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FLUORIMETRA
Principios

El fenmeno de fluorescencia se encuentra dentro de los fenmenos llamados de

luminiscencia que incluye adems de ste, la fosforescencia y la quimioluminiscencia. Todos ellos
son resultantes de la interaccin de la luz con la materia que acaba con emisin de energa
radiante.
Ao + h.v1

A*

Ao + h.v2

Siendo: Ao: absorbente en estado fundamental

h.v1: energa de excitacin
A*: absorbente en estado excitado
h.v2: energa de emisin
Segn el tipo de energa absorbida por la molcula se pueden clasificar los distintos
fenmenos luminiscentes en:
Fotoluminiscencia: cuando la fuente de excitacin electrnica es una radiacin luminosa; son
fenmenos de este tipo la fluorescencia y la fosforescencia.
Quimioluminiscencia: cuando es una reaccin qumica la que produce la energa capaz de excitar
la molcula.
Existen otros tipos de luminiscencia como son: bioluminiscencia, termoluminiscencia,
radioluminiscencia etc.
Los tipos de luminiscencia que tienen mayor aplicacin en bioqumica clnica son la
fluorescencia y la quimioluminiscencia.
La fluorescencia se produce cuando una molcula absorbe luz (longitud de onda de
excitacin), pasa a un estado excitado y al retornar a su estado fundamental, emite luz (longitud de
onda de emisin); la fluorescencia ser por tanto la emisin de esa radiacin. La energa de la
radiacin emitida es menor y por tanto, la longitud de onda es mayor que la de la radiacin
absorbida. La diferencia o aumento entre estas 2 longitudes de onda se denomina desviacin de
Stokes y, de forma general, los mejores resultados de las medidas de fluorescencia se obtienen con
compuestos que tienen grandes diferencias entre las 2 longitudes de onda de excitacin y de
emisin.
Slo ciertas sustancias poseen la propiedad de ser fluorescentes: son los fluorocromos
(fluorforos). Compuestos que no son en s mismo fluorescentes o slo dbilmente, pueden
convertirse en derivados muy fluorescentes mediante reacciones qumicas como condensaciones,
sustituciones, deshidrataciones u oxidaciones, o simplemente modificando su pH particular.
La fluorescencia es emitida por los compuestos en todas direcciones, pero slo se mide
una pequea parte que llega al detector.
El tiempo transcurrido entre la absorcin de la radiacin electromagntica y la emisin de la
fluorescencia es muy pequeo, del orden de 10 -8 segundos (10-8 - 10-4) (es ms lento el fenmeno
de fluorescencia que el de absorcin ya que la absorcin se produce en 10 -15 seg)
La fluorescencia emitida puede cuantificarse; la luz fluorescente se puede utilizar para
cuantificar la cantidad de compuesto fluorescente que la emite. Se puede aplicar al fenmeno de
fluorescencia la Ley de Beer, siempre que se trabaje con soluciones diluidas: segn ella, la
intensidad de la radiacin fluorescente es proporcional a la concentracin de la sustancia en solucin
(esta relacin es slo vlida para soluciones diluidas donde la absorbancia es <2% de la radiacin
excitante ya que si es mayor aparece el efecto de filtro interno).

