PROCESO HISTOLGICO

Denominamos proceso histolgico a una serie de

mtodos y tcnicas utilizados para poder estudiar las
caractersticas morfolgicas y moleculares de los tejidos.
Hay diversos caminos para estudiar los tejidos, es decir,
series de tcnicas que se utilizarn dependiendo de qu
caracterstica deseemos observar. En el siguiente esquema
se muestran los mtodos y tcnicas comnmente
empleados para el procesamiento de los tejidos para su
observacin con los microscopios ptico o electrnico. Sin
embargo, hay que tener en cuenta que existen muchas
variantes a estos "caminos" y su eleccin depender del
resultado final que queramos obtener.

Esquema del proceso histolgico.

El proceso histolgico comienza con la obtencin del tejido objeto de estudio.
En el caso de los tejidos vegetales directamente se toman muestras de los
distintos rganos que componen el cuerpo de la planta, mientras que para
los tejidos animales podemos optar por dos opciones: coger una porcin del
tejido u rgano y procesarla o procesar primero el animal completo y luego
extraer la muestra que nos interese. En cualquier caso las muestras son
habitualmente fijadas con unos soluciones lquidas denominadas fijadores,
las cuales se usan para mantener las estructuras celulares y moleculares
inalterables durante el procesamiento posterior y con una organizacin lo
ms parecida posible a como se encontraban en la muestra viva. Tambin
podemos fijar las molculas de los tejidos por congelacin rpida. Fijar un
tejido es como hacer una fotografa de dicho tejido, su estructura se
mantendr hasta su observacin. La fijacin por congelacin se emplea
cuando la fijacin qumica o los procesos histolgicos posteriores alteran las

caractersticas de la muestra que queremos estudiar, por ejemplo una

molcula sensible a dichos tratamientos.
Normalmente, tras la fijacin se procede a incluir el tejido para
posteriormente obtener secciones. Cuanto ms delgada queramos que sea
nuestra seccin ms tenemos que endurecer nuestra muestra. Esto se
consigue embebiendo el tejido con sustancias lquidas que posteriormente
polimerizarn (resinas) o se volvern consistentes (ceras). Tambin se puede
conseguir el mismo efecto mediante congelacin rpida. Cortes ms gruesos
de 40 m se pueden cortar sin necesidad de inclusin usando el vibratomo.
Los medios de inclusin no son normalmente hidrosolubles por lo que
tendremos que sustituir el agua de los tejidos por solventes orgnicos
liposolubles y posteriormente sustituirlos por el medio de inclusin.
Tras la inclusin o la congelacin se procede a cortar los tejidos, es
decir, obtener secciones. Existen diferentes aparatos de corte que permiten
conseguir secciones ultrafinas (del orden de nanmetros), semifinas (de 0.5
a 2 m), finas (entre unas 3 y 10 m) y gruesos (mayores a 10 m).
Habitualmente las secciones se procesan para poder observarlas y
estudiarlas, aunque ciertos tipos de microscopa, por ejemplo con contraste
de fase, permiten observar secciones de tejidos sin procesar.
Normalmente las secciones se tien con colorantes que son hidrosolubles,
por lo que hay que eliminar el medio de inclusin para que los colorantes
pueden unirse al tejido. Las secciones ultrafinas (observadas con el
microscopio electrnico) o semifinas (observadas con el microscopio ptico)
se pueden contrastar con metales pesados o con colorantes,
respectivamente, sin necesidad de eliminar el medio de inclusin.
Los tejidos procesados se observan con los microscopios. Existen dos
tipos bsicos de microscopios: ptico y electrnico. Los primeros ofrecen
una gran versatilidad en cuanto a modos de observar los tejidos: campo
claro, fluorescencia, contraste de fase, polarizacin o contraste de
interferencia diferencial, mientras que los segundos permiten un gran poder
de resolucin, pudindose observar caractersticas ultraestructurales.

