TALLER DE GENTICA 3

PRUEBAS DE DIAGNSTICO
MOLECULAR

Gua de actividades 2012

Taller de Gentica III: Pruebas de diagnstico molecular

Para resolver los problemas de este Taller se recomienda estudiar previamente los
fundamentos moleculares de la electroforesis de cidos nucleicos y su uso en las tcnicas de
Southern blot, PCR y secuenciacin.
Los objetivos del Taller III son los siguientes:
1- Identificar en qu casos son aplicables las tcnicas de diagnstico molecular
2- Interpretar la informacin que surge de la aplicacin de esas pruebas

Ejercicio 1
Introduccin. La anemia de clulas falciformes es una enfermedad sangunea caracterizada
por la presencia de glbulos rojos con forma anormal (de hoz). La forma de hoz est asociada
a una prdida de flexibilidad celular y resulta en movimientos restringidos de los glbulos rojos
a travs de los capilares ms pequeos, provocando disminuciones en la disponibilidad de
oxgeno de los tejidos por ellos irrigados. La enfermedad es crnica: los individuos se
encuentran en buen estado la mayor parte del tiempo, pero sufren peridicamente de dolorosos
ataques y su esperanza de vida est disminuida.
La anemia de clulas falciformes es una enfermedad monognica con un patrn de herencia
autosmico recesivo. La causa es una sustitucin puntual (A por T) en el gen de la globina
que provoca un cambio de sentido en la cadena polipeptdica en dnde cido glutmico es
reemplazado por valina. La globina resultante (globina mutante) se denomina hemoglobina S.
La hemoglobina S es soluble cuando est completamente oxigenada, pero cuando las
tensiones de oxgeno disminuyen sufre un marcado cambio conformacional que conduce a la
deformacin del glbulo rojo y a la hemlisis.
El diagnstico molecular para la mutacin descripta consiste en amplificar mediante PCR una
regin de ADN de 233 pb que abarca el sitio de la mutacin y luego tratar al producto
amplificado con la enzima de restriccin Dde I. Esta enzima produce dos fragmentos de 178 y
55 pb, respectivamente. La discriminacin de esta prueba se debe a que la mutacin produce
la prdida del sitio de restriccin para esta enzima. De esta manera, la resolucin
electrofortica puede revelar la presencia o ausencia de la mutacin.

Problema. Una pareja tiene dos hijos: una nia de diez aos sana y un nio de cuatro aos
con anemia de clulas falciformes. La mujer est esperando un nuevo hijo y se ha realizado un
muestreo de vellosidades corinicas para determinar si su nuevo hijo (el probando), heredar la
enfermedad.
Se muestra el resultado de la prueba de diagnstico tal como se describi previamente:

M: marcadores de peso molecular

1: control
2: padre
3: madre
4: probando
5: hija de 10 aos
6: hijo de 4 aos

A- Teniendo en cuenta el resultado de la prueba molecular determine el genotipo de

cada uno de los integrantes de la familia. Justifique explicando cmo interpreta
el patrn de bandas en cada caso.
B- Con los datos obtenidos, dibuje el rbol genealgico de la familia

