2014 - MANUAL - StepOne Showroom - RQ v1

IntroduccinaPCRenTiempoReal
SistemaStepOneTMyStepOnePlusTM
INDICE
Captulo 1: Introduccin a la PCR en Tiempo Real...........3
Captulo 2: Sistemas de deteccin para PCR en Tiempo Real.13
Captulo 3: Aplicaciones de PCR en Tiempo Real...23
Captulo 4: Sistema StepOneTM y StepOne PlusTM..34
Captulo 5: Cuantificacin Relativa (RQ) para expresin gnica...46
Capitulo 6: Ensayos TaqMan Assay on demand, Assay by design y P/P55
Anexo I: Productos recomendados para el desarrollo de experimentos de PCR en
tiempo real..69
Anexo II: Prcticas de laboratorio..74
Curso Terico-Prctico de PCR Tiempo Real y sus aplicaciones v.1.2014
CAPITULO 1
INTRODUCCIN
La reaccin en cadena de la polimerasa o PCR (por sus siglas en ingls) es un
mtodo utilizado para amplificar regiones gnicas especficas.
Ciclo1
Ciclo2
En esta metodologa se requieren los siguientes componentes:

- Templado (DNA)
- Primers, iniciadores o cebadores (Forward y Reverse)
- Buffer
- Mg2+
- Deoxinucletidos trifosfatos o dNTPs
- DNA polimerasa (Taq pol)
La reaccin se realiza en un termociclador y consta de 3 pasos:
1) Desnaturalizacin del templado dsDNA (~95C)
2) Alineamiento de los primers sobre el templado (~60C)
3) Extensin de la nueva cadena, generando un nuevo amplicn (~72C)
Ejemplo
1ciclodePCR
LaPCR
tericamente
duplicasublanco
despusdecada
ciclo
Estos tres pasos se repiten aproximadamente 40 veces, es por eso que hablamos
de ciclos. En una PCR se realizan 40 ciclos de amplificacin.
En PCR convencional o de punto final, la generacin del producto de PCR se
detecta hasta que la amplificacin ha terminado y posteriormente el amplicn es
visualizado en un gel de agarosa. Se realiza una electroforesis en un gel de
agarosa teido con bromuro de etidio.
PCR Tiempo real utiliza los mismos componentes que una PCR convencional
solo que se agrega fluorescencia a cada reaccin antes de la amplificacin.
La acumulacin del producto de PCR se monitorea mientras se lleva a cabo
la amplificacin
Analiza ciclo a ciclo los cambios de la seal fluorescente generada durante
las tres etapas del PCR
Entre mayor sea la cantidad de DNA de la muestra, menos sern los ciclos
necesarios para obtener una seal fluorescente detectable
Producto PCR
PCR
PCR
Para que la PCR en tiempo real sea un mtodo de cuantificacin necesita cumplir
con los siguientes parmetros bsicos:
Especfico: La especificidad esta dada por los primers y sonda TaqMan, que
reconocen un sitio especfico de secuencia
Exacto: Veracidad del valor medido en una muestra
Preciso: Presenta poca dispersin en los datos obtenidos, es decir, es
reproducible, muestras de igual concentracin darn siempre mismo valor
Amplio rango dinmico: Ventana de cantidades en la que el blanco puede

ser medido con exactitud y precisin
Sensible: Una sola molcula de DNA puede ser detectada por PCR en
tiempo real. La seal fluorescente obtenida es significativamente mayor al
ruido de fondo o background
Cintica de amplificacin del DNA en una PCR

La amplificacin por PCR tiempo real sigue una cintica exponencial en donde se
pueden distinguir tres fases: geomtrica, lineal y estacionaria
Cantidad de DNA
2n
Log Target DNA
Theoretical
Real Life
Cycle
Nmero de Ciclos
Fase Geomtrica: Durante esta fase todos los reactivos de la reaccin se
encuentran en abundancia; en esta etapa la eficiencia de amplificacin bajo
las condiciones experimentales es muy cercana al 100%. En esta fase la
cintica de amplificacin tiene un comportamiento 2n en donde a partir de una
molcula de DNA se generan 2 molculas de DNA.
Fluorescent
signal (log)
Geometric
2n
PCR cycle number
Fase Lineal: Durante esta fase los primers, dNTPs y/o la enzima comienzan
a ser factores limitantes. Adems, la generacin de pirofosfatos y el
decaimiento de la actividad enzimtica afectan la eficiencia de amplificacin
de manera constante, por lo que no es posible llevar a cabo un ensayo
cuantitativo en esta parte.
Linear
Fluorescent
signal (log)
PCR cycle number
Fase Estacionaria o Plateau: en esta fase se detiene la amplificacin, la

cantidad de producto obtenida es constante sin importar cuantos ciclos ms
se prolongue la reaccin.
Plateau
Fluorescent
signal (log)
PCR cycle number
Durante la fase geomtrica, la eficiencia de amplificacin es cercana al 100% y por

lo tanto es posible predecir la cintica de amplificacin mediante una ecuacin
matemtica que evale la cantidad de templado inicial.
Dadas estas condiciones, la ecuacin que describe la cintica de amplificacin
considerando la cantidad de templado inicial y la eficiencia de amplificacin es:
P= T*(1 + E)n
P= Cantidad de producto generado a n ciclos
T= Cantidad de templado inicial
E= Eficiencia de amplificacin
n= Nmero de ciclos
Debido a que en la fase geomtrica se mantiene la eficiencia de amplificacin y
esta es del 100%, podemos convertir la variable E a una constante=1. La ecuacin
se reduce a:
P= T*2n
Sin embargo, lo que se quiere obtener no es la cantidad de producto final sino la
cantidad de templado inicial as que despejando las variables obtenemos:
T= P
2n
La grfica que representa la cintica de amplificacin de una PCR en tiempo real

se conoce como Amplification Plot. En esta grfica observamos, en el eje de x el
tiempo o los ciclos y en el eje de y observamos la intensidad de fluorescencia
(Rn).
Baseline o lnea base son los ciclos iniciales de la PCR en donde el cambio en la
seal de fluorescencia es mnimo.
Para efectuar los ensayos de cuantificacin, dentro de la fase geomtrica es
necesario definir el punto de intensidad de fluorescencia o umbral de deteccin
(Threshold), en el cual todas las muestras puedan ser comparadas entre s.
El threshold se establece basndose en la fluorescencia del background y
equivale a 10 veces la desviacin estndar de la media de emisin de la lnea
base.
Finalmente, al ciclo en el cual cada muestra consigue llegar a este umbral de
deteccin, se le conoce como CT (threshold cycle, ciclo de umbral de deteccin).
De esta forma, el CT es un nmero fraccional que indica cuantos ciclos le tom a
cada muestra generar una cantidad suficiente de fluorescencia para llegar al
umbral de deteccin.
El valor de CT es inversamente proporcional a la cantidad inicial de templado y es
el fundamento para calcular la cantidad de mRNA o DNA. Mientras mayor cantidad
de DNA se encuentre en una muestra, menor nmero de ciclos requerir para
alcanzar el umbral de deteccin, diferencias en un CT indican el doble o la mitad
de cantidad de templado inicial.
2048 copias
P= T*2n
T
16
8
4
2
1
P
n ## inicial de copias
2048 23 20,000 copias
2048 24 10,000 copias
2048 25
5,000 copias
2048 26
2,500 copias
2048 27
1,250 copias
Referencia Pasiva
Todas las master mixes de Applied Biosystems incluyen como referencia pasiva el
fluorforo ROX.
Esta referencia pasiva tiene la finalidad de:
Normalizar entre diferentes reacciones
Compensa variaciones de volumen entre pozo y pozo
El fluorforo ROX provee una referencia interna contra la cual el fluorforo
reportero (FAM, VIC, SYBR Green, etc) puede ser normalizado.
El uso de un fluorforo como referencia pasiva disminuye los valores de
desviacin estndar que se presentan entre rplicas, esto tiene mayor importancia
cuando se trata de aplicaciones cuantitativas.
36 rplicas analizadas CON
ROX
36 rplicas analizadas SIN

ROX
Muestra 1
FAM
Fluorescencia
Muestra 1
Muestra 2
FAM
ROX
Fluorescencia
Muestra 2
FAM
FAM
x
x
ROX
Fluorescencia
Fluorescencia
A) Al analizar la fluorescencia total del reportero FAM la muestra 1 aparenta tener un mayor
valor (observe los crculos azules) que la muestra 2; B) Para normalizar se introduce la
referencia pasiva, de forma que los valores de FAM se presentan con respecto a ROX. As, se
puede concluir que las dos muestras tiene el mismo valor de fluorescencia normalizada (ver
crculos de igual tamao).
Los instrumentos de Tiempo Real de Applied Biosystems de forma automtica

estn programados para detectar la fluorescencia de ROX como referencia pasiva,
sin embargo se puede desactivar esta funcin.
ROX ayuda a:
Disminuir desviaciones estndar entre rplicas
Control de la reaccin:
Evaporacin
Picos de fluorescencia
Burbujas
Master mix o target no agregado
10
Diferencias de precisin entre PCR de Punto Final y Tiempo Real

Utilizando esta tecnologa es posible calcular la concentracin inicial de templado
incluso en muestras que analizadas por PCR de punto final aparentan tener la
misma concentracin.
De igual forma mediante PCR de tiempo real se puede discriminar con precisin
muestras que en PCR de punto final se observan de diferente concentracin, pero
que al analizar la regin geomtrica de la reaccin se ven indiscutiblemente de
misma concentracin. Estas observaciones descalifican an ms el uso de
ensayos de PCR de punto final para ensayos de cuantificacin.
Actualmente, PCR Tiempo Real es el mtodo ms confiable para cuantificacin.