Factores que afectan a las mediciones fluorimtricas

Los ms importantes son los siguientes:
Dispersin de la luz: la radiacin incidente no slo es absorbida o transmitida por la muestra, sino
que tambin es dispersada en todas direcciones; parte de esta luz dispersada puede ser detectada
junto con la radiacin fluorescente contribuyendo a elevar el ruido de fondo y ocasionando una
prdida de sensibilidad metrolgica (esto tiene especial importancia cuando se utilizan fluorforos
con un desplazamiento de Stokes pequeo, es decir, cuando la radiacin fluorescente tiene lugar a
unas longitudes de onda cercanas a las de la radiacin de excitacin).
Para disminuir esta interferencia se pueden utilizar filtros de interferencia o sitemas
monocromadores tanto en la parte de emisin como en la de excitacin.
Efecto de filtro interno: en aquellos casos en que el fluorforo est a concentraciones muy
elevadas podra aparecer el efecto de filtro interno, detectndose menos fluorescencia que la
correspondiente al mismo fluorforo en una solucin ms diluida; este efecto paradjico es
debido a lo siguiente: slo se mide la fluorescencia de una pequea porcin de la muestra, un
elemento de volumen colocado exactamente en el centro de la cubeta; para que la luz llegue al
elemento de volumen del centro de la cubeta, previamente ha de atravesar una parte de la muestra
que a su vez absorbera luz de excitacin, por lo que la intensidad de luz incidente que llega al
elemento de volumen central ser tanto menor cuanto mayor sea la concentracin de fluorforo y,
como consecuencia, menor ser la emisin fluorescente. A este efecto se le conoce como de filtro
interno y ha de ser evitado hasta donde sea posible; para ello lo aconsejable es disminuir la
concentracin de la muestra: normalmente para transmitancias mayores del 95%, lo cual significa
valores de absorbancia inferiores a 0,022, el efecto de filtro interno es prcticamente despreciable.
Atenuacin de la fluorescencia: la florescencia es bastante susceptible a ciertas variables en la
solucin como son:
La naturaleza del solvente
El pH: provoca alteraciones de carga molecular modifican la fluorescencia
La temperatura: las variaciones de la temperatura afectan a la viscosidad de la matriz y por tanto al
nmero de colisiones de las molculas fluorescentes con las molculas de la matriz
La presencia de impurezas
La presencia de iones: aniones como I -, Br - y Cl- tienen un marcado efecto de atenuacin de la
fluorescencia de ciertos compuestos
Impurezas fluorescentes:
Pueden existir impurezas fluorescentes propias de los solventes, tampones, reactivos, algunos
materiales de vidrio o plstico, residuos de detergentes para limpieza de material etc que
pueden absorber la luz de excitacin o la de emisin y ser capaces de emitir fluorescencia. No es
recomendable utilizar mezcla crmica para limpiar material de vidrio.
Se debe hacer un blanco de espectro (en el cual la cubeta contenga el solvente y todo
aquello que se utilice en la determinacin, sin el fluorforo).
Asimismo, las muestras de suero u orina pueden contener sustancias fluorescentes distintas de
las que se quiere investigar que tambin contribuyen a la fluorescencia de fondo: las protenas y la
bilirrubina son las que con mayor frecuencia contribuyen a esta fluorescencia no deseada (sin

embargo las protenas tienen una de excitacin mxima entre 260 y 290 nm, y su interferencia es
menor cuando se utilizan radiaciones de excitacin por encima de los 300 nm).
Instrumentacin
Para la medida de la fluorescencia se emplean fluormetros o espectrofluormetros; la
diferencia entre ellos es el sistema de seleccin de la de excitacin y de emisin:
Fluormetro: emplea filtros interferenciales o de vidrio
Espectrofluormetro: emplea prismas o redes de difraccin
Los componentes bsicos de estos aparatos son:
fuente de luz de excitacin
rendijas de excitacin y de emisin
selector de la de excitacin
compartimento para la muestra: cubeta
selector de la de emisin
detector
registro
La luz procedente de la lmpara de excitacin se hace pasar por el filtro o monocromador de
excitacin, que selecciona la adecuada que incide sobre la cubeta con el espcimen; parte de la
luz se absorbe y como consecuencia del proceso de fluorescencia, se emite luz de mayor ; sta se
hace pasar por el filtro o monocromador de emisin colocado perpendicularmente al primero, para
evitar interferencias de la luz de excitacin (si no se colocase as, se detectara no slo la luz emitida
por fluorescencia sino tambin aquella transmitida). Finalmente la luz llega al detector, donde se
transforma en energa elctrica.
Fuente de energa:
Las lmparas que se emplean deben emitir energa radiante de intensidad elevada porque
para detectar la emisin fluorescente ser necesario previamente excitar el mayor nmero
de flluorforos posible (la intensidad de la radiacin fluorescente es directamente
proporcional a la intensidad de la radiacin de excitacin).
El espectro de absorcin de la mayora de los compuestos fluorescentes de inters se sita
entre los 300-500 nm; por ello es conveniente una lmpara intensa capaz de emitir
energa radiante en una regin espectral amplia. Las fuentes de luz que mejor se ajustan
a este criterio son:
La lmpara de arco de xenn: produce un espectro continuo entre 250 y 600 nm con un mximo en
470 nm.
La lmpara de mercurio de alta presin: produce un espectro discontinuo con lneas de emisin
entre los 365 y 734 nm.
Otras fuentes: lmparas halgenas y combinacin de las lmparas de mercurio-xenn, a veces
tambin el lser.
Rendijas:
Las rendijas de entrada y salida son similares a las de un espectrofotmetro.
Selectores de la de excitacin y emisin:
Mediante:
Filtros: interferenciales o de vidrio coloreado

