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DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
DIVISION DE BIOQUIMICA Y FARMACIA
FACULTAD DE QUIMICA
UNAM
JULIO DE 1999
Pgina
INDICE
UNIDADES
CONVENCIONALES
UNIDADES
SI
Eritrocitos
Mujeres
4.3 5.0 X 106/mm3
Hombres
4.5-5.5 X 106/mm3
Mujeres
14.6 1.9 g/dl
Hombres
16.4 1.9 g/dl
Hemoglobina
Hematocrito
Mujeres
44 2.7 %
Hombres
2.6 %
0.44
0.027%
0.51 0.026%
Volumen
corpuscular
medio VCM
82 96 u3
82 96 fL
Hemoglobina
corpuscular
media HCM
27 31 uug pg
32 36 %
0.32 0.36
0.5 1.5%
25,000 75,000/mm3
25 75 x 109/L
Concentracin
corpuscular
media de Hb
CMHC
Reticulocitos
Leucocitos
4.0 11 X 103/mm3
Neutrofilos
segmentos
banda
Eosinfilos
Basfilos
Linfocitos
Monocitos
50 70% 1800-7000/mm3
1 3%
700/mm3
1 3%
450/mm3
0 1%
200/mm3
22 40% 1000-4800/mm3
3 8% 120 800/mm3
Plaquetas
150,000 450,000/mm3
0.15-0.40 X 1012/L
Velocidad
de
Sedimentacin
Mujeres
10 15 mm/h
Hombres
4 7 mm/h
USO
VENTAJAS
DESVENTAJAS
Degeneracin de los
granulocitos. Utilidad
limitada a los primeros
minutos en
extensiones.
IONIZANTES
EDTA al 10%
Sal distica ms
soluble
Citrato de sodio
3.8% (coagulacin)
Evita aglutinacin de
plaquetas, preserva
ms tiempo la sangre
Seco evita ms la
hemlisis.
Util en estudios de
anemias hemolticas
ANTITROMBINICOS
Heparina
Carbohidrato cido
MECANICO
Desfibrinizacin
DETERMINACION DE HEMOGLOBINA
1. INTRODUCCION
La hemoglobina es una protena conjugada la cual proporciona el color rojo de la
sangre. Se encarga de llevar el oxgeno a los tejidos y participa en el transporte
del CO2 para el equilibrio cido-base. La porcin porfirnica de la hemoglobina es
una protoporfirina IX, la cual combinada con Fe (II) constituye el grupo hem; ste
ms la parte proteca (globina) constituye la hemoglobina.
Existe una amplia variedad de tcnicas para cuantificar a la hemoglobina, entre las
que destacan: determinacin de su contenido de Fe, espectrofotometra,
refractometra, gasometra, etc.
El mtodo de cianometahemoglobina es el mtodo recomendado por el Comit
Internacional para la Estndarizacin en Hematologa y las ventajas que ofrece
este mtodo son:
FUNDAMENTO
2.- OBJETIVOS
Realizar una curva de calibracin de cianometahemoglobina
Valorar las concentraciones de hemoglobina en sangre total.
Distinguir valores normales de los patolgicos.
3- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 13 X 100 mm
Pipetas de 1.0 ml
Pipetas de 5.0 ml
Pipetas de sahli (0.02 ml
Boquilla
Gradilla
Celdas de 1 cm de dimetro
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Sangre capilar o venosa con anticoagulante.
3.3 EQUIPO
Espectrofotmetro o fotmetro
3.4 REACTIVOS
Solucin de EDTA al 10%
Reactivo de Drabkin
Solucin estndar de cianometahemoglobina
80 mg/dl. Facultad de Qumica, UNAM
Etanol al 70%
3.5 TOXICIDAD DE SUSTANCIAS
El reactivo de Drabkin y la solucin estndar de (HbCN) contienen derivados de
cianuro los cuales son txicos; sin embargo las concentraciones de stos estn
por debajo de la dosis letal referido a un litro de solucin. Se recomienda utilizar
perillas de seguridad para pipetear estas soluciones y no ingerir alimentos durante
la prctica; al finalizar la determinacin es necesario lavarse las manos.
3.6 TECNICA
CURVA ESTANDAR
Solucin estndar de
(HbCN) (ml)
Reactivo de
Drabkin (ml)
Concentracin
g/dl
Mmoles/L
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
MUESTRA PROBLEMA
5.- Dejar reposar durante 10 minutos y leer contra un blanco de reactivos (reactivo
de Drabkin). Interpolar las lecturas en la curva de calibracin. La reaccin es
estable un mnimo de 2 horas.
4- CALCULOS
Es necesario aplicar la siguiente frmula para calcular la concentracin de cada
uno de los tubos de la curva de calibracin.
g/dl de
251
hemoglobina =
5- VALORES DE REFERENCIA
Hombres
Mujeres
6- BIBLIOGRAFIA
Dacie,J.V. and Lewis, S.M. Practical Hematology. Fifth
edition. Churchill Livingstone, New York. 1975.
10
CUENTA DE ERITROCITOS
1. INTRODUCCION
El resultado de la eritropoyesis es la produccin de una clula eritrocito bien
diferenciada y capaz de ejercer su funcin principal, que es la de transportar
oxgeno y bixido de carbono.
Su falta de ncleo le da la capacidad de llevar el oxgeno sin consumir
prcticamente nada de l, su forma biconcava es la que mejor se presta para
afrontar la hemlisis; su membrana no admite la salida de la hemoglobina.
FUNDAMENTO
Se diluye una cantidad exacta de muestra con el lquido de Hayem, que es una
solucin isotnica y por lo tanto no altera la estructura de los eritrocitos; esta
mezcla se coloca en la cmara de Neubauer y se cuenta el nmero de clulas
localizadas en los cuadros indicados para elloc.
2.- OBJETIVOS
Practicar el recuento de eritrocitos
Reconocer a los eritrocitos
Manejar adecuadamente la cmara de Neubauer
3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 13X100 mm
pipetas de thoma para glbulos rojos
cmara de neubauer
boquillas
microscpios
gradilla
papel higinico
papel parafilm
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Sangre capilar o venenosa con anticoagulante.
11
3.3 EQUIPO
Microscopio
Agitador de pipetas
3.4 REACTIVOS
EDTA al 10%
Lquido de Hayem
3.4 TECNICA
Obtener sangre capilar o venosa anticoagulada con EDTA al 10% (un mg de
anticoagulante por cada ml de sangre)
a) Llenar con sangre bien mezclada, la pipeta de Thoma hasta la marca 0.5
b) Limpiar cuidadosamente la parte externa de la pipeta.
c) Completar con lquido de Hayem hasta la marca 101.
d) Sellar los extremos de la pipeta con papel parafilm.
e) Agitar durante 3 minutos, mezclar perfectamente.
f) Colocar el cubrehematmetro sobre la cmara.
g) Descartar las primeras 4-5 gotas de la pipeta y llenar la cmara por capilaridad
por uno de los bordes del cubrehematmetro.
h) Se deja que el lquido penetre lentamente entre la cuadrcula y el
cubrehematmetro, sin que se formen burbujas, ni huecos y sin sobrepasar los
canales de la cmara.
i) Dejar reposar de 3-5 min.
j) Con objetivo de 40X se cuentan los eritrocitos contenidos en 80 cuadros
pequeos (uno central y cuatro de los extremos del cuadro central de 1 mm2).
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4.- CALCULOS
Si consideramos que el cuadro central de 1 mm2 tiene 400 cuadros, se realiza el
siguiente clculo :
N X 200 X 10 X 400
80
N x 10,000
Donde:
N = Nmero de eritrocitos contados
200
= Factor de dilucin
10 = Correccin de l altura de la cmara
80 = Nmero total de cuadros contados
400
= Nmero total de cuadros del cuadro central
5. VALORES DE REFERENCIA
Hombres.-
Mujeres.-
6. BIBLIOGRAFIA
Cartwright, George E. El Laboratorio en el diagnstico clnico.4. edicin. Ed.
Cientfico Mdica. Barcelona, Espaa 1973
13
HEMATOCRITO
1.- INTRODUCCION
El hematocrito representa la proporcin de glbulos rojos en la sangre-circulante.
Este valor depende del nmero de hemates de sangre perifrica, de la forma y
tamao de los mismos. Al igual que la hemoglobina y la cuenta de eritrocitos, el
hematocrito es uno de los parmetros importantes para determinar los ndices
eritrocticos (VGM, CMHG).
FUNDAMENTO
2.-OBJETIVOS
Explicar los fundamentos de las tcnicas de hematocrito
Evaluar su importancia diagnstico.
3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 13 x 100 mm.
tubos de wintrobe graduado
pipetas Pasteur con bulbo
capilares
plastilina
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Sangre capilar o venenosa con anticoagulante
3.3 EQUIPO
centrfuga
disco lector de hematocrito
14
3.4 REACTIVOS
Anticoagulantes EDTA al 10% (Sal disdica).
3.4A TECNICA MACROHEMATOCRITO
a) Homogeneizar perfectamente la muestra de sangre.
b) Con una pipeta Pasteur llenar con sangre un tubo de Wintrobe hasta la marca
superior 10, evitar la formacin de espuma, no debe quedar ninguna burbuja
de aire dentro de la columna o en el fondo.
c) Centrfugar a 3600 rpm durante 30 minutos.
d) La lectura se realiza en el lnea de separacin superior de la columna de
glbulos rojos, donde empieza la de glbulos blancos, haciendo la referencia a
la escala ascendente del lado derecho. Cada lnea de la escala equivale a 1%.
3.4 TECNICA DE MICROHEMATOCRITO
a) Se llenan con sangre proveniente del tubo de la muestra, las 2/3 partes de dos
tubos capilares. Puede hacerse tambin a partir del punto de puncin con dos
capilares heparinizados.
b) El extremo vaco se cierra a la flama o con plastilina efectuando un movimiento
de rotacin.
c) Colocarlos en los canales o surcos radiales de la centrfuga (cabezal ranurado
con numeracin para colocar los capilares) con el extremo cerrado dirigido
hacia fuera, centrfugar a 12,000 rpm durante 5 minutos.
4. CALCULOS
Calcular el % del paquete eritrocitario midiendo la altura (M2) con relacin al
volumen total de la muestra (M1).