FIJACIN
Todos los tejidos, bien cuando se extraen de un organismo o bien cuando el
organismo en el que estn muere, sufren dos tipos de procesos degradativos:
autolisis por accin de enzimas intracelulares, es decir, autodigestin,

y putrefaccin por accin bacteriana. Adems, el procesamiento histolgico

posterior del tejido para poner de manifiesto y observar determinadas
estructuras supone una metodologa que puede degradar las estructuras
tisulares. Fijar un tejido es preservar sus caractersticas morfolgicas y
moleculares lo ms parecidas posibles a las que posea en su estado vivo. Es
como hacer una fotografa del tejido vivo y poder observarla, tras cierto
tratamiento, con el microscopio. As, los fijadores deben evitar la autolisis,
proteger frente a ataques bacterianos, insolubilizar elementos solubles que se
quieren estudiar, evitar distorsiones y retracciones tisulares, penetrar y
preparar el tejido para poder llevar a cabo tinciones especficas posteriores, si
es necesario, etctera.
No existe un fijador universal, ni un mtodo de fijacin nico. Incluso
podemos usar varios fijadores secuencialmente segn nuestras
necesidades. La eleccin depende de las caractersticas fijadoras que
necesitemos. Por ejemplo, si queremos estudiar actividades enzimticas
debemos usar un fijador que no nos altere el centro activo de las enzimas
en las que estamos interesados, y quiz para ello tengamos que sacrificar
en cierta medida la morfologa tisular. Si queremos estudiar la
ultraestructura celular debemos usar fijadores que la preserven y que
protejan a las membranas celulares durante el procesamiento de inclusin
en resinas, y quiz esto altere su apetencia por los colorantes generales. Si
queremos teir un determinado componente celular difcilmente teible
quiz debamos usar un fijador que lo modifique para que sea reconocido
ms fcilmente por los colorantes.
En cualquier caso hay caractersticas de los fijadores que tenemos que
tener en cuenta antes de su uso:
Velocidad de penetracin. El proceso de fijacin ha de ser rpido y la
velocidad de difusin de la sustancia fijadora en los tejidos es un factor
determinante. Este parmetro condiciona el tamao de la pieza que
queramos fijar, ms pequea cuanto menor sea la velocidad de difusin del
fijador empleado, y tambin determina el tiempo de fijacin, mayor cuanto
menor tiempo de difusin.
Velocidad de fijacin. Esta caracterstica no dependen de la velocidad
de difusin sino de las propiedades qumicas del fijador y condiciona el
tiempo que debe permanecer el tejido en contacto con el fijador.
Endurecimiento. Los fijadores generalmente endurecen los tejidos, lo
cual depende del tipo de fijador y del tiempo que el tejido haya estado
expuesto a l.
smosis y pH. Es indispensable evitar cambios de volumen en la
clulas producidos por una osmolaridad del fijador diferente a la del tejido.

