UNIDAD 2

RGANOS LINFOIDES Y CLULAS DEL SISTEMA INMUNE.

GENERALIDADES

La inmunologa es la ciencia que tiene como objetivo estudiar los procesos

moleculares y celulares implicados en la defensa de la integridad biolgica del
organismo a travs de la identificacin de las sustancias propias y deteccin de
las sustancias extraas. La palabra inmunidad deriva del latn immunis, que
significa estar libre de o estar exento de, en referencia al estado de
resistencia que mostraban los individuos que se recuperaban de una infeccin.
La disciplina que hoy llamamos inmunologa surgi a finales del siglo XIX, al
iniciarse el estudio de la resistencia del organismo hacia los agentes
infecciosos.
El sistema inmune est conformado por una serie de rganos (timo, mdula
sea, ndulos linfoides, bazo y algunas mucosas asociadas al tejido linfoide),
tejidos, clulas y molculas distribuidas por todo el cuerpo y su dentro de sus
funciones se incluye la defensa, la homeostasia y la vigilancia; lo cual se
pueden resumir en un principio bsico: Distinguir entre lo propio y lo no propio,
para intentar eliminar lo no propio.
Para el estudio de la inmunologa se ha dividido al sistema inmune en innato y
adaptativo. El innato es la primera lnea de defensa que siempre disponible
para prevenir, defender o eliminar amenazas que pongan en riesgo la
integridad del organismo. Dicho sistema incluye barreras como la piel,
secreciones, mucosas y el reflejo, as como sustancias liberadas por los
leucocitos, clulas con funcin fagocitaria y macrfagos. A esta defensa se
suman algunas protenas sricas conocidas como protenas de la fase
aguda , la protena C reactiva, complemento, lectinas, citocinas y muchas
ms. La segunda lnea de defensa conocida como adaptativa o adquirida
involucra la activacin y funcin de linfocitos T y B, la cual se desarrolla a partir
de la induccin del sistema inmune innato con el objeto de eliminar las
amenazas que evadieron la respuesta innata. La respuesta adquirida se adapta
para reconocer, eliminar y recordar al patgeno invasor.

PRCTICA No.
IDENTIFICACIN DE CLULAS DEL SISTEMA INMUNE EN RGANOS
LINFOIDES PRIMARIOS Y SECUNDARIOS.

MARCO TERICO
Las caractersticas histolgicas y anatmicas de los rganos linfoides primarios
(centrales) y secundarios (perifricos) aumentan la probabilidad del encuentro
entre el antgeno y los linfocitos con receptores especficos para l. Estos
rganos estn formados por una complicada red de clulas de origen epitelial o
reticular, macrfagos y clulas dendrticas. Estas ltimas tienen la capacidad
de presentar antgenos en su superficie, con o sin participacin de molculas
codificadas por MHC (Complejo principal de histocompatibilidad). Los linfocitos
circulan a travs de esta red celular, teniendo oportunidad de contactar al
antgeno que corresponde a su receptor.
En los rganos linfoides primarios, timo y mdula sea, se produce la
maduracin y diferenciacin de las clulas linfoides encargadas de la respuesta
inmune adaptativa. Durante la maduracin los linfocitos adquieren su
especificidad y sus caractersticas funcionales. Los linfocitos que maduran en el
timo se denominan linfocitos T y pueden pertenecer a dos grandes
subpoblaciones, los T CD4+ y los T CD8+. Son los encargados de la respuesta
celular adaptativa. En mdula sea maduran los linfocitos B que son
responsables de la respuesta humoral o de anticuerpos.
Los rganos linfoides secundarios incluyen a los numerosos ganglios
linfticos distribuidos por todo el organismo, al bazo y a los tejidos linfoides
asociados a piel (SALT) y a mucosas (MALT). La recirculacin linfocitaria entre
estos rganos a travs de la circulacin sangunea y linftica es permanente, si
bien existen reas en donde predominan linfocitos T o B. Los linfocitos suelen
ingresar desde la sangre a los ganglios linfticos a travs de las vnulas de
endotelio alto. Estas vnulas postcapilares especiales surgen a raz de la
estimulacin por citocinas producidas por linfocitos T activados por antgeno.
Prcticamente todos los mtodos empleados para teir clulas
hematopoyticas se basan en el empleo del colorante Romanoswky,
constituido fundamentalmente por la mezcla de eosina y azul de metileno.
Tanto la eosina como el azul de metileno son muy sensibles a las variaciones
de pH de las diferentes estructuras celulares, de forma que tienen carcter
bsico aquellas que fijan en mayor medida la eosina (colorante cido). Mientras
las que poseen propiedades cidas fijan principalmente el azul de metileno
(colorante bsico). Esto explica que ciertas estructuras basfilas como la
heterocromatina presente en el ncleo o estructuras que posean fosfatos,
sulfatos y/o carboxilos ionizados en el citoplasma se tien de azul, mientras
que otros componentes acidfilos como la hemoglobina y la matriz extracelular
adquieran un color rosado.