M1
M2
100%
x%
15
Varones
47%
2.5
Mujeres
42%
2.5
Nios
35%
5.0
Recin nacidos
56%
10.0
6.- BIBLIOGRAFIA
Gradwhol, R Clinical Laboratory Methods and Diagnosis. 7
edicin Vol. 3 de. Mosby Co. U.S.A. (1970)
Todd. Sanford- Davidsohn Clinical Diagnosis and Management by
Laboratory Methods. 16. edicin W.B. Saunders Co. (1979)
16
1.- INTRODUCCION
En una muestra de sangre, el descenso de los glbulos rojos causa
desplazamiento hacia arriba del plasma, lo cual produce una corriente ascendente
y una fuerza de retraso. En la sangre normal, las fuerzas descendente y
ascendente son casi iguales y hay poca sedimentacin
Cuando se aglomeran los eritrocitos, el aumento de peso de la masa tiene mayor
efecto para aumentar la velocidad de sedimentacin que el aumento de volumen
para retrasarla. En consecuencia, cualquier estado que cause aglomeracin de
eritrocitos o formacin de pilas de monedas aumentar la velocidad de
sedimentacin de los eritrocitos.
En estado normal los eritrocitos no se aglomeran, porque tienen carga negativa y
se repelen mutuamente. Se considera que un aumento de determinadas protenas
del plasma puede disminuir la carga negativa del hemate y originar su
aglomeracin. El aumento de fibringeno guarda estrecha relacin con el aumento
de la VSE, pero tambin puede guardar relacin con ella los aumentos de
globulinas y .
Las anemias, las infecciones bacterianas aumentan la VSE. A la inversa, la VSE
suele ser muy lenta en pacientes policitmicos. La mayor parte de las virosis se
acompaan de velocidad normal o con aumento mnimo. Las enfermedades de la
colgena, las neoplasias y muchos transtornos gastrointestinales y renales se
acompaan de aumento de la velocidad de sedimentacin, que tambin se
observa despus de ciruga, quemaduras o traumatismos importantes.
FUNDAMENTO
Los eritrocitos sedimentan porque su densidad es mayor que la del plasma , por lo
que la velocidad de sedimentacin es la distancia (en mm) que descienden los
eritrocitos por unidad de tiempo (generalmente una hora) desde la parte superior
de una columna de sangre hasta la parte superior de la capa de hemates.
2.- OBJETIVOS
Efectuar la tcnica de la velocidad de sedimentacin de los eritrocitos.
Analizar su importancia clnica.
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3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 13X100 mm
Tubos de Wintrobe de 11.5 cm de largo
por 3 mm de
Pipetas Pasteur con bulbo
Gradilla de sedimentacin
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Sangre capilar o venosa con anticoagulante.
3.3 EQUIPO
Centrfuga clnica
3.4 TECNICA
1.- Seguir todos los pasos de la tcnica del macrohematocrito para llenar un tubo
de Wintrobe.
2.- Despus de que el tubo de Wintrobe est lleno de sangre, colocarlo en
posicin vertical en una gradilla de sedimentacin por un lapso de 60 minutos.
3.- Leer en la escala descendente de la izquierda el nivel en que se encuentra la
zona de separacin entre el plasma y los eritrocitos sedimentados.
4.- Informar el resultado en milmetros en una hora.
4.- CALCULOS
Correccin por hematocrito
La velocidad de sedimentacin se corregir cuando el valor de Ht de la muestra se
encuentre por debajo de los valores de referencia. Utilizar la tabla de correccin.
0 20
0 20
09
18
mm/h
mm/h
mm/h
Dacie J.V., Lewis, S.M. Practical Hematology. 5th ed. Ed. Churchill
Livingstone. London (1975).
International Comittee for standardization in Hematology. Standard
techniques for the measurements of red cells of Hamatology. 25:801 (1973).
Jones, R.F. 1961. Determination of packed cell volume by centrifugation.
Journal of Clinical Pathology. 14, 198.
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CUENTA DE RETICULOCITOS
1.- INTRODUCCION
Durante el proceso de maduracin eritroide se observa una serie de cambios
bioqumicos y morfolgicos orientados a la formacin de un elemento maduro apto
para realizar el transporte gaseoso (02, C02). El objetivo fundamental de dicha
maduracin es la sntesis de hemoglobina (Hb).
Una vez que el eritroblasto ha expulsado su ncleo, la clula conserva parte de su
maquinaria biosinttica constituida principalmente por mitocondrias y
polirribosomas, los cuales una vez cumplido su cometido (la sntesis de Hb
restante) son autodegradados con lo cual la clula pasa a estadio de hemate
maduro.
En tinciones policromatfilas el reticulocito presenta un volumen mayor que el
eritrocito, asi como basoflia difusa, lo que indica su contenido variable de RNA
ribosomal. La fase de maduracin del reticulocito requiere de 2 a 4 das y se
realiza en la microcirculacin de la mdula sea.
FUNDAMENTO
2.- OBJETIVOS
Valorar de manera sencilla la produccin eritrocitaria.
Evaluar tempranamente en anemias carenciales la eficacia del
tratamiento.
Establecer el diagnstico diferencial entre anemias hemolticas y otro
tipo de anemias.
3. PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 10x75 mm
Pipetas Pasteur con bulbo
20
Portaobjetos
Cubreobjetos
Gradilla
Aplicadores
3.4 REACTIVOS
Solucin de nuevo azul de metileno
Solucin de azul de cresil brillante
Blsamo de Cnada
Aceite de inmersin
Xilol
3.5 TECNICA
1.- Coloque en tubo de 10x75 mm un volumen de sangre del paciente.
2.- Agrega un volumen del colorante supravital recin filtrado
3.- Mezclar suavemente y dejar en reposo 15 min. A temperatura ambiente
4.- Tomar una gota de la mezcla y efectuar un extendido fino en el portaobjetos (o
cubreobjetos), dejar secar el frotis al aire.
5.- Observar en el microscopio con objetivo de 100.
6.- Contar las clulas que tienen grnulos azules o reticulares en un total de 1000
hemates los cuales no deben estar agrupados o apilados.
21
hto paciente
hto. Normal
23,000 106,000/mm3
Hombre
27,000 118,000/mm3
6.- BIBLIOGRAFIA
Cartwright, G.E. El Laboratorio en el Diagnstico Hematolgico. 4. Edicin
Cientfico-Mdica (1973)
Rodrguez Moyado y Col. Procedimientos Bsicos para la seleccin de
Donadores de Sangre en la Cd. de Mxico. Rev. Med. IMSS Vol. VII, 131
(1968)
Todd Sanford- Davisohn. Clinical Diagnosis and Manegement by Laboratory
Methods. 16- Ed.W,B, Saunder Co. (1979)
William J. William. Hematology 3- Ed. MgGraw-Hill Book Co. (1983)
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CUENTA DE LEUCOCITOS
1.- INTRODUCCION
En la sangre normal pueden distinguirse los siguientes tipos de leucocitos:
Granulocitos.- neotrfilos, esinfilos, basfilos.
Agranulocitos.- linfocitos, monocitos.
La produccin de linfocitos es en sitios diseminados (bazo, ganglios linfticos y
otros tejidos linfticos organizados), pero la produccin de neutrfilos, monocitos,
eosinfilos y basfilos est limitada a la mdula sea en el ser humano normal.
El examen de los leucocitos comprende dos fases tcnicas. Una fase cuantitativa
que determina el nmero de leucocitos, las cifras absolutas y relativas de las
diversas formas de glbulos blancos, y la segunda, que determina la morfologa
celular.
En ocasiones basta su examen para formular un diagnstico especfico, por
ejemplo en las leucemias. Con ms frecuencia puede ser de ayuda diagnstica
para establecer un pronstico en relacin al curso de la enfermedad.
FUNDAMENTO
2.- OBJETIVOS
23
3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Pipetas de Thoma para glbulos blancos
Tubos de ensaye de 13 x 100 mm
Cmara de Neubauer
Boquillas
Gradilla
Papel parafilm
Papel higinico
3.2.-MATERIAL BIOLOGICO
Sangre capilar o venosa con anticoagulante
3.3.- EQUIPO
Microscopio
Agitadores de pipetas
3.4.- REACTIVOS
Solucin de EDTA al 10%
Lquido de Turk
Etanol al 70%
3.4 TECNICA
1.- Homogenizar perfectamente bien la sangre
2.- Con la pipeta de Thoma para glbulos blancos, aspirar sangre hasta la marca
de 0.5; secar cuidadosamente la parte exterior de la punta de la pipeta.
3.- Complementar con lquido de Turk hasta la marca de 11. (dilucin 1:20).
4.- Agitar 2 minutos.
5.- Desechar las primeras 4 5 gotas y se carga la cmara de Neubauer,
procedimiento descrito en el recuento de eritrocitos.
6.- Dejar reposar la cmara con la muestra durante 3 minutos.
7.- Observar con el microscopio utilizando el objetivo de 10 X.
24
8.- Se cuentan los leucocitos en cada uno de los cuatro cuadros de 1 mm2 de las
esquinas de la cuadrcula de la cmara de Neubauer.
4.- CALCULOS
Para obtener la cifra de leucocitos por milmetro cbico se emplea la siguiente
frmula:
N x 20 x 10
= N x 50
= leucocitos/ mm3
= leucocitos/l
en dnde :
N = nmero de leucocitos contados
20 factor de dilucin
correccin por altura de la cmara
4 nmero de cuadros de 1 mm2 en los que se efectu el conteo de
leucocitos.
El factor de 50 variar si cambia la dilucin y/o el nmero de cuadros contados.
4.5 10 X 109/L
4.- BIBLIOGRAFIA
Dacie, J.V. and Lewis, S.M. Practical Hamatology. Fifth
Edition, Churchill Livingstone, New York. 1975.
25
CUENTA DE PLAQUETAS
1.- INTRODUCCION
Las plaquetas se originan en la mdula sea a partir del megacariocito, son
redondas u ovaladas y miden de 1 a 3 micras de dimetro. Tienen una vida media
de 8 a 11 das, desempean una funcin crtica en la hemostasia que consiste en:
1) mantenimiento continuo de la integridad vascular; 2) paro inicial del sangrado
por formacin del tapn plaquetario; 3) estabilizacin del tapn hemosttico por la
contribucin de factores plaquetarios en el proceso de formacin de fibrina.
FUNDAMENTO
En una dilucin con citrato de sodio adicionado de azul de cresil brillante, las
plaquetas se observan al microscopio como clulas con un movimiento browniano.
