ADN RECOMBINANTE

PORTILLA CRUZ ITZEL SINAI

UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE BIOANLISIS
CAMPUS XALAPA

EXPERIENCIA EDUCATIVA
BIOLOGIA MOLECULAR

ACADMICO
LAURA CECILIA SNCHEZ GNZALEZ

PRESENTADOR
ITZEL SINAI PORTILLA CRUZ

ELABORACIN DE ADN RECOMBINANTE

JUEVES, 30 DE MAYO DE 2013

INTRODUCCIN
La habilidad para detectar y aislar genes normales y mutados, su secuencia y la expresin
de sus productos proteicos ha tenido un importante impacto en la biologa y la medicina.
La tecnologa del DNA recombinante ha hecho posible investigar ms a fondo la estructura
y funcin de los genes, especialmente de los genes eucariticos que eran inaccesibles por
otros mtodos. Estas investigaciones generan nuevos interrogantes e inquietudes, muchos
de los cuales tienen profundas implicancias ticas.
La Tecnologa del DNA recombinante se origin en los comienzos de 1970 con el
descubrimiento de las endonucleasas de restriccin, enzimas capaces de realizar el clivaje
especfico del DNA en fragmentos determinados.
Es factible que la molcula de ADN se rompa y se una (recombinar) con fragmentos de una misma
especie o de otra diferente.

PRPOSITO
La estructura del hueso es muy parecida al hormign armado que se utiliza en la
construccin de casas. Sobre un marco de barras de acero se vierte el cemento; sin las
barras de acero el cemento sera frgil y se rompera al menor movimiento y sin el cemento,
las barras no tendran el apoyo necesario y se doblaran. En los huesos, el papel de las
barras de acero lo asume el colgeno y el cemento son los minerales que aporta la sangre
(calcio, fsforo, etc.). Los minerales dan fuerza a los huesos y el colgeno proporciona
elasticidad.
La elaboracin de un ADN recombinante que permita la expresin del gen que codifica
para la colgena y produzca la protena es el objetivo de este trabajo, ya que de esta manara
se podra contrarrestar la enfermedad de la Osteognesis Imperfecta (OI), la cual es un
trastorno gentico que se caracteriza por la fragilidad de los huesos; los huesos pueden
fracturarse ante el mnimo golpe o incluso sin causa aparente. El trastorno va a persistir a lo
largo de toda la vida de la persona, aunque en muchas de ellas hay un descenso importante
del nmero de fracturas una vez pasada la adolescencia.
La OI se produce por un defecto congnito (que existe desde el nacimiento, no adquirido)
en la produccin de una sustancia denominada colgeno. El colgeno es la protena
principal del tejido conectivo, que es el tejido de sostn del cuerpo. En la OI hay menor
cantidad de colgeno o ste es de "mala calidad", por lo que los huesos son dbiles y se
fracturan con facilidad.
En la mayora de los casos, la OI es ocasionada por un fallo en uno de los dos genes que
codifican el colgeno I. El defecto influye en la produccin de colgeno. En la OI tipo I se

produce demasiado poco colgeno, pero de calidad normal. En los otros tipos el colgeno
es de mala calidad estructural, mientras que la cantidad puede estar tambin reducida.
La mayor parte de los casos de OI se producen por un defecto gentico de carcter
dominante. Algunos nios heredan la enfermedad de uno de los progenitores, si bien en
otros nios no hay ninguna historia familiar de la enfermedad y se considera que el defecto
gentico se debe a una mutacin espontnea.
Los genes son segmentos de ADN que contienen la informacin necesaria para construir
una protena; todas las caractersticas diferenciales hereditarias, (rasgos), estn codificadas
por los genes. Una enfermedad hereditaria puede ser el resultado de las caractersticas
anormales que aparecen como expresin de un gen anormal. Recibimos dos copias de cada
gen de cada padre, y realizan su misin de manera normal; en alguna ocasin los genes se
pueden transformar por una mutacin y hay un cambio en la estructura del ADN de un gen:
cuando se da una mutacin puede haber un cambio en la funcin normal del gen.
La mayora de los casos de OI se producen por una mutacin dominante. Cuando un gen
con una mutacin dominante se une a un gen normal, el gen defectuoso "domina" al gen
normal.
En la OI, se pueden dar dos circunstancias:

El gen dominante cambiado provoca alteraciones en una protena llamada colgeno,

cambios en la calidad del colgeno. Tipo II, III y IV.

