Universidad de Jan, Dpto.

Biologa Experimental, rea de Gentica

Gentica Aplicada
Curso 2010-2011

TEMA 5: IDENTIFICACIN DE SECUENCIAS ESPECFICAS

OBJETIVOS
-

Saber detectar molculas de AANN con una secuencia concreta a partir de un

grupo heterogneo de molculas, independientemente de cual sea el material
de partida.
Conocer distintos mtodos de transferencia de AANN a un soporte slido en
funcin del material de partida.
Ser capaces de generar sondas marcadas (ADNcs, ADNcd, ARN), tanto en
fro como en caliente.
Saber cmo se pone de manifiesto la presencia de una sonda marcada (fra o
caliente) que ha hibridado con su secuencia complementaria inmovilizada
sobre un soporte slido.

RESUMEN
Problema
Identificacin de molculas de AANN de secuencia especfica

Material de partida
a.
b.
c.
d.
e.
f.

ADN o ARN en solucin

En bacterias (colonias) o fagos (calvas)
Cromosomas metafsicos
En geles de agarosa
Tejidos (ARN)
Cortes (ARN)

Pasos necesarios para llevar a cabo la identificacin de secuencias especficas

1. Transferencia de cidos nuclicos a un soporte slido (cuando sea necesario: a-d)
LOS AA.NN. DEBEN ESTAR EN FORMA DE CADENA SIMPLE
SI SON DE CADENA DOBLE:
- Desnaturalizar antes de la transferencia
- Desnaturalizar despus de la transferencia
FORMAS DE TRANSFERENCIA EN FUNCIN DEL MATERIAL DE PARTIDA
- A partir de soluciones: Dot-blot o Slot-blot
- A partir de colonias o calvas: por contacto
- A partir de suspensiones de clulas en metafase: extensiones sobre un porta
- A partir de geles:
- Tipos de transferencia segn el tipo de AA.NN.
Southern-blot (ADN)
Northern-blot (ARN)
{[western-blot (proteinas)]}
- Tipos de transferencia segn mecanismo
Capilaridad
Vaco

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Gentica Aplicada
Curso 2010-2011

Electrotransferencia

2. Obtencin de la sonda
QU ES UNA SONDA
TIPOS MARCAJE
Caliente (nucletidos trofosfato con fsforo radiactivo generalmente en
posicin alfa o gamma). Detectable mediante autorradiografa.
Fro (anticuerpos conjugados a un nucletido trifosfato): Digoxigenina,
biotina o fluorescena. Detectables con anticuerpos especficos.
MTODOS DE MARCAJE
Traslado de la mella (Nick-traslation): DNasaI + ADN polimerasa I de E. coli
Primado al azar (Random-primer): Hexanucletidos + Fragmento Klenow
Adicin de colas marcadas en 3 (Oligonucleotide tailing): Transferasa
terminal
Marcaje en extremo 3 (3'-End-labeling): ADN polimerasa I fragmento Klenow
Marcaje en extremo 5 (5'-End-labeling): fosfatasa + polinucletido kinasa
Marcaje por PCR: Taq polimerasa (o cualquier polimerasa termoestable)
Marcaje por transcripcin in vitro: ARN-polimerasa, para sondas de ARN
3. Hibridacin
4. Revelado
- Sondas radiactivas: Deteccin mediante pelcula sensible a rayos X (autorradiografa)
- Sondas fras: Con anticuerpos especficos frente al anticuerpo empleado para marcar:
Deteccin:
Directa: anticuerpos especficos marcados con fluorocromo
Indirecta: anticuerpos especficos conjugados fluorocromos o con enzimas
(deteccin de la acctividad enzimtica de dicho enzima).

BIBLIOGRAFA RECOMENDADA

Ingenieria genetica vol.I. Preparacion, analisis, manipulacion y clonaje de DNA. J.

Perera, A. Tormo Garrido y J.L. Garcia. Ed. Sntesis (2002). Tema 4.

BIBLIOGRAFA ADICIONAL

Principles of gene manipulation and genomics. (2006, 7 ED.). S.B. Primrose and R.M.
Twyman.
Blackwell
Science.
ISBN:
1-4051-3544-1.
http://www.blackwellscience.com/primrose.

Recombinant DNA : Genes and genomes A short course. (2006, 3 Ed.) J.D. Watson,
A.A. Caudy, R.M. Myers, J.A. Witkowski. Cold Spring Harbour Press and Freeman.
ISBN: 0-7167-2866-4.

Gene cloning and dna analysis, an introduction (2006, 5 ED.) T.A Brown. Blackwell
Science. ISBN: 978-1-4051-1121-8.

Analysis of genes and genomes (2004, 1 ED.) Richard J Reece. Wiley. ISBN: 0-47084380-2.

Understanding dna and gene cloning. A guide for the curious (2004). Karl Drlica. Wiley.
ISBN: 0471-43416-7.

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Gentica Aplicada
Curso 2010-2011

From genes to genomes. Concepts and applications of DNA technology. J.W. Dale y M.
von Schantz. Wiley (2002). ISBN: 0-471-49783-5.