Ejercicio 2
Introduccin. En funcin de la tasa de mutacin que en el genoma humano es muy variable
se pueden distinguir dos tipos de mutaciones: mutaciones estticas y mutaciones dinmicas.
En las primeras, la tasa de mutacin es la misma tanto para la secuencia originada tras la
mutacin como para la secuencia predecesora. Sin embargo, las mutaciones dinmicas que
ocurren en secuencias de ADN repetitivo, se caracterizan por un tipo muy particular de
mutacin: la expansin de tripletes. En este caso, la tasa de mutacin depende del nmero de
copias, por lo que la mutabilidad de una nueva secuencia originada por mutacin es diferente
de la de la secuencia de la que proviene.
Se ha demostrado que las mutaciones dinmicas que originan un aumento en el nmero de
repeticiones en secuencias polimrficas de tripletes repetidos constituyen un nuevo mecanismo
de mutacin que conduce finalmente a diversas enfermedades neurolgicas hereditarias, un
ejemplo d estas es la distrofia miotnica (DM)
La DM es una enfermedad neuromuscular de herencia autosmica dominante con una
incidencia estimada de 1/7.500, siendo la forma ms comn de distrofia muscular en adultos. El
cuadro clnico de los pacientes afectados de DM es muy variable, y aunque son caractersticas
la miotona y la progresiva debilidad consecuente, tambin se ven afectados otros sistemas,
producindose defectos en la conduccin cardaca, cataratas, hipersomnia, atrofia testicular y
calvicie prematura en los varones. Esta extraordinaria variacin fenotpica, que tiene lugar tanto
entre las distintas familias afectadas como entre los individuos de una misma familia, es una de
las caractersticas ms notables de la DM. El fenmeno de la anticipacin (la enfermedad se
manifiesta en edades cada vez ms tempranas en generaciones sucesivas, presentando
adems sntomas ms severos) junto con el grado variable de penetrancia, son otras
caractersticas destacables de la DM. Desde el punto de vista clnico, los pacientes se
clasifican en tres categoras principales de acuerdo con la edad de manifestacin de la
enfermedad y la expresin fenotpica de la misma:
1. De manifestacin tarda. En muchos casos es difcil de diagnosticar por el ligero grado de
afectacin que muestran los pacientes.
2. De manifestacin en adultos
3. De manifestacin temprana, que es la forma ms severa de la enfermedad y se ve
frecuentemente asociada con un profundo retraso mental.
El defecto molecular subyacente a la DM se ha identificado como un fragmento de ADN
inestable que contiene repeticiones de triplete (CTG)n y que sufre expansin en los pacientes
afectados por la enfermedad. El nmero de repeticiones del triplete (CTG)n es muy variable en
la poblacin normal, oscilando entre 5 y 27 repeticiones; los pacientes mnimamente afectados
tienen al menos 50 repeticiones, mientras que los individuos ms severamente afectados
portan expansiones de dicha secuencia con cientos e incluso miles de repeticiones. El triplete
CTG se localiza en el extremo 3 no traducido (3UTR) del ARNm de la protena quinasa de la
miotonina (MDPK), es decir, por fuera de la regin codificante. El gen MDPK est ubicado en el
cromosoma 19 y contiene 15 exones que se extienden aproximadamente 13 kb, produciendo
finalmente un polipptido de 524 aminocidos.
Una vez identificada la amplificacin en el nmero de repeticiones CTG como la base gentica
de la DM, se ha realizado un gran esfuerzo para desentraar cmo la expansin podra
producir la enfermedad.
Algunos grupos de investigacin han demostrado que en clulas en cultivo, la expansin del
i
nmero de tripletes conduce a la ausencia del ARNm de la protena MDPK .
El mecanismo molecular responsable de este hecho se desconoce, aunque se cree que un
elevado nmero de repeticiones CTG en el extremo 3 del gen podra de algn modo producir
una disminucin en la tasa de sntesis o de procesamiento del ARNm correspondiente.

Problema. Un nio es diagnosticado clnicamente con la forma temprana de la DM. Las

entrevistas y el estudio clnico de los familiares determinan que su madre posee una forma leve
de la enfermedad, y permiten la construccin del siguiente rbol genealgico 1:

Para realizar un estudio detallado de los portadores, a los individuos que figuran en el rbol
genealgico se les realiz una prueba de diagnstico molecular. Partiendo de sangre perifrica,
la prueba consiste en realizar un Southern blot, digiriendo al ADN con la enzima de restriccin
NcoI y usando como sonda especfica una secuencia que hibrida con una regin del gen MDPK
muy cercana a la ubicacin de los tripletes CTG.
El resultado se muestra a continuacin. Los nmeros corresponden con los individuos del rbol
genealgico. M: marcador de peso molecular

A- Teniendo en cuenta el resultado de la prueba molecular determine el genotipo de

cada uno de los integrantes de la familia. Justifique explicando cmo interpreta
el patrn de bandas en cada caso.
B- Explique las diferencias en el patrn de bandas de los individuos 2, 3 y 6.
Relacione con la expresin fenotpica

Los nmeros que figuran en el rbol genealgico hacen referencia al estudio molecular posterior.