Cumple con los parmetros bsicos de especificidad, exactitud, precisin, amplio
rango dinmico y sensibilidad. Adems, de que sirve para mltiples aplicaciones y
no requiere de mtodos posteriores de anlisis como electroforesis.
11
Trminos comnmente usados en PCR Tiempo real
12
CAPITULO 2
Sistemas de Deteccin
Los primeros ensayos efectuados en PCR Tiempo Real fueron reportados por R.
Higuchi y cols. en 1993, en este estudio usaron bromuro de etidio como agente
intercalante, utilizaron un termociclador modificado que permita irradiar las
muestras con luz ultravioleta y detectar la fluorescencia mediante una cmara
CCD. Con esta tcnica se efectuaron los primeros ensayos de PCR en tiempo
real, sin embargo tena muchas desventajas, la baja sensibilidad del bromuro de
etidio, la falta de especificidad y adems el riesgo a la salud que involucra trabajar
con este agente.
Posteriormente, se describieron diferentes agentes detectores o reporteros que
pueden utilizarse para PCR Tiempo Real.
Las caractersticas que los reporteros deben cumplir son:
9 Sin efecto en la reaccin de PCR
9 Sensible
9 Aumento de la fluorescencia proporcional al incremento del amplicn
9 Seal especfica
Actualmente los agentes reporteros ms comunes, utilizados para ensayos de
tiempo real son: 1) SYBR Green, que igual que el bromuro de etidio es un
intercalante de bases de DNA y 2) Sondas TaqMan, que son fragmentos de DNA
especficos que tienen unido un fluorforo y un quencher.
SYBR Green
Sondas TaqMan
13
SYBR Green
SYBR Green es un intercalante de bases que se une al surco menor de dsDNA.
Al intercalarse y ser excitado mediante una fuente luminosa, genera una seal
fluorescente que es detectada por el sistema ptico de los diferentes equipos de
PCR tiempo real.
SYBR Green emite fluorescencia cuando est unido a
una doble cadena de DNA
Cuando el DNA es desnaturalizado SYBR Green se libera y la

fluorescencia se reduce drsticamente
En la fase de extensin los primers se alinean y se genera el

producto de PCR
Cuando la polimerizacin se completa, SYBR Green se une

resultando en un incremento neto de la fluorescencia
As, el aumento en la seal fluorescente de SYBR Green es proporcional al

aumento del amplicn.
14
SYBR Green es una molcula que se une a cualquier DNA de doble cadena,
por lo tanto puede considerarse que tiene una unin inespecfica.
Al trabajar con SYBR Green es importante realizar un proceso de validacin

posterior, con la finalidad de corroborar que slo un producto de amplificacin se
esta generando en la reaccin y que la fluorescencia registrada corresponde a ese
producto en particular y no a productos inespecficos o dmeros de primers. Esto
proceso se conoce como ensayo de disociacin, en ste la temperatura se
incrementa gradualmente hasta 95C, registrando la intensidad de fluorescencia
durante este proceso. Al incrementar la temperatura, las cadenas de DNA se
desnaturalizan gradualmente, disminuyendo la intensidad de fluorescencia
registrada, al llegar a la Tm del amplicn, la velocidad de disociacin se
incrementa drsticamente dado que el 50% del producto de amplificacin se
encuentra desnaturalizado, la curva de disociacin presentar un punto de
inflexin a esta temperatura
La grfica que se genera se conoce como curva de disociacin, curva melt o curva
melting.
Fluorescence
Temperature
60
95
La derivada negativa (dF/dT) resulta en un pico que corresponde a la temperatura

de disociacin del producto de amplificacin presente en la reaccin. Si durante la
reaccin se generaron varios productos inespecficos o dmeros de primers, estos
tendrn tambin un pico de disociacin a una temperatura diferente.
La temperatura de disociacin de un producto depende de:
- Tamao del amplicn
- Contenido de G/C
- Secuencia del amplicn
15
Una reaccin de PCR en tiempo real en la que se utiliza SYBR Green como
reportero debe validarse mediante este anlisis, se debe corroborar la presencia
de un solo pico en la grfica de disociacin para garantizar su especificidad.
Primera derivada negativa (dF/dT)
Fluorescence
Picos extra en una curva de disociacin
Fluorescence
Temperature
Cmo se mencion anteriormente, las amplificaciones no especficas y los

dmeros de primers son los que causan picos extras en este tipo de curvas.
A) Amplificaciones no especficas
Primers se unen a la secuencia incorrecta
16
Primers se unen a la secuencia correcta pero detecta gDNA y cDNA

(gDNA tiene Tm ms alta debido a los intrones)
EXON 1
cDNA
Expected peak
gDNA
2 peak at higher Tm
EXON 2
INTRON
EXON 1
EXON 2
* Se recomienda disear al menos un primer en una unin exn-exn

B) Dmeros de primers
Los Primers tienen entre s mucha homologa
Ejemplo:
TGGTGAGTTCGATACGCTA GCACTCTT
Forward primer:
Reverse primer:
ACCACTCA ATCTAGGCAATCCGTGAGAA
5
La proporcin de primer: templado es muy alto

Forward Primer
Reverse Primer
Primer Matrix
100nM
200nM
300nM
100nM
200nM
300nM
100/100
100/200
100/300
200/100
200/200
200/300
300/100
300/200
300/300
Aunque SYBR Green es el producto para anlisis de tiempo real ms econmico,

algunas veces se requiere una gran cantidad de tiempo y gasto de reactivos
durante el proceso de optimizacin.
Algunas consideraciones que debemos tener al usar SYBR Green son:
En el diseo de primers se deben evitar la formacin de estructuras
secundarias.
La temperatura de alineamiento de los primers (forward y reverse) no debe
variar ms de 1C
La concentracin final de los primers, no siempre concentraciones
equimolares funcionan por lo que se recomienda hacer matrices de
concentraciones de primers.
El tamao del amplicn debe ser de 50 a 150 nucletidos, a mayor tamao la
eficiencia de amplificacin es menor
17
Sondas TaqMan
Una sonda Taqman es un oligonucletido cuya secuencia es complementaria a la
regin central del amplicn. Tiene una secuencia de 13 a 18 nucletidos que
presenta en el extremo 5 una marca fluorescente (reportero) y en el extremo 3 un
apagador (quencher). Cuando estas dos molculas se encuentran unidas por la
sonda, toda la fluorescencia emitida por el reportero, es absorbida por el
apagador, por lo que la fluorescencia global observada es igual a cero, a este
fenmeno se le conoce como de Frster (o Fluorescent) Resonant Energy
Transfer (FRET).
Reportero
5
Quencher/Apagador
3
El ensayo TaqMan utiliza la tecnologa FRET
Excitacin
Cuando estn cerca, el dye

rojo absorbe o quenchea la
emisin del dye verde
Excitacin
Cuando el dye rojo esta lejos, el dye verde

emite fluorescencia
Theodor Frster 1948
Una sonda TaqMan debe tener una Tm de alineamiento mayor que los primers,
as, durante la etapa de alineamiento, la sonda se une a su secuencia blanco
especfica ANTES que los primers. Cuando la DNA polimerasa se une al extremo
3 del primer e inicia la elongacin, en su paso se encuentra con la sonda y la
18
degrada dada su actividad exonucleasa 5 3. Al ser degradada, libera al

reportero del quencher, y hay emisin de fluorescencia.
Dado que la fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de sonda
degradada, y esta a su vez es proporcional a la cantidad de templado generado,
este sistema permite visualizar el incremento de amplicn a lo largo de la reaccin
de PCR.
Nota importante sobre Tms de oligos

68-70C
58-60C
La Tm de la sonda debe ser varios C mayor a la Tm de los

primers (8-10 C para ensayos de qPCR).
19
Originalmente se utilizaba el fluorforo TAMRA como molcula apagadora, pero

actualmente se utilizan apagadores no fluorescentes con o sin MGB (Minor
Groove Binder).
MGB son las siglas de Minor Groove Binder. La molcula MGB se une al surco
menor del DNA, lo que confiere estabilidad a la sonda. Adems, permite el diseo
de sondas ms pequeas y que la Tm de alineamiento de la sonda sea mayor.
La utilizacin de sondas TaqMan presenta muchas ventajas en comparacin con

SYBR Green: debido a que la fluorescencia registrada corresponde nicamente a
un producto de amplificacin, la reaccin es altamente especfica.
El tercer oligonucletido (sonda) no genera ningn producto debido a que el
extremo 3 esta bloqueado por su unin con el quencher.
Otra ventaja es que no hay que hacer estandarizacin alguna pues los sistemas
TaqMan se entregan ya optimizados para su uso con protocolos universales de
amplificacin, lo que permite analizar simultneamente un gran nmero de
blancos.
20
DNA o RNA?
PCR Tiempo Real parte de DNA o cDNA, por lo tanto si lo que se analizar es
RNA, se requiere un paso extra llamado retrotranscripcin o transcripcin inversa.
La transcriptasa inversa o reverso transcriptasa es una enzima de tipo DNA
polimerasa, que tiene como funcin sintetizar DNA de doble cadena utilizando
como molde RNA monocatenario, es decir, catalizar la retrotranscripcin o
transcripcin inversa o reverso transcripcin. Esta enzima se encuentra presente
en los retrovirus.
El proceso de reverso transcripcin del RNA seguido por la PCR es conocido
como RT-PCR. Existen dos protocolos para la RT-PCR:
Protocolos disponibles RT-PCR:

1-Step
2-Step
Step1:
Convierte RNA a cDNA
Almacenamiento
En un tubo:
Convierte RNA a
cDNA
e inmediatamente
Amplifica y cuantifica
cDNA
Single
tube
Multiple
tubes
Step 2:
En un segundo tiempo y tubo
Amplifica y cuantifica cDNA
Two-Step vs. One-Step qRT-PCR

Protocolo Dos pasos: RT y PCR se realizan por separado
Ventajas:
Trabaja con un pool de cDNA y da resultados reproducibles (ej. recomendado para

estudios de expresin gnica)
Muchos blancos con poca muestra
El cDNA puede ser almacenado y usados para varios experimentos
Desventajas:
21
Mltiples pasos, mayor tiempo para resultados
Incrementa el riesgo de contaminacin
Protocolo One step : RT y PCR se realizan en el mismo tubo tubo

Ventajas:
Breve tiempo para la obtencin de resultados
Mltiples muestras con UNO o pocos blancos (ej. recomendado para deteccin de
virus)
Reduce la posibilidad de contaminacin cruzada
Facilidad con protocolos de altas cargas de trabajo (robots para manipulacin de

lquidos)
Desventajas:
El paso de RT influye en cada muestra, disminuye reproducibilidad
cDNA no puede ser almacenado
Condiciones para PCR estndar de ABI
Hot Start
T de hibridacin
y extensin
AmpErase (Uracil-NGlicosilasa)
Desnaturalizacin
Fase de coleccin
de datos
22
CAPITULO 3
APLICACIONES DE PCR EN TIEMPO REAL
De forma general las aplicaciones del PCR en Tiempo Real se dividen en dos
grandes grupos: aplicaciones cuantitativas y cualitativas.
Para cada una de ellas existe un protocolo muy simple a seguir dentro del
software SDS. Estas aplicaciones ofrecen la ventaja de facilitar el anlisis de
resultados.
Expresin Gnica (RQ)
Cuantitativas
Carga Viral (AQ)

