Simposio de Metrologa 2010

27 y 28 de Octubre

EVALUACIN DE LA INCERTIDUMBRE EN LA DETERMINACIN DEL

CAMPO VISUAL DE UN MICROSCOPIO PTICO COMPUESTO
Luis C. Martorelli, Javier R. Bergamini, Alejandro Paola
Laboratorio de ptica, Calibraciones y Ensayos- Facultad de Ciencias Astronmicas y Geofsicas
Universidad Nacional de La Plata. Argentina, TE 0054-221-4274914 jrbergamini@yahoo.com
Resumen: El presente trabajo es el resultado de la experiencia adquirida por el Laboratorio de ptica,
en el ensayo de microscopios pticos compuestos, siguiendo los procedimientos realizados, en acuerdo
con los requerimientos establecidos por la Norma ISO 17025. Nosotros proponemos un criterio para la
determinacin del dimetro del campo visual y la evaluacin de la incertidumbre de medida asociada a
dicha determinacin, de manera que podamos obtener el valor ms exacto posible del rea del campo
visual. Dicho valor estimado es utilizado para la realizacin de conteos directos en microscopios.
El Recuento Total de Microorganismos por el
Mtodo de Breed y Prescott [1], es un mtodo de
recuento realizado a travs de la observacin
directa en microscopios, actualmente utilizado
como mtodo de referencia [2]. Este mtodo fue
creado para realizar la determinacin del nmero
de clulas cuerpo en leche [3], [4]. El mtodo por
conteo directo en microscopios, es tambin
utilizado para realizar conteos de leucocitos en
orina [5], como as tambin en anlisis extendidos
de sangre [6]

1. INTRODUCCIN
El conocimiento de las estructuras del ser vivo
est basado casi totalmente en el estudio con el
microscopio. El microscopio ptico es un
instrumento que permite la observacin de objetos
y detalles de estructuras tan pequeas que no
podran ser observadas a simple vista. Con l,
nuestro grado de visibilidad se ampla en cientos o
miles de veces, gracias a un conjunto de lentes,
dispuestos convenientemente. Las principales
dificultades en la observacin y estudio de
estructuras biolgicas son su reducido tamao y
su transparencia a la luz visible. Dado que el
microscopio
permite
superar
estas
dos
dificultades, su uso y el conocimiento de los
principios y tcnicas en microscopa, resultan
fundamentales para el desarrollo de la
investigacin en ciencias biolgicas.

Uno de los parmetros ms importantes para

poder realizar estas mediciones es conocer con
mucha exactitud el rea del campo visual que
observamos, para distintos aumentos del objetivo
y el ocular. Dado que en muchos casos,
dependiendo de la calidad de sus componentes
pticos,
este
puede
presentar
algunas
deficiencias, generalmente hacia los bordes, como
aberraciones cromticas, deformaciones de la
imagen, falta de planicidad, en particular cuando
utilizamos las magnificaciones ms bajas, es
importante determinar el dimetro efectivo del
campo dentro del cual estas deficiencias no se
manifiestan.

El microscopio permite realizar un anlisis

cualitativo de las estructuras pero tambin es muy
til para realizar estudios cuantitativos de las
mismas. Es muy usual en el campo de la
microbiologa, la qumica, etc. utilizar el
microscopio para realizar mediciones sobre las
estructuras de microorganismos, o estudiar la
densidad de los mismos que se encuentran
presentas en una muestra, tarea esta que se la ha
denominado micrometra.

El objetivo del presente trabajo es desarrollar un

mtodo de medicin directa del campo visual, a
partir de la determinacin de su dimetro con una
reglilla micromtrica graduada y evaluar las
componentes de incertidumbre que se encuentran
presentes en dicha determinacin.

Varias tcnicas se han desarrollado actualmente

para poder realizar mediciones con los
microscopios. La
utilizacin de reglillas
micromtricas, oculares con retculos graduados, o
la comparacin directa de las dimensiones de la
muestra a una escala del micrmetro en el plano
x-y del microscopio, son algunas de ellas.

En el proceso de ensayo de un microscopio ptico

compuesto, realizado en el Laboratorio de ptica,
la medida del dimetro del campo visual,
acompaado con el valor de la incertidumbre que
caracteriza dicha medida, es una de las
magnitudes que el informe de dicho ensayo
provee al cliente para su correcta utilizacin.