Las plaquetas se cuentan en una cmara de Neubauer utilizando tambin
microscopa de contraste de fases despus de que los eritrocitos han sedimentado
en solucin con oxalato de amonio al 1%
2.- OBJETIVOS
3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 13 X 100 mm
Pipeta de Thoma para glbulos rojos
Cmara de Neubauer con cubrehematmetro
Caja de Petri
Gradilla para tubos
Boquilla
Papel sanitario
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Sangre capilar o venosa con anticoagulante (EDTA al 10%)
26
3.3 EQUIPO
Microscopio de campo claro
Microscopio de contraste de fases
Agitador de pipetas de Thoma
3,4 REACTIVOS
Solucin de EDTA al 10%
Lquido diluyente de plaquetas
Solucin de oxalato de amonio al 1%
3.6 TECNICA
1.- Cargar con la muestra de sangre una pipeta de Thoma para glbulos rojos
hasta la marca 1.0
2.- Limpiar cuidadosamente la sangre adherida al exterior de la pipeta.
3.- Completar el volumen hasta la marca de 101 con el lquido diluyente de
plaquetas o con oxalato de amonio al 1% (segn el mtodo a emplear) dilucin
1:100.
4.- Mezclar el diluyente y la sangre por agitacin durante 3 a 5 minutos.
5.- Descartar las primeras 4-5 gotas de la pipeta y cargar la cmara de Neubauer.
6.- Preparar una caja de Petri con papel filtro humedecido y sobre ste unos
soportes de madera para dejar reposar la cmara durante 15 minutos.
7.- Al finalizar este perodo, realizar la cuenta de las plaquetas con el objetivo de
40 y el ocular de 10X. Debe trabajarse con buena iluminacin en el
microscopio para evitar confundir las plaquetas con levaduras, colorante
precipitado o artefactos. En la cmara las plaquetas aparecen como cuerpos
refrctiles ovales o elongados.
8.- Contar todos los cuadros del cuadro central (para glbulos rojos) que tiene una
superficie de 1 mm2.
Nota: Esta determinacin debe hacerse rpidamente para evitar que las plaquetas
se aglomeren.
27
4.- CALCULOS
Nmero de plaquetas/mm3 = N x 10 x 100
= N x 1000
N = nmero de plaquetas contadas
10 = correccin por la altura de la cmara
100 = Factor de dilucin.
6.- BIBLIOGRAFIA
Dacie, J.V. and Lewis, S.M. Practical Hematology. Fifth
Edition. Churchill Livingstone, New York. 1975.
28
FROTIS Y TINCIONES
1.- INTRODUCCION
El examen cuidadoso del frotis sanguneo proporciona ms informacin que
cualquier otro parmetro de laboratorio, sin embargo la interpretacin solo se
adquiere con la prctica y el estudio constante. Es importante resaltar el hecho de
que la utilidad de esta prueba se ve correlacionada con una orientacin clnica
justificada por parte del mdico.
Por medio del examen del frotis de sangre perifrica teido con colorantes
policromatfilos, es posible detectar alteraciones morfolgicas en los hematies
como: Anisocitosis, macrocitosis, microcitosis, anisocromia, policromatofilia,
cuerpos de Howell Jolly, anillos de Cabot y otras variaciones en la forma, gracias a
lo cual es posible establecer un diagnstico presuntivo de algunos tipos de
anemia.
Asimismo, se puede realizar la identificacin de leucocitos en base a afinidades
tintoriales o morfolgicas y gracias a sto se pueden detectar transtornos
cuantitativos, mieloproliferativos y en ocasiones alteraciones cualitativas de los
leucocitos; la observacin de las plaquetas proporciona un valor semicuantitativo
de las mismas.
FUNDAMENTO
2.- OBJETIVOS
Identificar los diversos tipos celulares en el frotis de sangre perifrica en base
a sus caractersticas morfolgicas y tintoriales.
3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Portaobjetos
Cubreobjetos
Cmara detincin
Piseta
Vaso precipitado de 250 ml
29
DEL
FROTIS
DE
SANGRE
PERIFERICA
(METODO DEL
DE
FROTIS
DE
SANGRE
PERIFERICA
(METODO DEL
Tomar un cubreobjetos por las esquinas adyacentes con los dedos pulgar e
ndice, colocar una gota de sangre anticoagulada en el centro del
cubreobjetos, con la mano contraria tomar otro cubreobjetos de manera que
en conjunto formen un ctagono, con lo cual la sangre se extender rpida y
30
Se cubren los frotis con solucin de May-Grunwald sin diluir, dejar actuar
durante 3 a 5 minutos.
Se agrega la solucin amortiguadora de fosfatos pH 7.2, evitar sobrepasar el
efecto de la tensin superficial, se deja la mezcla de 5 a 10 minutos.
Lavar con solucin amortiguadora pH 7.2 hasta que el frotis adquiera una
tonalidad rosa plido.
31
El examen del frotis se efectua primero con el objetivo de (40X) con el fin de
observar la distribucin celular, as como las caractersticas de la tincin; se
selecciona un rea donde exista una monocapa de clulas (donde los eritrocitos
apenas se tocan).
Empleando ahora el objetivo de inmersin (100X) se realiza el examen del frotis.
La observacin incluye eritrocitos, los cuales son examinados en cuanto a tamao,
forma, color e inclusiones eritrocitarias.
Las plaquetas se aprecian en cuanto a cantidad y morfologa. Se observan los
leucocitos, determinando si el nmero esta normal, aumentado o disminuido,
posteriormente se efecta la cuenta diferencial evitando contar dos veces la
misma rea; para ello se sigue una rutina en greca de izquierda a derecha, bajar el
campo y si luego de derecha a izquierda, etc. se cuenta un mnimo de 100
leucocitos tambin deben ser reportadas.
4.- RESULTADOS
Informe de anormalidades cuantitativas y morfolgicas en las tres estirpes
celulares sanguneas, as como la cuenta diferencial leucocitaria en valores
porcentuales (relativos)
32
22 40 %
28
13
01
50 70
12
Valores absolutos
1100 4000/mm3
100 800
50 300
0 100
2500 7000
50 200
6.- BIBLIOGRAFIA
Cartwright, G.E. El laboratorio en el Diagnstico
Hematolgico. 4. Edicin Cientfico-Mdica (1973) Espaa.
Lynch-Raphael-Mellor. Mtodos de laboratorio. 2. Edicin.
Interamericana. (1972). Mxico
Todd Sanford Davisohn. Clinical Diagnosis and Manegament by Laboratory
Methods. 16- Ed.W.B. Saunder Co. (1979)
William J. William Hematology 3- Ed. McGraw-Hill Book Co.
(1983). USA.
33
MORFOLOGIA NORMAL
La informacin que se obtiene al examinar una extensin de sangre adquiere gran
importancia ya que mediante la morfologa del eritrocito se puede valorar :
a)
b)
c)
d)
La estimulacin de eritropoyetina
Hallazgos de anomalas de maduracin nuclear y citoplsmica.
Deteccin de transtornos en la mdula sea.
Transtornos hemolticos,
ERITROCITOS
El eritrocito presenta una forma bicncava con un rea central plida y mide
aproximadamente 7 en promedio. En cada laminilla pueden investigarse las
caractersticas generales de tamao, forma y color de los eritrocitos, as como de
los leucocitos. Las alteraciones en la maduracin nuclear se caracterizan por un
aumento en el tamao del eritrocito sin un cambio de la concentracin de
hemoglobina
A continuacin se definen las alteraciones ms comunes que es posible observar
en un frotis de sangre perifrica teido por las tcnicas habituales.
a)
b)
c)
d)
e)
f)
g)
i)
j)
LEUCOCITOS
35
Son los elementos formes ms pequeos, cuyo dimetro oscila entre 2-4 se
caracterizan por presentar una zona granular que se tie de manera semejante a
la de los ncleos de los leucocitos, rodeada por una zona hialina que le confiere
un aspecto difuso.
36
MORFOLOGIA ANORMAL
En esta prctica se presentar al alumno una serie de transparencias de las
anormalidades ms frecuentes que es posible observar en el laboratorio de
Hematologa.
A Continuacin se presenta la lista de las transparencias que integran el
programa.
MORFOLOGIA NORMAL Y ANORMAL
SERIE ROJA NORMAL
1.2.3.4.5.6.7.-
Pronormoblasto
Normoblasto basfilo
Normoblasto basfilo
Normoblasto policromatfilo
Normoblasto policromatfilo
Normoblasto ortocromtico
Retculocito
8.- Eritrocito normal
31.32.33.34.35.36.37.38.39.-
Mieloblasto
Mieloblasto y promielocito
Mielocito
Metamielocito
Banda
Neutrofilo bilobulado
Neutrlo multilobulado
Eosinfilo
Basfilo
9. Poiquilcitosis
10. Hipocromia
11. Hipocromia
12. Macrocitosis
13. Codocitos
14. Esferocitos
15. Ovalocitos
16. Drepanocitos
17. Esquizocitos
18. Esquizocitos
19. Acantocito
20. Punteado Basfilo
21. Cuerpo de Howell-Jolly
22. Anillos de Cabot
23. Anillos de Cabot
24. Cuerpos de Heinz
25. Alfa talasemia
26. Beta talasemia
27. Beta talasemia
28. Eritroblastosis fetal
29. Eritroleucemia
30. Sideroblastos en anillo
40.41.42.43.44.45.46.47.48.49.50.51.52.53.54.-
55.-
Anomalia de Pelger
Netrfilo multilobulado
Clula LE
Leucemia mieloblstica
Tincin de Sudn negro
Tincin de PAS
Linfocito
Linfocito
Clula plasmtica
Linfocito plasmocitoide
Linfocito atpico
Linfocito atpico
Tincin de PAS
Tincin de PAS
Monocito
Monocito vacuolado
SERIE MEGACARIOCITICA
56.57.-
58.-
Promegacariocito
Megacariocito
Megacariocito anormal
VARIOS
59 y 60.- Paludismo
HIERRO SERICO
37
1. INTRODUCCION
El hierro es un elemento que se combina con protoporfirina para formar el grupo
hem y con diversas protenas para originar enzimas importantes como catalasa,
citocromo y peroxidasa. La absorcin del hierro es mxima en el duodeno y
disminuye progresivamente en las partes distales del intestino; debido a que la
capacidad del cuerpo para excretar hierro es muy limitada, su absorcin en el
intestino debe ser controlada para que no se acumule en los tejidos y no alcance
niveles txicos.
La determinacin de hierro srico junto con la capacidad total de combinacin y
saturacin de la transferrina permiten evaluar los niveles de este elemento en el
organismo.