Transgnicos (GMOs)
SDS
(Sequence
Detection
Systems)
SNPs (AD)
Cualitativas
Patgenos (+/-)
Aplicaciones Cualitativas
Anlisis de Polimorfismos
Mapeo, asociacin enfermedades polignicas y unignicas
Estudios de Gentica de poblaciones
Anlisis de Farmacogenmica
Agbio: cruza selectivas
En el anlisis de polimorfismos se busca la presencia de un SNP (single
nucleotide polymorphism). Para esta aplicacin se requiere un ensayo TaqMan
que consiste en: dos primers que delimitan el SNPs y dos sondas TaqMan, la
primera sonda reconoce el polimorfismo del Alelo 1 mientras que la segunda
sonda se une al polimorfismo del Alelo 2.
23
Homocigoto alelo 1
Heterocigoto alelo 1 + 2
= VIC
Homocigoto alelo
2
= VIC + FAM
El software de los equipo de PCR Tiempo Real tienen la posibilidad de generar

grficas de discriminacin allica.
FAM (G/G)
Ambos (G/A)
NTCs
VIC (A/A)
Tambin genera una tabla de resultados que puede ser exportada a una hoja de
clculo para ah calcular las frecuencias allicas y genotpicas:
24
Para realizar esta aplicacin requerimos los siguientes materiales:
Material a evaluar: gDNA
Cada reaccin requiere de 10-40 ng totales
Master Mix:
TaqMan Genotyping Master mix

TaqMan Universal Master Mix II
Fast Advanced Master mix
SNP-specific TaqMan Assay
Primer Forward
Primer Reverse
Sonda TaqMan Alelo 1 - VIC
Sonda TaqMan Alelo 2 - FAM
Anlisis de Presencia/Ausencia
Identificacin de patgenos en alimentos, animales o frmacos
Deteccin de una secuencia Esta presente o no?
25
Ensayos plus/minus
Dos ensayos (dplex):
Assay para la deteccin del patgeno: FAM
Assay para la deteccin de un control positivo: VIC
FAM
VIC
Patgeno
IPC
En el caso de los anlisis de presencia/ausencia, requerimos analizar la presencia

de inhibidores en la reaccin. Esto se hace a travs de un control positivo
interno o IPC (por sus siglas en ingls), ste siempre debe amplificar de lo
contrario se concluye que en la reaccin se encuentra un inhibidor. Con esto, se
asegura que los negativos son verdaderos negativos.
Patgeno
Internal Positive Control
=?
= YES
= NO
= NO AMP
Patgenos (+/-)
E. Coli +
IPC+
IPC+
E. Coli -
26
El siguiente material se requiere para realizar esta aplicacin:
Material a evaluar: DNA o RNA (depende del patgeno)
Master mix
- TaqMan Universal Master mix II
- TaqMan Enviromental Master mix
- TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix
Ensayo TaqMan que detectar la secuencia del target

sonda marcada con FAM
IPC secuencia artificial, que se agrega al cocktail
Ensayo TaqMan que detectar la secuencia del IPC sonda

marcada con VIC
Aplicaciones Cuantitativas
Cuantificacin Absoluta
Es la determinacin de la concentracin o cantidad de templado inicial
utilizando una curva estndar
El clculo se basa en una curva estndar construida a partir de los valores
de CT de diluciones seriales de una muestra de concentracin conocida

(estndar de cuantificacin).
Dentro de la curva estndar generada por el software, se interpolan los
valores de CT de muestras desconocidas y esto refleja automticamente la
cantidad o concentracin inicial del templado.
27
Analizando la curva patrn

La curva patrn es el grfico del CT de los estndares contra la cantidad inicial de
cada estndar. El software calcula la regresin lineal haciendo el mejor ajuste
entre los puntos de la curva patrn. La frmula para el clculo de la regresin
lineal es la siguiente:
CT = m [log (Qty)] + b
En donde m es la inclinacin de la recta (pendiente), b es el intercepto de la recta,
y Qty es la cantidad inicial de DNA. Los valores asociados con el anlisis de
regresin pueden ser interpretados as:
Pendiente
Indica la eficiencia de amplificacin. Una pendiente cercana a -3.3 indica una
eficiencia de amplificacin ptima, prxima al 100%. Existe un lmite aceptable de
pendiente para cada sistema, determinado durante los experimentos de validacin
de los mismos.
Valor de R2 (Coeficiente de Correlacin)
Un valor de R2 0.99 indica un ajuste muy cercano entre la regresin lineal de la
curva patrn y los valores individuales de CT de las muestras patrn. Si el valor de
R2 es < 0.98 verificar lo siguiente:
La cantidad de la muestra digitada en el well inspector en cada pozo
corresponda a los puntos de la curva patrn
Si la dilucin serial de los patrones de DNA fue realizada correctamente.
El nmero de reacciones para las muestras desconocidas (al menos 2)
Falla en las reacciones de la curva patrn
Debido a efectos estocsticos, las reacciones de la concentracin ms baja
en los estndares resultan en los CT ms variables, esto puede afectar la
regresin lineal de la curva patrn.
Intercepto
Indica el valor esperado de CT de una muestra con una cantidad de 1.
Carga viral Qu necesitamos?
Material a evaluar: DNA o RNA de muestras desconocidas
Master Mix
- TaqMan Universal Master Mix II
- TaqMan Fast Advanced Master Mix
- TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix
Estndar de cuantificacin (RNA/DNA)
28
Cuantificacin relativa
Comparacin cuantitativa de una secuencia blanco, normalizada con una
referencia interna y comparada contra un calibrador
Para estos estudios de expresin gnica se requieren por lo menos dos genes:
- Gen de inters (Target)
- Gen normalizador (endgeno, housekeeping, mantenimiento)
- Un gen normalizador es aquel que se expresa constitutivamente en
todos los tipos de muestra que hay dentro de nuestro experimento
Ejemplos ms comunes:
18s
Beta-Actina
GAPDH
Ciclofilina
HPRT
GUS
Para efectuar este anlisis es posible utilizar una curva de calibracin estndar
o el mtodo de CT.
29
Curvas estndar:
Cuantificacin
Relativa
Alta precisin
Mayor gasto de reactivos
Se realizan curvas estndar para cada gen
en cada experimento
Delta Delta Ct (Ct comparativo)
Buena aproximacin
Mtodo ms publicado
*Los dos genes necesitan tener la misma
eficiencia de amplificacin
Menor costo
No se requieren curvas estndar para
cada experimento
En el caso de la curva estndar el mtodo es similar al de cuantificacin

absoluta, solo que en cuantificacin relativa la cantidad de DNA obtenida se
refiere a DNA o RNA total y no a copias de la secuencia especfica. Una vez
obtenidos los valores mediante esta tcnica, se normaliza con respecto al
control endgeno y posteriormente se compara con el calibrador elegido.
Mtodo 1: Curva Estndar
18s
Insulina
6420.6
4171.4
10,000
202.3
10,000
Sin Tx Ct
Con Tx Ct
74.6
1000
Con Tx Ct
Sin Tx Ct
100
1000
100
10
10
Ct
Ct
1
Cantidad Relativa
Cantidad Relativa
30
18s
Insulina
Q.normalizado
SinTxQ.
74.6
6420.6
0.012
ConTxQ.
202.3
4171.4
0.048
Escogeruncalibrador:ej,muestrasintratamiento
Calibrador Calibrador:
0.012 0.012 = 1
Tratada Calibrador:
0.048 0.012 = 4
Conclusin:Lamuestracontratamientoexpresa4xmsinsulinaquelamuestrasin
tratamiento
En el caso del mtodo CT o Ct comparativo, primero es necesario construir
una curva de rango dinmico para el gen blanco y el control endgeno, y
obtener el CT (CT target - CT control endgeno) para cada uno de los puntos.
Este CT se grafica contra la concentracin de cada uno de los puntos, y la
lnea obtenida debe tener una pendiente menor o igual 0.1, este primer paso se
conoce como validacin y es necesario para comprobar que la eficiencia de
amplificacin de ambos genes (endgeno y blanco) es la misma y es cercana al
100%.
Una vez validado el uso de este mtodo para los genes de inters (blanco y
endgeno), entonces se puede aplicar directamente la frmula 2-CT.
31
Ejemplo de clculos de Ct comparativo:

Expresin de c-myc en diferentes tejidos
cMyc
35
30
25
20
cMyc
15
10
5
0
Cerebro
Rin
Hgado
32
Pulmn
Expresin gnica Qu necesitamos?