Por tanto, hay que equilibrar la osmolaridad de las soluciones fijadoras y la

de los tejidos a fijar. No es necesario aadir sustancias complejas. Por
ejemplo, para los tejidos de animales terrestres basta con aadir 0.9 % de
cloruro sdico. Son sales que no afectan a la capacidad del fijador.
Normalmente se suelen usar soluciones tamponadoras a un pH semejante
al del tejido e isoosmticas con dicho tejido.
Efecto mordiente. Algunas estructuras tisulares son difciles de teir
puesto que tienen poca apetencia por los colorantes. Esta apetencia puede
ser incrementada con un tratamiento previo. Algunos fijadores, adems de
fijar, modifican qumicamente a ciertas estructuras celulares para que
posteriormente puedan unirse a ellas los colorantes. Este tipo de
modificacin qumica se le denomina efecto mordiente.
Artefactos. Los procesos de fijacin pueden acarrear alteraciones
tisulares como variaciones morfolgicas, cristalizacin de compuestos,
desplazamiento de sustancias, etctera. Estos cambios pueden producirse
por las caractersticas del fijador o por un mal uso de ste. En cualquier
caso deben tenerse en cuenta para no describir como caractersticas
tisulares lo que es un artefacto introducido durante la fijacin.
Existen diferentes formas de fijar los tejidos dependiendo del tipo de
fijador, de la estructura a fijar y de lo queramos observar. Los mtodos de
fijacin se pueden clasificar en dos tipos: fsicos y qumicos.
Los fijadores fsicos se basan o bien en una congelacin muy rpida del
tejido o bien en la aplicacin de calor elevado. Se utilizan cuando los
fijadores qumicos alteran las estructuras que queremos observar, cuando
necesitamos una fijacin muy rpida, o cuando el tipo de tejido y la tcnica
que usaremos lo requiera. La congelacin rpida es un buen mtodo de
preservacin de las caractersticas moleculares y es conveniente que sea
rpida puesto que as se impide la formacin de grandes cristales de hielo
que nos destrozaran la estructura del tejido. Existen variantes de esta
tcnica como son la criodesecacin o liofilizacin y la criosustitucin.
La criodesecacin parte de tejido previamente congelado al que
posteriormente se le sublima el hielo, es decir, el agua pasa de estado slido
a gaseoso sin pasar por estado lquido. Al eliminar el agua se impide que se
den reacciones qumicas, por lo que, adems de la fijacin, este mtodo
preserva el tejido en el tiempo. La criosustitucin tambin parte de tejido
congelado pero en este caso se produce una sustitucin lenta del hielo por
una solucin fijadora. Con ello se posibilita una fijacin qumica sobre un
material que no ha sufrido deterioro puesto que est congelado. Los
mtodos de fijacin por calor no son frecuentemente usados, excepto para el
estudio microorganismos.

Los mtodos qumicos utilizan soluciones acuosas compuestas por

molculas fijadoras que establecen puentes entre las molculas del tejido,
mantenindolas en sus lugares originales e impidiendo su degradacin. Hay
dos mtodos bsicos de fijacin con fijadores lquidos: inmersin y
perfusin. En cualquier caso el fijador debe llegar a todas las partes el tejido
lo ms rpidamente posible.
Inmersin. En el mtodo de inmersin las piezas de tejido se sumergen
en la solucin fijadora. Hay que tener en cuenta algunas precauciones.
1) Las piezas de tejido no deberan superar los 0.5 cm de espesor
para que el fijador alcance el interior de la pieza antes de que sta
comience a deteriorarse. Esto depende de la velocidad de
penetracin del fijador y de las caractersticas del tejido. Por
ejemplo, si tiene cavidades por donde penetre la solucin fijadora el
volumen podra ser mayor.

Fijacin por inmersin.

2) El volumen recomendado de fijador es 20 veces superior al
volumen de la pieza.
3) La osmolaridad del tejido y de la solucin fijadora deben estar
equilibradas.
4) El pH del fijador debe ser prximo al fisiolgico.
5) El tiempo de fijacin depende de cada tipo de fijador. Una agitacin
suave durante la fijacin ayuda a la penetracin del fijador y
disminuye el tiempo.
Perfusin. Por este procedimiento la solucin fijadora se introduce a travs
del sistema circulatorio por el cual accede a todas las clulas del tejido gracias
a la red de capilares. Mediante este mtodo se puede fijar un animal completo
introduciendo la solucin fijadora a travs del ventrculo izquierdo del
corazn. El fijador llegar a todas las clulas irrigadas por la sangre
bombeada por dicho ventrculo (circuito corporal). Si se quieren fijar los
pulmones habra que introducir el fijador por el ventrculo derecho. Tambin
podemos fijar un nico rgano en el caso de que podamos introducir la
solucin fijadora en la arteria principal que irriga dicho rgano. La perfusin

no siempre es posible en algunos casos como en muchas biopsias o en los

tejidos vegetales.
El mtodo de fijacin por perfusin es mucho ms efectivo que el de
inmersin ya que la solucin fijadora llega rpidamente a escasa distancia
de todas las clulas de la estructura perfundida. Por tanto, la velocidad de
penetracin del fijador no es una condicin limitante.
Antes de introducir el fijador en el sistema de vasos sanguneos hay que
eliminar previamente la sangre con una solucin de lavado oxigenada, de
otra manera su interaccin con el fijador produce trombos que impediran
la fijacin de determinadas zonas del animal o del rgano. Respecto a las
precauciones mencionadas anteriormente en el mtodo de inmersin
debemos cuidar aqu tambin la osmolaridad, el pH y el tiempo de fijacin.