MATERIAL
Microscopio ptico
2 Portaobjetos
2 Cajas petri
Alcohol
Aceite de inmersin
Colorantes de DADE Diff-Quik .
o Solucin fijadora: 1.8 g/L Triarilmetano en alcohol metlico
o Solucin I: 1 g/L Xanteno
o Solucin II: 1.25 g/L Thiazine (Mezcla de 0.625 g/L de azur A y
0.625g/L de azul de
metileno)
PBS pH 7.2 o SSI
Equipo y tabla de diseccin.
Agujas
Guantes
Jeringa de 1mL y de 5mL
Tela de Tergal Francs o de organza

TCNICA
1.
2.
3.
4.

Sacrificar al ratn por dislocacin cervical o en cmara de CO2.

Fijar el ratn a una tabla de diseccin utilizando agujas.
Rociar alcohol sobre el ratn para facilitar el manejo del mismo.
Realizar una incisin en la piel del ratn en la regin abdominal como se
muestra en el Esquema 1A. (Tener cuidado de no atravesar la musculatura
y el tejido celular que cubre el peritoneo).
5. Retirar con cuidado la piel del ratn hacia los lados y comenzar la
extraccin de los ganglios linfticos inguinales. (Apoyarse en el Esquema
1B).
6. Depositar los ganglios en una caja petri que contenga 1 mL de PBS.
7. Realizar una incisin en la regin axilar, localizar el ganglio linftico axilar,
extraerlo y depositarlo en una caja petri que contenga 1mL de PBS.
8. Abrir la regin peritoneal y localizar el bazo de lado izquierdo en la regin
abdominal del ratn.
9. Extraer el bazo con ayuda de unas pinzas y colocarlo en una caja petri con
1mL de PBS.
10. Abrir el trax mediante una incisin sobre las costillas y el esternn, con
ayuda de unas pinzas separar las costillas y dejar expuestos los pulmones y
el corazn para poder ubicar y extraer el timo fcilmente.
11. Depositar el timo en una caja petri con 1mL de PBS.
12. Una vez obtenidos los rganos colocar los ganglios y el timo por separado
entre dos trozos pequeos de tela y con la ayuda del embolo de una jeringa
macerar suavemente los rganos.
13. Para obtencin de clulas del bazo se perfundir el rgano con 2mL de
PBS.

14. Una vez obtenidas las suspensiones celulares.

15. Colocar una gota de la suspensin celular en un portaobjetos limpio y
desengrasado.
16. Cubrir con 100 L de Diff-Quik Fixative (solucin fijadora) dejar actuar
durante1 minuto.
17. Escurrir la solucin e inmediatamente colocar 100 L de Diff-Quik Solucin
I (Colorante acido) y dejar actuar 30 segundos.
18. Escurrir la solucin e inmediatamente colocar 100 L de Diff-Quik Solucin
II (Colorante Bsico) y dejar actuar 60 segundos.
19. Lavar con agua.
20. Dejar secar el portaobjetos a temperatura ambiente
21. Observar al microscopio ptico con el objetivo de 10-40X y posteriormente
a 100X utilizando aceite de inmersin.

