UNIVERSIDAD DEL CAUCA

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES EXACTAS Y DE LA EDUCACION

DEPARTAMENTO DE QUIMICA
LABORATORIO DE BIOQUIMICA I MACROMOLCULAS
PRACTICAS: 3 Y 4
PADILLA MUOZ, MARIA ALEJANDRA
CONSULTAS PRELIMINARES (PRACTICA 3):
1.
1.1. MTODO DEL CIDO BICINCONNICO (BCA)
Fundamento: Se basa en el principio de que las protenas reducen los iones
cpricos a iones cuprosos bajo condiciones alcalinas. Los iones cuprosos
reaccionan con el BCA (verdoso) para formar un color morado. El color formado es
proporcional al contenido proteico de la muestra.
1.2METODO DE ADHESIN DE COLORANTE ANINICO
Fundamento: La muestra proteica se mezcla con una cantidad excesiva conocida
de un colorante aninico en una solucin buffer.
Las protenas se unen al
colorante para formar un complejo insoluble. Se mide el colorante no adherido,
soluble posterior a la equilibracin de la reaccin y la remocin del complejo
insoluble
por centrifugacin y filtracin.
El colorante no adherido est
inversamente relacionado al contenido proteico de la muestra
Protena + exceso de colorante Complejo protena-colorante insoluble +
colorante no adherido soluble
1.3METODO DE ABSORCION UV(280 nm)
Las protenas muestran un fuerte grado de
principalmente por los residuos de triptfano
concentraciones de estos aminocidos en las
constantes se puede utilizar la absorbancia
concentracin de protenas.

absorcin a 280nm en UV,

y la tirosina. Ya que las
protenas son francamente
a 280nm para estimar la

1.4. METODO DE BRADFORD

El azul brillante G-250 Coomassie se adhiere a la protena, el colorante se torna de
rojizo a azulado ye l mximo de absorcin del colorante cambia de 465 a 595nm.
El cambio en la absorbancia a 595nm es proporcional a la concentracin de
protena en la muestra.
2. SENSIBILIDAD DE LOS METODOS ANTERIORES

3. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS METODOS ANTERIORES

3.1. MTODO DEL CIDO BICINCONNICO (BCA):
Ventajas del Mtodo del BCA

Sensibilidad comparable a la del mtodo de Lowry (0.5mg a 10mg)

La mezcla en un paso es ms fcil que en el mtodo de Lowry
El reactivo es ms estable que el reactivo de Lowry
Las sales de buffer y detergente no inico no interfieren con la reaccin
Las concentraciones del medio de reactivos desnaturalizantes no interfieren
(guanidina 4m-hcl o urea 3m)

Desventajas del mtodo del BCA:

El color no es estable con el tiempo. Se necesita controlar cuidadosamente el
tiempo entre el anlisis y la lectura en absorbancia.
Los azcares reductores interfieren con la reaccin.
Altas concentraciones de sulfato de amonio interfieren con la reaccin.
La respuesta en la absorbancia no es lineal
3.2METODO DE ADHESIN DE COLORANTE ANINICO
Ventajas de Adhesin de Colorante Aninico:
Mtodo rpido (15 minutos o menos)
Barato
Relativamente exacto para el anlisis de protenas en alimentos
Puede utilizarse para estimar los cambios en el contenido de lisina disponible de
los cereales durante su procesamiento.
No utiliza reactivos corrosivos
No mide nitrgeno no proteico
Ms preciso que el mtodo Kjeldahl

Desventaja de Adhesin de Colorante Aninico:

Las protenas difieren en su contenido de aminocidos bsicos difieren en su
capacidad de adhesin del colorante

 Se necesita elaborar curva de calibracin

Muchos componentes no proteicos tambin se pueden adherir al colorante
(almidn), metales (Ca o P) y causar errores en los resultados
3.3

METODO DE ABSORCION UV(280 nm):

Ventajas del Mtodo de Absorcin UV (280nm):

Mtodo rpido y relativamente sensible (varias veces ms sensible que el mtodo
de Biuret)
No existe interferencia del sulfato de amonio y otras sales buffer
Mtodo no destructivo
Utilizado en deteccin post-columna de las protenas
Desventajas del Mtodo de Absorcin UV (280nm):
Los cidos nuclicos tambin absorben en la regin de 280nm
El contenido de aminocidos aromticos difiere considerablemente en varias
protenas.
La solucin debe ser clara e incolora. La turbidez puede producir resultados
errticos
Se requiere un sistema relativamente puro para utilizar este mtodo
3.4. METODO DE BRADFORD:
Ventajas del Mtodo de Bradford:

Mtodo rpido (la reaccin se puede completar en 2 minutos)

Reproducible
Sensible (mucho ms que el mtodo de Lowry)
No existe interferencia de cationes como K+, Na+, y Mg+
No existe interferencia del sulfato de amonio
No existe interferencia de los polifenoles ni carbohidratos como la sacarosa
Mide protena o pptidos con una masa molecular aproximadamente igual o mayor
de 4 000 DALTONS

Desventajas del Mtodo de Bradford

El complejo protena-colorante formado puede unirse a las celdas de cuarzo

El color vara con diferentes tipos de protenas.
La protena estndar debe seleccionarse con mucho cuidado
Interferencia con detergentes.