Material a evaluar: mRNA o cDNA de muestras
desconocidas
Master Mix
TaqMan Universal Master Mix II
TaqMan Gene Expression Master Mix
TaqMan Fast Advanced Master Mix

Ensayo TaqMan que detectar la secuencia del gen
normalizador
33
CAPITULO 4
StepOneTM y StepOnePlusTM
Esta familia de sistemas de deteccin de secuencias por PCR en tiempo real se
compone de dos instrumentos, las principales diferencias entre ellas se muestran
en la siguiente figura.
Instrumento
Fuente de
# de
Filtros Velocidad
iluminacin pozos
Bloque
Veriflex
StepOne
LED
48
Stnd / Fast
No
StepOne
Plus
LED
96
Stnd / Fast
Caractersticas en comn
La principal caracterstica de estos instrumentos es que ofrecen la ventaja de
poder usarse sin la necesidad de encontrarse conectados a una computadora.
Cuentan con una pantalla tctil (touchscreen) desde donde se puede lanzar la
corrida en el programa adecuado. Para encenderlo simplemente se usa el
interruptor localizado en la parte trasera del equipo, el proceso de inicio toma
alrededor de 10 minutos. Sin embargo para apagar el equipo es necesario primero
apagar desde la pantalla y despus en el interruptor.
34
Estos equipos son llamados de plug and play porque su instalacin es muy
sencilla y es realizada por el usuario. Para hacer la instalacin el equipo se
acompaa de una gua rpida (Quick card) que paso a paso dirige al usuario.
StepOne: Desempaque el equipo

Conecte
Prenda el equipo
Ponga la hora, fecha y nombre del equipo en el touchscreen
Los equipos llegan calibrados de fbrica, slo se requiere que hagan una corrida
de verificacin con una placa de RNAsa P. Esta placa llega con el equipo y se
debe almacenar a -20C hasta su utilizacin.
Los equipos StepOneTM y StepOnePlusTM tienen la capacidad de hacer corridas en

velocidad estndar o rpida (Fast). Esto es por que tienen diferentes velocidades
de cambio de temperatura (ramp rate) para cada modalidad: en la modalidad
estndar la velocidad es de 1.6 C/seg, mientras que en la modalidad FAST es
de 2.2C/seg. Las corridas estndar tienen una duracin de poco menos de 2
horas, las corridas FAST solamente 40 minutos.
35
En cuanto a los consumibles plsticos se emplean tubos denominados fast que

tienen una capacidad mxima de 100 L o 0.1 mL. Para el StepOne se emplean
placas de 48 pozos y para el StepOne Plus de 96 pozos, en ambos casos las
placas se cubren con covers o adhesivos pticos. Tambin se pueden usar tiras
de 8 tubos o tubos individuales. Los volmenes de trabajo recomendados son 10
l como mnimo y 30 l como mximo.
Placa + cover de 48 pozos
Placa + cover de 96 pozos
Tubos
separados o
tiras de 8
tubos + tapas
Bloque VeriFlexTM
El equipo StepOne Plus cuenta con un bloque de 96 pozos que adems se
subdivide en 6 regiones de 16 pozos cada una. Estas 6 regiones pueden hacerse
independientes, con temperaturas diferentes. Cabe mencionar que entre dos
regiones adyacentes puede haber una diferencia de hasta 5C.
Para poder usar el bloque VeriFlexTM con temperaturas diferentes, nicamente se

programa desde el software como se describe a continuacin. Desde el submen
Set up, se elije la pestaa assign targets and samples, una vez ah se debe
cruzar la casilla Enable VeriFlex blocK y de esta forma el bloque queda
habilitado. De forma automtica se delimitan 6 zonas independientes con lneas
rojas.
36
Lneas que delimitan las

zonas independientes
La modalidad del bloque VeriFlexTM habilitado, proporciona la ventaja de trabajar a

diferentes temperaturas, lo que es muy conveniente para usuarios que tengan
protocolos ya establecidos con primers de diferentes temperaturas de
alineamiento.
Sistema ptico
Los equipos StepOne y StepOne Plus difieren en la capacidad de percibir colores.
El equipo StepOne puede discriminar tres colores (fluorforos FAM/SYBR Green,
VIC/JOE y ROX), mientras que la versin PLUS adicionalmente percibe TAMRA o
NED, esto de acuerdo a la longitud de onda a la cual emiten su fluorescencia.
Photodiode
3 filtros StepOneTM
4 filtros StepOnePlusTM
Emission filter wheel
Emissions
Blue LED
37
StepOne Plus
Ausente en StepOne
Colecta de datos
Cuando el instrumento no se encuentra conectado a una computadora, la colecta
de los datos se realiza de forma muy sencilla a travs de una memoria externa
USB. Para hacerlo, una vez que termina la corrida se oprime el botn data
collection, a continuacin el instrumento solicitar una memoria USB, se vuelve a
dar click en el mismo botn y se inicia la descarga de datos.
Calibraciones y Mantenimiento en general

Como parte de los cuidados que se le deben dar al instrumento para un ptimo
desempeo, se deben realizar peridicamente las calibraciones. A continuacin se
describe cules son stas y cada cuanto tiempo deben realizarse.
38
Calibracin Espacial. Cada 18 meses

Calibracin Background. Mensual
Calibracin Espectral. Cada 18 meses
Limpiar la superficie del equipo. Semanal
Para realizar las calibraciones es necesario seguir una serie de pasos muy
sencillos desde el software y contar con el kit de calibracin
- Step One Real Time PCR system spectral calibration kit, NP 4371433
- Step One Plus Real Time PCR system spectral calibration kit, NP 4371435
para el StepOnePlus).
CALIBRACIONES
Espacial: Determina el rea de exposicin de la placa a la CCD.
Background: Evala la seal fluorescente del sistema y la elimina de
la reaccin de PCR.
Espectral o Pure Dyes: Analiza el espectro que cada fluorforo emite
en cada uno de los filtros.
Sacar la placa apropiada de su bolsa de aluminio
Dar vortex y centrifugar.
Antes de iniciar es necesario esperar a que el kit se encuentre a temperatura

ambiente y proceder:
A1
39
1.- Para la calibracin espacial se debe usar la placa #1, se coloca en el

instrumento con la posicin A1 a la izquierda y al fondo.
2.- En el Software seleccionar Instrument, despus Instrument Maintenance
Manager. Aqu dar click en Spatial y despus en Start Calibration.
3.- Cuando se abra la ventana de dilogo seleccione: The calibration plate is
loaded into the instrument, clic en Next.
4.- Espere a que el equipo complete la calibracin.
5.- Confirme el status de la calibracin
a) Passed: Contine con el siguiente paso
b) Failed: Repita la calibracin y/o contacte a Applied Biosystems.
6.- Click en Finished
7.- Guardar la calibracin, click en Yes.
Para continuar con la calibracin Background, se emplea la placa Background
del kit de calibracin y se siguen pasos muy similares, nicamente en el panel de
navegacin de Maintenance Manager se selecciona Background, los pasos
siguiente se mantienen igual. Espere a que se complete la calibracin.
Confirme el status de la calibracin
b) Failed: Repita la calibracin con la misma placa, si el problema persiste
entones repita la calibracin con una nueva placa preparada con agua limpia
grado Biologa Molecular (30 L por pozo) y sellada con un cover ptico. Si an
as el problema contina se debe proceder a limpiar el bloque pozo por pozo con
etanol al 95% o bien con una solucin 0.6% de hipoclorito.
Gua para limpiar el bloque

En cada pozo se deben pipetear 30 L de la solucin elegida (etanol 95% o hipoclorito 0.6%). El
lquido se dispensa y se retira con la pipeta 3 veces. Al terminar esta operacin con todos los
pozos se deben secar con un pauelo libre de pelusa (kimwipes).
En el resultado de la calibracin background se debe ver un espectro uniforme,

esta es la seal de fluorescencia de fondo que proviene del bloque mismo y que el
instrumento resta de los valores de fluorescencia obtenidos durante la corrida.
Cada lnea del espectro observado corresponde a cada pozo.
Una vez que la calibracin pase es necesario guardarla.
40
La ltima de las calibraciones es la espectral o tambin llamada pure dyes.

Aqu se emplean las placas 1 y 2. Nuevamente los pasos son prcticamente
iguales, en Instrument maintenance manager se debe elegir System Dye
Calibration, a continuacin Start Calibration y aqu se abre un dilogo: Plate 1 is
loaded into the instrument, hay que dar click en Next, Start Run y hay que
esperar a que se termine esta parte de la calibracin. Al trmino hay que retirar la
placa 1 y colocar la 2 y continuar con el resto de la calibracin.
Confirme el status de la calibracin
b) Failed: Revise la orientacin de la placa y del dye empleado.
Revise que el espectro de los fluorforos coincida con las imgenes a
continuacin, d click en Finish y guarde la calibracin haciendo click en Yes.
Espectros observados en la calibracin espectral
Si desea calibrar un fluorforo diferente a los existentes, lo nico que debe hacer
es:
Preparar una placa con 30L por pozo de la concentracin deseada del
fluorforo en cuestin.
En el software elegir Instrument maintenance manager, en el panel de
navegacin hacer click en Dye
Click en Customer Dye
Click en Start Calibration
Click en New Dye
Complete la ventana del nuevo fluorforo con los datos nombre, longitud de
onda, tipo (si es quencher, reportero o ambos), click en close
Seleccione The custom dye plate is loaded into the instrument, y click
en Next.
41
D click en Start Run y espere a que el equipo complete la calibracin.
En cuanto al mantenimiento general no olvide mantener el equipo libre de polvo,

por esto es que se recomienda limpiarlo una vez por semana. Dependiendo de las
condiciones de humedad del sitio, tambin se puede recomendar cubrir el
instrumento con una funda apropiada cuando no se encuentre en uso.
Experimento de verificacin con RNAsa P

Materiales requeridos
Placa de verificacin rpida del instrumento TaqMan RNasa P.
Guantes libres de polvo
Gafas de seguridad
Centrifuga con adaptador para placa de reacciones
Cundo ejecutar el experimento con RNasa P?
Despus de instalar el sistema o hacer calibraciones.
Despus de mover el instrumento a otro lugar.
Cuando sea necesario confirmar el funcionamiento del instrumento
StepOne y dependiendo de los requisitos regulatorios de su laboratorio.
Propsito del experimento
Este experimento verifica el desempeo del instrumento StepOne. La placa
RNasa P est precargada con los reactivos necesarios para la deteccin y
cuantificacin de copias genmicas del gen humano RNasa P (una sola copia del
gen que codifica para una porcin de la enzima RNasa P).
Cada pozo contiene:
1X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG
Primers de RNasa P
Sonda especfica marcada con el fluorforo FAM
Una plantilla de concentracin conocida de ADN genmico humano.
La figura de abajo ilustra la distribucin de las poblaciones estndar y
desconocidas en la placa de RNasa P. La placa RNasa P contiene cinco grupos
duplicados de estndares (1250, 2500, 5000, 10,000 y 20,000 copias), dos copias
de poblaciones desconocidas (5000 y 10,000 copias) y tres pozos de control
negativo.
42
Despus de la ejecucin, el programa StepOne :

