UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

MANUAL PRACTICO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

DOCENTE: Dra. Mara Auxiliadora Alarcn Perasso

JUSTIFICACIN
El tipo de Microorganismo que se encuentre en un alimento o producto, depender de la
forma en que estos se han elaborado, transportado, almacenado o preparados para su
consumo. Para detectar la presencia y nmero de estos en los alimentos, se aplican
tcnicas y procedimientos establecidos por una normativa nacional o internacional.
A travs del Anlisis Microbiolgico, se puede determinar la causa de descomposicin
de un producto, para lo cual se identifica el grupo o grupos de microorganismos
responsables, o bien establecer la presencia de microorganismos patgenos en alimentos
contaminados responsables de enfermedades transmitidas por estos y que son
consideradas como un problema de salud que afecta a la poblacin.
El Qumico Farmacutico como profesional contribuye en el desempeo de las
actividades relacionadas con la Industria Alimentaria en general y con la Microbiologa
de los Alimentos en particular, por lo tanto durante su formacin profesional es
necesario que adquiera las competencias bsicas para desarrollar las metodologas
analticas que le permitan discernir los riesgos microbiolgicos potenciales en los
distintos tipos de alimentos as como tambien establecer las medidas pertinentes que
aseguren la calidad de los productos.

OBJETIVOS GENERALES
Adquirir los conocimientos y desarrollar las habilidades necesarias para realizar el
anlisis microbiolgico de los alimentos, aislando e identificando los microorganismos
que puedan contaminarlos, a travs de una participacin activa, responsable,
comprometida y tica.

OBJETIVOS PARTICULARES
1.- Realizar las determinaciones microbiolgicas de indicadores de la calidad sanitaria,
microorganismos patgenos y patgenos emergentes de algunos alimentos.
2.- Aplicar los criterios necesarios para interpretar los resultados obtenidos y la toma de
decisiones a la luz de las normas ecuatorianas vigentes.
3.- Evaluar a travs del anlisis microbiolgico la inocuidad y la calidad sanitaria de un
alimento o producto alimenticio.

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FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

PRCTICA #

TITULO DE LA PRCTICA Bioseguridad en el laboratorio de Microbiologa de

Alimentos

3.- FUNDAMENTACIN TEORICA.

Bioseguridad
La seguridad biolgica o bioseguridad, es la aplicacin del conocimiento, de las tcnicas
y de los equipos necesarios para prevenir la exposicin del personal, del rea de
laboratorio y del medio ambiente a agentes potencialmente infecciosos o biopeligrosos.
Agentes Biopeligrosos
Son todos aquellos agentes biolgicos y materiales que son potencialmente peligrosos
para los seres humanos, los animales y las plantas. Entre ellos podemos citar: bacterias,
virus, hongos, parsitos, productos recombinantes, alergenos, priones, etc.
Riesgo Microbiolgico
El Riesgo Microbiolgico se encuentra presente cada vez que se realiza una actividad
prctica en el Laboratorio, donde se requiera la manipulacin de cultivos de
microorganismos los cuales pueden alcanzar concentraciones muy elevadas y pueden
llegar a provocar una infeccin si no son manipulados adecuadamente. Para que se
produzca un accidente por un agente biolgico deben estar presente bsicamente 4
elementos: un husped susceptible, un agente infeccioso, una concentracin suficiente
de ste y una ruta de transmisin adecuada; siendo este ltimo punto el que mejor se
puede controlar en el laboratorio.
Vas de Infeccin
Los microorganismos pueden ingresar al organismo a travs de: la boca, los pulmones,
la piel (intacta o lesionada), la conjuntiva, etc. Las vas de contaminacin ms
frecuentes en el laboratorio, se dan a travs de:
La boca
Comer, beber y fumar en el laboratorio.
Realizar transferencias con pipetas sin utilizar ningn tipo de proteccin.
Transferencia indirecta de microorganismos a travs de los dedos o utensilios
contaminados (lpices, bolgrafos, etc).
La piel
Inoculacin accidental con una aguja hipodrmica u otros instrumentos punzantes o de
vidrio.
Cortaduras o rasguos.
Los ojos
Salpicaduras de materiales infecciosos.
Transferencia indirecta de microorganismos a travs de los dedos contaminados.
Los pulmones
Inhalacin de microorganismos transportados por el aire (aerosoles).

En los Laboratorios de Microbiologa de la Facultad de Qumica y Farmacia estamos

seguros que comprendiendo y teniendo conocimiento de todos estos posibles riesgos,
aprendiendo y ejecutando las tcnicas adecuadas, contribuiremos con una parte
importante e integral del proceso de educacin, as como tambien reducir el nmero de
accidentes en el laboratorio y en futuras actividades fuera de l.
NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y otros objetos
personales en el lugar que se les indique para tal fin.
Llevar puesta la bata de laboratorio en todo momento. La misma debe permanecer
completamente cerrada.
Limpiar y desinfectar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar la
Sesin prctica.
Lavar las manos con agua y jabn antes de realizar las actividades programadas, antes
de salir del laboratorio y siempre despus de manejar materiales que se sabe o se
sospecha que son contaminantes.
Trabajar cerca del mesn, adoptando una buena postura y estando fsicamente cmodo.
Llevar un calzado apropiado, preferiblemente cerrado y de suela antideslizante en las
reas de laboratorio.
Evitar llevar en el laboratorio accesorio que podran ser fuente de contaminacin (por
ejemplo joyas).
Recoger el cabello largo.
Evitar desplazamientos
indispensable.

innecesarios,

movimientos

bruscos.

Hablar

slo

lo

No comer, beber, fumar, almacenar comida, objetos personales o utensilios, aplicarse

cosmticos ni ponerse o quitarse lentes de contacto en ningn rea del laboratorio
Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de iniciar las
actividades indicadas en la prctica. Si usted tiene alguna duda, dirjase al profesor.
Mantener el rea de trabajo ordenada, libre de libros, cuadernos u objetos personales,
exceptuando aquellos equipos y materiales necesarios para la realizacin del trabajo
prctico.
Tener cuidado con el alcohol o el gas cuando manipule el mechero.
Nunca debe dejar ste desatendido.
Regresar los reactivos y equipos empleados (microscopio, mechero, etc.), limpios y de
manera ordenada a su respectivo lugar una vez finalizada la actividad. Reporte cualquier
dao de los mismos al profesor.
Colocar los materiales de vidrio contaminados en los recipientes dispuestos para tal fin,
por ejemplo: las pipetas en los pipeteros, tubos y placas de Petri en las ollas de desecho,
etc.