Monocromadores. prismas o redes de difraccin

De todos ellos, los filtros interferenciales son los ms utilizados, pues los filtros transmiten
ms luz y son menos costosos que los monocromadores.
Los selectores se colocan antes y despus del compartimento de la muestra.
Fin: los de excitacin, seleccionar la de la radiacin de excitacin y los de emisin,
seleccionar la de la radiacin de emisin (eliminar las no deseadas) antes de que la luz
incida en el detector.
Compartimento para la muestra:
Forma: las cubetas utilizadas son generalmente rectangulares, por lo menos con 2 caras
adyacentes transparentes; las 2 caras restantes pueden ser tambin transparentes o pueden tener
una superficie reflectante para dirigir la emisin fluorescente hacia el detector. Tambin pueden ser
cilndricas.
Material: generalmente de cuarzo para UV-visible. Las de vidrio slo para la zona del visible, a
veces de plstico para la zona del visible, pero pueden causar fluorescencia adicional, lo que
producira prdida de sensibilidad
5. Detector:
Los ms utilizados son los tubos fotomultiplicadores (ya que son capaces de cuantificar la
pequea seal fluorescente, logrando as el deseado nivel de sensibilidad en la medida).
Generalmente estn dispuestos en ngulo recto respecto del haz de luz incidente.
Aspectos prcticos
La ventaja ms importante de la fluorimetra es su enorme sensibilidad: puede llegar a ser
de 100 a 1000 veces ms sensible que las tcnicas colorimtricas.
Como ya se dijo, las medidas de fluorescencia, se deben hacer sobre soluciones diluidas.
Las medidas de fluorescencia se realizan con referencia a un estndar de fluorescencia
mxima: el aparato se lleva a cero con un blanco adecuado no fluorescente (solvente puro) y a
continuacin se coloca en la cubeta el estndar de mayor valor y se ajusta el aparato a 100%. Se
miden el resto de los estndares y las muestras y sus valores se expresan como porcentaje del
estndar mayor (con los estndares se obtiene una recta de calibracin).
La necesidad de una recta patrn surge de que en las medidas de fluorescencia no hay una
magnitud equivalente al coeficiente de extincin molar () y, por tanto, no se puede desarrollar una
ecuacin similar a la de Lamber-Beer.
Aplicaciones en bioqumica clnica
Una gran variedad de compuestos se pueden determinar mediante mtodos fluorimtricos,
tanto de forma directa porque sean ellos fluorescentes, como de forma indirecta, acoplando una
sustancia no fluorescente a un reactivo fluorescente.
Estos procedimientos tienen inters porque debido a su enorme sensibilidad metrolgica y
bajo lmite de deteccin, pueden determinarse sustancias que estn presentes en
concentraciones muy bajas en los distintos fluidos biolgicos como: vitaminas, enzimas
(oxidoreductasas, peroxidasas.), hormonas (estrgenos urinarios), frmacos (fenitona,

fenobarbital).
La utilizacin de marcadores fluorescentes en inmunoanlisis (fluoroinmunoanlisis) (Acs
monoclonales marcados) ha supuesto una alternativa importante a los marcadores radiactivos; en
este campo es donde la espectrometra de fluorescencia molecular tiene mayor inters en
bioqumica clnica.