1. Genera una curva estndar desde el ciclo (CT) de valores del umbral
promediados de los estndares de los grupos replicados.
2. Calcula con la curva estndar la concentracin de las dos poblaciones
desconocidas.
3. Calcula lo siguiente para evaluar el desempeo del instrumento StepOne:
[(CopyUnk2) 3(_CopyUnk2)] > [(CopyUnk1) + 3(_CopyUnk1)] donde:
CopyUnk1= Nmero de copias promedio del grupo desconocido #1
(poblacin de 5,000 copias)
CopyUnk1 = Desviacin estndar del grupo desconocido #1 (poblacin de
5,000 copias)
CopyUnk2 = Nmero de copias promedio del grupo desconocido #2
(poblacin de 10,000 copias)
CopyUnk2 = desviacin estndardel grupo desconocido #2 (poblacin de
10,000 copias)
El instrumento StepOne pasa el experimento RNasa P si mantiene desigualdad
y el instrumento exitosamente distingue entre 5,000 y 10,000 copias con un
porcentaje de confiabilidad del ms del 99.7 %.
Instrucciones para realizar el experimento
1. Saque del congelador la placa TaqMan RNasa P de verificacin rpida.
Permita que alcance la temperatura ambiente del laboratorio (aprox. 5 minutos).
2. Squela de su empaque.
3. Mezcle en el vortex la placa por 5 segundos.
4. Centrifguela por 2 minutos a <1500 rpm.
IMPORTANTE! La placa de reaccin debe ser bien mezclada y centrifugada.
5. Confirme que el lquido est en el fondo de cada pozo. Si no es as, centrifugue
nuevamente a mayor velocidad y por ms tiempo.
43
Empiece la ejecucin
1. Si el programa StepOne abri automticamente el cuadro de dilogo de
ejecucin del RNasa, vaya al paso 2. De lo contrario, abra el instalador como
sigue:
a. Seleccione Instrument Instrument Maintenance Manager
b. En el administrador de mantenimiento del instrumento, seleccione en la
columna de navegacin RNasa P.
c. Haga clic en Start RNasa P Run.
2. En la pantalla de configuracin del instalador de ejecucin del RNasa P,
seleccione
The RNasa P plate is loaded into the instrument.
3. Haga clic en Next.
4. En la pantalla de ejecucin del instalador del RNasa P, haga clic en Start Run.
Analice el experimento
Revise los datos para confirmar los resultados del experimento.
Nota: Antes que el programa StepOne complete la ejecucin del RNasa P,
automticamente analiza el experimento y muestra los resultados en pantalla de
anlisis.
1. En la pantalla de anlisis del instalador del RNasa P, confirme el estatus de la
ejecucin:
Passed (pasado): El instrumento StepOne pas la ejecucin de RNasa P.

Vaya al paso 5.
Failed (fallado): El instrumento StepOne fall la ejecucin del RNasa P.
Vaya al paso 2 para revisar el experimento y detectar valores atpicos.
Si la ejecucin ha fallado, el anlisis automatizado ha podido incluir valores

atpicos que causaron el fracaso del anlisis inicial. Los errores experimentales
podran causar que algunos pozos no amplifiquen suficientemente o no
amplifiquen en lo absoluto.
Estos pozos tpicamente producen valores de CT que difieren significativamente
del promedio para los pozos asociados replicados. Si estos datos alejados
(valores atpicos) se incluyen en los clculos se pueden producir resultados
errneos.
2. En el diagrama de amplificacin (amplification plot), seleccione CT vs. Well del
men desplegable sobre los tipos de diagramas (plot type).
3. Confirme la uniformidad de cada poblacin replicada en la placa de reaccin
(control, estndar y desconocida) al hacer la comparacin de las agrupaciones de
valores CT:
a. En el diseo de la placa, seleccione todos los pozos que contienen 10,000
copias de poblacin desconocida (los pozos de las columnas 1, 2, 6, 7 y 8 y las
filas D, E y F).
44
b. En el diagrama, confirme que los CTs para la poblacin replicada son

equivalentes.
Nota: Los nmeros del eje de x del diagrama corresponden a los pozos de la placa
de reaccin de 48 pozos. Empezando con el pozo A1, los pozos estn numerados
de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo.
c. Si hay un valor atpico en la poblacin, seleccione el pozo correspondiente en la
distribucin de la placa, despus haga clic en Omit (omitir) para quitar el pozo del
anlisis.
IMPORTANTE! Para cumplir con las especificaciones de instalacin, puede omitir
hasta dos pozos con valores atpicos, bien de la poblacin duplicada o hasta
cuatro valores atpicos del total de pozos de la placa RNasa P. Si hay demasiados
valores atpicos, ordene otra placa RNasa P y repita el experimento.
d. Repita los pasos 3a al 3c para cada poblacin replicada (controles
desconocidos, estndar, y negativos) en la placa de reaccin.
4. Haga clic en Reanalyze (analizar de nuevo) para analizar el experimento sin los
valores atpicos. Si el estatus del experimento RNasa P Run es Failed (fallado)
despus de ejecutar los pasos 2 al 4, repita el experimento RNasa P con una
nueva placa diferente. Si el problema continua, contacte a Applied Biosystems.
5. Revise la curva estndar:
a. Seleccione la pestaa Standard Curve (curva estndar).
b. Confirme que el valor de R2 es mayor o igual a 0.990.
Nota: Si el valor de R2 es menor que 0.990, repita el experimento RNasa con una
nueva placa. Si el problema continua, contacte a Applied Biosystems.
6. Haga clic en Finish (finalizar), haga clic en Yes (s) cuando se pida guardar el
experimento.
45
CAPITULO 5
Cuantificacin Relativa (RQ) para expresin gnica
Por definicin, cuantificacin relativa es la comparacin cuantitativa del cido nucleico
blanco con respecto a una muestra de referencia o calibrador.
Los resultados se expresan como un cambio en el nmero de veces que un mRNA se
expresa en una muestra con respecto al calibrador. Este cambio puede ser positivo o
negativo, ya que el calibrador por definicin siempre tiene un valor de 1 o bien 100%.
Existen dos mtodos para realizar la cuantificacin relativa

Con curva estndar
Mtodo Ct comparativo (Delta Ct)
Cualquiera de estos mtodos, requiere del uso de dos blancos para analizar. Uno de ellos
es el blanco experimental, mientras que el segundo es un gen de expresin constitutiva (se
le conoce tambin como normalizador, housekeeping, control o endgeno). Este gen
constitutivo debe tener un patrn de expresin constante en las condiciones
experimentales que se estn analizando. Los ms comnmente empleados son GAPDH,
-Actina y RNA ribosomal (rRNA 18S) entre otros.
A continuacin se presenta una lista de trminos de uso comn en la cuantificacin relativa
usando PCR en tiempo real:
Amplicn
Fragmento de DNA amplificado durante la PCR.
Calibrador
Muestra usada como base o referencia para los clculos, su

valor es de 1 100%. La expresin del gen blanco en el resto
de las muestras se calcula en funcin del valor obtenido en el
calibrador.
Se trata de un tejido, ensayo, tiempo, tratamiento o condicin
experimental.
Control Endgeno
(housekeeping)
Gen de control interno. Est presente en todas la muestras

analizadas. Esta referencia activa permite normalizar la
cuantificacin del RNAm blanco, as se eliminan diferencias
debidas a concentracin inicial o carga.
Ejemplos son 18S, GAPDH, Actina, HPRT.
Estndar
Muestra de concentracin conocida que se usa para realizar la

curva estndar
Curva Estndar
Curva realizada con diluciones seriales de una muestra de

concentracin conocida.
Rango Dinmico
Rango de las concentraciones (mnimo a mximo) o de

cantidades iniciales de la muestra, que un ensayo particular es
capaz de detectar
Eficiencia de
Amplificacin
Tasa a la cual se produce un amplicn de PCR. Comnmente

se expresa como un valor en porcentaje
46
Eficiencia de Amplificacin en una reaccin de PCR

La eficiencia de amplificacin es la tasa a la cual se genera el amplicn, comnmente se
expresa como un valor de porcentaje. Si un amplicn particular duplica su cantidad durante
la fase geomtrica de la amplificacin, entonces ese ensayo tiene una eficiencia del 100%.
Amplificacin geomtrica.
Asumiendo eficiencia del 100%

Ciclo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Cantidad relativa
2
4
8
16
32
64
128
256
512
1024
20
1048576
30
1.07E+09
40
1.1E+12
Amplificacin geomtrica.
Asumiendo eficiencia del 85%
PCR= 2n
n=nmero
de ciclos
Ciclo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Cantidad Relativa
1.85
3.4225
6.331625
11.71351
21.66999
40.08948
74.16553
137.2062
253.8315
469.5883
20
220513.2
30
1.04E+08
40
4.86E+10
XN= X0[1+E]n
No se cumple que en cada

ciclo se duplique la
cantidad de amplicn y no
se pueden aplicar las
mismas frmulas.
La pendiente de una curva estndar se emplea comnmente para estimar la eficiencia de

amplificacin en un experimento de PCR en tiempo real. A partir de diluciones seriales
(1:2, 1:5, 1:10) de un stock de concentracin conocida se hace la amplificacin de un
blanco especfico
Entre los factores que pueden alterar la eficiencia de amplificacin de un producto de PCR
se encuentran:
Preparacin de la reaccin (pipeteo)
Calidad del templado (mtodo de extraccin de cidos nucleicos)
Presencia de inhibidores (protenas, SDS, fenol, cloroformo, carbohidratos etc)
Diseo de los primers (Tm, estructuras secundarias, dimerizacin de primers)
Condiciones de termociclado.
Concentracin de reactivos.
Tamao del amplicn (a menor tamao, mayor eficiencia)
Validacin
La eficiencia de amplificacin de un diseo particular debe ser validado. El mejor mtodo
para validar es una curva estndar.
47
Curva estndar. La amplificacin de un blanco especfico (gen), a travs de diluciones seriales

hechas a partir de una muestra de concentracin conocida genera varias lneas, tres por cada
dilucin (ya que cada punto se hace por triplicado). Entre cada dilucin existe una separacin que
deriva del efecto de dilucin, mientras ms diluido se encuentra cada punto le toma mayor nmero
de ciclos alcanzar el umbral (threshold).
Cuando la eficiencia es del 100%, se obtiene un incremento de 10 veces la cantidad del

amplicn cada 3.32 ciclos durante la fase exponencial de la PCR. NOTA: Recordar que al
partir de un stock de concentracin conocida, se sabe con exactitud la cantidad de cido
nucleico en cada punto de la dilucin
Es la pendiente que resulta de esta grfica la que se toma en cuenta para estimar la
eficiencia de amplificacin. Mientras que un valor de pendiente de -3.32 equivale a
reaccin con 100% de eficiencia, valores ms negativos que ste (p. ej. -3.9), indican una
eficiencia menor al 100% lo que podra deberse a la presencia de un inhibidor. Por otro
lado pendientes ms positivas (p. ej. -2.5), pueden atribuirse a la calidad de la muestra o
bien a problemas de pipeteo.
La frmula por la cual se puede calcular la eficiencia a partir del valor de pendiente de la
curva estndar es:
E = (10 -1/pendiente -1) x 100
La estimacin precisa de la eficiencia de una reaccin de PCR depende de un conjunto de
variables: Reactivos, preparacin experimental, calidad de la muestra, etc.
48
VALIDACIN
Verificacin de que los dos genes son amplificados con la misma