FUNDAMENTO
2. OBJETIVOS
Determinar la concentracin de Fe en suero aplicando el mtodo de Beale et
al modificado por Loria, A.
3. PROCEDIMIENTO (A)
3.1- MATERIAL
Tubos de ensayo de 13x100 mm
Pipetas serolgicas de 0.1 ml
Pipetas serolgicas de 1.0 ml
Pipetas serolgicas de 5.0 ml
Gradilla para tubos
Piseta
Celdas
Propipeta
El material de vidrio debe estar libre de Fe por lo que es necesario colocar toda la
noche en cido ntrido o clorhdrico diluido con un volumen igual de agua; al da
siguiente se enjuaga con agua libre de hierro y se deja secar.
38
3.3 EQUIPO
Espectrofotmetro
Agitador de tubos
3.4 REACTIVOS
Solucin de batofenantrolina al 0.64%
Solucin amortiguadora de glicina-HCl pH 1.9
Solucin de cido ascorbico al 0.5%
Solucin de trabajo: cido ascorbico al 0.5%
En amortiguador de glicina-HCl pH 1.9
Solucin de cloruro de sodio al 0.85%
Solucin estandar de hierro 150 ug/dl
Agua desionizada
39
3.6 TECNICA
Preparar 3 tubos de ensaye de 13x100 mm de acuerdo a la siguiente tabla (es
recomendable realizar el problema y el estndar por duplicado).
BLANCO
ESTANDAR
PROBLEMA
ml
Amortiguador
2.0
2.0
2.0
Suero o plasma
---
---
0.5
Solucin salina
0.5
---
---
---
0.5
---
0.05
0.05
0.05
4.- CALCULOS
Calcular la concentracin de hierro presente en el suero del paciente empleando la
siguiente frmula ;
Fe (g)/dl) =
A2 A1 del problema
A2 A1 del problema
40
3.- PROCEDIMIENTO
(B)
3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 13x100 mm
Pipetas serolgicas de 1.0 yh 5 ml
Gradilla para tubos
Piseta
Celdas
propipeta
El material de vidrio debe estar libre de Fe por lo que es necesario colocarlo toda
la noche en cido ntrico o clorhdrico diluido con un volumen igual de agua; al da
siguiente se enjuaga con auga libre de hierro y se deja secar.
3.3 EQUIPO
Espectrofotmetro
Agitador de tubos
Bao de incubacin
3.4 REACTIVOS
Buffer de fosfato de sodio 0.4 M pH 5.5
Reactivo de coloracin.- Acido
Batofenantrolindisulfnico, sal disfica 0.68 mM, fosfato de sodio 0.4 M
pH 5.5
Ascorbato de sodio
Solucin estandar de hierro 1 ug/ml = 17.91 mmol/L
Agua desionizada
HCl 1 N
Acido triclorocetico 20%
Acetato de sodio al 30%
41
3.6 TECNICA
SIN DESPROTEINIZAR
Ascorbato de sodio
BLANCO
Reactivos
ESTANDAR
5 mg
5 mg
BLANCO
Problema
PROBLEMA
5 mg
5 mg
1.0
---
ml
Buffer
Reactivo de color
---
---
1.0
1.0
--Disolver el ascorbato agitando lentamente.
1.0
Solucin estandar
---
1.0
---
---
Agua destilada
1.0
---
---
----
Suero
---
---
1.0
1.0
42
PROBLEMA
ESTANDAR
BLANCO
ml
Suero
2.0
---
---
Estandar
---
2.0
---
Agua destilada
---
---
2.0
HCl 1 N
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
Sobrenadante
exento
de
protenas o mezcla patrn o
mezcla blanco
2.0
2.0
2.0
Acetato de sodio
1.0
1.0
1.0
5 mg
5 mg
5 mg
1.0
1.0
1.0
Ascorbato de sodio
Reactivo de color
4.- CALCULOS
SIN DESPROTEINIZACION
CONCENTRACION DE HIERRO = (EPROBLEMA EBLANCO) x F g/dl
F= 100
EESTANDAR
43
59 158 g/dl
Mujeres
37 145 g/dl
6.- BIBLIOGRAFIA
Beale, R.N., Bostrom, J.O. Improved rapid methods for the determiantion of
iron content and binding capacity of serum.
Jclin. Pathol
Loria, A., Monge, B. Tcnicas de dosificaciones sricas de hierro y capacidad
de fijacin de hierro. Rev. Inv. Clin. 20:429 (1969).
44
1.- INTRODUCCION
En el plasma, el hierro se encuentra unido a la trasnferrina (b-globulina) y la
capacidad total de fijacin de hierro (C.T.F.H.) depende de la concentracin de
esta globulina. La transferrina que no se encuentra unida a hierro se conoce como
la capacidad libre de fijacin de hierro. La concentracin de hierro en el suero ms
la capacidad libre de fijacin de hierro es igual a la capacidad total de fijacin de
hierro.
CAPACIDAD TOTAL
DE FIJACION DE HIERRO
HIERRO EN EL
= SUERO
CAPACIDAD LIBRE DE
+ FIJACION DE HIERRO
FUNDAMENTO
2.- OBJETIVOS
Determinar la capacidad libre de fijacin de
hierro.
de la transferrina.
3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 13x100 mm
Pipetas serolgicas de 0.1 ml
Pipetas serolgicas de 1.0 ml
Pipetas serolgicas de 5.0 ml
Gradilla para tubos
45
Piseta
Celdas
Propipeta
Esptula
Papel sanitario
El material de vidrio debe estar libre de Fe por lo que es necesario colocarlo toda
la noche en cido ntrico o clorhdrico diluido con un volumen igual de agua; al da
siguiente se enjuaga con agua libre de hierro y se deja secar.
1. MATERIAL BIOLOGICO
Suero o plasma libre de hemlisis
2. EQUIPO
Espectrofotmetro
Agitador de tubos
Centrfuga
3. REACTIVOS
Solucin de batofenantrolina al 0.64%
Solucin amortiguadora de glicina-HCl pH 1.9
Solucin de sico ascorbico al 0.5%
Solucin de trabajo: cido ascorbino al 0.5%
En amortiguador de glicina-HCl pH 1.9
Solucin de cloruro de sodio al 0.85%
Solucin estandar de hierro 150 ug/dl
Solucin de hierro de 600 ug/dl
Carbonato de magnesio
Agua desionizada
4. MANEJO DE SUSTANCIAS
Para pipetear el material biolgico y los reactivos de esta tcnica es
necesario emplear propipeta.
46
5. TECNICA
Preparar tubos de ensaye de 13x100 mm de acuerdo a la siguiente tabla (es
recomendable realizar el problema por duplicado).
PROBLEMA
TUBO 1
TUBO 2
ml
Suero o plasma
Solucin hierro de
600 ug/dl
1.0
1.0
Dejar en reposo 20 minutos
Carbonato de magnesio
200.0 mg
1.0
1.0
200.0 mg
47
BLANCO
ESTANDAR
PROBLEMA
ml
Amortiguador
2.0
2.0
2.0
Suero o plasma
---
---
0.5
Solucin salina
0.5
---
---
---
0.5
---
0.05
0.05
0.05
4.- CALCULOS
Capacidad libre
de combinacin
% de saturacin
A2 - A1 del problema
A2 - A2 del estndar
Conc. De Fe en suro
X conc.
estndar
Del
X 100
Capacidad libre
Capacidad total
de fijacin
de hierro
= hierro en el suero +
48
Hombres
Mujeres
% de saturacin
20 - 50
3.- PROCEDIMIENTO
(B)
3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 13x100 mm
Pipetas serolgicas de 0.1 y 0.2 ml
Pipetas serolgicas de 1.0 ml
Grandilla para tubos
Piseta
Celdas
Propipeta
El material de vidrio debe estar libre de Fe por lo que es necesario colocarlo toda
la noche en cido ntrico o clorhdrico diluido con un volumen igual de agua; al da
siguiente se enjuaga con agua libre de hierro y se deja secar.
3.3 EQUIPO
Espectrofotmetro
Agitador de tubos
Bao de incubacin
3.4 REACTIVOS
Buffer Tris (hidroximetil) aminometano 1.0 M pH 8.3
Solucin reductora.- Sulfato de metilaminofenol 30
MM, hidrogenosulfito de sodio 162 mM.
Reactivo de coloracin.- Acido
Batofenantrolindisulfnico, sal disdica 1.7
Solucin estandar de hierro 2.5 mg/dl
Agua desionizada
49
BLANCO
Reactivos
ESTANDAR
BLANCO
Problema
PROBLEMA
ml
Suero
---
---
1.0
1.0
Buffer
0.5
0.5
0.5
0.5
Solucin estandar
--0.2
0.2
0.2
Mezclar, tapar los tubos y dejar en bao de agua durante 10 minutos a 450
C
Solucin reductora
0.2
0.2
0.2
0.2
Agua destilada
1.2
1.0
0.2
----
Reactivo de color
0.2
0.2
---
0.2
4.- CALCULOS
CAPACIDAD LIBRE DE
FIJACION DE HIERRO
F=
500
EESTANDAR
50
6.- BIBLIOGRAFIA
Beale, R.N., Bostrom, J.O. Improved rapid methods for the determination of
iron content and binding capacity of serum.
Jclin. Pathol. 15:156 (1962)
Loria, A., Monge, B. Tcnicas de dosificaciones sricas de hierro y capacidad
de fijacin de hierro. Rev. Inv. Clin. 20:429 (1969).
51
HEMOGLOBINA FETAL
(DESNATURALIZACION ALCALINA)
1.- INTRODUCCION
La hemoglobina normal en el adulto (Hb A) consta de dos molculas protecas,
cada una de las cuales contiene dos cadenas polipeptdicas, llamadas a y b.
La hemoglobina fetal (Hb F) es similar a la Hb A, posee dos cadenas a pero difiere
en la presencia de dos cadenas y en lugar de las cadenas b. Al nacer, la Hb F
constituye el 80% de la Hb total, sin embargo, esta desciende a menos del 2-38 a
los seis meses de edad y persiste hasta la vida adulta.
La informacin para producir Hb F esta latente pero se manifiesta en niveles
importantes en ciertas patologas como son: transtornos talasmicos, algunas
hemoglobinopatas, anemia aplasica y metstasis medular.
FUNDAMENTO
2.- OBJETIVOS
Cuantificar la Hb F en una muestra de sangre.