C- Encuentra discordancias entre los resultados de la prueba molecular y el

diagnstico clnico? En caso afirmativo, indique a qu pueden deberse.

Ejercicio 3
Introduccin. La Fibrosis qustica es la enfermedad autosmica recesiva ms comn en la
poblacin de origen caucsico, y se presenta en uno de cada 2000 a 2500 nacidos vivos y
tiene una frecuencia de portadores de uno cada 20 a 25 nacidos vivos. Los pacientes con
fibrosis qustica tienen una conduccin anormal de cloruros a travs de la membrana apical de
las clulas epiteliales, causando secreciones espesas en las vas areas, pncreas, intestinos,
y vas deferens. La enfermedad es causada por mutaciones en el gen regulador de la
conductancia transmembrana de la Fibrosis Qustica (CFTR) que est ubicado en el
cromosoma 7q31-32., el cual codifica una protena de 1480 aminocidos que funciona como un
canal de cloruro regulado por AMP cclico.
Se han descripto ms de 1000 mutaciones en este gen, muchas de las cuales son muy poco
frecuentes. Pero una mutacin se destaca por ser la ms frecuente. Est presente en cerca del
57% de los cromosomas fibroqusticos en Argentina y se denomina F508, y consiste en una
delecin de tres pares de bases (CTT) en el exn 10 que resulta en la prdida del aminocido
fenilalanina en la posicin 508 de la protena.
Problema. Una nia recin nacida presenta signos compatibles con la fibrosis qustica, pero el
diagnstico es controversial. Se decide realizar una prueba de diagnstico molecular para
determinar la presencia de la mutacin F508. La prueba consiste en amplificar mediante PCR
una regin del gen que contiene el triplete CTT del exn 10. Los productos de amplificacin se
resuelven luego en un gel de poliacrilamida.
A continuacin se muestra el resultado de la prueba molecular de los miembros de la familia
(ver correspondencia numrica)

C1, C2: controles (individuos de genotipo conocido)

A- Explique el patrn de bandas para cada individuo. Pude explicarse el

diagnstico clnico del probando con esta prueba?

Posteriormente, se realiz la bsqueda de la segunda mutacin ms frecuente, llamada

G551D, que es una mutacin de sustitucin con cambio de sentido que provoca un cambio de
un aminocido de glicina (G) por un cido asprtico (D) en la posicin 551 de la cadena
polipeptdica.
B- Determine si la siguiente estrategia experimental es adecuada para detectar la
mutacin G551D. Justifique su respuesta:

Se utilizan primers adecuados para amplificar una regin que contenga a la

zona de la sustitucin. Los productos de amplificacin se resuelven en un gel de
poliacrilamida
Para realizar la bsqueda de la mutacin G551D se utiliz PCR alelo especfica. En este
abordaje experimental uno de los primers del par utilizado slo puede hibridar con la secuencia
si est presente la mutacin buscada. De modo tal que slo habr amplificacin en ese caso, y
de all viene el nombre de esta variante de la tcnica de PCR.
El siguiente es el resultado de la PCR alelo especfica (los nmeros hacen referencia los
individuos analizados):
M: marcadores de peso molecular
CA, CB: controles (individuos de genotipo conocido)