Fijacin por perfusin de un organismo completo. Mediante este tipo de

perfusin se introduce la solucin fijadora en el sistema sanguneo. La bomba
peristltica aporta la presin suficiente para permitir al fijador entrar a travs
del ventrculo izquierdo (Vi) y pasar a la aorta, desde la cual se distribuye por
todo el cuerpo (excepto por el circuito pulmonar). Tras pasar por la red capilar
la solucin fijadora pasa a los vasos venosos que terminan por verter su
contenido en la aurcula derecha (Ad). A esta cavidad hay que hacerle una
abertura para que la solucin fijadora, una vez realizada su funcin, salga del
circuito. Ai: aurcula izquierda; Vd: ventrculo derecho.

Este mtodo de fijacin por perfusin requiere conocer la presin a la que se

va a introducir la solucin fijadora en el animal o estructura, la cual debe ser
similar a la que posee la presin sangunea normal en estado vivo. La presin
que ejercer la solucin fijadora se puede regular mediante bombas
peristlticas (ver figura) o por gravedad, es decir, variando la altura a la cual
se coloca la solucin fijadora respecto a la del animal. Esto es importante
porque una presin muy baja podra impedir que la solucin fijadora
alcanzara todas las partes de la estructura y un presin muy alta podra
provocar roturas de los vasos sanguneos y de la propia estructura tisular.
FIJADORES
Existen multitud de fijadores en los manuales de tcnicas histolgicas. Aqu
slo trataremos aquellos que consideramos de uso ms comn para la
observacin de tejidos al microscopio, es decir, aquellos que mejor preserven
la estructura celular. Los fijadores qumicos son los ms frecuentemente
empleados, bien compuestos por un solo tipo de sustancia fijadora o con
mezclas de varias de ellas.
Atencin! La mayora de las sustancias fijadoras son txicas por
inhalacin o por contacto, algunas de ellas cancergenas. Hay que seguir las
indicaciones de seguridad para su manejo y utilizacin.
FIJADORES SIMPLES
Alcohol etlico. Fija por deshidratacin y se usa entre el 70 y 90 %. Es un
buen fijador para preservar protenas, como enzimas, glucgeno, pigmentos y
es til para fijar las extensiones citolgicas. Debido a que deshidrata, a la vez
que fija, se puede usar tambin como un conservante de las muestras. Tiene
algunos inconvenientes como producir endurecimiento y la retraccin de los
tejidos. Carece de efecto mordiente.

cido actico. Su proceso de fijacin consiste en cambiar el estado coloidal de

las protenas. Se utiliza a una concentracin que vara entre el 1 y el 5 %. Es
el fijador ideal para cidos nucleicos y nucleoprotenas. Como inconvenientes
cabe destacar la destruccin de las mitocondrias y mala fijacin de
membranas y citoplasma. Se suele usar en combinacin con otros fijadores.

cido pcrico. La fijacin la produce porque las sales del tipo picrato coagulan
las protenas de los tejidos. Se suele usar del 2 al 15 % de una solucin
saturada de cido pcrico. Preserva bien la estructura celular, no produce
retracciones cuando el tiempo de fijacin es ptimo, preserva bien glucgeno y
lpidos. Es un buen fijador para tinciones generales puesto que tiene efecto
mordiente y favorece la unin de los colorantes. Hay que eliminarlo

completamente antes de proceder a la inclusin en ceras como la parafina

puesto que dificulta la penetracin de la parafina. Se suele usar combinado
con otros fijadores.

Formaldehdo. Acta mediante la formacin de puentes entre las molculas

tisulares. Se utiliza a concentraciones prximas al 4 %. Es un fijador
ampliamente usado por la buena preservacin del tejido, acta como
conservante, produce poca retraccin tisular, es un buen fijador para lpidos,
es compatible con la mayora de las tinciones histolgicas, incluidas las de
inmunocitoqumica e hibridacin de cidos ribonucleicos. Normalmente se usa
en solucin tamponada e isotnica. Actualmente se prepara a partir de
paraformaldehdo, sustancia slida.