Demostrar que la Hb F es ms resistente que las dems hemoglobinas,
frente a la desnaturalizacin con hidrxido de sodio.
3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 13 X 100 mm
Tubos de ensayo de 13 x 150 mm
Pipetas de 0.2, 5.0 y 10 ml
Pipetas de sahli (0.02 ml)
Boquilla
Gradilla
Celdas de 1 cm de dimetro
52
3.3 EQUIPO
Centrfuga
Espectrofotmetro o fotmetro
Agitador de tubos (Vortex)
3.4 REACTIVOS
Citrato de sodio al 3.8%
Hidrxido de sodio 0.083 N
Solucin salina al 0.9%
Cloroformo R.A.
EDTA al 0.3%
Sulfato de amonio al 50%
3.5 TECNICA
SEPARACION DEL HEMOLIZADO
a.-
b.-
c.-
d.-
e.-
Hacer un control por dilucin del hemolizado con EDTA al 0.3% en una
relacin de 1:251.
f.-
Leer las absorbancias del contrl y del filtrado contra agua a 540 nm.
53
4.- CALCULOS
% de Hb fetal =
=
X 100
X 20
6.- BIBLIOGRAFIA
Williams, W.J. Hematologa. Ed. Salvat. 2. Edicin. 1983.
54
FRAGILIDAD OSMOTICA
1.- INTRODUCCION
La prueba de fragilidad osmtica es un mtodo simple para valorar la relacin que
existe entre el rea/volumen del glbulo rojo y detectar por lo tanto la presencia de
algn defecto en la membrana del eritrocito. En algunas anemias hemolticas se
presentan alteraciones en la fragilidad de los glbulos rojos como sera el caso de
la esferocitosis hereditaria y las talasemias.
FUNDAMENTO
2.- OBJETIVOS
Evaluar la resistencia de la membrana de los eritrocitos a los cambios a que
son sometidas in vitro.
Determinar la resistencia mnima y mxima de una muestra.
3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 13x100 mm
Pipetas serolgicas de 0.1 ml
Pipetas serolgicas de 1.0 ml
Pipetas serolgicas de 5.0 ml
Gradilla para tubos
Piseta
55
Celdas
Propipeta
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Sangre heparinizada o desfibrinada o bien sangre recientemente
extraida en EDTA al 10% y lavada varias veces con solucin salina
isotnica.
3.- EQUIPO
Espectrofotmetro
Agitador de tubos
Centrifuga
3.4 REACTIVOS
Heparina
Solucin de NaC1 al 10% en amortiguador de fosfatos de pH 7.4
Solucin de trabajo de NaC1 al 1% (diluir la solucin anterior 1:10).
56
3.6 TECNICA
Preparar 13 tubos de ensaye de 13x100 mm de acuerdo a la siguiente tabla:
TUBO
NaC1 1%
Ml
Agua dest.
Ml
Conc. De
NaC1 (X)
Absorbancia
Hemolisis
%
4.50
0.50
0.90
4.25
0.75
0.85
3.75
1.25
0.75
3.25
1.75
0.65
3.00
2.00
0.60
2.75
2.25
0.55
2.50
2.50
0.50
2.25
2.75
0.45
2.00
3.00
0.40
10
1.75
3.25
0.35
11
1.50
3.50
0.30
12
1.00
4.00
0.20
13
0.50
4.5
0.10
100
57
4.- CALCULOS
Obtener el % de hemlisis de cada uno de los tubos, relacionando la
absorbancia de cada tubo con la obtenida en el tubo # 13, sta equivale al
100% de hemlisis.
Graficar % de hemlisis contra la concentracin final de NaC1.
Obtener el valor de la concentracin de NaC1 a la cual obtiene el 50% de
hemlisis.
50% de hemlisis.
6.- BIBLIOGRAFIA
Decie, J.V. and Lewis, S.M. Practical Hematology. Fifth edition. Churchill
Livingstone, New York. 1975.
58
INDUCCION DE DREPANOCITOS
1.- INTRODUCCION
Existe una serie de alteraciones posibles en el proceso de sntesis de la mlecula
de hemoglobina, entre las ms estudiadas de estas hemoglobinopatas, se
encuentran la Hb S cuya presencia ocasiona la llamada drepanocitosis, la cual es
una alteracin en la secuencia de aminocidos de la cadena beta de las globinas
(sustitucin de cido glutmico por valina), esto se traduce en una variacin de las
propiedades fisicoqumicas de la molcula, entre otras la baja solubilidad en
condiciones de baja tensin de oxgeno, polimerizando la Hb y favoreciendo la
forma caracterstica de este tipo de anemia.
FUNDAMENTO
2.- OBJETIVO
Diagnosticar la presencia de anemia drepanoctica o sus variantes.
3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Portaobjetos y cubreobjetos
Tubos de 10x75 mm
Gradilla
59
3.3 EQUIPO
Microscopio
3.4 REACTIVOS
Metabisulfito de sodio al 2% en agua destilada (recin preparado)
3.5 TECNICA
En un portaobjetos colocar una gota del metabisulfito de sodio al 2% y una gota de
sangre venosa o capilar, mezclar con un aplicador. En seguida colocar un
cubreobjetos sobre la mezcla, paralelamente se monta un control, sustituyendo el
agente reductor por solucin salina fisiolgica.
Se mantiene en cmara hmeda durante 15 a 30 minutos y se observa al
microscopio con objetivo de 40X
6.- BIBLIOGRAFIA
Cartwright, G.E. El laboratorio en el Diagnstico Hematolgico. Ed. CientficoMdica 1973.
William J. William Hematology 3 Ed. Mc Graw-Hill Book Company 1983.
60
1.- INTRODUCCION
Entre las causas principales de anemia, se encuentran las hemolticas, cuya
naturaleza puede ser intracorpuscular (hereditarias) o extracorpuscular
(adquiridas); en las primeras la destruccin se realiza en el vaso (extravascular) y
en las segundas generalmente se hemolizan intravascularmente, en este ltimo
tipo de anemias los niveles de hemoglobina en plasma se incrementan
notablemente, as que este parmetro es indicativo del tipo de hemlisis que sufre
el paciente.
FUNDAMENTO
2.- OBJETIVO
Determinar los niveles de hemoglobina libre en plasma de una muestra
problema.
3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de ensaye de 13 X 100 mm
Tubos de ensaye de 16 X 150 mm
Pipetas serolgicas de 0.1, 1.0, 5.0 y 10.0 ml
Propipeta
Piseta
Gradilla
Celdas
3.3 EQUIPO
61
Centrifuga
Espectrofotmetro
3.4 REACTIVOS
EDTA al 10%
Heparina
Bencidina al 1%
Agua oxigenada al 1%
Estndar de hemoglobina 200 mg/L
3.5 TECNICA
Obtener la muestra de sangre de preferencia con heparina como anticoagulante
(0.1 ml, 100 unidades) o en su defecto con EDTA al 10% mezclar y centrifugar,
separar el plasma cuidadosamente y centrifugar nuevamente, transferir el plasma
a otro tubo.
Marcar 3 tubos de 16 X 150 mm :
PROBLEMA
ESTANDAR
BLANCO
Bencidina 1%
1.00 ml
1.0 ml
2.0 ml
Plasma
0.02 ml
---
---
Estndar de Hb
---
0.02%
---
Agua destilada
1.0 ml
1.0 ml
1.0 ml
H2O2
1.0 ml
1.0 ml
1.0 ml
MANTENER LOS TUBOS A TEMPERATURA AMBIENTE DURANTE 20
MINUTOS
Acido actico 10%
10.0 ml
10.0 ml
10.0 ml
62
6.- BIBLIOGRAFIA
63
64
FRAGILIDAD CAPILAR
(PRUEBA DEL TORNIQUETE)
1.- INTRODUCCION
La hemostasis es el conjunto de fenmenos que tienden a controlar el sangrado
cuando hay lesin en un vaso sanguneo. Dentro de los mecanismos que
participan en este proceso estn: Los Vasculares y los Celulares, representados
por el endotelio vascular y las plaquetas respectivamente.
Una de las pruebas que mide ambos mecanismos es la prueba del torniquete o
fragilidad capilar, puesto que las plaquetas y el cemento intercelular de los vasos
(vitamina C) son los factores de mayor importancia para conservar la integridad de
los vasos.
FUNDAMENTO
2.- OBJETIVO
Conocer y aplicar una prueba til en la deteccin de transtornos
vasculares y celulares de la coagulacin.
3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Esfingonanmetro
Estetoscopio
65
3.3 REACTIVOS
No requiere reactivos
3.3 TECNICA
1.-
2.-
3.-
4.-
6.- BIBLIOGRAFIA
Cartwright, G.E. El Laboratorio en el Diagnstico Hematolgico. Ed.
Cientfico-Mdica 1973
Lynch-Raphael. Mtodos de Laboratorio en el Diagnstico 2. Ed.
Interamericana 1972.
Todd-Sanford. Diagnstico Clnico por el Laboratorio 6. Ed. Salvat 1979.
William J. Williams Hematology 3. Ed. Mc. Graw-Hill Bool Company
1983.
66
TIEMPO DE SANGRADO
1.- INTRODUCCION
Un tiempo de sangrado normal indica una retraccin normal de los capilares y la
existencia de un nmero suficiente de plaquetas con actividad normal. Se alarga
en la insuficiencia del factor VII, prpura trombocitopnica, tromboastenia de
Glanzmann, en la enfermedad de Von Willebrand, etc.
Esta prueba da informacin de la funcin hemosttica global de las plaquetas in
vivo, por la determinacin del tiempo del sangrado de una incisin estndar en la
piel mietras se mantiene aumentada la presin venosa, con ayuda de un
esfingomanmetro.
Adems de ser una prueba global de los mecanismos de coagulacin, es
importante en la evaluacin de trombocitopenia debido a su capacidad para
discriminar entre las plaquetas con funcin normal y las que tienen funcin
disminuida o aumentada.
FUNDAMENTO
2.- OBJETIVOS
Realizar dos determinaciones de tiempo de sangrado.
Evaluar la importancia de esta determinacin, as como sus ventajas y
limitaciones.
