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Extrao de DNA e

anlise gentica
Valeska Portela Lima

Tipos de DNA

Procariontes
DNA

cromossomal;

DNA

plasmidial.

Eucariontes

DNA nuclear;

DNA mitocondrial;

DNA do cloroplasto.

Fundamentos de Extrao de DNA

Aplicaes de DNA
Diagnstico;
Medicina

(estudo

de

cncer;

identificao

doenas);
Processos

evolutivos
populacionais);

(filogenias,

Genoma;
Investigaes

forenses, paternidade.

estudos

Extrao de DNA

Passos principais:

Lise das membranas


plasmticas e nucleares;

Degradao de protenas;

Purificao do DNA

Extrao de DNA

Lise de membranas e degradao de


protenas:

A lise atravs de tampo de


extrao, contendo SDS, EDTA,
DTT, e mais agentes tamponantes.

O uso da Proteinase K para


degradao
das
Protenas
(rapidamente inativa as nucleases,
que degradam o DNA);

Extrao de DNA

Lise de membranas e degradao de


protenas:

A membrana solubilizada por

agentes que rompam associaes


hidrofbicas,
destruindo
a
bicamada lipdica e desnaturando
as protenas;

Extrao de DNA

Extrao em solventes orgnicos;

Purificao de DNA (eliminao de resduos


orgnicos);

Molcula de DNA no solvel em lcool

(isopropanol ou etanol), precipitando em meio


alcolico e peletizado por centrifugao;

Ressuspeno de DNA em tampo pH=7,4,

contendo RNAse para degradar o RNA;

Extrao de DNA

Conservao de DNA
de DNA a temperaturas menores de 20 C, evitando descongelamentos sucessivos;

Estocagem

Extrao de DNA
Pretratamento de Amostras:
Material

Vegetal (calos, folha, plntula): triturao


em N2 liquido, digesto em tampo CTAB, mercaptoetanol, EDTA;

Tecido

animal e fludo biolgico: digesto em


tampo TrisEDTA, SDS, NaCl, DTT e proteinase K;

Extrao de DNA
Pretratamento de Amostras:
Osso

e dente: triturao em N2 liquido,


descalcificao e lavagem com EDTA 0,5M, digesto
em SDS, NaCl, DTT e proteinase K;

Microorganismos:

Lavar e centrifugar em tampo


PBS 1X antes da digesto em tampo de extrao
(TrisEDTA, SDS, NaCl, e proteinase K);

Mtodos de Extrao

Fenol/clorofrmio;

Chelex;

Isotiocianato de Guanidina;

Minicolunas;

Kits Comerciais com slica;

Extrao Orgnica de DNA

Fenol: desnaturao das protenas


eficiente, remove as partes orgnicas;

de

maneira

Fenol-Clorofrmio: eficiente para desproteinizar e


sua ao se fundamenta na propriedade hidrofbica
das protenas que apresentam afinidade por solventes
orgnicos;

Clorofrmio: retira resduos de fenol;

Extrao Orgnica de RNA

A principal preocupao na extrao de RNA consiste


na sua degradao por ribonucleases (RNAses), que
so enzimas extremamente resistentes a vrios
tratamentos,
inclusive
trmicos
(fervura,
autoclavagem etc.);

DEPC (dietilpirocarbonato): diminuir a contaminao


com RNAses das solues, equipamentos, vidrarias e
reagentes; Bons cuidados: pipetas, vidraria, luvas.

Extrao Orgnica de RNA

Extrao usa: TRIZOL consiste num reagente pronto


para o uso no isolamento de RNA total de clulas e
tecidos;

DNAse I; O RNA total livre de contaminaes por


DNA ou protenas

Extrao de DNA em amostras forenses

Tipos de amostra de DNA

Sangue/saliva,

Urina

Smen

Tecido

Osso

Cabelo

Marcas e pontas de cigarro;

Impresses em armas de fogo;

Coleta e Preservao de Evidencias de


DNA

Antes de qualquer coleta;

Anotaes, rotular, fotografias;

Uso de Luvas de ltex!!