Glutaraldehdo. Forma puentes entre las molculas de los tejidos. Se usa a

una proporcin de entre el 0,5 y el 3 %. Tiene una alta capacidad para
preservar la estructura celular, por lo que es el fijador de referencia para
observacin de ultraestructuras celulares con el microscopio electrnico. Pero
hay que tener cuidado con su baja penetracin tisular y puede producir
retracciones. Se usa en soluciones tamponadas isotnica

Tetrxido de osmio. Forma puentes entre molculas. Se emplea al 1 % en

soluciones tamponadas. Es buen fijador de la ultraestructura de la clula por
lo que se emplea habitualmente para las observaciones con el microscopio
electrnico. Es un buen fijador para grasas y membranas celulares. Por su
fuerte carcter oxidante no se usa para tinciones convencionales, excepto para
las impregnaciones argnticas como el mtodo de Golgi.
MEZCLAS FIJADORAS
La mayor parte de los procesos de fijacin usan varias sustancias
fijadoras, bien mezcladas en la solucin acuosa inicial o utilizadas
sucesivamente en el tiempo. Con ello se aprovechan las ventajas de cada
una de ellas y se pueden contrarrestar sus desventajas. Hay multitud de
formas de usar los diferentes fijadores, tanto en sus componentes como en
las proporciones de stos, dependiendo de las necesidades posteriores, es
decir, qu tipo de tejido queremos fijar y qu queremos ver de dicho tejido. A
continuacin vamos a mencionar algunas combinaciones usadas
frecuentemente porque tienen unas propiedades de fijacin que las hace
apropiadas para las observacin de una gran variedad de tejidos y para el
uso diversas de tcnicas de tincin.
Lquido de BOUIN. Est formado por cido pcrico, formaldehdo y
cido actico glacial. Es una solucin muy utilizada para el procesamiento

de tejidos que se incluirn en parafina (ver captulo de inclusin) y a cuyas

secciones se le pueden aplicar un amplio espectro de tinciones. Es muy til
para tejidos blandos y embriones, y preserva bien el ncleo y el glucgeno.
Hay que tener cuidado con el tiempo de fijacin, que no debe exceder de 48
horas en el caso de fijaciones por inmersin. Tras la fijacin las muestras de
tejido se pueden conservar en alcohol de 70. No est recomendado para el
rin ni para el estudio de mitocondrias. Antes de la inclusin en parafina
es conveniente eliminar el cido pcrico mediante lavados en alcohol de 70
porque puede hacer que no se produzca una buena inclusin o que las
tinciones no sean adecuadas.
Karnoy. Es un buen fijador para el glucgeno, para los hidratos de
carbono simples y para las protenas fibrosas. Es bueno para visualizar los
cidos nucleicos, aunque no la morfologa nuclear, y para los grumos de
Nissl del sistema nervioso. Puede producir retracciones tisulares. Est
formado por etanol absoluto 60 %, cloroformo 30 % y cido actico glacial
10 %.
Mezclas con formaldehdo. El formaldehdo es quiz el fijador ms
usado hoy en da, tanto para tcnicas histolgicas rutinarias como para
otras como la inmunocitoqumica o la hibridacin de cidos nucleicos. Lo
ms frecuente es utilizarlo en solucin al 4 % junto con otros fijadores. Se
suele disolver en soluciones tamponadas que tienen una osmolaridad
similar a la del tejido que se pretende fijar. Para fijaciones de tejidos
destinados a microscopa electrnica se suelen utilizar soluciones fijadoras
que contienen formaldehdo y glutaraldehdo. La funcin del formaldehdo
es iniciar una fijacin rpida, por su mayor capacidad de penetracin,
mientras que el glutaraldehdo realizar una fijacin ms poderosa, pero
ms lenta que no afectar a la estructura tisular puesto que el
formaldehdo ya ha realizado una fijacin previa.
Glutaraldehdo-tetrxido de osmio. Los fijadores en combinacin no
tienen necesariamente que usarse al mismo tiempo. Es habitual que los
tejidos destinados a microscopa electrnica sean inicialmente fijados en
glutaraldehdo (1 al 3 %) y paraformaldehdo (2 al 4 %), para posteriormente
ser postfijados en tetrxido de osmio al 1 % en solucin tamponada. Este
ltimo es un buen preservador de la ultraestructura celular, sobre todo
membranas, en cooperacin con los aldehdos. Esto es importante porque el
proceso para microscopa electrnica supone incubar el tejido en solventes
orgnicos y polimerizacin de resinas a 60 C, durante las cuales el tejido
debe ser preservado.