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2. DETERMINACIN DEL DIMETRO

CAMPO VISUAL Y SU INCERTIDUMBRE

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misma. En la fig. (3) se observa la reglilla

descentrada, desplazada levemente hacia abajo,
de un hipottico centro.

DEL

La determinacin del valor del dimetro del

campo, al cual definimos como el mensurando, se
realiza colocando una reglilla micromtrica
graduada sobre la platina del microscopio (fig. 1),
la cual se ajusta hacia los bordes haciendo que
estos se observen bien definidos.

Fig, 3
En la fig. (4) esquematizamos la situacin
descripta. Supongamos que trazamos una lnea
imaginaria por el centro de la reglilla y que ella
determinar la medida realizada del campo.
Podemos fcilmente visualizar que la incorrecta
ubicacin de la reglilla nos llevara a cometer un
error en la lectura del campo.

Fig. 1
La fig. (2) muestra la imagen que observamos al
medir el campo visual con una reglilla

Fig. 4
Fig. 2

Debemos observar que cualquier medicin que

realicemos de un crculo, al no pasar por un
dimetro del mismo, la medida obtenida ser
siempre menor que este.

La correcta ubicacin de esta reglilla es uno de los

pasos que requieren mayor cuidado en el proceso
de medicin. Dada la falta de referencia del centro
del campo es altamente probable que la lectura
que obtengamos del dimetro del campo este
influenciada por una inadecuada ubicacin de la

A fin de facilitar la comprensin del problema

hemos incorporado un sistema coordenado
coincidente con el centro del campo visual.

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Podemos suponer entonces que todas las

medidas que realicemos del campo, sern iguales
o menores al valor del mensurando D. Asumimos
desde la experiencia que las mismas estarn
concentradas en una franja simtrica respecto del
eje x. La menor medida que podemos obtener
ser aquella que este paralela al dimetro y
desplazada hacia arriba o hacia abajo. La fig. (5)
caracteriza esta situacin donde se representan
varias medidas obtenidas del campo visual, a las
que denominamos Lk y la menor medida Linf

Mediante una rotacin podemos expresar a L en

trminos de D y el ngulo , como muestra la fig.
(7).
L = (D/2) x (1 + cos ( 2 ))

(2)

Fig. 7
De manera que la expresin obtenida para el
dimetro del campo, suponiendo a este una
circunferencia es:
D = L/cos()

Fig. 5

En la prctica el ngulo es muy pequeo

entonces podemos realizar el siguiente cambio de
variable, cos() 1 , con << 1. El valor de
ser siempre positivo, aun cuando puede tomar
valores positivos o negativos. De manera que D se
expresa como:

Cualquier medida que realizamos, la podemos

expresar en funcin del valor del dimetro D del
campo y los ngulos y tal cual muestra la fig.
(6). La expresin obtenida para L ser.
L = (D/2) x (1 + cos ( + ))

(3)

(1)

D = Lm x (1 + )

(4)

Donde Lm es la mejor estimacin de L y es igual a

la media aritmtica debida a n mediciones
independientes Lk, de L. Denominamos Lk, a la
lectura obtenida al medir el dimetro del campo
con la reglilla micromtrica. El valor obtenido para
es discutido en la siguiente seccin.
El valor as obtenido para D ser entonces el
resultado de la medicin, la cual es solo una
aproximacin o estimacin del valor del
mensurando. Esta medida solo estar completa
cuando est acompaado por la estimacin de la
incertidumbre [7].
La evaluacin de la incertidumbre del resultado de
la medida refleja la falta de conocimiento exacto
del valor del mensurando y se realiza siguiendo la
Gua para la Expresin de Incertidumbre en las
Mediciones publicada por ISO (Edicin 1993).