Esquema 1. A) Diagrama de la incisin abdominal en el ratn. B) Diagrama de la

distribucin de los rganos linfoides.

RESULTADOS
Localizacin y extraccin de los diferentes rganos linfoides primarios y
secundarios. Identificacin y anlisis de las caractersticas morfolgicas y de la
afinidad por colorantes de las clulas presentes en cada rgano mediante un
frotis de la suspensin celular de cada rgano.
RGANO
BAZO

GANGLIOS

TIMO

OBSERVACIN
GENERAL
A travs de este frotis
se observar una gran
proporcin de eritrocitos
(6 m) teidos de color
rojo por la eosina, los
cuales se caracterizan
por ser clulas sin
ncleo. Por otro lado se
observar
algunas
clulas
del
sistema
inmune.

CARACTERISTICAS MORFOLGICAS
LINFOCITOS: estas clulas son del tamao
aproximado a los 8 m. Tienen un solo
ncleo teido fuertemente de azul que
ocupa casi todo el espacio de la clula, su
pequeo citoplasma se tie ligeramente de
color rosado.
MACRFAGOS: son los leucocitos de mayor
tamao (14 M), poco frecuentes y tienen
un ncleo grande, laxo, redondo y azul.
CLULAS DENDRTICAS: Clulas poco
frecuentes de un tamao aproximado a los
16 m, presentan una gran cantidad de
prolongaciones citoplasmticas, un ncleo
grande, compacto, redondo y azul.

Se
observar
gran
abundancia de clulas
del sistema inmune.
No
se
observarn
eritrocitos.

LINFOCITOS: estas clulas son del tamao

aproximado a los 8 m. Tienen un solo
ncleo teido fuertemente de azul que
ocupa casi todo el espacio de la clula, su
pequeo citoplasma se tie ligeramente de
color rosado.
MACRFAGOS: son los leucocitos de mayor
tamao (14 M), poco frecuentes y tienen
un ncleo grande, laxo, redondo y azul.
CLULAS DENDRTICAS: Clulas poco
frecuentes de un tamao aproximado a los
16 m, presentan una gran cantidad de
prolongaciones citoplasmticas, un ncleo
grande, compacto, redondo y azul.

Al igual que en el ganglio

no
se
observarn
eritrocitos,
pero
se
observarn abundantes
linfocitos
y
algunas
clulas del estroma.

LINFOCITOS: estas clulas son del tamao

aproximado a los 8 m. Tienen un solo
ncleo teido fuertemente de azul que
ocupa casi todo el espacio de la clula, su
pequeo citoplasma se tie ligeramente de
color rosado.

MATERIAL DE APOYO PARA EL ANLISIS DE CORTES HISTOLGICOS.

TIMO
Es un rgano linfoide primario que consta de dos lbulos, est rodeado de una
delgada cpsula de tejido conectivo que se proyecta hacia el interior como
septos dividiendo al rgano en lobulillos. En cada lobulillo se aprecia una
corteza de linfocitos densamente agrupados y una mdula ms clara. El timo
carece de ndulos linfoides y est sostenido por clulas reticulares epiteliales.
Los corpsculos de Hassall son exclusivos del timo y se localizan en la mdula.
Son estructuras redondeadas y acidfilas constituidas por clulas epiteliales
aplanadas dispuestas en forma concntrica, que pueden sufrir queratinizacin y
calcificacin en la zona central.
Lobulillos
a) Cpsula, b) Corteza, c) Mdula y
d) Trabculas

a)Corpsculos de Hassall
en zona medular y
b) clulas epitelioreticulares.

b
b

c
d
10X

40X

GANGLIOS LINFTICOS
Los ganglios linfticos son rganos linfoides secundarios que se distribuyen por
todo el cuerpo. En la fotografa se distingue el tejido conjuntivo capsular fibroso
por debajo del cual aparece el seno subcapsular como un espacio vascular que
en determinados puntos es difcil de apreciar, en la parte cortical se observan
folculos secundarios y tejido linfoide difuso quedando una porcin central
correspondiente a la zona medular rica en vasos sanguneos y senos linfticos.
a) Cpsula, b) paracorteza, c) corteza
y d) mdula.