No usar ningn reactivo que no est debidamente identificado, verificar las etiquetas de
los mismos y estar seguro de cmo emplearlo
No devolver sustancias a sus envases originales.
Emplear la propipeta al medir lquidos. Est rigurosamente prohibido pipetear con la
boca. De igual manera las pipetas tendrn tapones de algodn para reducir la
contaminacin de estos dispositivos de pipeteo.
Realizar solamente aquellas actividades indicadas por el profesor, no llevar a cabo
experimentos no autorizados.
Reportar inmediatamente cualquier accidente al profesor (derrame de material
contaminado, heridas, quemaduras, etc.), ninguno puede ser catalogado como menor.
Reducir al mnimo la formacin de aerosoles durante la realizacin de cualquier trabajo
prctico.
Extremar las precauciones cuando se utilicen agujas y jeringas para evitar la inoculacin
accidental y la generacin de aerosoles durante su manipulacin.
Emplear tcnicas aspticas para el manejo de cultivos de microorganismos.
12.- BIBLIOGRAFIA
1.- Bioseguridad en el Laboratorio de Microbiologia y Biomedicina. 4th editions. CDC.
2.http://www.ucv.ve/fileadmin/userupload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_normas_
de_bioseguridad.pdf

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ASIGNATURA MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

PRCTICA # 2

TITULO DE LA PRCTICA: EQUIPOS Y MATERIALES USADOS EN

EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

FUNDAMENTACIN TERICA.
Conocer los materiales y equipos necesarios en un laboratorio de microbiologa.
Detallar la funcin de cada uno de los equipos y materiales en un laboratorio de
microbiologa.

1. Elementos y materiales ms frecuentes de un laboratorio de Microbiologa

Clnica

1.1. Mesas de laboratorio y fregadero

1.2. Vitrinas y armarios

1.3. Mechero Bunsen

Todas las manipulaciones deben realizarse en un radio de 10-15cm de la llama del

mechero (zona asptica).
En caso de utilizar mechero nunca se debe coger material por encima de la llama
Antes de comenzar a trabajar se procurar disponer de todo el material necesario para el
procesamiento de la muestra

Tomar las medidas necesarias para evitar la contaminacin de las muestras o/ y cultivo
por microorganismos ambientales

1.4. Gradillas

1.5. Estufa de incubacin

Es una cmara de temperatura controlada para cultivo de microorganismos.

Se utiliza para facilitar el desarrollo de los microorganismos a su temperatura ptima de

crecimiento (generalmente 35-37).

1.6. Frigorfico o cmaras refrigeradas

Se utilizan para conservar tanto materiales (medios de cultivo, reactivos) como

microorganismos.
Generalmente estn a una temperatura fija de 4C.

1.7. Congeladores
Se utilizan para la conservacin de reactivos y microorganismos a temperaturas
inferiores a 0C, llegando a -80C (los ms frecuentes son -20, -40 y -80).

1.8. Microscopio ptico

1.9. Centrfuga
Aparato que aplica sobre los tubos una fuerza centrfuga lo que permite la separacin de
los distintos componentes de la muestra mediante la precipitacin en el fondo del tubo
de las partculas en suspensin.

1.10. Cmaras de seguridad biolgica (ver practica 2)

1.11. Desionizador de agua.

La mayor parte de los trabajos que se realizan en un laboratorio de Microbiologa
necesitan la utilizacin de agua pura con el fin de evitar cualquier tipo de interferencia.
Entre otras caractersticas debe: estar exenta de materiales en suspensin o un pH
comprendido entre 5,0 y 7,5. Durante aos se ha utilizado agua destilada, en la
actualidad los destiladores se han ido abandonando para dar paso a desionizadores que
funcionan con resinas de intercambio inico. Tambin se pueden utilizar otras tcnicas
como la smosis inversa.

1.12. Contador de colonias: Es un aparato que mediante la iluminacin de la placa y

una lupa, nos permite observar con mayor nitidez las colonias y por tanto facilita su
recuento.

1.13. Balanzas

1.14. Baos termostticos: son recipientes que contienen agua y un sistema de

regulacin de la temperatura. Se utilizan para atemperar medios de cultivo o incluso
para incubar cultivos de microorganismos.

1.15. Agitador/ mezclador

vortex

agitador horizontal

1.16. Jarras de anaerobios:

Recipientes que se usan para conseguir una atmsfera libre de oxgeno para el cultivo de
microorganismos anaerobios.

1.17. Asas de siembra:

Se utilizan para sembrar. Pueden ser metlicas o de plstico, curvas o rectas (para la
siembra por picadura).

1.18. Ph-metros:

1.19. Material fungible

Placas de Petri: recipientes para la preparacin de medios de cultivo slidos

Placas de Petri con medio slido

Tubos con medio lquido

Tubos con medio slido

Pipetas de vidrio, de plstico y pipeteadores.

Pipetas

Pipeteador automtico

Pipeteador manual

Pipetas automticas (micro pipetas) y puntas de pipeta:

Se utilizan para pipetear pequeas cantidades de lquidos.
Se utilizan con puntas desechables de distinto tamao y color segn la micro pipeta.
Existen cuatro tamaos: de 0,5-2m; de 2-20 m; de 20-200 m y de 200-1000 m.

Asas acodadas o Asas de Digralsky:

Se utilizan para la extensin de microorganismos sobre la superficie de un medio de
cultivo en placa Petri.

Portas y cubres
Para realizar las observaciones al microscopio.

Vasos de precipitados y matraces

Cucharas y esptulas:
Se utilizan para pesar muestras o medios de cultivo.

rea de limpieza de material y eliminacin de residuos

Zona donde se procede a la esterilizacin mediante autoclave del material utilizado. El

material desechable se elimina y con el material reciclable se procede a la eliminacin
de residuos y lavado. De esta manera el material queda dispuesto para ser utilizado.

rea de esterilizacin
Procedimiento por el que se consigue la muerte de todos los organismos vivos y formas
de resistencia en un objeto o producto tratado.

Autoclave

Es el equipo ms utilizado.
Es un procedimiento de esterilizacin mediante calor hmedo. Se realiza en al
autoclave durante 15 20 min, segn el volumen, a 115C 121C, segn la
naturaleza del material que se desee esterilizar.
Autoclavado: es un procedimiento en el que se emplea vapor a presin (a 1 atmsfera).
Como tiene gran poder de penetracin la temperatura y el tiempo utilizados son
menores que los que se emplean con el horno Pasteur (121 C, 15-20 minutos).

Se utiliza para esterilizar: Medios de cultivo, ropa, material de plstico resistente al

calor hmedo, objetos de metal que no se alteren con la humedad y sobre todo
material de vidrio.

Horno de Pasteur: emplea altas temperaturas (160-180 C) durante un tiempo

prolongado (1.5 a 3 horas). Debido a su poca capacidad de penetracin se usa para
esterilizar vidrio y metales. Acta principalmente desnaturalizando las protenas y
secundariamente oxidando los compuestos celulares.

