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Assunto: Biotecnologia Aplicada Agropecuria

Autores: Maria Julia Franco da Cunha; Marcelle Balduno de Almeida; Juliana Freitas Asta;
Raquel Luciana Boscariol-Camargo.
Ttulo do artigo: TRANSFORMAO GENTICA DA LARANJA DOCE VISANDO RESISTNCIA A
PATGENOS
Peridico: 8Congresso Interinstitucional de Iniciao Cientfica CIIC2014 Campinas, So
Paulo.

Volume, pginas e ano: n 10, 2014.


Resumo
O trabalho visa apresentar alternativas para proporcionar resistncia em citros, o texto descreve o
problema enfrentado por lavouras em So Paulo que sofrem com a ao da bactria Candidatus
Liberibacter spp., agente causal do huanglongbing (HLB) que trazem prejuzos ao citricultor, visto que
estas bactrias deixam as folhas das laranjeiras amareladas e mosqueadas. Como no a resistncia gentica
descrita em citrus, os pesquisadores tentam por meio deste trabalho encontrar alternativas para obter
resistncia, como por exemplo, a transformao gentica mediada por Agrobacterium tumefaciens . A partir
da identificao de genes potenciais envolvidos na interao citros/HLB, foi clonado o gene CsiBiP, CsiBIP
uma protena de ligao pertencente a famlia multignica HSP70 (heatshockprotein) que foi clonada de
Citrussinensis. O maior objetivo deste projeto foi obter plantas geneticamente modificadas de laranja doce
Pineapple que superexpressem o gene CsiBiP, visando resistncia a patgenos.
A citricultura brasileira apresenta nmeros expressivos que traduzem a grande importncia
econmica e social que a atividade tem para a economia do pas, porm nos ltimos dez anos pragas e
doenas erradicaram um nmero significativo de rvores. Com isso cresceu os estudos e as tecnologias para
controlar as doenas que influenciaram negativamente essas produes.
Entre os problemas fitossanitrios que afetam a citricultura, os principais fatores biticos limitantes
aos citros incluem bacterioses como a clorose variegada dos citros (CVC), o cancro ctrico, o huanglogbing
(HLB) e tambm a leprose, causada pelo vrus CiLV. Assim, as ferramentas de biotecnologia na
diversificao gentica dos pomares so imprescindveis, pois fornecem tcnicas para criar uma maior
resistncia a patgenas e um melhoramento dos pomares.
O material e mtodos apresentam-se a seguir: Utilizou-se a agrobactria contendo o vetor com o
gene de CsiBip foi plaqueada em meio LB slido (10 g/L extrato de levedura, 10 g/L de peptona e 5 g/L de
NaCl e 15 g/L de gar, com pH 7,0) contendo os antibiticos rifampicina (50 mg/ml) e canamicina (100
mg/ml) e colocada para crescimento em B.O.D a 28C, por trs dias. Aps este perodo, uma colnia
isolada foi inoculada em 50 mL de meio LB lquido, com os antibiticos j citados acima, e colocada para
crescimento overnight, sob agitao constante de 130rpm, a 28C (pr-inculo). Aps a cultura atingir uma
O.D entre 0,8 a 1,0, este inculo foi centrifugado por 10 minutos, 25C, e as clulas bacterianas foram
ressuspendidas em meio de cultura MS lquido com acetosseringona (100 M) e colocado em contato com

os explantes. Epictilos provenientes de plntulas germinadas in vitro de laranja doce (Citrussinensis L.


Osbeck) variedade Pineapple foram utilizados como explantes, aps segmentao (segmentos de 1 cm).
Foram utilizados aproximadamente cento e setenta explantes em cada experimento de transformao
gentica. Desses, trinta explantes foram utilizados como controles no transformados e o restante foi
incubado com a suspenso bacteriana, por 20 minutos. Aps este perodo, os explantes foram secos em
papel toalha estril, para retirada do excesso de agrobactria e, em seguida, transferidos para o meio de cocultivo, composto pelos sais de MS, 30 g/L de sacarose, 0,1 g/L de inositol, 6 g/L de gar, 1mg/L de BAP e
100M de acetosseringona, pH 5,5. Aps trs dias de co-cultivo em B.O.D a 24C, cerca de 25 explantes
foram distribudos por placa de Petri contendo meio seletivo MS j descrito, acrescido de 250 mg/L do
antibitico cefotaxima, 150mg/L de timetin e 100 mg/L de canamicina, sendo mantidos a 28C, com
fotoperodo de 16 horas, at o desenvolvimento de brotos.
Foram feitos outros trs procedimentos, confirmao da transformao gentica por meio de anlise
de expresso do gene GUS, analise por PCR e microenxertia. O primeiro procedimento foi utilizado para
confirmar a expresso do gene introduzido na planta (gene GUS), para isso foi utilizado a soluo X-Gluc
que serviu para imergir o tecido foliar dos brotos, o segundo procedimento o DNA dos brotos positivos no
teste de GUS foi extrado com mtodo CTAB, este DNA foi utilizado para a reao de amplificao em
cadeia da polimerase e o terceiro procedimento utilizou as plantas transgnicas foram microenxertadas in
vitro seguindo o protocolo de Navarro et al. (1974) e posteriormente foram aclimatizadas em casa de
vegetao.

A obteno de brotos transgnicos expressando o gene CsiBiP via Agrobacterium apresentou


variaes de eficincia, mas permitiu a obteno dos brotos transformados. No entanto, houve alguns
problemas como o comprometimento de plantas no perodo de microenxertia in vitro e aclimatao em casa
de vegetao, resultando no total de treze plantas transformadas aclimatadas, as quais podero ser
desafiadas com diferentes patgenos dos citros.
Aluna: Amanda Maria Alencar de Moura