Centro germinal

a
b
c
10X

20X

BAZO
La preparacin histolgica de bazo muestra una cpsula fibrosa de la que se
desprenden trabculas o septos que dividen parcialmente al parnquima
esplnico. El bazo consta de una pulpa blanca y una pulpa roja. La pulpa
blanca est situada periarteriolarmente (alrededor de las ramas de la arteria
esplnica central) formando estructuras envolventes o vainas cilndricas
conocidas como vaina linfoide periarteriolar que se mantienen parcialmente
separadas de la pulpa roja por una capa de tejido linfoide laxo conocida como
zona marginal. Dentro de la pulpa blanca las clulas linfoides se distribuyen
tanto de forma dispersa como agrupadas en folculos. La pulpa roja est
formada por senos venososo y cordones celulares (cordones de Billroth).
a) Pulpa roja, b) Pulpa blanca y c) Trabculas

a
c

10X

20X

PLACAS DE PEYER
Las placas de Peyer estn formadas por agregados de ndulos linfoides
situados en la lmina propia y submucosa de intestino delgado, particularmente
leon. Se pueden apreciar en ocasiones los centros germinales. El tejido
linfoide difuso entre dichos folculos linfoides est formado por linfocitos T. En
el corte histolgico se puede apreciar las vellosidades intestinales y la placa de
peyer asociada a la submucosa del intestino.

b
a) Vellosidades intestinales y
b) Placa de peyer
20X

PRCTICA No.
IDENTIFICACIN DE LAS CLULAS DEL SISTEMA INMUNITARIO EN
SANGRE.
MARCO TEORICO
La mejor forma de observar y diferenciar los distintos componentes celulares
de la sangre es mediante la tcnica de frotis. La falta de contraste entre las
clulas y el medio que la rodea es la principal dificultad para diferenciar las
clulas observadas en el microscopio ptico. El medio ms simple de aumentar
el contraste es la utilizacin de colorantes. La mayora de los colorantes son
compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales
celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas
positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes
celulares cargados negativamente, tales como los cidos nuclicos y los
polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos o bsicos son el azul
de metileno, el cristal violeta y la safranina. Los cololantes cidos, cuya
propiedad est basada en su polaridad negativa, les permiten enlazarse con
componentes celulares de carga positiva, tales como muchas protenas. Dentro
de los colorantes cidos se incluyen la eosina (derivado de xanteno), la fucsina
cida y el rojo Congo.
Los eritrocitos son los responsables de dar el color rojo a la sangre por su alto
contenido en hemoglobina, una protena que contiene hierro en su estructura.
Su principal misin es la de transportar el oxgeno y el CO2. El eritrocito, tienen
una forma bicncava, no posee ncleo y carece de mitocondrias y otros
orgnulos celulares. Constituyen aproximadamente el 45 % del volumen
sanguneo.
Las plaquetas son pequeas porciones de citoplasma sin ncleo. Su principal
misin es cooperar en la aglutinacin y coagulacin sangunea. Se forman
mediante "desgajes" del citoplasma de unas clulas denominadas
megacariocitos que se encuentran en la mdula sea.
Los leucocitos son clulas con gran movilidad que realizan sus funciones ms
importantes fuera del torrente sanguneo. Su nmero es de 5,000 a 9,000 por
milmetro cbico de sangre. Se los clasifica en cinco tipos distintos segn sus
caractersticas de tincin especficas y su morfologa celular y funciones
especficas. Al microscopio de luz pueden dividirse en:
Leucocitos granulares
Leucocitos no granulares
Los leucocitos presentan ncleo y son incoloros en la sangre fresca. Su funcin
principal es la defensa del organismo. Esta funcin la realizan fuera de la
propia sangre puesto que tienen la capacidad de atravesar la pared vascular y
actuar en los tejidos daados. Realmente utilizan el sistema circulatorio para
desplazarse por el organismo.