Fig. 6

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n
Lm = 1 / n L i
i=1

2.1 Incertidumbre en la medida del campo

visual
La expresin para la incertidumbre estndar
combinada de D, Uc(D), para magnitudes de
entradas no correlacionadas, en acuerdo con la
Gua ISO [8], viene dada por la raz cuadrada
positiva de la varianza combinada Uc(D).
Uc(D) = (D/L) x U(Lm) + (D/) x U()

Dado que la estimacin de L se realiza a partir de

n observaciones independientes repetidas Li, la
incertidumbre estndar u(Li) de su estimacin Lm
es u(Li) = S(Lm) donde S(Lm) es el desvo estndar
experimental de la media y es igual a la raz
cuadrada de la varianza experimental de la media
S2(Lm), donde:

(5)

Donde D = f(Lm,), con lo cual derivando D en la

ec. (4) obtendremos:
Uc(D) = (1+) x U(Lm) + Lm x U()

n
S2(Lm) = 1/n(n-1) (Li Lm)2
i=1

La varianza experimental de la media y su raz

cuadrada
positiva,
el
desvo
estndar
experimental, caracterizan la dispersin de los
valores obtenidos Li alrededor del valor medio Lm.
Denominamos
a
esta
componente
de
incertidumbre de repetibilidad, tal que:

la
n
2
2
2
u (rep ) = S (Lm) = 1/n(n-1) (Li Lm)
i=1

La Estimacin del valor de y su incertidumbre

asociada se encuentra desarrollada en la Gua
para la Expresin de Incertidumbre en las
Mediciones [9]. De all obtenemos que el valor
esperado para ser:
E() = /2

(11)

b) Resolucin de la Regla Micromtrica: Al

obtener una medida del campo es muy probable
que se deba realizar una estimacin de una
fraccin del valor de L, dentro del menor intervalo
de resolucin de la regla graduada. Esta
estimacin lleva asociada una componente de
incertidumbre debido a que en realidad existe una
distribucin de valores probables alrededor del
valor que asumimos como el mejor estimador.

(7)

Donde , es la varianza que caracteriza la

distribucin normal de valores que toma ,
alrededor de su valor esperado cero.

Supongamos que sea h la menor divisin de la

reglilla, los valores que podramos obtener para
una medida de L ser un nmero entero de h ms
una fraccin de la misma, la cual es estimada por
el observador a partir de su
prctica y
experiencia en el laboratorio, en nuestro caso se
estiman fracciones de h/4; h/2 y 3h/4.

La incertidumbre asociada a , U() queda

determinada por el desvo estndar de y ser
igual a la raz cuadrada de la varianza de .
2
4
(8)
U () = /2
El valor de caracteriza la incertidumbre estndar
atribuida a , cuyo valor se obtiene de una
distribucin evaluada a partir de la informacin
disponible basada en la experiencia del
Laboratorio.
2.3 Componentes que contribuyen en
determinacin de la incertidumbre de L

(10)

(6)

La raz cuadrada positiva de U(Lm), caracteriza

la incertidumbre asociada a la medida de L y la
raz cuadrada positiva de U() caracteriza la
incertidumbre para la componente .
2.2 Componentes que contribuyen en
determinacin de la incertidumbre de

(9)

Asumimos que este valor estimado es el ms

probable de un conjunto posibles de valores que
se distribuyen alrededor de l y que suponemos
siguen una distribucin trapezoidal simtrica con
igual pendiente a ambos lados. El trapezoide es
issceles con base inferior igual a h/2 y base
superior igual a hz/2 donde 0 z 1. Cuando z1
la distribucin se aproxima a una rectangular.
Cuando z0 tendremos una distribucin
triangular.

la

a) Repetibilidad de las Mediciones: Tomamos

como mejor estimador de la esperanza de la
magnitud L, de la cual se han obtenido n
mediciones independientes bajo las mismas
condiciones, a la media aritmtica o promedio de
las n observaciones:

Para esta distribucin la varianza asociada, en

cualquiera de los puntos tomados como mejor
estimador ser:

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u2(res) = (h/4)2 x (1+z2)/6

Para la componente de la incertidumbre estndar

debido a la resolucin, u(res), hemos considerado
que la misma se obtiene de suponer que los
posibles valores que se distribuyen alrededor del
mejor valor estimado, siguen una distribucin
trapezoidal. En la prctica, para valores de baja
magnificacin, en general el que se obtiene con
objetivos de 4x, dada que la apreciacin por el
observador es ms dificultosa es recomendable
utilizar una distribucin rectangular, en tanto que
para las magnificaciones mayores, dado que se
facilita la estimacin para las fracciones de la
menor divisin de la reglilla, la distribucin podra
tender a la triangular, quedando a criterio del
Laboratorio en funcin de su experiencia y
prctica.