BIBLIOGRAFA.http://campus.usal.es/~micromed/Practicas_odontologia/unidades/labv/LabMicro/p
ractica1.html

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ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

PRCTICA # 3

TITULO DE LA PRCTICA: SISTEMA DE MUESTREO

FUNDAMENTACIN TEORICA
El muestreo de alimentos destinados al anlisis microbiolgico es la operacin que
consiste en separar un nmero determinado de muestras de un lote, remesa, partida, etc,
con el fin de obtener unos resultados analticos fiables. Se pretende con ello obtener una
muestra representativa del total.
La necesidad de un muestreo adecuado se hace patente cuando cabe la posibilidad de
que existan grmenes patgenos o sus toxinas, distribuidos de forma escasa o irregular
en un alimento o conjunto de alimentos del mismo origen. Es igualmente necesario
para saber si una remesa de productos alimentarios cumple o no las normas
microbiolgicas legales establecidas para dichos productos.
NMERO DE MUESTRAS.
Para que el muestreo tenga utilidad estadstica, se debe realizar sobre un nmero
apreciable de unidades de un lote o cualquier porcin. El nmero de muestras destinadas
a un anlisis microbiolgico est en relacin con la precisin que se debe obtener en los
resultados. Este nmero se suele fijar cuando se dispone de muchas unidades, sobre
todo en forma de lote.
Mtodo de muestreo aleatorio.- este, mtodo consiste en separar del lote un nmero de
muestras calculado previamente, utilizando la tabla de nmero al azar. Dicha tabla est
integrada por colunnas y filas de dgitos obtenidas mediante clculos estadsticos.
Normas generales para el muestreo.- como la finalidad del muestreo en
Microbiologa Alimentaria es, principalmente, obtener una muestra representativa del
alimento para su anlisis inmediato y conseguir resultados fiables sobre su estado
higinico sanitario, es necesario que el producto , en el momento de su anlisis, rena
las mismas condiciones microbiolgicas que tena al ser muestreado. Por esta razn, son
necesarias unas pautas para conseguir la muestra idnea.
4.-MATERIALES
Envases para la toma de muestras
Instrumentos para la apertura de envases
Etiquetas y material para marcar.
Equipo de esterilizacin
Refrigeracin

Lquido desinfectante.
Control de temperatura.
Esterilizacin
12.- BIBLIOGRAFIA:
Microbiologia Alimentaria. Pascual Anderson Ma. Del Rosario

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ASIGNATURA MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

PRCTICA # 4

TITULO DE LA PRCTICA ANLISIS DE SUPERFICIES

FUNDAMENTACIN TEORICA
Los Controles de superficies se realizan para asegurar la higiene de los elementos y
superficies en contacto con los alimentos procesados.
Los Controles de manipuladores de alimentos se realizan para asegurar la higiene de
los manipuladores en contacto con los alimentos procesados.
La higiene de las superficies, equipos y utensilios, es uno de los pilares donde se
asientan las buenas prcticas de manufactura y si se considera que entre el 6 y 15 % de
los alimentos producidos poseen algn tipo de contaminacin, cifra que podra
dispararse de manera imprevisible en un mercado de produccin a escala macro como lo
hacen las industrias alimenticias en la actualidad, la respuesta a estos grados de
contaminacin son varias, pero una de ellas se basa en la comprobacin de que existen
microorganismos capaces de resistir los tratamientos habituales de limpieza(Forte,
L.M.y Rebagliati, J.E.,2000).
Los microorganismos patgenos pueden pasar de un alimento a otro por contacto
directo o bien a travs de quienes los manipulan, de las superficies de contacto del aire
(CAC/RCP 1, 1997).
Una correcta higiene de los alimentos est determinada por una multitud de factores:
condiciones de obtencin de los mismos, caractersticas de los medios empleados para
su transporte, temperaturas y condiciones de conservacin, estructura de los locales
donde se manipulan, destacando entre todos ellos la higiene de las prcticas de los
manipuladores de alimentos (Prez Silva Garca, M.; Belmonte Corts, S. y Martnez
Corral, J.; 1998).
Entre los agentes etiolgicos productores de enfermedades transmitidas por alimentos
(ETA) predominan los biolgicos (Gmez, D.; Cotella, O.; Fernandez Pascua, C. y
Ameztoy, A.M., 1997); entre los cuales se destaca el gnero Salmonella.
En la industria de los alimentos Escherichia coli es un organismo de particular
importancia por su impacto en salud, y se considera que, conocindose el papel de los
reservorios, la prevalencia del organismo en las plantas procesadoras y en los alimentos
,sera fundamental establecer el significado de stos (Rodrguez; H.R.1995),. Tambin
se deberan conocer cules seran las operaciones o procedimientos en las etapas de
produccin y en las posteriores de procesamiento que facilitan o producen
contaminacin microbiana, la investigacin sobre estos organismos aportara la
informacin cientfica necesaria para sustentar programas de control de estos
emergentes.
Asimismo, la intoxicacin estafiloccica es una de las ETA ms frecuentes, con especial
preponderancia en la regin latinoamericana, y su presentacin ocurre por las
enterotoxinas producidas por numerosas cepas de Staphilococcus aureus que proliferan
en los alimentos, los estafilococos abundan en el medio y el origen de la contaminacin
por lo regular est relacionada con heridas de la piel, la nariz, la boca o la garganta de
los manipuladores, cuando se procesan an estando ya cocidos y calientes (INPPAZ /
OPS / OMS, 1997). La contaminacin cruzada entre materias primas crudas o entre
productos crudos y los ya cocidos a travs de manos, equipos o utensilios, es otra forma
frecuente de contaminacin que origina toxiinfecciones.

MATERIALES Y METODOS
MATERIALES.Caldo de peptona
Hisopos de algodn
Medios de cultivos selectivos de acuerdo al microorganismo que se investiga.
MTODO.Tcnica de frotacin con hisopo de algodn.
Si el muestreo es en una planta de alimentos, se considerar sectores bien definidos de
la planta, que se correspondan con las reas de elaboracin de alimentos, teniendo en
cuenta las etapas de produccin pre operacionales y operacionales, que al tratarse de
superficies en contacto con productos terminados para consumo directo, conllevan un
alto riesgo sanitario.
Para la toma de la muestra se utiliza la tcnica de frotacin con hisopo de algodn
humedecido en caldo peptona al 0.1 %, sobre superficies de utensilios, mesones,
equipos y manos de operarios.
Los hisopos se transportaran en tubos individuales con 10 ml de la solucin referida,
refrigerados y en un lapso no mayor a 2 horas de obtenidas las muestras, se proceder a
su procesamiento en el laboratorio.
Cada uno de los tubos conteniendo los hisopos se agitan manualmente, mediante 50
movimientos de rotacin en un dimetro de 15 cm en un tiempo de aproximadamente
10", posteriormente se procede a efectuar el aislamiento y tipificacin de especies
patgenas con especial referencia a Salmonella Sp., Coliformes totales, Escherichia coli
y Staphilococcus aureus.
RESULTADOS.UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
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REPORTE DE RESULTADOS

MUESTRA..

MTODO..

MARCA

FECHA..

RESULTADO
.