LEUCOCITOS GRANULARES
A. NEUTROFILOS
Su cantidad es del 50% al 70% de los leucocitos. Su nmero absoluto se
considera entre 3,000 a 6,000 por milmetro cbico de sangre. Poseen un
ncleo multilobulado (3-5 lbulos), y grnulos azurfilos lisosomas) en su
citoplasma que contienen enzimas hidrolticas, lisozima y mieloperoxidasa las
cuales le permiten actuar en la fase aguda de la inflamacin
B. EOSINOFILOS
Se encuentran entre el 1% y el 4% de las clulas de sangre perifrica. Su
nmero absoluto es de 120 a 350 por milmetro cbico de sangre. Tienen un
ncleo bilobulado y poseen granulaciones acidoflicas que contienen enzimas
hidrolticas y peroxidasa que son liberadas en las vacuolas fagocticas. Tiene
una funcin reguladora en las alergias. Un nmero elevado de eosinfilos en la
sangre perifrica puede ser un indicador de que la persona sufre de parasitosis.
C. BASOFILOS
Constituyen solo el 0.5% de los leucocitos de la sangre perifrica. Su nmero
llega a 40 por milmetro cbico de sangre. Poseen un ncleo bilobulado y
grandes grnulos esfricos basoflicos y metacromticos dados por heparina e
histamina. Pueden acumularse en zonas donde se producen reacciones
alrgicas.
LEUCOCITOS NO GRANULARES
A. LINFOCITOS
Los linfocitos comprenden entre el 20% y el 50% de los leucocitos sanguneos.
El nmero total es de 1,500 a 4,000 por milmetro cbico. Generalmente son
clulas pequeas que contienen un ncleo circular azul oscuro y un escaso
citoplasma azul claro o rosado. Existen dos tipos:
- Linfocitos T: Se diferencian en el timo y circulan en la sangre
perifrica, donde ellos son los principales artfices de la inmunidad
celular. Poseen funciones como ayudadores (CD4) supresores
(CD8), modulando la respuesta a travs de sus efectos sobre otras
clulas.
- Linfocitos B: se diferencian en la mdula sea y son los principales
encargados de la respuesta humoral a travs de la produccin de
anticuerpos. Una vez se colocan en contacto con un antgeno se
diferencian en clulas plasmticas que sintetizan anticuerpos.
B. MONOCITOS
Los monocitos comprenden de 2% al 8% de los leucocitos sanguneos. El
nmero absoluto son de 200 a 30 por milmetro cbico de sangre. Son las
clulas circulantes de mayor tamao. Poseen un ncleo excntrico en forma de
U en forma arrionada. Los monocitos sirven como precursores de los
macrfagos. Tiene una vida media de tres das, para luego migrar fuera del
torrente sanguneo.

MATERIAL
Microscopio ptico
2 Portaobjetos
Lanceta estril
Torundas de Alcohol
Aceite de inmersin
Colorantes de DADE Diff-Quik .
Solucin fijadora: 1.8 g/L Triarilmetano en alcohol metlico
Solucin I: 1 g/L Xanteno
Solucin II: 1.25 g/L Thiazine (Mezcla de 0.625 g/L de azur A y
0.625g/L de azul de metileno).
TCNICA
1. Limpiar y desengrasar perfectamente dos portaobjetos.
2. Limpiar el dedo pulgar con agua y con jabn. Desinfectarlo posteriormente
con una torunda de alcohol.
3. Con la lanceta estril realizar una puncin en la parte apical del dedo de
forma paralela a la huella digital del dedo pulgar.
4. Depositar una gota de sangre de en un extremo de un portaobjetos. Colocar
un portaobjetos como indica el esquema 1 y deslizarlo sobre toda la superficie
del portaobjetos de manera que se pueda obtener una fina pelcula de sangre
(monocapa). Dejar secar a temperatura ambiente.
5. Colocar el frotis de sangre sobre la bandeja de tincin.
6. Cubrir con 500 L de Diff-Quik Fixative (solucin fijadora) dejar actuar
durante 1 minuto.
7. Escurrir la solucin e inmediatamente colocar 500 L de Diff-Quik Solucin I
(Colorante acido) y dejar actuar 30 segundos.
8. Escurrir la solucin e inmediatamente colocar 500 L de Diff-Quik Solucin II
(Colorante Bsico) y dejar actuar 60 segundos.
9. Lavar con agua y dejar secar.
10. Observar al microscopio ptico con el objetivo de 10-40X y posteriormente
a 100X utilizando aceite de inmersin.