C- Por qu es especialmente importante en esta tcnica usar controles? Expliqu

cul es el genotipo de los controles utilizados (CA,CB) en funcin de su patrn
de bandas
D- Qu conclusin puede sacar de esta prueba para la familia analizada?
Se realizaron pruebas con otras 10 mutaciones frecuentes, que en conjunto permiten explicar el
84% de los casos. No se pudo encontrar una de estas mutaciones en la familia estudiada.
Por esta razn se decidi pasar a otra estrategia experimental: secuenciar el gen de CFTR de
los miembros de la familia y compararlo con la secuencia normal. Se utiliz el mtodo de los
dideoxi automatizado, en donde cada dideoxi (A,T,C,G) est marcado con un fluorforo
diferente, y la secuencia aparece como una sucesin de picos de fluorescencia de diferentes
colores.
Durante la secuenciacin del exn 3, en la posicin 113, apareci una mutacin que estaba
presente en los individuos 2 y 4, pero no en los individuos 1 y 3.
A continuacin se muestra el fragmento de la secuenciacin que compara la secuencia normal
y la mutada:
secuencia
secuencia normal

E- Por qu hay un doble pico en la posicin mutada?

F- Puede concluirse que la mutacin hallada explica el diagnstico clnico de
fibrosis qustica? Discuta

Ejercicio 4
Introduccin. A excepcin de los gemelos idnticos, el material gentico de cada individuo es
nico. Se ha estimado que dos genomas humanos, escogidos al azar, difieren
aproximadamente en uno cada 500 nucletidos. Si el genoma humano contiene 3 109 bases,
existen entonces, 6 109 bases diferentes entre dos personas ii . Esa variabilidad interindividual
puede ser estudiada a travs del producto gnico o mediante el anlisis directo del ADN. Uno
de los objetivos del estudio de la variabilidad humana de inters cada vez mayor con el curso
de los aos, es su aplicacin en pruebas de paternidad y otras relaciones genticas y para la
identificacin de seres humanos involucrados en hechos delictivos, ya sea como vctimas o
criminales. Con esos objetivos, la identificacin se realizaba inicialmente con anlisis
morfolgicos, bioqumicos e inmunolgicos, correspondientes stos ltimos a productos de
genes ubicados en una fraccin del genoma menor del 10%. Quedaba as un 90% de ADN, no
codificante, cuyo potencial para el estudio de la variabilidad humana empez a ser descubierto
a partir de los aos 80, cuando se reconoci que estaba repleto de polimorfismos de secuencia
que fueron puestos en evidencia con el uso de las enzimas de restriccin y los fragmentos de
iii
longitud variable que stas generaban (RFLP) .
El genoma humano nuclear extragnico est constituido por secuencias nicas y repetidas. Un
subgrupo de secuencias repetidas que representan aproximadamente el 60% de ellas, son las
secuencias repetidas en tndem, que constituyen un ADN altamente polimrfico y que abrieron
nuevas posibilidades, inimaginables para la identificacin de marcadores con elevado poder de
discriminacin iv
El ADN repetitivo en tndem est constituido por
secuencias que no incluyen genes funcionales y
que se disponen en arreglos de repeticiones, una
al lado de la otra y cada una de ellas contiene
una secuencia central bsica Se clasifican de
acuerdo al tamao promedio del arreglo en: ADN
satlite, ADN minisatlite y ADN microsatlite
(Figura 1). De estos tipos de ADN, el minisatlite
y el microsatlite son los que mayor importancia
tienen hoy da para resolver problemas en
identificacin humana y pruebas de paternidad.
Los loci ms variables descubiertos en el
genoma
humano
son
las
secuencias
minisatlites,
conocidas
como
regiones
hipervariables
y
posteriormente,
como
repeticiones en tandem de nmero variable
(VNTR). Su hipervariabilidad es debida a la
diversidad en el nmero de reiteraciones de
Figura 1. Repeticiones en tndem de nmero variable:
determinadas secuencias de nucletidos las
mini y microsatlites
cuales para estos loci, oscilan entre 7 y unos 30
nucletidos. Existen grandes similitudes en las
secuencias de la unidad central que se repite en
un gran nmero de minisatlites. Esta similaridad le sugiri a Alec Jeffreys, en Inglaterra, que si
se empleaban sondas que contuvieran repeticiones de esa unidad central se podran detectar
fragmentos de ADN de longitud variable a travs del mtodo de transferencia de Southern y
producir, para cada individuo un patrn especfico de bandas de ADN al cual denomin "DNA
fingerprinting" o huella digital de ADN
Metodologa. Este proceso involucra la digestin del ADN por una enzima de restriccin,
seguida por la separacin de los fragmentos mediante una electroforesis, transferencia del
ADN y la hibridacin con una sonda marcada que reconoce la unidad repetitiva (Southern
propiamente dicho).
_