.
OBSERVACIONES

CONCLUSIONES

12.- BIBLIOGRAFIA
http://www.analizacalidad.com/arm2004-4.pdf
http://www.geocities.com/seguridad_alimentaria/meofilos.rtf
http://www2.uah.es/farmacia/programas/microbiologia/material_didactico_de _microli
mentos.htm

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PRCTICA # 5

TITULO DE LA PRCTICA: RECUENTO DE AEROBIOS

TOTALES EN QUESOS

FUNDAMENTACIN TERICA
El queso fresco es elaborado con leche sin pasteurizar, la cual es transportada
sin refrigerar hasta la quesera artesanal, es un queso con elevado contenido de
humedad, de sabor suave y un periodo de vida de anaquel corto.
El queso es considerado entre los productos que producen enfermedades alimentarias
debido a su deficiente calidad microbiolgica. El grupo de organismos mesfilos y
coliformes es utilizado en microbiologa de alimentos como indicador de contaminacin
por malas prcticas de higiene en produccin y manufactura.
Evaluar la calidad bacteriolgica del queso determina las deficiencias higinicas en la
manufactura lo cual representa un riesgo para la salud del consumidor.
MATERIALES Y MTODOS
MATERIALES.-

Medio de cultivo Plate Count

Diluyente: agua peptonada al 0.1%
Placas Petri
Tubos de dilucin
Frasco o matraz
Pipetas
Mechero Bunsen
Stomacher
Balanza
Contador de colonias
MTODO.Preparar la muestra de alimento trada segn su tipo, si es
l q u i d o h a y q u e homogenizar, si es slido hay que licuar o triturar la

mezcal por trituracin en vaso esterilizado de licuadora a una velocidad

aproximada de 14.000 rpm y en un tiempo medio de 60-90 segundos.

Luego preparamos las diluciones correspondientes, generalme nte
hacemos 6
Luego de hacer las diluciones, y de haber agregado los inculos, pasamos a agregar a
cada placa el agar Plate Count, este debe estar a 45 46 C (10 a
1 5 m L . p o r placa).
Luego hacemos la mezcla (agar + inculo).
La mezcla se realiza de la sgte. Manera: hacer rotaciones 5 veces sentido horario,
5veces de abajo arriba, 5 veces anti horario y 5 veces derecha e izquierda.
Luego esperamos que solidifique el medio y luego incubamos a 29 31 C por 24h
(dejamos una placa control).
Realizamos las lecturas a las 24 y 48 h.
Se puede realizar un cmputo de recuento estndar en placa o computo estimado de
recuento estndar en placa.
Hay que elegir placas que tengan de 30 a 300 colonias.
RESULTADOS.-

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REPORTE DE RESULTADOS

MUESTRA..

MTODO..

MARCA

FECHA..

RESULTADO

.
.
OBSERVACIONES

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFIA

http://www.analizacalidad.com/arm2004-4.pdf
http://www.geocities.com/seguridad_alimentaria/meofilos.rtf
http://www2.uah.es/farmacia/programas/microbiologia/material_didactico_de _microli
mentos.htm
THATCHER, F. S. y D. S., CLARK (1993) Anlisis
M i c r o b i o l g i c o d e l o s Alimentos. Edit. Acribia. Zaragoza.10

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PRCTICA # 6

TITULO DE LA PRCTICA ANLISIS MICROBIOLOGICO DE

AGUAS DE CONSUMO N.M.P.

FUNDAMENTACIN TERICA
Los controles microbiolgicos rutinarios para determinar la potabilidad del agua (agua
exenta de microorganismos patgenos y sustancias qumicas peligrosas para la salud),
se basan en la bsqueda de microorganismos indicadores cuya presencia nos aporte
informacin sobre la posibilidad de encontrar microorganismos patgenos.
Los microorganismos indicadores son microorganismos que generalmente se
encuentran en la materia fecal del hombre y los animales, su presencia en el agua es una
evidencia de que el agua est contaminada con materia fecal de humanos u otros
animales de sangre caliente y por consiguiente con el microorganismo patgeno.
Entre los microorganismos indicadores de la calidad del agua se encuentran los
coliformes totales. Del grupo coliformes forman parte los coliformes fecales como
Escherichia
coli,
Enterobacter,
KlebsiellaCitrobacter,entreotros.
El microorganismo utilizado como indicador es Escherichia coli y su deteccin se
puede hacer mediante pruebas sencillas como: cultivo en caldo lactosado y
determinacin del nmero ms probable (NMP) de coliformes totales y fecales o
mediante filtracin en membrana usando medios selectivos y diferenciales.
MATERIALES.Pipetas automticas
Tubos de vidrio
Campanas durhann
Cajas petri
Puntas
Bao de agua a 44.5 0,1C.
Incubadora a 35 2,0C
Horno para esterilizar material de vidrio

REACTIVOS

Caldo lauryl sulfato

Caldo Bilis verde brillante.
Caldo EC
Agar EMB
Agua de peptona
Caldo RM VP
Agar SIM
Agar Urea
Agar Citrato de Simmons
PROCEDIMIENTO
TOMA DE LA MUESTRA.- La muestra debe ser recogida en condiciones de
esterilidad, el recipiente debe ser plstico o de vidrio, estril y de boca ancha. Los
frascos ms adecuados son los de vidrio neutro con tapn esmerilado o roscado, muy
limpio y esterilizado en autoclave a 120C durante treinta minutos o en horno de Pasteur
a 180C durante dos horas. Tambin pueden utilizarse frascos de material
macromolecular con tapn roscado, esterilizados mediante etileno xido, radiaciones
gamma u otros sistemas adecuados. El tapn y el cuello del frasco se protegern con una
cubierta de papel, papel de aluminio u otro similar.
El volumen a tomar debe ser el adecuado para que en una sola muestra se puedan
efectuar simultneamente la totalidad de los anlisis microbiolgicos y estar en funcin
de la tcnica analtica a utilizar. Para los anlisis que utilicen la tcnica del NMP se
tomarn, como mnimo, 250 ml y para los que empleen la de membranas filtrantes,
como mnimo, 500 ml. La muestra debe ser representativa en relacin con su lugar de
procedencia. Las muestras se cerrarn convenientemente de formas que quede
garantizada su inviolabilidad. Rotulada con datos como: lugar de procedencia, fecha de
recoleccin, hora, temperatura, direccin, presencia cercana de contaminantes:
basureros , salidas de aguas negras, establos vertederos, mtodos de purificacin si los
hay,
nombre
del
recolector
Una vez tomada la muestra se acondicionar de modo que quede en la oscuridad,
debiendo remitirse cuanto antes al laboratorio. Es conveniente iniciar el anlisis antes de
que transcurran seis horas desde la toma de la muestra. Sin embargo, podr demorarse
su anlisis hasta veinticuatro horas cuando haya sido conservada en refrigeracin a
4C (2C).
De Grifo Una vez retirados filtros u otros accesorios se proceder a una cuidadosa
limpieza con agua o alcohol. Con el grifo cerrado se flamear el extremo del mismo,
mediante la llama obtenida con un poco de algodn empapado de alcohol y sostenido
con unas pinzas o bien una lmpara de soldar. Se abrir el grifo para que el agua fluya

abundantemente y se renueve la contenida en la tubera que la alimenta. Se destapar el