eficiencia, para poder ser comparados entre s
Proceso que slo se hace una vez al inicio del proyecto
Evaluacin del rango dinmico: Anlisis en EXCEL
Dos curvas estndar con
m= -3.3 10%
Eficiencia amplificacin = 100% 10%
R2= 0.99
Validacin de eficiencias de dos genes:
A-F = Ct1
B-G = Ct2
C-H = Ct3
D-I = Ct4
E-J = Ct5
A
F
B
C
Ct
E
J
Target
Normalizer
[Template]
El gen de inters debe tener la misma eficiencia de

amplificacin que el gen endgeno usado para normalizar
(referencia activa).
Ct = Ct
gen inters
- Ct
gen endgeno
gen que nos

interesa
cuantificar
gen de expresin constitutiva

cuyos niveles no cambian en las
condiciones experimentales
usadas
49
-0.1 Slope 0.1
A-F = Ct1
Ct
B-G = Ct2
C-H = Ct3
Ct1
Ct2
Ct3
Ct4
Ct5
D-I = Ct4
E-J = Ct5
Dilution point
Cuantificacin relativa de Expresin gnica: Diseo Experimental y Anlisis

Antes de iniciar, es necesario definir qu mtodo de cuantificacin cubre mejor sus
necesidades: AB soporta dos mtodos de cuantificacin relativa. Mtodo con Curva
Estndar y el mtodo de CT comparativo. A continuacin se discuten las ventajas de cada
mtodo.
Mtodo 1: Cuantificacin Relativa con Curva Estndar

Ventaja: Este mtodo prcticamente no requiere validacin ya que no es necesario
que el blanco y el gen de control endgeno, tengan la misma eficiencia de

amplificacin.
Consideraciones y aplicaciones: Este mtodo requiere que en cada placa de
reaccin se incluyan una curva estndar, por lo tanto requiere MAS REACTIVOS y
ESPACIO. Este enfoque genera datos de alta precisin, ya que los resultados
cuantitativos de muestras desconocidas son interpolados desde la curva estndar.
Considere este mtodo cuando est analizando un bajo nmero de blancos dentro de
un pequeo nmero de muestras, as como tambin si est usted buscando cambios
muy discretos en los niveles de expresin.
En el caso de la curva estndar el mtodo es similar al de cuantificacin

absoluta, solo que en cuantificacin relativa la cantidad de DNA obtenida se
refiere a DNA o RNA total y no a copias de la secuencia especfica. Una vez
obtenidos los valores mediante esta tcnica, se normaliza con respecto al
control endgeno y posteriormente se compara con el calibrador elegido.
50
Mtodo 1: Curva Estndar
18s
Insulina
6420.6
4171.4
10,000
202.3
10,000
Con Tx Ct
74.6
1000
Con Tx Ct
Sin Tx Ct
100
1000
100
Sin Tx Ct
10
10
Ct
Ct
1
Cantidad Relativa
Cantidad Relativa
18s
Insulina
Q.normalizado
SinTxQ.
74.6
6420.6
0.012
ConTxQ.
202.3
4171.4
0.048
Escogeruncalibrador:ej,muestrasintratamiento
Calibrador Calibrador:
0.012 0.012 = 1
Tratada Calibrador:
0.048 0.012 = 4
Conclusin:Lamuestracontratamientoexpresa4xmsinsulinaquelamuestrasin
tratamiento
En el caso del mtodo CT o Ct comparativo, primero es necesario construir
una curva de rango dinmico para el gen blanco y el control endgeno, y
obtener el CT (CT target - CT control endgeno) para cada uno de los puntos.
Este CT se grafica contra la concentracin de cada uno de los puntos, y la
lnea obtenida debe tener una pendiente menor o igual 0.1, este primer paso se
51
conoce como validacin y es necesario para comprobar que la eficiencia de

amplificacin de ambos genes (endgeno y blanco) es la misma y es cercana al
100%.
Una vez validado el uso de este mtodo para los genes de inters (blanco y
endgeno), entonces se puede aplicar directamente la frmula 2-CT.
52
Ct comparativo (ddCt)
Sin Tx
Tx 1
Tx 2
Cttarg.
targ.
Ctnorm.
norm.
dCt
ddCt
2(-ddCt)
26.1
23.8
22.8
16.7
16.0
17.7
9.4
7.8
5.1
0
-1.6
-4.3
1
3
20
Se necesita normalizar los datos para compensar

las diferencias entre muestras
Cttarg.
targ.
Sin Tx
Tx 1
Tx 2
26.1
23.8
22.8
Ctnorm.
norm.
-16.7
-16.0
-17.7
dCt
=
=
=
9.4
7.8
5.1
ddCt
2(-ddCt)
0
-1.6
-4.3
1
3
20
Esto se hace restando: Cttarget Ctnormalizer.
Escoja una muestra de referencia, reste el valor de

Ct en todas las muestras
Sin Tx
Tx 1
Tx 2
Cttarg.
targ.
Ctnorm.
norm.
dCt
ddCt
26.1
23.8
22.8
16.7
16.0
17.7
9.4
7.8
5.1
0
- 9.4
- -9.4
1.6
4.3
- -9.4
2(-ddCt)
=
=
=
1
3
20
Primero, normalice la muestra vs ella misma (referencia - referencia).

Despus, normalice todas las muestras con la referencia (muestras
desconocidas referencia).
53
Calculo Final ddCt

Valor de cuantificacin relativa (RQ)
Sin Tx
Tx
Tx
1
2
Cttarg.
targ.
Ctnorm.
norm.
dCt
ddCt
2(-ddCt)
26.1
23.8
22.8
16.7
16.0
17.7
9.4
7.8
5.1
0
-1.6
-4.3
1
3
20
Finalmente, convertir a: 2-ddCt.
RQ
Sin Tx
Tx 1
Tx 2
54
CAPITULO 6
Assay on demand (AoD), Assay by design (AbD) y Primers &
Probes
Ensayos TaqMan
Existen tres formatos disponibles de ensayos TaqMan:
Assay on Demand, ensayos para varias especies (humano, rata y ratn, C.
elegans, S. cerevisiae, D. rerio, etc) previamente diseados, validados y
ajustados a un formato de tubo nico. Garantizados
Assay by Design o Custom Assays, el usuario manda su secuencia,
Applied Biosystems disea, sintetiza y enva sondas y primers ajustados a un
formato de tubo nico
ABI PRISM Primers and Probes, el usuario disea su propio ensayo y

solicita sntesis de primers y sondas TaqMan de acuerdo a su diseo
Assay on Demand (AoD)
Son ensayos pre-diseados, validados y ajustados a un formato de tubo nico.
Existen ensayos disponibles ms de 23 especies entre las que se encuentan:
humano, rata, ratn, M. mulatta (Rhesus), D. rerio (pez cebra), G. gallus (pollo), S.
scrofa (cerdo), A. thaliana, D. melanogaster, C. elegans, O. sativa (arroz), G. max
(soya), perro, bovinos, conejo, caballos, entre otros.
+ 1,200,000 ensayos prediseados
19 especies
Son ensayos diseados para las condiciones universales de amplificacin:

Permite el anlisis de mltiples blancos simultneamente
Mxima sensibilidad en el rango dinmico ms amplio
Donde iniciar la bsqueda?
En la pgina de Internet: www.lifetechnologies.com/ordertaqman
55
La pgina que se despliega le permitir acceder a una serie de criterios para

limitar su bsqueda de los ensayos, deber indicar el tipo experimento que desea
llevar a cabo: Gene Expression, el tipo de ensayo: All Gene Expression Assays
y adems indicar la especie: Humano, rata, ratn, etc.
56
El resultado de la bsqueda desplegar diferentes opciones de ensayos, estos diferirn

en la regin del gen donde han sido diseados, as como la longitud del amplicn.
Cada ensayo tienen un Assay ID nico

Genus-species
Number
Assay suffix
Al seleccionar el link de Assay ID (el nombre clave del ensayo marcado en azul) podr
conocer a detalle otras caractersticas del ensayo, como la longitud que tiene, las clonas
de NCBI que identifica y en cada clona en que base comienza el amplicn; de este modo
usted podr determinar cul es el ensayo ms adecuado para cubrir sus necesidades.
57
Detalles del ensayo
Para solicitar el ensayo de su eleccin, enve el Assay ID que corresponda a este,

conservando la cantidad de guiones bajos que aparezcan en l, por ejemplo:
Hs03046964_s1
Y enve tambin el Nmero de Catlogo, ejemplo:
4331182
El sufijo del Assay ID, es decir, las letras posteriores al guin bajo indican el tipo
de cido nucleico blanco hacia el que esta dirigido, es decir, la localizacin del
ensayo.
_m
Se refiere a un ensayo cuya sonda identifica un punto de unin exn-exn
en un gen. No identifica DNA genmico solo RNA mensajero.
_g
Se refiere a un ensayo cuya sonda esta dirigida a un punto de unin exnexn (mRNA) pero podra detectar DNA genmico si esta presente en la muestra.
_s
Se refiere a un ensayo cuyos primers y sonda estn diseados dentro de un
solo exn de tal forma que invariablemente detectar DNA genmico.
_mH, gH sH
El ensayo fue diseado sobre un transcrito que pertenece a
una familia con alta homologa en la secuencia. Los ensayos son diseados para
obtener entre 10 Ct y 15 Ct de diferencia entre el gen blanco especfico y el gen
con la secuencia homloga ms cercana. An as un ensayo detectar el
58
transcrito blanco con una sensibilidad o discriminacin de entre 1000 a 30000

veces mayor que el gen con la secuencia homologa ms cercana.
_u
Se refiere a un ensayo cuyos primers estn cada uno separados por un
exn. Este ensayo puede detectar DNA genmico, transcritos sin splicing o con
splicing parcial. La sonda reside completamente dentro de uno de los dos exones
o potencialmente dentro de un exn entre ambos primers. Este tipo de ensayos es
poco comn, ejemplo: Hs0192287_u1.
El nmero de catlogo cambiar dependiendo de la escala de sntesis disponible
para este ensayo, para seleccionar la escala de sntesis y el fluorforo con el cual
ir marcada la sonda, d click en la muesca localizada en la parte superior
derecha justo abajo del nmero de catlogo, se desplegar una ventana con las
opciones de tamaos y los fluorforos disponibles para este ensayo.
Algunos de los nmeros de parte disponible son los siguientes:
59
Assay by design (AbD) o Custom Assay