Esquema 1. Dejar que el porta objetos

absorba la gota y la arrastrar, pero sin
pasar por encima de la sangre para no
daar las clulas.

RESULTADOS
Identificacin de los diferentes componentes celulares de la respuesta inmune
en sangre perifrica humana a travs de sus caractersticas morfolgicas y de
afinidad por colorantes.

MATERIAL DE APOYO PARA EL ANLISIS MICROSCPICO DEL FROTIS

SANGUNEO.
Nombre
Plaquetas

Eritrocitos

Neutrfilos

Eosinfilos

Basfilos

Monocitos

Linfocitos

Caractersticas morfolgicas y funcionales

Por medio del microscopio se observarn pequeas porciones de
citoplasma sin ncleo. Su principal misin es cooperar en la aglutinacin y
coagulacin sangunea.
Al microscopio se vern con un dominio predominante eritrocitos teidos de
color rojo por la eosina. No tienen ncleo y son ms delgados por el centro
que por los bordes. Su principal misin es la de transportar el oxgeno y el
CO2.
Poseen un ncleo multilobulado (3-5 lobulaciones), y grnulos azurfilos
lisosomas) en su citoplasma que contienen enzimas hidrolticas, lisozyma y
mieloperoxidasa las cuales le permiten actuar en la fase aguda de la
inflamacin.
Tienen un ncleo bilobulado y poseen granulaciones acidoflicas que
contienen enzimas hidrolticas y peroxidasa que son liberadas en las
vacuolas fagocticas. Esta poblacin celular se caracteriza por teir
fuertemente sus grnulos con eosina. Aumentan en infecciones parasitarias
y procesos alrgicos principalmente.
Poseen un ncleo bilobulado y grandes grnulos esfricos basoflicos y
metacromticos dados por heparina e histamina. Al microscopio se
observar que esta poblacin celular se caracteriza por teir sus grnulos
de color azul. Liberan adems aminas vasoactivas y sustancia de reaccin
lenta de la anafilaxia.
Son las clulas circulantes de mayor tamao. Poseen un ncleo excntrico
en forma de U o en forma arrionada. Son los precursores del sistema
mononuclear fagoctico, que incluye macrfagos (histiocitos), osteoclastos,
macrfagos alveolares, clulas de Kupffer en el hgado y la microglia en el
sistema nervioso central.
Generalmente son clulas pequeas que contienen un ncleo circular
oscuro y un escaso citoplasma violeta. Existen dos tipos:
- Linfocitos T: Se diferencian en el timo y circulan en la sangre perifrica,
donde ellos son los principales artfices de la inmunidad celular. Poseen
funciones como cooperadores (CD4) o citotxicos (CD8), modulando la
respuesta
a
travs
de
sus
efectos
sobre
otras
clulas.
- Linfocitos B: se diferencian en la mdula sea y son los principales
encargados de la respuesta humoral a travs de la produccin de
anticuerpos. Una vez se colocan en contacto con un antgeno se diferencian
en clulas plasmticas que producen anticuerpos.

Referencias.
1. http://webs.uvigo.es/mmegias/a-imagenes-grandes/sangre.php
2. http://www.uv.es/histomed/practicas/09-linfoide/09-linfoide.htm
3. Inmunologa de Kuby. T J Kindt, RA Goldsby, BA Osborne. Edit. Mc
Graw Hill. 6ta. Edicin. Mxico 2007.
4. Inmunobiologa: El sistema inmunitario en la salud y en la enfermedad.
Ch. Janeway, P.Travers, M. Walport y J. D. Capra. Edit. Masson. Madrid.
2003.
5. MH Rosse, W Pawlina. Histologa Texto y Atlas color con biologa celular
y molecular. 5ta. Edicin. Edit, Panamericana. Argentina 2007.