frasco esterilizado sin tocar la boca del mismo ni el interior del tapn. Todos los
movimientos debern realizarse sin interrupciones, al abrigo de corrientes de aire y con
las mximas precauciones de asepsia.
De pozos y depsitos Si se dispone de bomba de captacin se opera como se ha
indicado en el caso del grifo. Si no existe sistema de bombeo, no es posible obtener una
muestra representativa. Con esta salvedad se introducir en la masa de agua el frasco de
muestreo o un cubo lo ms limpio posible, sostenidos con una cuerda y tomando la
muestra tras haber agitado la superficie del agua con el mismo recipiente.
Tambin podrn utilizarse aparatos especiales lastrados que permiten introducir el
frasco esterilizado y destaparlo a la profundidad deseada. En estos casos debern
utilizarse frascos con tapn a presin.
Lagos, ros y lagunas En ros o cursos de agua ser preciso considerar diversos
factores, tales como: profundidad, caudal, distancia a la orilla, etc. La muestra se tomar
lo ms lejos posible de la orilla, procurando no remover el fondo y evitando los
remansos o zonas de estancamiento. Para tomar una muestra del agua de un lago o de un
ro se sujetar el frasco por el fondo en posicin invertida, sumergindolo
completamente y dndole la vuelta en sentido contrario a la corriente (ro) o
desplazndolo horizontalmente en la direccin de la boca del frasco (lago).
En manantiales naturales, o fuentes de caudal continuo, sin dispositivos de
intermitencia, se tomar la muestra directamente sin adoptar medidas especiales.
PROCEDIMIENTO.PRUEBA PRESUNTIVA
Todas las operaciones debern efectuarse en absolutas condiciones de
Asepsia
. 1. Agitar vigorosamente la muestra por lo menos 20 veces para lograr una distribucin
uniforme de los microorganismos.
2. Dependiendo del origen de la muestra y el contenido bacteriano esperado preparar
diluciones.
3. Para preparar las diluciones, con una pipeta estril tomar una alcuota de 1 mLde la
muestra original y llevarlo a uno de los tubos conteniendo 9ml de agua de peptona
estril, obteniendo de esta manera una dilucin de 10-1
4. Agitar el tubo de la dilucin 10-1y con otra pipeta estril tomar una alcuota de1 mL
y llevarlo a otro tubo con 9 mL de agua de dilucin estril para obtener una dilucin de
10-2
5. Proceder de la misma manera hasta obtener una dilucin de 10-3
O hasta donde sea necesario.
6. Inocular aspticamente con 1 mL de muestra por triplicado tubos de

Fermentacin conteniendo caldo lactosado o caldo lauryl triptosa, a partir de las ltimas
3 diluciones y conservar todas las anteriores en refrigeracin por si se requieren su
utilizacin posterior.
7. Incubar todos los tubos a una temperatura de 35 C durante 24horas.
8. Despus de 24 horas de incubacin efectuar una primera lectura para
Observar si hay tubos positivos, es decir, con produccin de cido, si el medio contiene
un indicador de pH, turbidez y produccin de gas en el
interior de la campana Durham.
9. Al hacer esta verificacin es importante asegurarse que la produccin de gas sea
resultado de la fermentacin de la lactosa, en cuyo caso se
Observar turbidez en el medio de cultivo, y no confundir con burbujas de
aire.
10. Para evitar este tipo de confusiones es recomendable revisar las
Campanas Durham antes de proceder a la inoculacin y desechar aquellos tubos cuyas
Campanas contengan burbujas de aire de alguna manera eliminar stas y as poder
utilizarlos.
11. De los tubos que en la primera lectura den positivos, ya se pueden hacer las pruebas
confirmatorias para coliformes totales y coliformes fecales.
12. En caso de no apreciarse crecimiento en el resto de los tubos, continuarn en
incubacin 24 horas ms.
13. Despus de 48 horas (2h) a partir de la inoculacin, se hace la lectura final.
14. Si pasadas 48 h tampoco se aprecia crecimiento ni produccin de gas, los tubos se
toman como negativos.
INTERPRETACIN:
Si el total de tubos son NEGATIVOS: El examen se da por terminado, reportando la
AUSENCIA DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES en la muestra analizada.
Todos aquellos tubos que den POSITIVOS para prueba presuntiva se
Anotarn convenientemente y se proceder a realizar la PRUEBA CONFIRMATORIA
para Coliformes Totales y Fecales.
PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES TOTALES:
1.A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva,
agitndolos para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos conteniendo caldo
Lactosa Bilis Verde Brillante (LBVB).
2. Incubar durante 48 3 h a 35 0.5 C.
3. Despus de la incubacin observar la presencia de turbidez y de gas.
INTERPRETACIN:
Si se observa turbidez y produccin de gas: La prueba se considera POSITIVA,
debiendo anotar el nmero de tubos positivos para
Posteriormente hacer el clculo del NMP.
Si en ninguno de los tubos se observa produccin de gas, aun cuando
se observe turbidez: Se consideran NEGATIVOS, establecindose el Cdigo 0,0,0 para
efecto del clculo del NMP
Si todos los tubos dan negativos todos dan positivos, con base en los
grados de dilucin analizados, considerar la necesidad de repetir el
anlisis a partir de grados de dilucin menores (mayores volmenes de
muestra) mayores (menores volmenes de muestra), respectivamente.
PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES FECALES:

1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva,
agitndolos para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos conteniendo caldo E.C.
(Escherichia coli).
2. Incubar durante 24 horas a 44.5 0.2 C. y despus de este perodo,
Observar presencia de turbidez y gas.
INTERPRETACIN:
Si se observa turbidez y produccin de gas: La prueba se considera
POSITIVA, de gas: La prueba se considera POSITIVA, debiendo anotar el nmero de
tubos positivos y establecer el cdigo para posteriormente hacer el clculo del NMP,
.
.3)Si no se observa produccin de gas, aun cuando se observe turbidez:
Se consideran negativos, establecindose el Cdigo 0,0,0 para efecto del
clculo del NMP.

Si todos los tubos dan negativos todos dan positivos, con base en
Los grados de dilucin analizados, considerar la necesidad de repetir el
anlisis a partir de grados de dilucin menores (mayores volmenenes de
muestra) mayores (menores volmenes de muestra), respectivamente.
VI.
CLCULOS
De acuerdo a los tubos positivos en las pruebas confirmativas para ColiformesTotales y
Fecales, establecer los cdigos correspondientes
para calcular por referencia en las tablas estadsticas el NMP de ColiformesTotales y
Fecales en 100 mL de agua.
En caso de no encontrar en las tablas la combinacin de tubos adecuada, emplear para
los clculos la siguiente ecuacin:

VII.ELABORACIN Y PRESENTACIN DE RESULTADOS.

Los resultados se elaboran de la siguiente manera
Los resultados se elaboran de la siguiente manera:
Si se han realizado diluciones, se ha de obtener una serie final con valor
cero.
A continuacin se establece el triplete de valores correspondiente a las tres
series anteriores a la del valor cero que podr ser leda en la tabla del
NMP.
Para efectos de expresar el valor obtenido basndose en 100 mL de
Muestra habr de dividirse el resultado de la tabla por el volumen real de
Muestra inoculada en cada tubo de la serie central de cada triplete
En general se tiene:

Los resultados obtenidos se expresarn de la siguiente manera:

NMP DE COLIFORMES TOTALES: __________ / 100 mL
NMP DE COLIFORMES FECALES: _________ / 100 mL
RESULTADOS.-

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
REPORTE DE RESULTADOS
MUESTRA..
MTODO..

MARCA
FECHA..