3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Lencetas steriles
Torundas de algodn con alcohol
Papel filtro
3.2 EQUIPO
Esfingomanmetro
67
3.3 TECNICA
METODO DE DUKE
a) Dar masaje suave al lbulo de la oreja y limpiarlo con una torunda de algn
impregnada con alcohol (tambin puede hacerse en el pulpejo del dedo
anular).
b) Con una lanceta estril hacer una puncin de 2 x 4 mm de profundidad (con un
movimiento rpido) en el borde inferior del lbulo de la oreja o en el pulpejo del
dedo. En el momento en que aparece la gota de sangre se marca el tiempo en
el cronmetro.
c) Cada 15 segundos se aplica cuidadosamente sobre la gota de sangre el borde
de un papel filtro, sin tocar la herida.
d) Para el cronmetro en el momento en que el papel filtro ya no se manche de
sangre.
Nota: No abarcar venas visibles ni lesiones cutneas. Hay que recordar que
ciertos factores locales (presencia de hematomas) pueden variar el tiempo de
sangrado.
NOTIFICACION DE MARX
Despus del paso (b) del mtodo anterior, se introduce el lbulo de la oreja, en un
vaso de precipitado de 50 ml con agua a 37 C; el cronmetro se pone en marcha
cuando se observa la aparicin de un hilo continuo de sangre. En el instante en
que este se interrumpe se para el cronmetro.
METODO DE IVY
68
1 3 minutos
3 5 minutos
3 7 minutos
5.- BIBLIOGRAFIA
Cartwright, G.E. El laboratorio en el Diagnstico
Hematolgico. 4. Edicin Cientfico-Mdica (1973) Espaa.
William J. William. Hematology 3- Ed. MgGraw-Hill Book Co. (1983) USA.
69
1.- INTRODUCCION
Cuando los mecanismos celulares de la coagulacin se activan como ocurre en
una lesin vascular, las plaquetas tienden a obturar el sitio lesionado formando as
un trombo dentro del cual quedan atrapados adems de plaquetas los otros
elementos formes de la sangre. Las plaquetas entonces liberan una protena
fibrilar contractil, llamada trombosteninan que es la causante de la retraccin del
cogulo. Existen transtornos plaquetarios sobre todo cualitativos donde esta
funcin esta alterada.
FUNDAMENTO
2.- OBJETIVO
Evaluar mediante esta prueba la cantidad y calidad de las plaquetas en una
muestra problema.
3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de centrfuga graduados
Tapn de hule con tirabuzn
3.3 EQUIPO
Bao de incubacin a 37 C
70
3.4 TECNICA
Se toma 5 ml de sangre por puncin venosa y se colocan en el tubo de centrifuga
graduado, se tapa con el tapn de hule con tirabuzn, se deja coagular y se
mantiene a 37 C durante una hora.
Despus de esta incubacin se saca y se observa el cogulo (compacto o
gelatinoso); el tubo con el suero y los glbulos rojos restantes se centrifugan a
3000 rpm durante 5 minutos despus de lo cual se lee el volumen total de suero
que corresponde al suero expulsado del cogulo.
4.- RESULTADOS
El volumen total de sangre es el 100%
El volumen de suero representa el x %
A este resultado se le resta el valor del hematocrito y esto es el porcentaje de
retraccin.
5.-VALORES DE REFERENCIA
25% de retraccin
6.- BIBLIOGRAFIA
William J. William. Hematology 3- Ed. MgGraw-Hill Book Co. (1983)- USA.
71
TIEMPO DE COAGULACION
1.- INTRODUCCION
El diagnstico y estudio de un efecto de coagulacin cualquiera, representa
interacciones complejas entre sistemas enzimticos y varias protenas enzimticas
lbiles.
Se encuentran tiempos prolongados en la hemfilia clsica y en la deficiencia del
factor IX, la prueba carece de valore para insuficiencias ligeras de distintos
factores, porque basta una pequea cantidad de trombina para producir un
cogulo de fibrina.
Es menos til para anomalas de las ltimas etapas de la coagulacin.
FUNDAMENTO
Nos da un ndice de la eficacia global del sistema intrnseco, as como del sistema
celular.
2.- OBJETIVO
Medir el tiempo de coagulacin de la sangre in vitro
3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 13x100 mm
Gradilla para tubos
Tubos capilares
Lancetas estriles
3.2 MATERIAL
Bao de incubacin a 37 C
Cronmetro
3.3 MATERIAL BIOLOGICO
Sangre total sin anticoagulante.
3.4 METODO
72
1) Mtodo de Lee-White
a) Colocar sangre obtenida por puncin venosa en dos tubos de ensayo
(2 ml aproximadamente), poner en marcha el cronmetro.
b) Poner los tubos en bao de incubacin a 37C.
c) Al cabo de 3 minutos se inclina un tubo cada 15 segundos con
agitacin suave y otro cada 30 segundos con el fin de determinar el
tiempo de coagulacin.
d) Se nota como tiempo de coagulacin al intervalo de tiempo
transcurrido desde que la sangre entra en contacto con el cristal hasta
que al invertir completamente el segundo tubo la sangre ya no fluye.
Sacando el promedio de los dos tubos se obtiene el tiempo de
coagulacin.
2) Mtodo capilar
a) Aseptizar la yema del dedo y puncionar firmemente con una lanceta
estril.
b) Se desecha la primera gota y se llena un capilar, cuidando de que no
queden burbujas de aire, poner el cronmetro en marcha.
c) A partir del tercer minuto se procede a romper pedazo a pedazo el
capilar hasta observar la formacin del hilo de fibrina, en el momento
en que se presenta la coagulacin; parar el cronmetro.
5 VALORES DE REFERENCIA
Mtodo de lee-White
Mtodo capilar
5 10 minutos
3 5 minutos
Comentarios
1) El tiempo de coagulacin es relativo. Sobre el tiempo normal de coagulacin
influyen: La temperatura, el tamao y la superficie del tubo, el pH de sangre,
frecuencia e inclinacin y otros factores ms.
2) La puncin no debe ser traumtica, no debe ejercerse presin sobre el rea de
puncin.
73
6.- BIBLIOGRAFIA
Cartwright, G.E. El laboratorio en el Diagnstico
Hematolgico. 4. Edicin Cientfico-Mdica (1973) Espaa
William J. William. Hematology 3- Ed. MgGraw-Hill Book Co. (1983) USA.
74
TIEMPO DE PROTROMBINA
1.- INTRODUCCION
La protrombina tiene un peso molecular aproximado de 75,000. La protrombina es
una a-1 globulina que se sintetiza en el
hgado y requiere para su sntesis la vitamina k.
Esta prueba mide la actividad coagulante del sistema extrnseco incluyendo
fibringeno, protrombina y factores V, VII y X. Adems permite registrar los efectos
de anticoagulantes y tambin se emplea en el diagnstico de transtornos de la
coagulacin congnitos y adquiridos.
FUNDAMENTO
2.- OBJETIVOS
Realizar una curva de actividad de protrombina vs tiempo.
Evaluar el tiempo de protrombina en plasmas normales y patolgicas.
75
3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo por 13x100 mm
Tubos de ensayo de 10x75 mm
Pipetas serolgicas de 0.1 ml
Pipetas serolgicas de 1.0 ml
Pipetas serolgicas de 5.0 ml
Pipetas Pasteur con bulbo
Gradilla para tubos
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Plasmas citratado pobre en plaquetas. (sangre venosa adicionada de
citrato de sodio al 3.8% en una proporcin de 9 partes de sangre y una
de anticoagulante, la cual es centrifugada a 3000 rpm durante 10
minutos).
3.3 EQUIPO
Centrifuga
Bao de incubacin a 37C
Cronmetro
3.4 REACTIVOS
Citrato de sodio al 3.8 %
Tromboplastina lquida activada
Cloruro de calcio 0.02 M
76
PLASMA
NORMAL
ml
SOLUCION
NaC1 0.85%
ml
ACTIVIDAD
%
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
Con cada una de las diluciones continuar a partir del punto 4 de la tcnica.
Graficar los valore sobtenidos del tiempo en segundos contra actividad en %.
Utilizar para ello papel milimtrico o semilogartmico.
77
4.- RESULTADOS
Los resultados se expresan en tiempo en segundos o bien en % de actividad.
Un tiempo prolongado (% de actividad bajo, es decir menor al 60%) indicar la
deficiencia de uno o ms de los siguientes factores
Factor I (Fibringeno)
Factor II (Protrombina)
Factor V (Proacelerina, Factor lbil)
Factor VII (proconvertina, factor estable)
Factor X (Factor de Stuart-Prower)
6.- BIBLIOGRAFIA
Dacie,J.V. and Lewis, S.M. Practical Hematology. Fifth
Edition. Churchill Livingstone, New York. 1975
78
1.- INTRODUCCION
Es un estudio sobre el efecto del factor antihemoflico en las pruebas de
coagulacin de una fase, Longdell, Wagner y Brinkhous (1953) demostracin que
haba dos tipos de actividad troboplastnica y confirmaron la observacin de Mills
(1926) de que los preparados de cefalina cruda no coagulan el plasma hemoflico
tan pronto como al plasma normal.
Cuando las tromboplastinas hsticas activas fueron diludas o fraccionadas, tenan
estos preparados una actividad semejante a la de la cefalina cruda. Basndose en
estos hallazgos, lso preparados de tromboplastina pueden describirse como
completos o parciales. Las tromboplastinas completas son capaces de producir
una coagulacin tan rpida en el plasma hemfilico como en el normal, mientras
que ocn la parcial el plasma hemoflico coagula menos rapidamente que el plasma
normal.
FUNDAMENTO
3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
tubos de ensayo de 13x100 mm
tubos de ensayo de 10x75 mm
pipetas serolgicas de 0.1 ml
79
ml de
plasma, mezclar
80
4.- RESULTADOS
La prolongacin anormal indica deficiencias intrnsecas de un factor o presencia
de un inhibidor. Solo el factor VII no est incluido en el tiempo de tromboplastina
parcial. Detecta deficiencias importantes de los factores VIII, IX, XI, XII o presencia
de inhibidores (anticoagulantes circulantes) como la heparina, anticuerpos
dirigidos contra el factor VIII o IX.
6.- BIBLIOGRAFIA
Dacie,J.V. and Lewis, S.M. Practical Hematology. Fifth Edition. Churchill
Livingstone, New York. 1975
81
TIEMPO DE TROMBINA
1.- INTRODUCCION
La trombina es la enzima activa que transforma el fibringeno en fibrina. El calcio
acelera esta reaccin, pero no es aadido a la prueba. La velocidad de
coagulacin con la trombina es una funcin de la concentracin de fibringeno. La
trombina es una globulina que tiene un PM de 37,700 daltons.