24

16

1 v5

La identificacin de individuos, mediante el anlisis de ADN, se basa en el alto nivel de

polimorfismo existente en los loci analizados, que generan un nmero muy alto de genotipos
posibles, a diferencia de los sistemas biolgicos de identificacin clsicos proteicos, tales como
enzimas, grupos sanguneos, etc, permitiendo distinguir un individuo de otro, prcticamente en
cada caso Otra ventaja del anlisis del ADN con respecto a los marcadores protecos, es su
ubicuidad, ya que puede aplicarse en cualquier clula nucleada y es muy resistente a la
degradacin Con las sondas multilocus o con una batera de 5 a 6 sondas unilocus, con
heterocigosis de alrededor del 90%, el poder de exclusin puede llegar a 99,99%.
18

Problema. Los casos 1 y 2, que se muestran ms abajo, intentan determinar si un individuo

que alega ser el padre de un nio es su padre biolgico. A tal fin se ha analizado los VNTR de
un locus de minisatlite con la metodologa descripta previamente.

A- Explique por qu el patrn de bandas de cada individuo consta de dos bandas

B- Teniendo en cuenta los patrones de bandas Qu conclusiones puede sacar en
cada uno de los casos acerca del lazo biolgico entre el padre** y el nio?
C- Las conclusiones obtenidas con esta prueba Son un 100% certeras? Discutir
Ejercicio 5
Determine para cada uno de los siguientes casos si hara alguna prueba molecular para
realizar el diagnstico. En caso afirmativo, diga cul es la prueba que considera ms
adecuada, y describa brevemente como discrimina un diagnstico positivo de uno negativo.
1- Enfermedad monognica con gen identificado. La mutacin ms frecuente es una
sustitucin (A por T) en una posicin puntual.
2- Enfermedad monognica con patrn de herencia ligado al X recesivo y gen no
descripto.
3- Enfermedad autosmica dominante con gen identificado. Una de las mutaciones ms
frecuentes es una insercin de un par de bases en una posicin particular.
4- Enfermedad autosmica dominante con gen conocido. El mecanismo mutacional
implica expansin de tripletes.
5- Enfermedad multifactorial. Algunos de los genes involucrados se conocen.
6- Enfermedad cromosmica. Translocacin robertsoniana entre el cromosoma 14 y el 21.

Carango P, et al. Absence of myotonic dystrophy protein kinase (MDPK) mRNA as a result of a triplet repeat
expansion in myotonic dystrophy. Genomics 1993; 18: 340-348.
ii

Pena, S.D.J, et al. DNA diagnosis of human genetic individuality. J. Mol. Med. 73: 555-564, 1995.

iii

Bohm, I, et al. Oligonucleotide DNA fingerprinting: Results of a multicenter study on realiability and validity. In: DNA
fingerprinting: State of Science (Pena, S.D.J., Chakraborty, R., Epplen, J.T. e Jeffreys, eds) Basilia, Birkhuser Verlag,
1993, pp. 257-260.
iv Stratan, T. The human genome BIOS Scientific publishers,1972, p. 160.
v

Jeffreys, A.J., et al. The efficiency of multilocus DNA fingerprint probes for individualization and establishment of
family relationship, determined from extensive casework. Am. J. Hum. Genet. 48: 824-840,1991.