RESULTADO
.
.
OBSERVACIONES
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFA.Standard Methods for the examination of water and wastewater
http://www.umass.edu/tei/mwwp/acrobat/sm9010-40intro.PDF
www.fda-gov
www.codexalimentarius.net
www.consumaseguridad.com.es

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

ASIGNATURA MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

PRCTICA # 7

TITULO DE LA PRCTICA ANLISIS MICROBIOLOGICO DE

LECHE PASTEURIZADA N.M.P.

FUNDAMENTACIN TERICA
La leche es uno de los alimentos ms consumidos por la humanidad, por la tradicin de
los pueblos tanto por sus caractersticas organolpticas y sus propiedades nutricionales.
La composicin qumica de la leche le confiere un extremado valor en la dieta del
hombre pero al mismo tiempo se convierte en un medio excelente para e l crecimiento
incontrolado de una gran cantidad de microorganismos, que puede conducir a la
alteracin de este producto y a veces al desarrollo de patgenos (Varnam & Sutherland,
1995).
La leche por su gran cantidad de nutrientes ideales para el desarrollo
microbiano, es necesario realizarle frecuentes anlisis microbiolgicos queden una
informacin de la calidad de su elaboracin La leche es un alimento que constituye un hbitat
ideal para el desarrollo bacteriolgico, y a q u e c o n s t a d e g r a s a
e m u l s i o n a d a , u n a c o n c e n t r a c i n fisiolgica de azucares, sales, protenas, vitaminas y
minerales disueltas en agua. Los carbohidratos estn representados por la lactosa y
galactosa. Su pH es de 6.8 que es el lmite ptimo para la mayora de las bacterias. Los
microorganismos invaden la leche y la contaminan por medio del polvo de ah que pueden
desarrollarse todas las especies. El organismo que generalmente invaden
primero es el Streptococcus lactis, el cual f e r m e n t a l a l a c t o s a c o n
produccin de acido lctico principalmente. C u a n d o e l p H
baja
se
desarrollan
otras
especies
como
e l bacillus
acidophilus y el Lactobacillus casei.
A una temperatura corporal se desarrolla el enterobacter
aerogenes y la E. coli.
MATERIALES Y MTODOS
MATERIALES.-

Pipetas automticas
Tubos de vidrio
Campanas durhann
Cajas petri
Puntas
Bao de agua a 44.5 0,1C.
Incubadora a 35 2,0C

Horno para esterilizar material de vidrio

REACTIVOS
Caldo Bilis verde brillante.
Caldo EC
Agar EMB
Agua de peptona
Caldo RM VP
Agar SIM
Agar Urea
Agar Citrato de Simmons
PROCEDIMIENTO.PRUEBA PRESUNTIVA
Todas las operaciones debern efectuarse en absolutas condiciones de
Asepsia
1. Agitar vigorosamente la muestra por lo menos 20 veces para lograr una distribucin
uniforme de los microorganismos.
2. Dependiendo del origen de la muestra y el contenido bacteriano esperado preparar
diluciones.
3. Para preparar las diluciones, con una pipeta estril tomar una alcuota de 1 mLde la
muestra original y llevarlo a uno de los tubos conteniendo 9ml de agua de peptona
estril, obteniendo de esta manera una dilucin de 10-1
4. Agitar el tubo de la dilucin 10-1y con otra pipeta estril tomar una alcuota de1 mL
y llevarlo a otro tubo con 9 mL de agua de dilucin estril para obtener una dilucin de
10-2
5. Proceder de la misma manera hasta obtener una dilucin de 10-3
O hasta donde sea necesario.
6. Inocular aspticamente con 1 mL de muestra por triplicado tubos de
Fermentacin conteniendo caldo lactosado o caldo lauryl triptosa, a partir de las ltimas
3 diluciones y conservar todas las anteriores en refrigeracin por si se requieren su
utilizacin posterior.
7. Incubar todos los tubos a una temperatura de 35 C durante 24horas.
8. Despus de 24 horas de incubacin efectuar una primera lectura para

Observar si hay tubos positivos, es decir, con produccin de cido, si el medio contiene
un indicador de pH, turbidez y produccin de gas en el
interior de la campana Durham.
9. Al hacer esta verificacin es importante asegurarse que la produccin de gas sea
resultado de la fermentacin de la lactosa, en cuyo caso se
Observar turbidez en el medio de cultivo, y no confundir con burbujas de
aire.
10. Para evitar este tipo de confusiones es recomendable revisar las
Campanas Durham antes de proceder a la inoculacin y desechar aquellos tubos cuyas
Campanas contengan burbujas de aire de alguna manera eliminar stas y as poder
utilizarlos.
11. De los tubos que en la primera lectura den positivos, ya se pueden hacer las pruebas
confirmatorias para coliformes totales y coliformes fecales.
12. En caso de no apreciarse crecimiento en el resto de los tubos, continuarn en
incubacin 24 horas ms.
13. Despus de 48 horas (2h) a partir de la inoculacin, se hace la lectura final.
14. Si pasadas 48 h tampoco se aprecia crecimiento ni produccin de gas, los tubos se
toman como negativos.
INTERPRETACIN:
Si el total de tubos son NEGATIVOS: El examen se da por terminado, reportando la
AUSENCIA DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES en la muestra analizada.
Todos aquellos tubos que den POSITIVOS para prueba presuntiva se anotarn
convenientemente y se proceder a realizar la PRUEBA CONFIRMATORIA para
Coliformes Totales y Fecales.
PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES TOTALES:
1.A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva,
agitndolos para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos conteniendo caldo
Lactosa Bilis Verde Brillante (LBVB).
2. Incubar durante 48 3 h a 35 0.5 C.
3. Despus de la incubacin observar la presencia de turbidez y de gas.
INTERPRETACIN:
Si se observa turbidez y produccin de gas: La prueba se considera POSITIVA,
debiendo anotar el nmero de tubos positivos para
Posteriormente hacer el clculo del NMP.
Si en ninguno de los tubos se observa produccin de gas, aun cuando
se observe turbidez: Se consideran NEGATIVOS, establecindose el Cdigo 0,0,0 para
efecto del clculo del NMP
Si todos los tubos dan negativos todos dan positivos, con base en los
grados de dilucin analizados, considerar la necesidad de repetir el
anlisis a partir de grados de dilucin menores (mayores volmenes de
muestra) mayores (menores volmenes de muestra), respectivamente.
PRUEBA CONFIRMATORIA PARA COLIFORMES FECALES:
1. A partir de cada uno de los tubos que han resultado positivos en la prueba presuntiva,
agitndolos para homogeneizar, inocular con tres asadas tubos conteniendo caldo E.C.
(Escherichia coli).
2. Incubar durante 24 horas a 44.5 0.2 C. y despus de este perodo,
Observar presencia de turbidez y gas.

INTERPRETACIN:
Si se observa turbidez y produccin de gas: La prueba se considera
POSITIVA, de gas: La prueba se considera POSITIVA, debiendo anotar el nmero de
tubos positivos y establecer el cdigo para posteriormente hacer el clculo del NMP,
.
.3)Si no se observa produccin de gas, aun cuando se observe turbidez:
Se consideran negativos, establecindose el Cdigo 0,0,0 para efecto del
clculo del NMP.