No sacolas de plstico!! Sacos de papel ou mini-sacolas


com boa circulao de ar;

Luz e calor so inimigos dos DNA! Refrigerar amostras.

Coleta e Referncia de DNA

Swab Bucal

Exemplo de extrao de DNA em resduos de


sangue

Mancha de sangue (3mm x 3mm) colocada em microtubo


2mL;

1. Acrescentar tampo de extrao: (10mMTris,0,1MNaCl,


40mM DTT, 10mM EDTA, 2% SDS);

2. Sais e detergentes ajudam solubilizar os componentes


da clula; DTT reduz e quebra ligaes disulfeto (entre
cistenas na protena);

3. Digerir protenas com proteinase K

Extrao de DNA

4. Fenol/Clorofrmio/lcool isoamlico (25/24/1)


at formar uma soluo turva;

5. Centrifugar at formar duas fases (13000rpm);

6. Fase aquosa conter DNAprotenas, lipdeos; e


outros interferentes hidrofbicos ficaro na fase
orgnica;

7. Protenas so separadas na interfase;

8. Fase aquosa removida e o DNA isolado por


microcolunas (microcon) ou precipitao em
etanol;

9. Estocagem em gua ou tampo TE;

Fase Aquosa
(DNA)
Interfase
(protenas)
Fase orgnica
(lipdeos

Extrao em Chelex 100

Chelex uma resina de intercmbio catinico


utilizado para anlise de PCR. Testes demonstraram
ter rendimento elevado em 6 X do que a extrao
fenol-clorofrmio;

Procedimento onde no so realizadas digesto de


protenas e extrao de DNA;

Chelex 100

Resina Chelex um copolmero


divinilbenzeno estireno contendo pares
inicos iminodiacetatos;

Seletividade por ctions divalentes so


muito mais altos do que ctions
monovalentes (~5000 a 1);

Suspenso 5% tem pH entre 10 e 11.

Vantagens do Chelex

Processo simples realizado s em um microtubo;

Combinao de suspenso alcalina e ebulio


quebra a membrana celular liberando o DNA;

Os metais fortemente quelantes os removem da


suspenso celular. Removendo inibidores hemo e
tambm outros ctions divalentes, os quais
catalisam a quebra enzimtica;

Extrao Chelex

Procedimento:

1. Amostra (sangue) suspendida em Chelex 5% e incubar


por 30min a 56C;

2. Levar a ebulio por 8min, este procedimento lisa as


clulas e precipita hemoglobina;

3. Centrifugar amostra, e uma alquota do sobrenadante


utilizada para analise de PCR,

4. As esferas de intercambio inico, protenas


desnaturadas e outros interferentes sero precipitados.

Mtodo de Extrao em Fase Solida

Esferas de vidro ou slica inseridas em membranas

Isotiocianato de guanidina e Cl-, NaI ou NaClO4

Altas concentraes so usadas sob condies cidas

para quebrar ligaes entre molculas de gua & DNA;

O DNA absorvido no vidro ou membrana;

Teor do sal reduzido, e em meio alcalino, o DNA

liberado do vidro e se tornando negativo;

Separao de DNA por Adsoro em


Slica

Extrao Automatizada de DNA

Nova tecnologia com partculas magnticas (DNA IQ Promega) para


amostras forenses;

Lise de clulas com agentes caotrpicos;

DNA se liga superfcie de partculas magnticas de slica;

Separao do lisado via magntica;

Lavagem;

Liberao do DNA das partculas magnticas;

Eluio;

Dispositivos DNA IQ (Promega)

Quantificao de DNA

Qualidade da Extrao (espectrofotmetro);

Determinao da quantidade de DNA extrado;

Nucleotdeos podem ser detectado por


espectrofotometria 260nm;

Razo 260/280; para estimar a contaminao de


protenas;

1,7 a 2,0 amostra de DNA com pureza adequada. Valores


inferiores indica contaminao com protena. Um valor
superior indica contaminao com RNA;

Qualidade do DNA

Obrigada!!!