(12)

La raz cuadrada positiva de la varianza ser la

incertidumbre estndar debido a la apreciacin de
la medida, realizada por el observador u(res).
c) Incertidumbre del instrumento de Medicin:
La reglilla micromtrica graduada incorpora una
fuente de incertidumbre en la medida del campo y
su contribucin viene dada por el certificado de
calibracin de la misma. A esta componente la
denominamos
incertidumbre
estndar
del
instrumento, u(inst)
3. RESULTADOS y CONCLUSIONES

En el presente trabajo no se han tenido en cuenta

posibles contribuciones a la incertidumbre debidas
a la variacin de las condiciones ambientales, ya
que se desconoce en nuestro laboratorio el
comportamiento del instrumento de medida ante
dichas variaciones. A fin de minimizar dicha
contribucin, el ensayo de medicin del campo
visual del microscopio, se realiza en las
condiciones ms prximas posibles en las cuales
ha sido calibrada la reglilla y que se encuentran
expresadas en su certificado de calibracin.

Hemos comprobado que cualquier medicin

realizada del campo visual, supuesto este una
circunferencia, que se encuentre desplazada del
dimetro, puede ser representada en trminos del
mensurando D y el ngulo que caracteriza dicha
desviacin ec. (2) y (3).
Mediante un cambio de variable hemos
reemplazando por . Al asignar a el valor de
su esperanza tal cual la ec. (7), el valor obtenido
para el dimetro del campo visual en la ec. (4)
queda expresado como:
D = Lm x (1 + /2)

En el apndice presentamos un ejemplo de

aplicacin realizado en el Laboratorio. Es
interesante observar los rdenes de magnitud de
las contribuciones de cada una de las fuentes de
incertidumbre. En tal sentido podemos decir que la
contribucin dominante es la debida a la
resolucin de la reglilla. Por su parte la
incertidumbre debida a la incorrecta alineacin de
la reglilla con el dimetro del campo, est
aproximadamente dos rdenes de magnitud por
debajo de la primera y es del mismo orden que la
incertidumbre debido al instrumento.

(13)

Donde recordemos que Lm es la mejor estimacin

de L y es igual a la media aritmtica debida a n
mediciones independientes Li, de L.
En tanto es la varianza que caracteriza la
distribucin normal de valores que toma ,
alrededor de su valor esperado cero. Este valor de
ser intrnseco de cada laboratorio y afectar al
valor obtenido del dimetro del campo visual del
microscopio. De esta manera el valor del
mensurando D, quedar afectado por la
incertidumbre de una magnitud de entrada ya que
= u(,) o bien, = u()

Si bien el trabajo se ha realizado tomando la

experiencia de trabajo sobre microscopios pticos
compuestos, el mtodo se puede utilizar para
lupas pticas.

La expresin de la incertidumbre estndar

combinada para D, Uc(D) determinada en la ec (6)
quedar entonces:
REFERENCIAS
Uc(D) = (1+ /2) x U(Lm) + Lm x U()

(14)
[1]

Donde:
U2() = 4/2
2

U(Lm) = u (rep ) + u (res) + u (inst)

(15)

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The Determination of the Number of Body

Cells in Milk by e Direct Method. S.C. Prescott
y R.S. Breed. El diario de enfermedades
infecciosas, vol. 7, N 5 (25 de Octubre de
1910), pp 632-640. Publicado por: University
of Chicago Press.
URL: http://www.jstor.org/stable/30071855

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[2] Leche cruda - Determinacin de clulas

somticas -Mtodo microscpico directo de
Prescott y Breed, declarada Norma Chilena
Oficial de la Repblica por decreto No. 295,
de fecha 8 de octubre de 1979,del Ministerio
de Agricultura, publicado en el Diario Oficial
No. 30.496 del 23 de octubre de 1979.
[3]

Recuento electrnico de clulas somticas en

leche
fresca
y
determinacin
del
comportamiento celular en vacas de primer,
segundo y tercer parto durante la primera
mitad de la lactancia. Pedro j. Saelzer, M.V. ;
Vctor B. Gonzlez, M.V. ; Jaime A. Lutecke,
M.V. Archivos de Medicina Veterinaria
Suplemento 1: 57-64 1979. Publicacin de la
Universidad Austral de Chile.