Problema de cantidad de colgeno (disminucin de la cantidad total): tipo I.

DESCRIPCIN DE LA ELABORACIN DEL ADN RECOMBINANTE

TCNICA GENERAL
Se utilizan enzimas especiales para insertar genes humanos en el ADN de las bacterias. Los
genes humanos hacen que las bacterias elaboren un nuevo material, que no eran capaces de

producir con anterioridad. En condiciones adecuadas, las bacterias e multiplican

rpidamente, de modo que se puede generar una gran cantidad de la nueva sustancia en un
tiempo corto de tiempo. De esta manera, los genes que controlan la produccin de la
colgena, se pueden colocar en una clula bacteriana, con el fin de que estas elaboren la
protena. Despus ests sustancia es extrada del cultivo de las bacterias y preparada para su
uso por parte de los enfermos que la precisen.
MTODO RECOMBINANTE PARA LA PRODUCCIN DE COLGENA
Primeramente sabiendo el panorama general de la tcnica y teniendo el conocimiento
terico especficamente del procedimiento a realizar se procede a recombinar el gen
especfico para colgena dentro del plsmido (secuencias de ADN extracromosmicas que
tienen la capacidad de reproducirse autnomamente y, algunos, de pasar de una clula a
otra y convertirse en parte integrante del cromosoma que los acoge) seleccionado que es
pUC18, el cual cuenta con 2686 bp en su conformacin.
El plsmido que vamos a utilizar es un plsmido artificial derivado del plsmido pBR322.
El plsmido pUC18 tiene un tamao aproximado de 2,7 Kb y en su secuencia destacan dos
genes que actan como marcadores de seleccin.

En
lugar contendr, un
Figura 1. Esquema representativo de un plsmido del tipo pUC18 en el que se destacanprimer
los marcadores
R
gendede
resistencia
al antibitico
Ampicilina
quecomo
confiere
a las bacterias
seleccionables (gen
resistencia
al antibitico
Ampicilina,
Amp R, (gen
y gen Amp
LacZ)) as
la regin
a dicho
antibitico.
El la
otro
gen es el gen LacZ. Este gen codifica para la enzima
dnde se localizanresistencia
las dianas de
restriccin
tiles para
clonacin.
-galactosidasa que degrada la lactosa y otros -galactsidos como el 5-bromo-4-cloro-3Indol--D-galactsido (X-gal). Sin embargo, esta copia del gen del plsmido pUC18 es
defectuosa en 3 y, por tanto, el polipptido producido tras la expresin de este gen carece
de actividad -galactosidasa.
Este plsmido se utiliza en experimentos de clonacin para transformar clulas DH5 de
Escherichia coli. Esta cepa de E. coli posee un gen LacZ defectuoso en 5 aunque posee un
codn AUG interno que permite el inicio de la traduccin del mensajero LacZ, defectivo,
en un polipptido sin actividad -galactosidasa.
Cuando una clula DH5 es transformada con el plsmido pUC18 (intacto), los
polipptidos producidos por los dos genes LacZ defectuosos (el de la bacteria y el del