Diseo personalizado sobre una secuencia enviada por el usuario. Applied
Biosystems disea, sintetiza y enva sondas y primers ajustados a formato de tubo
nico. Y se mandan para utilizarse con las condiciones universales de
termociclado.
El flujo de trabajo para este formato es el siguiente:
Seleccionar secuencia
BLAST
Enmascarar (N) polimorfismos, regiones no
Usuario
deseadas o conservadas
Dar formato en File Builder y

enviar el archivo
Diseo y sntesis del ensayo

Control de calidad
Applied Biosystems
Envo de ensayo
60
IMPORTANTE!: La calidad de los resultados depende de la calidad de la secuencia

enviada.
Cmo debe ser la secuencia enviada?
Tamao recomendado 300 - 600 pb (secuencias menores limitan las posibilidades

de ensayos)
Secuencia nica (analizada por BLAST)
RNAm maduro (sin intrones) o gDNA
Dar formato en File Builder
Proceso de enmascaramiento
Al seleccionar la secuencia se debe realizar un BLAST (alineamiento), con el objetivo de
determinar que la secuencia a enviar sea una sola secuencia, si se trata de la bsqueda
de una secuencia comn a diferentes cepas, organismos o genes en estudio.
Se debern enmascarar con una N los polimorfismos y/o regiones no deseadas (que no
deben ser usadas para generar sobre ellas el ensayo).
61
Secuencia enmascarada:
La secuencia enmascarada tiene que tener formato en File Builder.

Este software es de licencia libre y se puede adquirir en la pgina de la
compaa: www.appliedbiosystems.com
Se recomienda utilizar el wizard. La primera pantalla que se despliega es de datos, llene
los campos con la informacin solicitada, al terminar de click en next, y seleccione el tipo
de ensayo que desea que se disee: expresin gnica o genotipificacin.
Seleccione la escala de sntesis (nmero de reacciones) en que desea recibir su ensayo

que vendr en formato de nico tubo, ya estandarizado en cuanto a las concentraciones y
temperaturas de amplificacin. Estas escalas aparecern como siguen, en cada caso:
GX
SNPs
62
De un nombre a su secuencia (no exceda de 10 caracteres) con este ser etiquetado su

ensayo. Copie la secuencia de cualquier tipo de archivo (texto, fasta, word, gene bank)
puede auxiliarse con las teclas Ctrl + C.
En el caso de ensayos para expresin gnica los nicos caracteres que se permiten son:
A,G,C,T y N. En el caso de ensayos para SNPs los caracteres vlidos son: A, G, T, C, N,
*, [, / y ], por lo tanto su mutacin deber reportarse como [A/G] o la sustitucin
correspondiente. En el caso de Inserciones-deleciones (mximo de 6 bases) se pondr la
secuencia que podra estar seguida de la diagonal (/) y luego un asterisco (*): [ATGCGT/*]
En File Builder se debe dar al menos una coordenada, si no tiene ninguna coordenada de
inters, seleccione varios sitios a lo largo de la secuencia (junction point) o de ANY/ANY
(automtico), para asegurar un ptimo diseo:
SNP, seleccionar coordenadas a ms de dos bases de Ns (la coordenada ser el
SNP de inters).
Para expresin gnica no debe haber Ns en las 5 bases adyacentes a la
coordenada.
Si no sabe cual es la coordenada ms adecuada puede poner su secuencia previamente
en el software Primer Express y al generarse los ensayos usted sabr cual o cuales son
las zonas ms estables de su secuencia.
63
La secuencia obtenida debe enviarse por correo electrnico a su representante de ventas

o al personal de ventas internas.
Life Technologies se encarga de disear y sintetizar el ensayo (primer forward, primer
reverse y sonda) y lo enva en formato de tubo nico una vez que han pasado los estrictos
controles de calidad.
ABI PRISM Primers and Probes

En este formato, el usuario solicita primers (Forward y Reverse) y sondas de su propio
diseo o descritos en alguna publicacin
Las sondas se pueden disear con:
1) Los fluoroforos FAM, VIC, TET y NED en el extremo 5 y en el extremo 3 un quencher
no fluorescente con MGB
2) Sondas marcadas con FAM, VIC y TET en el extremo 5 y el fluorforo TAMRA como
quencher en el extremo 3.
En ambos casos se les pide que nos proporcionen un nmero de parte (Part number) que
depende de la concentracin.
- Sonda TaqMan con MGB:
- Sonda TaqMan con TAMRA:
Los primers tambin pueden pedirse a diferente concentracin y cada una tiene un Part
number diferente.
- Primers:
64
Para solicitar primers y sondas a la compaa se necesita que nos enven los siguientes
datos:
Primers:
Nmero de parte del primer.
4304970
Nombre del primer
PrimerForward (No ms de 16 caracteres)
Secuencia en direccin 5-3
AGATGAGTCTTCTAACCGAGGTCG (No ms de 45
caracteres)
Primer Fw y Rv
Sondas:
Nmero de parte de la sonda.
4316034
Nombre de la sonda.
Sonda TaqMan
Sondauno (No ms de 16 caracteres)
Marcaje- Secuencia en direccin 5-3
NED-TCAGGCCCCCTCAAAGCCGA (Dye-secuencia sin espacios ni nmeros,
mximo 25 caracteres)
El software Primer Express, permite disear primers y sondas propias
para expresin gnica o discriminacin allica (SNP).
Primer Express incluye por default los parmetros ptimos para el diseo de primers y
sondas, como puede ser la longitud de la secuencia, la cantidad de G/C, etc. Estas
caractersticas se resumen a continuacin:
Taqman Probe
Primer
13 nucletidos
18 a 24 mx 45 nt
Amplicones recomendados de 50 a 150 pb

Contenido de G/C entre el 30 al 80% (ideal 50%)
Evitar repeticiones consecutivas de la misma base,
especialmente repeticiones de mas de 4 Gs deben ser evitadas
Usando el Primer Express software la
Tm debe ser de 68 a 70C
Usando el Primer Express software la

Tm debe ser de entre 58 y 60C
Ninguna G en el extremo 5
Los ltimos 5 nucletidos del extremo

3 no deben tener ms de 2 Gs o Cs
65
Al abrir el software, se debe dar click en nuevo experimento y seleccionar el tipo de

ensayo que se va a realizar ok.
A continuacin, copie y pegue su secuencia, dar click en el tringulo verde.
66
Para ensayos de discriminacin allica se debe indicar el SNP utilizando cdigo IUPAC.
Por ejemplo, T/G se debe indicar como K.
67
A continuacin se despliega una lista de posibles ensayos (primers y sonda) que se

disearon con la secuencia enviada. Cada ensayo tiene un valor de penalty que se va
incrementando conforme se va alejando de los parmetros establecidos por el software.
En esta misma pantalla aparece la secuencia del primer forward, primer reverse y sonda,
as como las estructuras secundarias o dmeros que se llegarn a formar con esos
diseos.
Ests secuencias son las que nos pueden enviar para su sntesis.
68
ANEXO I: PRODUCTOS RECOMENDADOS PARA Experimentos de PCR tiempo real

TaqMan Fast Advanced Master Mix 5 mL 4444557
Master mix que incluye todo lo necesario para el uso de sondas TaqMan en todas sus
aplicaciones. Especialmente diseada para detecciones en mltiplex.
Cuenta con la ventaja de reducir el tiempo de corrida incluso en equipos Standard.
La mejor master mix actualmente !!
TaqMan PreAmp Master Mix (40 Rx) 4391128

Este master mix preamplifica pequeas cantidades de cDNA sin
introducir alteraciones en los perfiles de expresin, esto permite
que de una muestra limitada se pueda obtener suficiente material
para varios procedimientos de amplificacin.
TaqMan Gene Expression Master Mix 5 mL (200 Rx) 4369016

Master mix diseada especficamente para la cuantificacin precisa
por PCR tiempo real, particularmente en los siguientes casos
Deteccin de transcritos raros
Ensayos Dplex
Deteccin especfica de miembros de familias gnicas
Validacin de silenciamiento por RNAi y microarreglos de RNA
Nmero de reacciones calculado en base en un volumen final

de 50 l
TaqMan Genotyping Master Mix 10 mL 4371355
Especialmente diseada para ensayos de Discriminacin

allica con sondas TaqMan
Ensayos Dplex VIC y FAM
Recomendada para los experimentos de Determinacin de

nmero de copias CNV
69
Menor fluorescencia basal y mayor poder de discriminacin que otras

formulaciones
SYBR green PCR master mix
Incluye todos lo necesario para la amplificacin: enzima, SYBR green a

concentracin optimizada y referencia pasiva ROX
La versin POWER Sybr green, ofrece mayor sensibilidad para genes escasamente
representados en la muestra.
Tambin disponible en opcin Fast para amplificaciones a mayor velocidad, aunque
la curva de disociacin permanece al mismo ritmo normal
High Capacity RNA-to-cDNA Kit (50 Rx) 4387406

Este kit est diseado para realizar una reaccin de retrotranscripcin
de alta calidad de hasta 2g de RNA por reaccin.
Ventajas que ofrece:
Flujo se trabajo simple con pocos pasos de pipeteo
Tiempo de reaccin corto (0.5 a 1h)
Retro transcripcin confiable de blancos tanto abundantes

como limitados
Nmero de reacciones basado en un volumen final de 20 l.

