1040
1060
1080
1100
1120
1140
1160
1180
1200
1220
1240
1260
1280
1300
1320
1340
1360
1380
1400
1420
1440
1460

98,3
98,3
98,8
98,7
98,9
98,7
98,7
98,8
98,8
99,3
99,3
99,6
99,2
99,6
99,5
98,8
99,6
100,2
99,7
99
99,5
99
98,9
99,2
99,4
99,4
98,3
98,5
97,8
99,2
99
99,3
100,4
98,9
99,6
99,5
99,4
99,8
98,8

253,6
253,6
254,9
254,6
255,2
254,6
254,6
254,9
254,9
256,2
256,2
257,0
255,9
257,0
256,7
254,9
257,0
258,5
257,2
255,4
256,7
255,4
255,2
255,9
256,5
256,5
253,6
254,1
252,3
255,9
255,4
256,2
259,0
255,2
257,0
256,7
256,5
257,5
254,9

1480
1500
1520
1540
1560
1580
1600
1620
1640
1660
1680
1700
1720
1740
1760
1780
1800
1820
1840
1860
1880
1900
1920
1940
1960
1980
2000
2020
2040
2060
2080
2100
2120
2140
2160
2180
2200
2220
2240

98,5
99
99,5
99,5
99
98,7
99,1
98,5
99,2
98,4
98,5
98,7
98,7
99
99,1
98,2
98,9
98,7
99,4
98
97,8
98,7
97,8
97,2
97,4
97,3
97,1
97
97,4
96,6
96,4
96,3
96,3
96,6
96,6
97
96,6
96,4
96,9

254,1
255,4
256,7
256,7
255,4
254,6
255,7
254,1
255,9
253,9
254,1
254,6
254,6
255,4
255,7
253,4
255,2
254,6
256,5
252,8
252,3
254,6
252,3
250,8
251,3
251,0
250,5
250,3
251,3
249,2
248,7
248,5
248,5
249,2
249,2
250,3
249,2
248,7
250,0

2260
2280
2300
2320
2340
2360
2380
2400
2420
2440
2460
2480
2500
2520
2540
2560
2580
2600
2620
2640
2660
2680
2700
2720
2740
2760
2780
2800
2820
2840
2860
2880
2900
2920
2940
2960
2980
3000
3020

96,9
97
96,9
96,4
96,8
99
98
97,4
97,8
97,2
97,4
95,9
96,7
96,1
96,5
96,8
95,1
95,2
94,5
95
94,7
94,7
94,6
94,6
93,8
93,9
94,2
93,8
93,8
93,9
93,3
93,6
94,5
93,7
93,7
93,9
93,2
92,8
93,1

250,0
250,3
250,0
248,7
249,7
255,4
252,8
251,3
252,3
250,8
251,3
247,4
249,5
247,9
249,0
249,7
245,4
245,6
243,8
245,1
244,3
244,3
244,1
244,1
242,0
242,3
243,0
242,0
242,0
242,3
240,7
241,5
243,8
241,7
241,7
242,3
240,5
239,4
240,2

3040
3060
3080
3100
3120
3140
3160
3180
3200
3220
3240
3260
3280
3300
3320
3340
3360
3380
3400
3420
3440
3460
3480
3500
3520
3540
3560
3580
3600
3620
3640
3660
3680
3700
3720
3740
3760
3780
3800

93,3
94,2
93,2
93,8
93,5
93,8
94,4
93,4
92,3
92
91,2
92,1
92,2
92,1
92,1
91,7
91,8
91,8
91,5
91,5
91
90,9
90,4
89,6
90
89,3
89,1
88,9
89,1
89,5
89,2
89
89,2
89
88,9
89,2
89
88,5
88,8

240,7
243,0
240,5
242,0
241,2
242,0
243,6
241,0
238,1
237,4
235,3
237,6
237,9
237,6
237,6
236,6
236,8
236,8
236,1
236,1
234,8
234,5
233,2
231,2
232,2
230,4
229,9
229,4
229,9
230,9
230,1
229,6
230,1
229,6
229,4
230,1
229,6
228,3
229,1