plsmido), que carecan de actividad -galactosidasa por separado, complementan

(fenmeno conocido con el trmino complementacin ) y la clula ve restablecida la
funcin -galactosidasa. Sin embargo, la complementacin no ocurre si el plsmido
introducido en la bacteria es un plsmido recombinante. Ello es porque las diferentes dianas
de insercin se localizan dentro del gen LacZ en lo que se conoce como polylinker (regin
rica en diferentes dianas de restriccin nicas). As, en un experimento de clonacin,
cualquier inserto de ADN forneo interrumpira el gen lacZ del plsmido y la bacteria con
plsmido recombinante carecera de funcin -galactosidasa como las bacterias DH5 sin
plsmido pUC18.
Hay que destacar que la incorporacin artificial del polylinker dentro del gen lacZ del
plsmido consiste en una insercin que no altera la pauta de lectura del mensajero transcrito
a partir del promotor lacZ y que su traduccin supone la insercin de unos pocos
aminocidos en la cadena polipeptdica correspondiente sin que ello altere la actividad galactosidasa del polipptido una vez complementa con el polipptido bacteriano.
La presencia de los marcadores AmpR y lacZ en el plsmido pUC18 permite seleccionar
bacterias con plsmidos recombinantes tras un experimento de clonacin. Para ello, las
clulas DH5 que han pasado por una experiencia de transformacin son sembradas en una
placa con medio de cultivo slido (medio LB) que contiene Ampicilina y X-gal. El X-gal es
un -galactsido degradado por la -galactosidasa. Uno de los productos de degradacin
del X-gal forma un precipitado de color azul sobre las colonias bacterianas con funcin galactosidasa.
As las cosas, la forma de discriminar entre las tres poblaciones de clulas bacterianas
obtenidas tras un experimento de clonacin en una placa con LB+Amp+X-gal tiene su base
en lo siguiente:
1. Las bacterias no transformadas (carecen de plsmido pUC18 de cualquier tipo) no
crecern en nuestra placa dado que son sensibles al antibitico ampicilina.
2. Las bacterias transformadas con plsmido no recombinante (sin inserto gen
codificante a colgena) crecern formando colonias de color azul (dado que son
resistentes a ampicilina y dado que tienen actividad -galactosidasa.
3. Las bacterias transformadas con plsmido recombinante (con inserto de gen de
colgena) crecern formando colonias de color blanco (dado que son resistentes a
ampicilina y dado que no tienen actividad -galactosidasa)

PROCEDIMIENTO A SEGUIR:

Despus de seleccionar el plsmido y a la cepa de E. coli que se someter a la prueba

procedemos en primer punto a realizar una toma de muestra de sangre, para realizar una
extraccin de ADN mediante su respectiva tcnica.
El ADN puede ser proveniente de cualquier persona, ya que slo pretendemos obtener los
genes que codifican para la colgena.
A este ADN que fue extrado se le someter a una hibridacin in situ en donde se
identificar la secuencia especfica del ADN en una laminilla. Con el propsito de realizar
esta identificacin, se requiere una sonda u oligonucletido complementario. O se puede
usar de igual forma una PCR que a la vez es imposible de identificar en ausencia de
hibridacin entre molculas complementarias.
En este caso se obtuvo la secuenciacin gentica de la colgena de tipo I (revisada de
acuerdo a una genoteca), la cual podra ser til tratar a pacientes con Osteognesis
Imperfecta por disminucin en la produccin de su colgena.

Figura 2. Gen que codifica para la protena colgena de tipo I

(En el anexo se puede observar la secuenciacin proteica de la colgena)

Para llevar a cabo la recombinacin fue necesario aprender a cortar y despus unir
especficamente el ADN, esto se realiza mediante las endonucleasas de restriccin que
rompern la doble hebra de ADN al reconocer la secuencia especfica de 4 a 8 bases, en
este caso Hind III, que como se muestra en la figura se puede ver es sitio de restriccin
donde realiza el corte.

Figura 3. Imagen que muestra la localizacin del sitio de corte de Hind III en el plsmido
pCU18, y su respectivo sitio de corte en la secuencia de nucletidos respectivos de ADN.

Se utiliza un mapa de
restriccin para reflejar la disposicin de secuencias de nucletidos especficas en la regin
elegida para el corte. Esto significa que es posible realizar la comparacin de diferentes
regiones de ADN, sin tener que determinar sus secuencias de nucletidos.
Los mapas de restriccin son tambin importantes para la clonacin de ADN y para la
ingeniera gentica, permitiendo localizar un gen de inters en un fragmento determinado,
facilitando as su aislamiento.
Posterior a esto se asla el ADN que se desea clonar mediante cromatografa lquida o por
centrifugacin. Adems de realizar un purificacin del ADN mediante una electroforesis.