[4]

Mtodos de Ensayos Rpidos de Deteccin

de Microorganismos en la Leche. Nuria Dvila
Fernndez y Juan Emilio Hernndez Garca.
Instituto de Investigaciones en Normalizacin,
Ministerio de Ciencia, Tecnologa y Medio
Ambiente. Sede Universitaria de S. Spritus.
Maestra en Higiene Veterinaria de los
Alimentos Universidad Agraria de la Habana,
Cuba. Revista Electrnica de Veterinaria,
REDVET. ISSN 1695-7504. Vol VII, N7, Julio
2006

[5]

Comparacin del citmetro UF-100i con el

sistema Kova y el mtodo convencional para
el conteo de leucocitos y eritrocitos en orina.
Vernica Gomez Gavio y otros. Revista
Bioquimia Vol. 33 N 2, AbrilJunio 2008, p.
51-58.

[6]

Comparacin entre tres mtodos manuales

empleados en la cuenta diferencial de
leucocitos
respecto
a
un
equipo
automatizado. Eduardo Brambila, Rosalba
Castillo Guerra y Patricia Lozano-Zarain.
Bioquimia, Vol. 28 N 3, Septiembre 2003, p.
4-12

[7]

Punto 3.1.2, Guide to the expression of

uncertainty in measurements, (edition 1993)
ISO/ IRAM 35050.

[8]

Punto 5.1.1, 5.1.2, 5.1.3, Guide to the

expression of uncertainty in measurements
(edition 1993) ISO/ IRAM 35050

[9]

Apendice F.2.4.4 Guide to the expression of

uncertainty in measurements (edition 1993)
ISO/ IRAM 35050.

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APENDICE
n
a) u2(rep ) = S2(Lm) = 1/n(n-1) (Li Lm)2

Ejemplo de aplicacin

i=1

Presentamos a continuacin un ejemplo de la

determinacin del campo visual de un microscopio
y la incertidumbre asociada a la misma.

u2(rep ) = 1.1 x 10-5

2

b) u (res) = (h/4) x (1+z )/6

A tal fin
realizamos 10 determinaciones del
dimetro del campo visual de un Microscopio
ptico Olympus modelo CX21, con ocular de 10X
y objetivo de 10X. Las mediciones son realizadas
con una reglilla para microscopio cuya escala es
de 10 mm de largo y mnima divisin de 0.1 mm

Para un aumento de objetivo de 10x consideramos

una distribucin trapezoidal con lo cual: Z = 0.5 y h
la menor divisin de la reglilla es: h = 0.1 mm
2

u (res) = 1.302 x 10

-4

c) u2(inst) se obtiene del certificado de calibracin

La siguiente tabla muestra

obtenidos expresados en mm.

los

resultados

La incertidumbre expandida dada en el certificado

es U = 0.001 mm para un K = 2. De manera que
obtenemos:

Li(mm)

1.8

1.8

1.8

1.775

1.8

u2(inst) = 2.5 x 10-7

10

La incertidumbre estndar U(Lm) toma entonces

el valor:

Li(mm)

1.8

1.8

1.775

1.8

1.8

U(Lm) = 0.00014153
La varianza asociada a es:

1) El valor Obtenido para el Dimetro es:

U () = /2

D = Lm x (1 + )

U2() = 7,91 x 10-7

10

Donde: E() = /2 y Lm = 1 / 10 L i
i=1

El valor obtenido para la incertidumbre estndar

combinada es entonces:

Lm = 1.795 mm

-2

Para los aumentos de ocular y objetivo

considerados, el valor obtenido en el Laboratorio
para , la varianza que caracteriza la distribucin
normal de valores que toma , alrededor de su
valor esperado cero es:

A continuacin presentamos en la tabla los valores

de las componentes de incertidumbre estndar y
la incertidumbre combinada.

= 1,258 x 10-2

u(rep )

u(res)

u(inst)

U()

Uc(D)

0,00331

0,0114

0,0005

0,000889

0,012

Uc(D) = 1,20 x 10 mm

Con lo cual el valor del Dimetro D es:

D = Lm x (1 + /2)
D = 1,796 mm
2) La incertidumbre combinada ser
Uc(D) = (1+ /2) x U(Lm) + Lm x U()
Donde:
U(Lm) = u2(rep ) + u2(res) + u2(inst)

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