Consta de 2 cadenas de longitud desigual unidas por un puente disulfuro. La
cadena A de la trombina contiene 49 residuos de aminocidos y no contiene
carbohidratos; la cadena B tiene 225 residuos y deriva de la terminal C de la
protrombina y contiene el centro activo de la enzima (residuo de la serina).
FUNDAMENTO
2.- OBJETIVO
Emplear una prueba rpida para determinar la concentracin de fibringeno.
Detectar la presencia de productos de la degradacin del fibringeno o de la
fibrina.
3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 10 x 75 mm
Pipetas de 1.0 ml graduadas 1/100
Crnometro
Gradilla
Bao de incubacin a 37C
82
3.5
TECNICA
4.- RESULTADOS
Anotar el tiempo de la formacin del cogulo.
83
6.- BIBLIOGRAFIA
Dacie,J.V. and Lewis, S.M. Practical Hematology. Fifth Edition. Churchill
Livingstone, New York. 1975
84
FIBRINOGENO
1.- INTRODUCCION
Los procedimientos para determinar fibringeno pueden ser: Cuantitativos
(Colorimtricos y fsicos) y semicuantitativos (observacin del cogulo): Dentro de
los ms usados se cuentan los mtodos nefelomtricos, enzimticos y
gravimtricos.
FUNDAMENTO
2.- OBJETIVO
Ejecutar e interpretar correctamente esta prueba.
3.4 REACTIVOS
85
3.6
-
TECNICA
PREPARACION DE LA CURVA DE CALIBRACION
86
Si el tiempo obtenido es muy corto (ms de 800 mg/dl) se diluye el plasma 1:20 y
el resultado obtenido se multiplica por 2.
Si el tiempo es muy prolongado (menos de 50 mg/dl) se efecta una dilucin 1:5 y
el resultado se divide entre 2.
Si con una dilucin 1:2 el plasma no coagula, la concentracin de fibringeno es
menor de 15 mg/dl.
87
3.3 EQUIPO
Espectrofotmetro
Bao de incubacin
Centrfuga
3.4 REACTIVOS
Citrato de sodio 3.8%
Solucin de cloruro de sodio 0.85%
Hidrxido de sodio al 10%
Carbonato de sodio al 20%
Reactivo de Folin-Ciocalteau
Tromboplastina lquida activada
Cloruro de calcio 0.02 M
Solucin estndar de tirosina 20 mg/dl = 234 mg/dl de fibringeno
88
3.5 TECNICA
Colocar en un tubo de centrfuga de 15 ml:
ml
Vidrio molido
1.5
10.0
Tromboplastina
0.2
1.5
89
Problema
Blanco
ml
1.0
1.0
3.0
3.0
Agua destilada
7.0
7.0
Folin-Ciocalteau
1.0
1.0
1.0
1.0
Agua destilada
2.0
2.0
90
CURVA DE CALIBRACION
Concentracin
mg/dl
blanco
702
468
234
93.6
ml
Estndar de tirosina
1.5
1.0
0.5
0.2
--
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
Agua destilada
5.5
6.0
6.5
6.8
7.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
Folin-Clocalteau
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
6.- BIBLIOGRAFIA
Cartwright, G.E. El laboratorio en el Diagnstico
Hematolgico. 4. Edicin Cientfica-Mdica (1973)
Teliz Sandoval E. Estudio comparativo de 5 mtodos para determinar el
fibringeno en plasma Tesis de Licenciatura UNAM, 1982.
William J. Williams, Hematology, 3. Ed. Mc. Graw-Hill Book Company 1983.
91
1. INTRODUCCION
En la fraccin euglobulinica del plasma, se encuentra el fibringeno, el
plasmingeno y las fibrinlisinas. Esta tcnica suprime los inhibidores del
plasmingeno. Las fibrinlisinas del glbulo rojo destruidas aceleran la lisis, pero
se encuentran en cantidades muy constantes, en cambio existe variacin en la
fibrinlisis plasmtica.
Si el paciente cursa con un cuadro de fibrinlisis aumentada, las actividades
presentes en dicha reaccin transformarn al plasmingeno en plasmina y esta
ltima actuar sobre la fibrina formada de manera acelerada.
FUNDAMENTO
2.- OBJETIVO
Valorar el componente fibrinoltico.
3- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de cultivo de 13 x 100 mm
Pipetas serolgicas de 0.2, 1.0 y 5.0 ml
Aplicadores de madera
Gradilla
Matraz erlenmeyer de 50 ml
Papel sanitario
Papel parafilm
92
Centrfuga
Bao de incubacin a 37 C
3.4 REACTIVOS
Acido clorhdrico 0.1 N
Amortiguador de imidazol pH 7.3
Trombina diluida (solucin de trabajo 1:10)
Acido actico 1%
Cloruro de calcio 0.025 M
3.5 TECNICA A
a. En un tubo de ensaye de 13 X 100 mm colocar:
4.2 ml de agua destilada
0.15 ml de cido clorhdrico
0.3 ml de plasma problema
b. Tapar el tubo con papel parfilm y agitarlo por inversin suavemente.
c. Centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos
d. Desechar el sobrenadante.
e. Agregar 0.3 ml de amortiguador de imidazol
f. El precipitado se resuspende con aplicador previamente mojado en
amortiguador de imidazol.
g. Agregar 0.1 ml de trombina diluida
h. Agitar el tubo suavemente, taparlo con papel parafilm y colocarlo en bao de
incubacin a 37 oC
i.
93
TECNICA B
j.
5.- BIBLIOGRAFIA
Astrup, T. The biological significance of fibrinolysis Lancet 11:565. 1956.
Dacie,J.V. and Lewis, S.M. Practical Hematology. Fifth Edition. Churchill
Livingstone, New York. 1975
94
SULFATO DE PROTAMINA
1.- INTRODUCCION
El sulfato de protamina tiene la propiedad de inducir la polimerizacin no
enzimtica de complejos solubles de monmeros de fibrina, que se forman en el
plasma cuando se encuentran trazas de trombina circulante. Tal fenmeno se
denomina paracoagulacin y consiste en la formacin de filamentos de fibrina o de
un verdadero cogulo despus de aadir sulfato de protamina.
FUNDAMENTO
2.- OBJETIVO
Detectar los monmeros solubles de fibrina y/o los productos de degradacin
de fibringeno y fibrina.
3- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de cultivo de 10 x 75 mm
Pipetas serolgicas de 0.2, 1.0 y 5.0 ml
Tubos de centrfuga de 5 ml
Papel sanitario
Papel parafilm
3.3 EQUIPO
Cronmetro
Bao de incubacin a 37 oC
95
3.4 REACTIVOS
Solucin de sulfato de protamina 1% en amortiguador TRIS pH 6.5
0.05 M.
Amortiguador TRIS pH 6.5 0.05 M
3.5 TECNICAS
a) Efectuar una dilucin 1:5 de la solucin de sulfato de protamina con el
amortiguador TRIS.
b) Colocar 0.2 ml de esta dlucin en un tubo de 10 x 75 mm.
c) El plasma pobre en plaquetas (ppp) del problema se obtiene al centrifugar el
plasma rico en plaquetas durante 10 minutos a 3500 rpm. El ppp se coloca en
un tubo limpio y se incuba a 37 oC durante 5 minutos.
d) Adicionar 0.2 ml del ppp al tubo que contiene 0.2 ml del sulfato de protamina
(dilucin 1:5).
e) Tapar el tubo y colocarlo a 37 oC durante 30 minutos. Agitar suavemente y
observar la apariencia de la mezcla de reaccin. Reportar considerando los
criterios indicados en la parte de resultados.
4.- RESULTADOS
g
rf
+
=
=
=
=
=
gelacin
red de fibrina
precipitado grueso
precipitado fino
solucin clara
96
3- BIBLIOGRAFIA
Seaman, A.J. The plasma protamine paracoagulation test.
1985. Arch Intern Medical.
Barrantes, A. Hemostasia y trombosis. 1980. Laboratorio de investigacin
clnica.
97
GELACION DE ETANOL
1.- INTRODUCCION
En algunas patologas de los sistemas de la coagulacin como en Coagulacin
Intravascular Diseminada (CID) o en procesos fibrinolticos, se producen productos
de degradacin de la fibrina o del fibringeno, as como monmeros de fibrina; los
cuales son capaces de paracoagular en presencia de etanol.
FUNDAMENTO
2.- OBJETIVO
Observar las reacciones de paracoagulacin en una muestra problema.
3- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de cultivo de 10 x 75 mm
Pipetas serolgicas de 1.0 ml
Gradilla
Papel sanitario
Papel parafilm
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Plasma citratado pobre en plaquetas
3.3 EQUIPO
Bao de incubacin a 22 C
3.4 REACTIVOS
Citrato de sodio al 3.8%
Etanol al 50% en agua destilada
98
3.5 TECNICA
En un tubo de 10 x 75 mm colocar 0.5 ml de plasma pobre en plaquetas. Colocarlo
en el bao de incubacin durante 3 minutos; adicionar 0.15 ml de etanol al 50%,
agitar suavemente el tubo y mantener en reposo durante 10 minutos a 2 oC (TA),
despus de este tiempo observar con inclinacin cuidadosa del tubo, la
gelificacin de la muestra.
4.- RESULTADOS
Gelacin
No gelacin
= positiva
= negativo
6.- BIBLIOGRAFIA
Martnez C. Adela, et al. Tcnicas de Hemostasia y trombosis Grupo
CLATES. Buenos Aires, Argentina. 1975.
99
HEMOLISINAS Y AGLUTININAS
1.- INTRODUCCION
Los anticuerpos completos son capaces de producir aglutinacin o hemlisis en
presencia de solucin salina. Las hemolisinas son anticuerpos que producen la
hemolisis de los hemates en presencia de completo.
Las aglutininas son anticuerpos que producen aglutinacin de los hemates. El
antigno del hemate se denomina aglutingeno para que tenga lugar la
aglutinacin, no es necesario que haya complemento.
En el campo de la Inmunohematologa se ha comprobado que existen distintos
tipos de anticuerpos en base a su tamao, peso molecular, temperatura ptima de
reaccin medio de reaccin, etc. en cuanto a estas propiedades han sido
clasificados en dos grupos: anticuerpos fros y anticuerpos calientes.
Los anticuerpos fros reaccionan mejor en rango de temperatura de 20 a 30 oC.
Puede interferir en la clasificacin sangunea del individuo y en las pruebas de
compatibilidad realizadas a temperatura ambiente. Estos anticuerpos se
denominan IgM con un peso molecular de 900,000 y reacciona en medio salino.