Despus de cortar el vector con la respectiva enzima de restriccin se van a clonar el ADN
recombinado con el vector mediante los extremos cohesivos formados.

Figura 4. Imagen que muestra un ejemplo claro de como se realiza la clonacin por extremos
cohesivos.

Una vez que se introducido el ADN al vector, se le denomina ADN inserto, y se liga
mediante una ligasa mediante enlaces covalentes en una bacteria competente que en este
caso fue la cepa comercial de Escherichia coli DH5 y como ya se sealo esta cepa de E.
coli posee un gen LacZ defectuoso en 5 aunque posee un codn AUG interno que permite
el inicio de la traduccin del mensajero LacZ, defectivo, en un polipptido sin actividad galactosidasa. El mtodo usado es la transformacin.
Despus de todos los pasos se somete a un choque trmico las bacterias para facilitar as la
captacin del material gentico, ya podemos sembrarlas en un medio rico en ampicilina, y
con esto la proliferacin bacteriana con un supuesto contenido del gen codificante de
colgena.
Y para ello se efectu el estriado en la caja Petri con medio de cultivo LB (rico en
ampicilina y X-gal) que es especifico para determinar bacterias con ADN recombinante.
Tras la siembra como ya comentamos anteriormente encontraremos dos posibilidades, bien
colonias azules es seal de que esas bacterias no han incorporado el plsmido, el color azul
viene de la dinmica del gen lac-z, codifica para la (beta)-galactosidasa, y degrada del
medio lactosa. En realidad, los colores nos sirven para diferenciar claramente que bacterias
han incorporado el ADN, (colonias blancas) de aquellas que no lo han incorporado
(colonias azules).

Posterior a esto se procede a identificar de secuencias clonadas especficas. El problema

ahora es identificar y seleccionar slo el clon o clones que contienen el gen que nos
interesa, y determinar si un clon determinado contiene todo el gen o slo una parte de l.
Hay varias maneras de hacerlo, y la eleccin depende de las circunstancias y de la
informacin disponible. En este caso se realizar una sondas para rastrear clones

especficos estos son polinucletidos radioactivos que contienen una secuencia de bases
complementaria a todo o a parte del gen de inters.
Y para culminar se hace un anlisis de las secuencias clonadas utilizando los insertos de
DNA clonados en vectores en experimentos de hibridacin para caracterizar la identidad de
genes especficos, para localizar regiones codificantes o regiones reguladoras flanqueantes
en secuencias clonadas y para investigar la organizacin molecular de las secuencias
genmicas.
La utilizacin de segmentos de DNA clonado, separados por electroforesis, transferidos a
filtros, y rastreados con sondas. Conocido como transferencia de Southern (Southern
blot). En el, el DNA clonado se corta en fragmentos con una o ms enzimas de restriccin,
y estos fragmentos se separan por electroforesis en gel. El DNA se desnaturaliza dentro del
gel en fragmentos de cadena sencilla, y stos se transfieren a un filtro de un material,
normalmente nitrocelulosa o un derivado del nylon, que une el DNA. La transferencia se
hace colocando la hoja de la membrana encima del gel, y provocando que el tampn pase
por el gel y por la hoja de nitrocelulosa o de nylon por capilaridad. El tampn pasa por el
gel y por la membrana, arrastrando al DNA fuera del gel e inmovilizndolo en la
membrana.
El gen de colgeno en mamferos posee ms de 50 secuencias diferentes que dependen del
tipo de colgeno del que se trate.
BIBLIOGRFIA
Luque, J., y Herrez, . Texto ilustrado de Biologa
Molecular e Ingeniera Gentica. Ed. Harcourt, 2001.
Lewin, B. Genes IX, Pearson Education, 2007.
[Genes VII, Marbn, 2001 (2000)].
Lodish, H., et al. Molecular Cell Biology, 5th ed.,
W. H. Freeman, 2004. [Biologa celular y molecular
(5 ed.). Editorial mdica panamericana, 2005 (2004).

ANEXO
ORIGIN
1
61
121
181

mhpglwlllv
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pgpigiqgpt
pgqpgprgpp
gdpglpgldg
dvglpgpagp

241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
1201
1261
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1561
1621

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