4. INTERFERENCIAS PARA ELIMINARLAS

Mtodo del acido Bicinconnico (BCA)

En este mtodo se presentan interferencias por parte de detergentes o altas
concentraciones de sales, particularmente en microensayos. Como este mtodo
involucra la reduccin de Cu2+ a Cu+ por protenas, compuestos reductores
(diotreitol, cistena o azcares reductores), o agentes quelantes como EDTA

interfieren tambin. Para la eliminacin de estas interferencias se utiliza

precipitacin de protenas
5. FUNDAMENTO DE REACCION QUIMICA DEL METODO DE BIURET:
La presencia de protenas en una mezcla se puede determinar mediante la
reaccin del Biuret. El reactivo de Biuret contiene CuSO 4 en solucin acuosa
alcalina (gracias a la presencia de NaOH o KOH). La reaccin se basa en la
formacin de un compuesto de color violeta, debido a la formacin de un complejo
de coordinacin entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del
nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos.
La reaccin debe su nombre al biuret, una
molcula formada a partir de dos de urea (H 2N-CONH-CO-NH2), que es la ms sencilla que da positiva
esta reaccin, comn a todos los compuestos que
tengan dos o ms enlaces peptdicos consecutivos
en sus molculas.

Reaccin:

6. FRASES R Y S DE LOS REACTIVOS A MANIPULAR:

CARBONATO DE SODIO (Na2CO3):
R36: Irrita los ojos; S22: No respirar el polvo; S26: En caso de contacto con los
ojos, lvese inmediata y abundantemente con agua y acdase a un medico.
HIDROXIDO DE SODIO (NaOH):
R35: Provoca quemaduras graves; S26: En caso de contacto con los ojos, lvese
inmediata y abundantemente con agua y acdase a un medico; S36/37/39: sese
indumentaria y guantes adecuados y proteccin para los ojos/ la cara; S45: En
caso de accidente o malestar, acdase inmediatamente al medico.
SULFATO DE COBRE (CuSO4.5H2O):
R22: Nocivo por ingestin; R36: Irrita los ojos; R38: Irrita la piel; R50: Muy txico
para los organismos acuticos. R53: Puede provocar a largo plazo efectos
negativos en el medio ambiente acutico; S2: Mantngase fuera del alcance de los
nios; S22: No respirar el polvo; S60: Elimnese el producto y su recipiente como
residuos peligrosos; S61: Evtese su liberacin al medio ambiente. Recbense
instrucciones especficas de la ficha de datos de seguridad.

 TARTRATO SDICO (C4H4O6Na2):

Este producto no est includo en el ndice de sustancias peligrosas con su nmero
de ndice CE correspondiente.
Na2WO4.H2O:
R22: : Nocivo por ingestin.
H3PO4:
R34: Provoca quemaduras; S26: En caso de contacto con los ojos, lvese
inmediata y abundantemente con agua y acdase a un medico; S36/37/39: sese
indumentaria y guantes adecuados y proteccin para los ojos/ la cara; S45: En
caso de accidente o malestar, acdase inmediatamente al medico.
HCl:
R34: Provoca quemaduras; R37: Irrita las vas respiratorias; S26: En caso de
contacto con los ojos, lvese inmediata y abundantemente con agua y acdase a
un medico; S36/37/39: sese indumentaria y guantes adecuados y proteccin para
los ojos/ la cara; S45: En caso de accidente o malestar, acdase inmediatamente
al medico.
CONSULTAS PRELIMINARES (PRACTICA 4):
1. DENSIDAD DE LA LECHE DE RES:
Densidad media de 1032 g/ml
2. PUNTO ISOELECTRICO DE LA CASEINA
El pI: 4.6 a 4.7
3. FRASES R Y S DE LOS REACTIVOS A MANIPULAR:
ACETATO DE SODIO AL 0.2 M:
HCl 0.2N:
R34: Provoca quemaduras; R37: Irrita las vas respiratorias; S26: En caso de
contacto con los ojos, lvese inmediata y abundantemente con agua y acdase a
un medico; S36/37/39: sese indumentaria y guantes adecuados y proteccin para
los ojos/ la cara; S45: En caso de accidente o malestar, acdase inmediatamente
al medico.
ETANOL (C2H2OH):
R11: Fcilmente inflamable; S7: Mantener el recipiente bien cerrado; S16:
Conservar alejado de toda llama o fuente de chispas- No fumar.
BIBLIOGRAFIA:
HORMAZA. A. MANUAL DE LABORATORIO DE BIORGNICA. 2004.
PLUMMER, D. T: BIOQUIMICA PRACTICA 2da Ed. Mc Graw-Hill
BAILEY, J. L. Biochemistry of Amino Acids, 2Ed. Vol 1 y 2, ElServier. 1967