TRI Reagent (100 mL) AM9738
Este es un reactivo completo, listo para usarse, para el aislamiento simultneo de RNA,
DNA y protenas a partir de gran variedad de muestras biolgicas.
Ventajas que ofrece:
Simple: Un solo reactivo para obtener RNA, DNA y protenas.
Productivo: Rendimiento mayores que los obtenidos en los mtodos de tiocianato

de guanidina o cesio.
70
Verstil: til para su uso en muestras humanas, de plantas, levadura, bacterias y

virales.
Flexible: Fcil de escalar, dependiento de la cantidad inicial de material y el

rendimiento deseado.
Familia RNaseZap
RNaseZap 250 ml
AM9780
RNaseZap 6 x 250 ml AM9782
RNaseZap 4 L
AM9784
Solucin completa para eliminar la contaminacin por RNAsas de vidrio y superficies
plsticas. Ideal para limpiar superficies, pipetas y equipo en general.
Incluso ha probado ser til para limpiar tubos de microfuga, sin inhibir reacciones
enzimticas posteriores.
RNaseZap remueve los altos niveles de RNAsas donde productos similares fallan.
71
CONSEJOS GENERALES PARA HACER EL ANLISIS POR PCR EN TIEMPO

REAL.
De forma general en anlisis por PCR en tiempo real se recomienda que se
agreguen reacciones de control sin amplificacin, denominados No Template
Control o NTC, por triplicado. Estos controles se constituyen con todos los
elementos de la reaccin excluyendo el DNA.
Sellado de placas con las membranas pticas adhesivas.
Las placas de plstico debern ser manipuladas siempre con guantes libres de
talco y colocadas en las bases splash free.
Una vez agregados los reactivos en la placa, se realiza el sellado:
a.
Extraer un cover ptico de la caja y ubicar la superficie brillante. El cover
no debe ser tocado en esta superficie.
b.
Doblar los extremos del cover y retirar la cubierta de papel blanco. Evitar
tocar la superficie transparente.
c.
Colocar el cover sobre la placa de plstico sin hacer presin. Asegurarse
de que quede centrada.
d.
Usando el aplicador limpio se fija el cover. Seguir la figura.
72
Cuidados generales en el manejo de reactivos

Es muy importante homogenizar los reactivos por inversin o empleando. En caso
de utilizar el vortex debe ser un pulso suave, enzimas e inhibidor de RNAasas no
se mezclar con vrtex.
Los reactivos debern ser protegidos de la luz cubrindolos con papel aluminio y
colocados en hielo.
Para homogenizar las mezclas de reactivos se puede emplear una centrfuga
dando un pulso suave.
Los reactivos debern ser pipeteados lentamente ya que son ligeramente
viscosos.
PRACTICAS DE PIPETEO QUE PUEDEN

AMPLIFICACIN Y DESEMPEO DEL ENSAYO
AFECTAR
LA
EFICIENCIA
DE
Las siguientes recomendaciones tienen la intensin de prevenir los errores ms comunes

en cuanto al pipeteo, y son las principales fuentes de error que impiden con frecuencia
alcanzar altas eficiencias de amplificacin:
Se debe tener un juego de pipetas especfico para PCR, esto favorece la
reproducibilidad de resultados y disminuye el error experimental
Calibrar regularmente las pipetas
Evitar el acarreo de gotas alrededor de la punta de la pipeta
Evitar el uso del segundo tope de la pipeta, particularmente al cargar la placa de
reaccin, ya que esto introduce una burbuja de aire debajo de los reactivos
No manipular los lquidos con la pipeta a 30, es mejor mantenerla de forma
vertical
De preferencia no manipular los stocks en su forma mas concentrada
Evitar manipular los reactivos muy fros, es mejor dejarlos atemperar
Preparar grandes cantidades (stocks) tanto de RNA o cDNA como de diluciones de
oligonucletidos y reactivos en general.
73
ANEXO II: Prcticas de Laboratorio
Protocolo de Validacin de ensayos TaqMan

Curva con factor de dilucin 1:5
El proceso de validacin tiene como finalidad probar que los productos de PCR a medir
(gen housekeeping y gen problema) amplifican con la misma eficiencia. Para hacerlo se
realizan las amplificaciones con diferentes cantidades de DNA (diluciones seriales a partir
de un stock).
1. Preparacin de la curva estndar de DNA a partir de un stock
Para la preparacin de los estndares, rotular 5 tubos eppendorf (St1, St2 St5), a cada
uno agregar 20l de agua.
Para formar el estndar 1 (St1), tomar del 5 l del stock de cDNA y agregarlos al tubo
correspondiente, homogeneizar. Para el St2 tomar 5 l del St1 y agregarlos a los 20 l de
agua, homogeneizar. Repetir estos pasos hasta formar los 5 estndares.
Dilucin serial 1:5
5l
Stock
ST1
ST2
ST3
ST4
ST5
*Cada tubo debe

tener 20l de agua
2. Preparacin de un cctel mix con todos los componentes de la reaccin

EXCEPTO el DNA
- Se preparar un cctel mix suficiente para el total de reacciones que se van a correr:
3 replicas para cada punto de la dilucin (5) = 15
1 NTC (no template control)
1 reaccin de exceso
TOTAL= 17 reacciones
- Se evaluarn dos genes en dplex, por lo tanto ambos irn dentro del mismo cctel mix.
1. cMyc (gen problema)
2. Gen endgeno (18S, GAPDH o HPRT)
Concentracin
2X
10M
10M
5M
20X
Reactivo
Master Mix
Primer Fw cMyc
Primer Rv cMyc
Sonda cMyc
Assay
(endgeno)
Agua
cDNA
Total
L por
reaccin
10
1
1
1
Volumen
final
# reacciones
1
1
5
20
74
-----17
Dividir el cctel mix en cinco tubos eppendorf de la siguiente forma:
En cada uno de los tubos agregar 46 l del coctel mix. Esto es necesario para 3
reacciones (triplicados) con un poco de exceso.
A estos mismos tubos agregar 15 l de DNA de cada dilucin. Esto es suficiente

para 3 reacciones por dilucin.
El sobrante del coctel se usar para formar los NTC. A estos slo faltar
agregarles 5 l de agua a cada uno ya en la placa
47 l
(master mix, ensayo AbD, primers,

sonda y agua)
NTC
4
3
Dispensar 20 l de la mezcla a cada pozo de la placa de reaccin de 48 pozos
NOTA: En cada paso es importante homogeneizar suavemente la mezcla ya sea con

ligeros golpecitos en el tubo o por inversin. Trabajar en hielo y no exponer
excesivamente a la luz.
Gold
Condiciones de termociclado
95C
10 min
PCR
95C
60C
3
A
B
C
D
E
15 seg
60 seg
75
Hold
40 ciclos
6
Protocolo de Trabajo para Cuantificacin Relativa

Expresin Gnica
Homogeneizar perfectamente todas las muestras y reactivos (inversin o vrtex ligero excepto enzima- y pulso en la centrfuga)
Se preparar un cctel mix suficiente para el total de reacciones que se van a correr:
- Muestras problema: 3 tejidos x triplicado (3)=9 reacciones
Tejidos: rin, hgado y pulmn
+ 2 NTC (no template control)
+ 1 exceso
TOTAL= 12 reacciones
Preparacin de Cctel Mix para las reacciones con cada ensayo.
Concentracin
2X
10M
10M
5M
20X
Reactivo
Master Mix
Primer Fw cMyc
Primer Rv cMyc
Sonda cMyc
Assay
(endgeno)
agua
cDNA
total
L por
reaccin
10
1
1
1
1
1
5
20
Volumen
final
#
reacciones
-----
12
Dividir el cctel mix en cuatro tubos eppendorf de la siguiente forma, los tubos deben ir
rotulados con el nombre de cada uno de los tejidos:
En cada uno de los tubos agregar 46 l del coctel mix. Esto es necesario para 3
reacciones (triplicados) con un poco de exceso.
A estos mismos tubos agregar 15 l de DNA de cada tejido. Esto es suficiente

para 3 reacciones.
46 l
(master mix, ensayo AbD,

primers, sonda y agua)
NTC
Rin
Hgado
Pulmn
76

El sobrante del coctel se usar para formar los NTC. A estos slo faltar
agregarles 5 l de agua a cada uno ya en la placa.
Dispensar 20 l de la mezcla a cada pozo de la placa de reaccin de 48 pozos

NOTA: En cada paso es importante homogeneizar suavemente la mezcla ya sea con
ligeros golpecitos en el tubo o por inversin. Trabajar en hielo y no exponer
excesivamente a la luz.
Condiciones de termociclado
PCR
Gold
PCR
95C
95C
60C
10min
15 seg
60 seg
77
Hold
40 ciclos
NOTAS
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
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78

2014 - MANUAL - StepOne Showroom - RQ v1

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Al trabajar con SYBR Green es importante realizar un proceso de validacin

La derivada negativa (dF/dT) resulta en un pico que corresponde a la temperatura

Primera derivada negativa (dF/dT)

Picos extra en una curva de disociacin

Cmo se mencion anteriormente, las amplificaciones no especficas y los

Primers se unen a la secuencia correcta pero detecta gDNA y cDNA

* Se recomienda disear al menos un primer en una unin exn-exn

La proporcin de primer: templado es muy alto

Aunque SYBR Green es el producto para anlisis de tiempo real ms econmico,

Curso Terico-Prctico de PCR Tiempo Real y sus aplicaciones v.1.2014

El ensayo TaqMan utiliza la tecnologa FRET

Cuando estn cerca, el dye

Cuando el dye rojo esta lejos, el dye verde

Theodor Frster 1948

degrada dada su actividad exonucleasa 5 3. Al ser degradada, libera al

Nota importante sobre Tms de oligos

La Tm de la sonda debe ser varios C mayor a la Tm de los

Curso Terico-Prctico de PCR Tiempo Real y sus aplicaciones v.1.2014

Originalmente se utilizaba el fluorforo TAMRA como molcula apagadora, pero

La utilizacin de sondas TaqMan presenta muchas ventajas en comparacin con

Curso Terico-Prctico de PCR Tiempo Real y sus aplicaciones v.1.2014

Protocolos disponibles RT-PCR:

Two-Step vs. One-Step qRT-PCR

Trabaja con un pool de cDNA y da resultados reproducibles (ej. recomendado para

Muchos blancos con poca muestra

El cDNA puede ser almacenado y usados para varios experimentos

Mltiples pasos, mayor tiempo para resultados

Incrementa el riesgo de contaminacin

Protocolo One step : RT y PCR se realizan en el mismo tubo tubo

Breve tiempo para la obtencin de resultados

Reduce la posibilidad de contaminacin cruzada

Facilidad con protocolos de altas cargas de trabajo (robots para manipulacin de

El paso de RT influye en cada muestra, disminuye reproducibilidad