Si todos los tubos dan negativos todos dan positivos, con base en
Los grados de dilucin analizados, considerar la necesidad de repetir el
anlisis a partir de grados de dilucin menores (mayores volmenenes de
muestra) mayores (menores volmenes de muestra), respectivamente.
VI.
CLCULOS
De acuerdo a los tubos positivos en las pruebas confirmativas para ColiformesTotales y
Fecales, establecer los cdigos correspondientes
para calcular por referencia en las tablas estadsticas el NMP de ColiformesTotales y
Fecales en 100 mL de agua.
En caso de no encontrar en las tablas la combinacin de tubos adecuada, emplear para
los clculos la siguiente ecuacin:

VII.ELABORACIN Y PRESENTACIN DE RESULTADOS.

Los resultados se elaboran de la siguiente manera
Los resultados se elaboran de la siguiente manera:
Si se han realizado diluciones, se ha de obtener una serie final con valor
cero.
A continuacin se establece el triplete de valores correspondiente a las tres
series anteriores a la del valor cero que podr ser leda en la tabla del
NMP.
Para efectos de expresar el valor obtenido basndose en 100 mL de
Muestra habr de dividirse el resultado de la tabla por el volumen real de
Muestra inoculada en cada tubo de la serie central de cada triplete
En general se tiene:

Los resultados obtenidos se expresarn de la siguiente manera:

NMP DE COLIFORMES TOTALES: __________ / 100 mL
NMP DE COLIFORMES FECALES: _________ / 100 mL
RESULTADOS.-

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
REPORTE DE RESULTADOS

MUESTRA..

MTODO..

MARCA

FECHA..

RESULTADO
.
.
OBSERVACIONES
CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFA.Norma Inem
AOAC Official Methods of analysis (Laboratorio de Microbiologia)
www.fda.gov
www.foodsafey.gov

www.consumaseguridad.com.es

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ASIGNATURA MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

PRCTICA #

TITULO DE LA PRCTICA: DETERMINACIN DE

STAPHILOCOCCUS

FUNDAMENTACIN TERICA
Los estafilococos son cocos anaerobios facultativos, son Gram positivos y se presentan
solos, en pares o racimos, no son mviles, ni esporulados; algunos biotipos son capaces
de producir una toxina altamente termoestable, as por ejemplo, Staphilococcus aureus
produce 5 toxinas, que pueden provocar severas intoxicaciones en el hombre. Su
metabolismo es oxidativo/fermentativo, es catalasa positivo y puede metabolizar una
gran variedad de carbohidratos en condiciones aerbicas, con la subsecuente liberacin
de cido, principalmente cido actico con pequeas cantidades de bixido de carbono;
en condiciones anaerobias, el producto principal de la fermentacin es el cido lctico.
Las tres condiciones necesarias para su ptimo desarrollo son: pH cercano a la
neutralidad, temperatura alrededor de 30C y ausencia de microorganismos
competitivos. Este ltimo punto es importante, ya que Staphilococcus aureus no es
competitivo en presencia de otros
microorganismos.Staphylococcus se puede encontrar en a) medio ambiente como puede
ser: aire, polvo, superficies en donde se manejan alimentos, agua, agua residual, b) en
alimentos: por ejemplo los que presentan un alto contenido proteico, como puede ser
la leche y derivados lcteos, tambin se desarrolla en aquellos alimentos que presentan
altas concentraciones de sal, uno de ellos sera el jamn; otro factor importante en los
alimentos es el pH, as tenemos en el caso de la mayonesa, sta tiene un pH lo
suficientemente bajo para inhibir el desarrollo de S.aureus, sin embargo, al diluirse y
neutralizarse en una ensalada por ejemplo, el pH asciende lo suficiente como para
permitir el desarrollo de este microorganismo enterotoxignico y finalmente c) tambin
se puede localizar en personas y animales. Estos ltimos, los animales y las personas
son los principales reservorios de estos microorganismos.
Algunas razones para determinar Staphilococcus aureus son:
Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de
intoxicaciones.
Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos, es fuente potencial de este
microorganismo enterotoxignico.
Demostrar la contaminacin postproceso, la cual es usualmente debida a contacto
humano o con superficies inadecuadamente sanitizada
MATERIALES Y MTODOS
MATERIALES.Pipetas graduadas estriles de 1 mL con tapn de algodn
(se debe utilizar una pipeta para cada dilucin) o pipetas automticas
Pipetas Pasteur estriles

Pipetas graduadas estriles de 10 mL con tapn de algodn (en caso que la muestra sea
lquida.)
Propipeta.
Varillas de vidrio de 3.5 mm de dimetro aproximadamente y 20 cm. de largo, dobladas
en ngulo recto (forma de L), estriles (se debe utilizar una por dilucin).
Utensilios estriles para manipular las muestras: cuchillos, cucharas, pinzas, tijeras,
esptulas y separador de huevo.
Vaso de licuadora estril o Bolsa para Stomacher
Motor para licuadora o Stomacher
Asa bacteriolgica
Portaobjetos
Microscopio ptico
Balanza gramera
Horno para esterilizar material de vidrio.
Autoclave
Bao de agua a ebullicin
Incubadora a 35 2C

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

4 cajas de Petri con 20.0 mL de agar Baird Parker
7 tubos de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo infusin cerebro corazn (BHI)
1 caja de Petri con 20.0 mL de agar DNA
7 tubos de 13 x 100 mm con 3.0 mL cada uno de caldo manitol
(Opcional)
1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad conteniendo 90.0 mL de agua peptonada
al 0.1% o una solucin amortiguadora de fosfatos 0.1 M de pH 7.2
3 tubos 16 x 150 mm conteniendo 9.0 mL de agua peptonada al 0.1% o una solucin
amortiguadora de fosfatos 0.1 M de pH 7.2
SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES
Colorantes para Tincin de Gram
Parafina o aceite mineral estril
(Slo si se siembra en caldo manitol)
Colorante azul de ortotoluidina 0.1M, (solamente que el medio de cultivo no contenga
este indicador)
HCl 1N, en caso de no contar con la orto toluidina
BIOLGICOS
Plasma de conejo
PROCEDIMIENTO.1. Aislamiento selectivo
1. Pesar 10.0 g de muestra en una caja de Petri estril.
2. Transferir la muestra pesada a una bolsa de Stomacher o vaso de licuadora estril.
3. Adicionar 90.0 mL de agua peptonada estril al 01% o solucin amortiguadora de
fosfatos 0.1M de pH 7.2.
4. Homogeneizar 30 segundos en Stomacher a velocidad media o 10 segundos en
licuadora a velocidad mnima.
5. Realizar diluciones decimales hasta 10-4(el nmero de diluciones est en funcin de
la procedencia de la muestra) en tubos de 16 x 150 mm
conteniendo cada tubo 9.0 mL del mismo diluyente.
6. Transferir 0.1 mL de las diluciones 10-1, 10-2, 10-3y 10-4a cajas de Petri con agar
Baird Parker.