I N C L U S I N

Una vez fijado el tejido tenemos que procesarlo para su observacin con el
microscopio. Ello implica hacer secciones para teirlas primero y
posteriormente observarlas. Como regla general se procede al endurecimiento
de la muestra para poder obtener dichas secciones ya que lo normal es
que cuanto ms delgada queramos una seccin ms consistente debe ser la
muestra de la que se obtiene.
La congelacin de los tejidos previamente fijados permite la obtencin de
secciones que pueden ir desde unas 50 m hasta nm de grosor, para lo que se
utilizan diferentes aparatos: microtomo de congelacin para secciones de
decenas de m, criostato para secciones de entre 5 y 20 m y ultracriotomo
para secciones ultrafinas del orden de nm. Para evitar los daos que se
producen durante los procesos de congelacin, como la formacin de cristales
de hielo que nos agujerean los tejidos, se pueden usar: a) Anticongelantes que
impidan la formacin de cristales. El crioprotector ms usado es la sacarosa al
30 %, aunque tambin se usa el dimetil sulfxido, el glicerol, etiln glicol y
otros. La eleccin de uno u otro depende del tipo de muestra y de la tcnica
que se vaya a usar. b) Una congelacin lo ms rpida posible, por ejemplo, con
nitrgeno lquido. Cuanto ms rpida es la congelacin menores son las
dimensiones de los cristales de agua formados.

La inclusin es el mtodo ms comn de endurecer el tejido y consiste en

infiltrar la muestra con sustancias lquidas que tras un proceso de
polimerizacin o enfriamiento se solidifican, sin afectar a las caractersticas del
tejido. Con ello se consigue obtener cortes del orden de m a nm, segn el
medio de inclusin, sin que el tejido se rompa o se deteriore. Adems, son un
buen mtodo para preservar las muestras durante largos periodos de tiempo.
Existen diferentes sustancias o medios de inclusin dependiendo del grosor del
corte y de la tcnica que necesitemos realizar. Cuando se quieren hacer
secciones para su observacin con el microscopio ptico los medios de
inclusin ms frecuentemente usados son la parafina o la celoidina, mientras
que si vamos a realizar observaciones con el microscopio electrnico la
inclusin se realiza con resinas, principalmente de tipo acrlicas o epoxy. La
mayora de estas sustancias no son hidrosolubles, es decir, no son miscibles
con el agua, luego si queremos que la sustancia en la que vamos a incluir
ocupe todo el tejido tenemos que eliminar el agua y sustituirla por un lquido
miscible con dicha sustancia. Si una muestra no est completamente
embebida en el medio de inclusin se deteriorar y la obtencin de secciones
homogneas ser imposible.
INCLUSIN EN PARAFINA
La parafina es una sustancia de aspecto ceroso que est formada por mezclas
de hidrocarburos saturados. A temperatura ambiente es slida y su punto de
fusin puede variar entre 40 C y 70 C segn la composicin de la mezcla de
hidrocarburos.
Las parafinas ms usadas tienen un punto de fusin en torno a los 60 C.
Podemos tambin modificar las caractersticas de las parafinas aadiendo
sustancias para variar su dureza, viscosidad, fragilidad.
La parafina no es miscible con agua, mientras que todos los tejidos estn
formados principalmente por agua. Adems, la mayora de los fijadores son
soluciones acuosas. Esto implica que para que la parafina lquida pueda
penetrar completamente en el tejido ha de sustituirse el agua por un solvente
orgnico. Esto se consigue mediante la deshidratacin del tejido en alcoholes,
normalmente etanol, de gradacin creciente hasta alcohol de 100.
Posteriormente se transfiere el tejido a un lquido que es miscible tanto con el
alcohol de 100 como con la parafina, denominado sustancia intermediaria,
como es el benceno, xileno, tolueno o el xido de propileno, entre otros. Estas
sustancias son normalmente aclarantes por lo que comprobando la
translucidez de la pieza podemos cerciorarnos de la penetracin de la
sustancia intermediaria en el tejido. El tiempo de incubacin de la pieza en
algunos de estos lquidos intermediarios como el tolueno o xileno no debe ser
excesivo puesto que estas sustancias endurecen la pieza y crean problemas al
hacer las secciones.