3820
3840
3860
3880
3900
3920
3940
3960
3980
4000
4020
4040
4060
4080
4100
4120
4140
4160
4180
4200
4220
4240
4260
4280
4300
4320
4340
4360
4380
4400
4420
4440
4460
4480
4500
4520
4540
4560
4580

88,6
88,5
88,4
89,4
89,5
89,1
89,1
88,5
87,5
87,8
88,4
88
87,9
88,6
87,9
89
88,1
88,2
87,4
87
88
88
88,4
88
87,2
87,3
87,3
87,8
86,6
87,7
88,6
88,2
88,7
88,5
87,7
86,9
86,7
85,7
86,5

228,6
228,3
228,1
230,7
230,9
229,9
229,9
228,3
225,8
226,5
228,1
227,0
226,8
228,6
226,8
229,6
227,3
227,6
225,5
224,5
227,0
227,0
228,1
227,0
225,0
225,2
225,2
226,5
223,4
226,3
228,6
227,6
228,8
228,3
226,3
224,2
223,7
221,1
223,2

4600
4620
4640
4660
4680
4700
4720
4740
4760
4780
4800
4820
4840
4860
4880
4900
4920
4940
4960
4980
5000
5020
5040
5060
5080
5100
5120
5140
5160
5180
5200
5220
5240
5260
5280
5300
5320
5340
5360

85,6
85,3
86,2
86
85,8
85,9
85,5
85,2
85,2
84,9
85
84,7
84,8
84,9
84,6
83,7
83,9
84,7
84,6
84,9
84,8
84,7
84,4
84
84,2
84,4
84,2
84,3
84,1
84,7
85,3
85,7
83,5
83,5
83,7
83,8
82,9
83,7
84,3

220,8
220,1
222,4
221,9
221,4
221,6
220,6
219,8
219,8
219,0
219,3
218,5
218,8
219,0
218,3
215,9
216,5
218,5
218,3
219,0
218,8
218,5
217,8
216,7
217,2
217,8
217,2
217,5
217,0
218,5
220,1
221,1
215,4
215,4
215,9
216,2
213,9
215,9
217,5

5380
5400
5420
5440
5460
5480
5500
5520
5540
5560
5580
5600
5620
5640
5660
5680
5700
5720
5740
5760
5780
5800
5820
5840
5860
5880
5900
5920
5940
5960
5980
6000
6020
6040
6060
6080
6100
6120
6140

83,4
83
83,1
83,3
83,5
83,7
83,4
82,7
82,8
82,7
82,7
82,7
81,6
82,2
81,6
80,2
80,7
80
80,1
79,8
79,8
79,9
79,9
80,6
79,9
78,7
79,4
78,7
78,9
79
78,6
78,3
78,5
79
78,3
78,9
79,1
77,2
77,2

215,2
214,1
214,4
214,9
215,4
215,9
215,2
213,4
213,6
213,4
213,4
213,4
210,5
212,1
210,5
206,9
208,2
206,4
206,7
205,9
205,9
206,1
206,1
207,9
206,1
203,0
204,9
203,0
203,6
203,8
202,8
202,0
202,5
203,8
202,0
203,6
204,1
199,2
199,2

6160
6180
6200
6220
6240
6260
6280
6300
6320
6340
6360
6380
6400
6420
6440
6460
6480
6500
6520
6540
6560

77,4
76,9
76,7
75,5
75,6
75,6
76,5
76,2
75,8
75,5
75,4
75,1
75,2
75,1
75,2
74,8
74,3
74,4
74,3
73,9
73,8

199,7
198,4
197,9
194,8
195,0
195,0
197,4
196,6
195,6
194,8
194,5
193,8
194,0
193,8
194,0
193,0
191,7
192,0
191,7
190,7
190,4

A continuacin se presenta el grfico correspondiente

Concentracin de Oxgeno vs. Tiempo


Conentracin O2 (nmoles/mL)

300,0
250,0
200,0
150,0
100,0
50,0
0,0
0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

Tiempo (s)
(O2) (nmoles/mL)

En este grfico se debera observar una meseta correspondiente a la fase de


Inicio en la primer etapa de la reaccin de lipoperoxidacin, seguida de una
franca disminucin de la concentracin de Oxgeno que marca la etapa de
Propagacin y luego su pendiente disminuye para la Fase de terminacin.
Lamentablemente por la dispersin que presentan los datos, las fases no se
ven tan claramente evidenciadas en la Grfica.