FUNDAMENTO
2.- OBJETIVO
100
3- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de cultivo de 13 x 100 mm
Tubos de cultivo de 10 x 75 mm
Pipetas Pasteur con bulbo
Gradilla
Papel sanitario
Papel parafilm
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Suero problema (A, B O)
Suspensin de glbulos rojos (A, B AB) al 4% en solucin salina
3.3 EQUIPO
Centrfuga
3.4 REACTIVOS
Solucin de cloruro de sodio al 0.9%
101
3.5 TECNICA
Preparar una serie de tubos con las siguientes diluciones del suero problema
empleado solucin salina para ello:
1:1, 1:2, 1:4, ..........., 1:1024
4 gotas del suero
problema +
4 gotas de sol.
Salina
4 gotas de
sol. salina
4 gotas de
dil. 1:2
4 gotas
del suero
problema
sin diluir
1:1
....... Dil.
1:1024
1:2
1:4
4.- RESULTADOS
Dilucin :
Dilucin :
Hemolisinas
Aglutininas
6.- BIBLIOGRAFIA
Dacie,J.V. and Lewis, S.M. Practical Hematology. Fifth Edition. Churchill
Livingstone, New York. 1975
102
ANTICUERPOS IRREGULARES
1.- INTRODUCCION
Dentro de los sistemas antgeno-anticuerpo a nivel eritrocitario se presentan
anticuerpos, tanto regulares como irregulares; dentro de stos se encuentran
generalmente inmunoglobulinas anti A y anti B, a los que se les ha denominado
hemolisinas, aglutininas, anticuerpos fros, anticuerpos completos, anticuerpos
salinos o anticuerpos regulares; generalmente de naturaleza IgM.
Tambin es posible detectar anticuerpos de otros sistemas diferentes al ABO y a
stos se les denomina anticuerpos calientes, anticuerpos albumina o anticuerpos
irregulares, de naturaleza IgG.
La reaccin antgeno-anticuerpo es especfica; tenemos que poner en contacto el
anticuerpo con el antgeno especfico, para lo cual necesitamos como reactivo a
eritrocitos con sus antgenos identificados plenamente. Estos eritrocitos pueden
conseguirse comercialmente, pero tambin son preparados por el Banco Central
de Sangre del IMSS. Se les conoce Panel de clulas de fenotipo conocido.
FUNDAMENTO
2.- OBJETIVO
Determinar la presencia de anticuerpos irregulares y si stos estn presentes
identificar su especificidad.
3- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de ensaye de 13 X 100 mm
Tubos de hemlisis 10 X 75 mm
Pipetas Pasteur con bulbo
Gradilla
Piseta
103
Papel sanitario
Papel parafilm
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Suero problema
Eritrocitos problema al 2-3% en solucin salina
Panel de clulas de fenotipo conocido, lavadas y suspendidas al 2-3%
en solucin salina.
3.3 EQUIPO
Centrfuga
Reloj de intervalos
Bao de incubacin a 37 C
3.4 REACTIVOS
Solucin salina al 0.9%
Albumina bovina al 22% o 30%
Suero antiglobulina humana (suero de Coombs)
3.5 TECNICA
a. Rotular 10 tubos de 10 X 75 mm del a al 10 y otro ms como autotestigo.
b. Poner en cada tubo 2 gotas del suero del paciente.
c. Poner una gota de los eritrocitos del panel en su tubo correspondiente.
d. Colocar una gota de los eritrocitos del paciente (2%) al tubo marcado como
autotestigo.
e. Mezclar y centrifugar a 3400 rpm por 30 segundos.
f. Leer aglutinacin tubo por tubo. Reportar el resultado.
Aglutacin
No aglutinacin
104
j.
Lavar el botn de glbulos rojos 3 veces con solucin salina despus del ltimo
lavado eliminar el sobrenadante y resuspender el botn.
4.- RESULTADOS
Si no hubo hemlisis ni aglutinacin en ninguno de los tubos el resultado es
negativo, es decir no hay anticuerpos irregulares fuera del sistema ABO.
Si hubo resultados positivos, stos se comparan con la carta que acompaa a las
clulas del panel que se llama carta del panel para identificar la especificidad y se
reporta as:
Anticuerpos irregulares antieritrocito fuera del sistema ABO positivos de probable
especificidad ___________________ (la encontrada por ejemplo Anti S, anti P).
105
Hay que recordar que las 10 clulas del panel es un muestreo de los fenotipos de
la poblacin. Estn seleccionados los antgenos contra los cuales se producen
anticuerpos ms frecuentemente. La importancia de elegir el panel elaborado por
el Banco Central de Sangre, es que est elaborado, tomando en cuenta la
estructura antgenica de nuestra poblacin mexicana.
Una vez establecida la especificidad, efectuar titulacin de anticuerpos irregulares
mediante la prueba de alb-Coombs para ellos se efectan diluciones al doble del
suero en solucin salina y se adicionan los eritrocitos correspondientes, se
procesa igual que en la tcnica anterior, el ltimo tubo donde se observa
aglutinacin es el ttulo de anticuerpos irregulares.
6.- BIBLIOGRAFIA
Quintanar, E. Manual de tcnicas y procedimientos del Banco Central de
Sangre. Instituto Mexicano del Seguro Social.
106
REACTIVOS
1. SOLUCION DE EDTA AL 10%
10.0 g
100.0 ml
1.0 g
0.20 g
0.05 g
0.10 g
1000.00 ml
Cloruro de mercurio
Cloruro de sodio
Sulfato de sodio anhidro
Agua destilada c.b.p.
Disolver en el orden indicado. Estable por 2-3 semanas.
4. SOLUCION DE NUEVO AZUL DE METILENO
Nuevo azul de metileno
Oxalato de potasio
Cloruro de sodio
Saponina
Agua destilada c.b.p.
0.50 g
1.40 g
0.80 g
100.00 ml
1.00 g
100.00 ml
6. SOLUCION DE TURK
Acido actico glacial
Violeta de gensiana al 1%
Agua destilada c.b.p.
3.00 ml
1.00 ml
100.00 ml
107
70.00 ml
100.00 mL
3.80 g
0.20 ml
0.10 g
100.00 ml
1.00 g
100.00 ml
2.00 g
100.00 ml
0.85 g
100.00 ml
180.00 g
27.31 g
4.86 g
2000.00 ml
108
3.80 g
100.00 ml
Citrato de sodio
Agua destilada c.b.p.
14.SOLUCION DE CLORURO DE SODIO AL 0.9%
Cloruro de sodio
Agua destilada c.b.p.
0.90 g
100.00 ml
3.32 g
1000.00 ml
350.00 g
500.00 ml
0.30 g
100.00 ml
18.REACTIVO DE BENDICINA
Bendicina
Acido actico glacial
Agua destilada c.b.p.
1.00 g
90.00 ml
100.00 ml
3.30 g
100.00 ml
10.00 g
100.00 ml
0.64 g
100.00 ml
Batofenantrolina sulfonatada
Agua destilada c.b.p.
22.SOLUCION DE ACIDO ASCORBICO AL 0.5%
Acido ascrbico
Agua destilada (libre de Fe)
50.00 g
10.00 ml
0.75 g
30.00 ml
50.00 ml
150.00 mg
100.00 ml
1.38 g
1000.00 ml
2.22 g
1000.00 ml
110
11.75 g
14.67 g
500.00 ml
ml
2000.00 ml
50.00 ml
100.00 ml
1.14 g
0.49 g
900.00 ml
1000.00 ml
111
%T
%T
%T
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
10.0
10.5
11.0
11.5
12.0
12.5
13.0
13.5
14.0
14.5
15.0
15.5
16.0
16.5
17.0
17.5
18.0
18.5
19.0
19.5
20.0
20.5
21.0
21.5
22.0
22.5
23.0
23.5
24.0
24.5
25.0
25.5
2.000
1.824
1.699
1.602
1.523
1.456
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1.347
1.301
1.260
1.222
1.187
1.155
1.126
1.097
1.071
1.046
1.022
1.000
.979
.959
.939
.921
.903
.886
.870
.854
.838
.824
.810
.796
.782
.770
.757
.745
.733
.721
.710
.699
.688
.678
.668
.658
.648
.638
.629
.620
.611
.602
.594
26.0
26.5
27.0
27.5
28.0
28.5
29.0
29.5
30.0
30.5
31.0
31.5
32.0
32.5
33.0
33.5
34.0
34.5
35.0
35.5
36.0
36.5
37.0
37.5
38.0
38.5
39.0
39.5
40.0
40.5
41.0
41.5
42.0
42.5
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43.5
44.0
44.5
45.0
45.5
46.0
46.5
47.0
47.5
48.0
48.5
49.0
49.5
50.0
50.5
.585
.577
.569
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.553
.545
.538
.530
.523
.516
.509
.502
.495
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.482
.475
.469
.462
.456
.450
.444
.438
.432
.426
.420
.414
.409
.403
.398
.392
.387
.382
.377
.372
.367
.362
.357
.352
.347
.342
.337
.332
.328
.323
.319
.314
.310
.305
.301
.297
51.0
51.5
52.0
52.5
53.0
53.5
54.0
54.5
55.0
55.5
56.0
56.5
57.0
57.5
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59.0
59.5
60.0
60.5
61.0
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62.0
62.5
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65.5
66.0
66.5
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67.5
68.0
68.5
69.0
69.5
70.0
70.5
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75.0
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.292
.288
.284
.280
.276
.272
.268
.264
.260
.256
.252
.248
.244
.240
.237
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.229
.226
.222
.218
.215
.211
.208
.204
.201
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.194
.191
.187
.184
.181
.177
.174
.171
.168
.164
.161
.158
.155
.152
.149
.146
.143
.140
.139
.134
.131
.128
.125
.122
76.0
76.5
77.0
77.5
78.0
78.5
79.0
79.5
80.0
80.5
81.0
81.5
82.0
82.5
83.0
83.5
84.0
84.5
85.0
85.5
86.0
86.5
87.0
87.5
88.0
88.5
89.0
89.5
90.0
90.5
91.0
91.5
92.0
92.5
93.0
93.5
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95.0
95.5
96.0
96.5
97.0
97.5
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99.5
100.0
.119
.116
.114
.111
.108
.105
.102
.100
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.071
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.056
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.051
.048
.046
.043
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.036
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.016
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.011
.009
.007
.004
.002
.000
112
113