Por ltimo se pasa el tejido a parafina previamente licuada en una

estufa regulada a la temperatura apropiada para dicho tipo de parafina. Se
dan tres pasos por parafina lquida para favorecer una completa sustitucin
del lquido intermediario por la parafina. El tiempo que dura dichos pasos
depende de lo voltil que sea el lquido intermediario y lo grande que sea
nuestra pieza. Ser mayor cuanto menos voltil es el lquido intermediario o
mayor sea la muestra de tejido. Hay que tener en cuenta que un tiempo
excesivo en parafina puede endurecer el tejido. Tras el embebimiento completo
de la muestra se vierte parafina lquida en un molde, se introduce la muestra y
se coloca segn la orientacin deseada de corte y se deja solidificar a
temperatura ambiente.

I N C L U S I N

E N

R E S I N A

Para la observacin de la ultraestructura celular es necesario hacer secciones

de tejido muy delgadas, del orden de nanmetros, denominadas ultrafinas, y
usar un microscopio electrnico de transmisin. La obtencin de secciones
ultrafinas implica que tenemos que endurecer enormemente el tejido.
En las inclusiones en resinas tipo epoxy, normalmente para muestras
que se observarn en el microscopio electrnico, se suelen seguir las
siguientes recomendaciones:
a) Las soluciones fijadoras suelen contener glutaraldehdo y es
necesaria una postfijacin posterior en tetrxido de osmio. Con ello nos
aseguramos una fuerte fijacin para preservar la ultraestructura celular y
que no perderemos los lpidos que forman las membranas celulares durante
el proceso de inclusin, gracias al tetrxido de osmio.
b) Partimos de tamaos de muestras mucho ms pequeas, de unos
pocos milmetros, puesto que no nos interesa ver la organizacin general del
tejido sino detalles del mismo. Si queremos observar zonas diferentes de un
rgano es conveniente hacer bloques de muestra pequeos e independientes
de cada una de ellas.
c) Las resinas ms comnmente usadas para la inclusin no son
hidrosolubles, por lo que tenemos que sustituir el agua del tejido por un
solvente orgnico que sea miscible con la resina. Para ello se deshidrata el
tejido mediante incubaciones sucesivas en gradaciones crecientes de etanol
o acetona. Como lquido intermediario entre la acetona pura o el etanol de
100 y las resinas se suele utilizar el xido de propileno.
d) El endurecimiento del medio de inclusin, la resina, no es por
enfriamiento sino por polimerizacin, normalmente a 60 C.
e) Al medio de inclusin, la resina, se le aaden aceleradores y
plastificantes que regulan las caractersticas de la polimerizacin y la
dureza de la resina polimerizada. Las resinas tipo epoxy son las ms
usadas puesto que aportan una mayor homogeneidad en las polimerizacin
y ms facilidad a la hora de obtener secciones regulares. Por el contrario las
resinas acrlicas presentan algunos inconvenientes y hay que ser muy
cuidadosos a la hora de elegir las condiciones de polimerizacin, obtencin
y tratamiento de los cortes ultrafinos.