2.- Consumo de Antioxidantes Endgenos

Para llevar a cabo esta parte del experimento, previamente se procede a


realizar un espectro, midiendo la absorbancia para todo un rango de
longitudes de onda de modo de evidenciar en cual de ellas se encuentran los
picos correspondientes a las longitudes de onda de mxima absorcin.

Longitud de onda (nm) Absorbancia


380
0,246
390
0,233
400
0,229
410
0,228
420
0,227
430
0,242
440
0,244
450
0,245
460
0,249
470
0,241
480
0,235
490
0,229
500
0,203
510
0,174
520
0,151
530
0,135
540
0,118
550
0,109
0,300

Absorbancia

0,250
0,200
0,150
0,100
0,050
0,000
0

100

200

300

400

500

600

Longitud de onda (nm)

El mayor pico se observ a 460 nm, dado por la presencia de anillos


aromticos en la estructura de los carotenoides y se seleccion esta longitud

de onda para la siguiente medida a los efectos de maximizar la sensibilidad


en la determinacin.

Luego se realiz la reaccin con Cu(II) y se midi la absorbancia en funcin


del tiempo.
Tiempo (s)
0
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
33
36
39
42
45
48
51
54
57
60

A
0,314
0,318
0,322
0,291
0,263
0,236
0,204
0,175
0,169
0,149
0,133
0,126
0,112
0,098
0,095
0,093
0,091
0,088
0,086
0,085
0,084

Absorbancia vs tiempo
0,35

Abosribancia

0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0

10

20

30

40

50

60

70

Tiempo (s)

En este Grfico la dispersin permite observar mejor la Etapa de Propagacin


y Terminacin con un cambio de pendiente ms marcado.
La velocidad de propagacin puede calcularse a partir de la pendiente de
dicha fase y es del orden de 7x10-3 s-1.

3.-Electroforesis

La Oxidacin de las lipoprotenas tambin se estudi mediante una


Electroforesis en Gel agarosa , oxidndose previamente con Cu (II). Luego de
la corrida electrofortica se observ el siguiente patrn de bandas que se
presenta a continuacin, con la identificacin de los componentes que se
asignan a cada una de ellas.

Albmina

Fraccin Lipoproteica en
proceso de
lipoperoxidacin

CONCLUSIONES
Se pudo dosificar la lipoprotena LDL mediante el revelado por la tcnica de
Biuret y posterior lectura espectrofotomtrica.

En lo que respecta a la oxidacin se presume que la dispersin de datos no


fue exactamente la esperada debido a una oxidacin previa de la protena
que afect su estabilidad en las muestras problema. Esto se evidenci tanto
en el seguimiento por consumo de O2 como en el consumo de antioxidantes
endgenos, aunque este caso fue menos marcado el efecto.

En la corrida electrofortica se identific principalmente a la Albmina, dado


que es la protena plasmtica de mayor concentracin. Luego se observ un
corrimiento de las bandas a medida que aumentaba el tiempo de exposicin
de la muestra a la oxidacin, si bien no fue posible separar todas las

lipoprotenas, ni tampoco se espera observar a la LDL aislada dada su baja


concentracin en plasma.

BIBLIOGRAFA
(1)
(2)

Herrera E. Metabolismo de las Lipoprotenas, In; Graw Hill IM. Ed,


Elementos de Biuqumica, 1993
Material proporcionado por la Ctedra a modo de Gua prctica

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