7. Extender el volumen inoculado a cada una de las cajas de Petri con una varilla de
vidrio estril, en forma de L, iniciando a partir de la mayor dilucin (Mtodo de
inoculacin por extensin en superficie).
8. Mantener las placas en su posicin hasta que el inoculo sea absorbido por el agar,
entre 5 y 10 minutos aproximadamente.
9. Invertir las placas e incubar a 35 1 C. durante 45 a 48 h.
10. Despus de incubar, observar las colonias caractersticas de este
microorganismo en el agar Baird Parker (BP). stas se presentan como:
colonias negras, circulares, brillantes, convexas, lisas con dimetro de 1 a 2 mm,
muestran una zona circular opaca y un halo claro alrededor de la colonia.
2. Recuperacin de la cepa.
1. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias tpicas de S. aureus, si
no es posible, seleccionar las placas que contienen
concentraciones de la muestra ms diluidas, no obstante que contengan ms de 150
colonias.
2. Cuando las placas contengan menos de 15 colonias tpicas, tambin
pueden ser utilizadas y al reportar se deber agregar la nota de valor
estimado.
3. Con ayuda del cuadro 1, determinar el nmero de colonias a evaluar,
tomando en cuenta el nmero de colonias tpicas de S. aureus
obtenidas en el agar Baird-Parker: As mismo seleccionar las colonias para realizar las
pruebas cuantitativas y cualitativas; dentro de estas ltimas estn comprendidas la
coagulosa y la termonucleasa.
4. Reinocular cada una de las colonias aisladas y seleccionadas, que son
caractersticas de este microorganismo, utilizando asa bacteriolgica recta estril, en
caldo infusin cerebro corazn.
5. Incubar a 35 +1C durante 24 h.
6. Inocular e incubar en la misma forma, cepas tipo de S. aureus
ATCC 6538 y S. epidermidis ATCC 12228, como controles positivo y negativo
respectivamente de las pruebas bioqumica
Cuadro N 1. NMERO DE COLONIAS A EVALUAR DE S. AUREUS
CUENTA TOTAL DE COLONIAS COLONIAS
SOSPECHOSAS
SOSPECHOSAS EN
UNA CAJA CARACTERIZAR
REPRESENTATIVA
BIOQUIMICAMNTE
MENOS DE 50 UFC
3
51 100 UFC
5
7
101 150 UFC

3. Pruebas bioqumicas.
1. Realizar la confirmacin bioqumica del microorganismo, haciendo las pruebas de
presencia de las enzimas: coagulasa y termonucleasa.
3.1 Prueba de la presencia de la enzima coagulasa.
1. Con una pipeta estril de 1 mL, tomar 0.2 mL de la suspensin del microorganismo
que desarroll en el caldo infusin cerebro corazn, adicionar 0.2 mL de plasma de

conejo. Dicho plasma previamente diluido volumen a volumen con solucin salina
estril.
2. Incubar en bao Mara o en incubadora, entre 35 y 37 C y observar durante 6 h. en
intervalos de 1 hora; en caso de no presentarse formacin de cogulo, prolongar el
perodo de observacin hasta por 24 h.
3. Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo, tomar 0.5 mL de plasma
reconstituido y depositarlo en un tubo de 13 X 100 mm, posteriormente aadir una gota
de cloruro de calcio al 5%; se debe formar un cogulo entre 10 a 15 segundos.
NOTA
Analizar la consistencia del cogulo y registrar sta, de acuerdo con los valores del
cuadro 2.
Considerar la prueba positiva solamente si hay formacin de cogulo con un valor igual
o superior a 2 cruces.
Cuadro N 2. Interpretacin de las reacciones en la prueba de coagulasa
VALOR
CARACTERISTICAS
NEGATIVA
NO SE OBSEVA FORMACIN DE
COAGULO
1+ POSITIVA
FORMACIN
DE
COAGULOS
PEQUEOS DESORGANIZADOS
2+ POSITIVA
FORMACIN
DE
COAGULO
PEQUEO ORGANIZADO
3+ POSITIVA
FORMACIN
DE
UN
GRAN
COAGULO ORGANIZADO
4+ POSITIVA
TODO EL CONTENIDO DEL TUBO
EST COAGULADO, AL INVERTIR
ESTE TUBO EL COAGULO SE
MANTIENE EN EL FONDO DEL
MISMO.

3.2 Prueba de la enzima termonucleasa.

1. Calentar 0.3 mL. de la suspensin del microorganismo que creci en caldo infusin
cerebro corazn durante 15 minutos en bao de agua hirviendo.
2. Hacer orificios circulares en el agar DNA y colocar una gota de la suspensin
bacteriana, del punto anterior, con ayuda de una pipeta Pasteur estril. Es recomendable
incluir testigos tanto positivos (S. aureus ATCC 6538), como negativos (S. epidermidis
ATCC 12228).
3. Incubar a 352 C en cmara hmeda, durante 4 a 24 h.
4. Despus de incubar, adicionar el colorante azul de orto-toluidina 0.1M a los orificios
hechos en el agar DNA. (Existe un agar DNA que ya contiene el indicador de ortotoluidina).
5. La formacin de un color rosa brillante extendido por lo menos un milmetro
alrededor del orificio, en donde se inocul, indicar que el microorganismo posee la
enzima termonucleasa.
6. En el caso de no contar con orto toluidina, se puede utilizar HCl 1.0N como
indicador. De encontrarse esta enzima, se observa un halo transparente alrededor de la
colonia, seguido de un precipitado blanco.

3.3 Prueba de fermentacin de manitol en anaerobiosis (opcional, no lo exige la

norma). . Inocular 2 asadas en caldo manitol, de la suspensin del microorganismo que
desarrollado en el medio infusin cerebro corazn.
2. Adicionar a cada tubo de caldo manitol que ha sido inoculado, entre 0.3 y 0.5 mL de
parafina o aceite mineral estril.
3. Incubar a 35C2C por 24 h. y observar los resultados.
4. Considerar la prueba como positiva, si se presenta desarrollo y vira el indicador. Si el
medio contiene como indicador el rojo de fenol, el medio debe virar a color amarillo por
la produccin de acidez.
3.4 Prueba de la catalasa (opcional, no lo exige la norma).
1. Con una asa bacteriolgica, tomar un inculo del caldo infusin cerebro corazn
despus de su incubacin, y colocarlo sobre un portaobjetos,
2. Adicionar una o dos gotas de perxido de hidrgeno al 30%, mezclar perfectamente
bien y observar los resultados.
3. Si se presenta formacin de burbujas, se considera positiva la prueba, esto es que s
contiene la enzima catalasa. En caso de no formarse burbujas la prueba se interpretar
como ausencia de esta enzima.

RESULTADOS.-

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
REPORTE DE RESULTADOS

MUESTRA..

MTODO..

MARCA

FECHA..

RESULTADO
.

.
OBSERVACIONES

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFA.AOAC Official Methods of Analysis (Laboratorio de Microbiologia)

Bacteriological Analytical Methods On Line (BAM)
www.fda.gov
www.codexalimentarius.net
www.foodsafety.gov.
www.consumaseguridad.com.es