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Objetivos

Conhecer as propriedades fsico-qumicas fundamentais do DNA atravs de sua


extrao do material gentico da cebola, a partir dos tecidos do bulbo, e de suas propriedades
ticas.

Parte experimental
Extrao do DNA da cebola:

Determinao da concentrao do DNA:

Determinao da estabilidade trmica e da pureza do DNA:

Determinao da massa molecular do DNA por eletroforese em gel de agarose:

Resultados e discusso
Para que se retire o DNA do ncleo das clulas, deve-se, primeiramente, realizar a lise
da membrana celular. H diversos protocolos na literatura, alguns mais eficientes que outros,
entretanto, o nvel de complexidade elevado. A maneira mais simples e rpida para sua lise
propiciar um choque trmico na amostra, pois dessa forma existe a ruptura da membrana
celular e, posteriormente, a liberao do DNA. Esse um mtodo limitado a pequenas
quantidades de DNA [1].
Em seguida, a camada fosfolipdica da biomembrana eliminada pela presena de um
detergente, no presente caso o dodecil sulfato de sdio (SDS), o qual tambm auxilia na
inativao enzimtica e dissocia o DNA das protenas, mantendo seu enovelamento

[2]

Importante ressaltar que o sal cloreto de sdio tambm auxilia a dissociao do DNA das
protenas. O EDTA, por sua vez, responsvel por prevenir que o processo de apoptose

[3,4]

ocorra, uma vez que ons de clcio (Ca2+) e magnsio (Mg2+), os quais fazem parte e so
essenciais para tal processo, se encontram complexados em sua presena.
Usualmente, a precipitao do DNA realizada na presena de lcoois. No presente
caso, utilizou-se uma soluo de etanol 95%, a qual foi adicionada lentamente, de maneira a
no perturbar o sistema em grande extenso e, portanto, promover a precipitao do DNA de
maneira cuidadosa, uma vez que outas macromolculas como, por exemplo, RNA, protenas,
lipdeos, polifenis e polissacardeos, tambm podem ser precipitados

[5]

, contaminando a

amostra. O etanol promove a transio estrutural nas molculas de cidos, fazendo-as se


agregarem, com consequente precipitao e ele se torna menos denso, que a soluo aquosa
obtida.6 Fernanda7 e companheiros demonstraram, em seu trabalho, a eficincia da
precipitao do DNA tanto pelo etanol quanto pelo isopropanol, alm de misturas desses dois
lcoois.
A amostra de DNA obtida pode, ento, ser avaliada quanto a sua pureza e
concentrao por meio da tcnica de espectroscopia na regio do ultravioleta, uma vez que o
DNA apresenta grupos em sua estrutura que possibilitam a absoro de radiao nessa regio
do espectro. Vale ressaltar que protenas tambm apresentam grupos que proporcionam tal
propriedade. Exemplos de bases nitrogenadas, que constituem o DNA, e de aminocidos, que

constituem as protenas, e que absorvem na regio do ultravioleta so apresentados na Figura


X.

Figura X: Representao da estrutura das 4 bases nitrognadas, que constituem o DNA, e de


aminocidos, que constituem as protenas, que apresentam anis aromticos em sua estrutura.

Compostos que so constitudos por anis aromticos, normalmente, absorvem luz na


regio do ultravioleta como consequncia das ligaes conjugadas. Entretanto, para cada
tipo de composto, sua absoro se apresenta em comprimentos de onda caractersticos:
enquanto para as bases nitrogenadas se verifica uma absorbncia na regio de 260 nm, os
resduos de aminocidos so caracterizados por absorverem na regio de 280 nm. Outra
ligao presente, que tambm absorve nessa regio do espectro, a ligao peptdica. Porm,
deslocado para menor comprimento de onda, aproximadamente em 230 nm [8].
Dessa forma, as relaes entre as absorbncias nos diferentes comprimentos de onda,
A260/A280 e A230/A260, fornecem uma ideia da pureza da amostra, isto , quanto menor for a
absorbncia em 280 nm e 230 nm, maior a pureza da amostra e consequentemente, maior
o valor da primeira relao e menor o valor da segunda relao. Normalmente, amostras cujos
valores de A260/A280 inferiores a 1,8 so consideradas contaminadas [8].

A concentrao estimada pela seguinte relao: uma absorbncia de 1,0 em 260 nm


indica uma concentrao de 50 g da dupla hlice do DNA por mL de soluo. A
concentrao , ento, calculada pela seguinte equao:
Concentrao DNA= A 260 x 50 x fator de diluio
Uma vez que o valor de abosrbncia obtido para a amostra foi de 0,139 e
considerando-se a diluio realizada, a concentrao de DNA de 590 g mL -1. Uma vez que
a amostra de DNA foi solubilizada em 5 mL da soluo de solubilizao, ento a quantidade
de DNA extrada da cebola foi de 2950 g.
Na Tabela 1, possvel encontrar os valores de absorbncia nos comprimentos de
onda de 260 nm e 280 nm para as solues de DNA, as quais foram tratadas de maneiras
distintas: a primeira no foi aquecida, a segunda aquecida e resfriada lentamente a
temperatura ambiente e a terceira aquecida e resfriada rapidamente.
Tabela 1: Valores de absorbncia para as diferentes solues de DNA nos comprimentos de onda de 260 nm e
280 nm.

Primeira soluo
Segunda soluo
Terceira soluo

Absorbncia 260 (nm)


0,484
0,460
0,593

Absorbncia 280 (nm)


0,371
0,347
0,489

Razo A260/280
1,30
1,32
1,21

Dessa maneira, todas as solues investigadas so consideradas contaminadas uma


vez que a relao A260/280 inferior a 1,8. Possivelmente o processo de extrao do DNA no
foi realizado com o devido cuidado, alm de sua retirada da superfcie do lquido ser bastante
dificultada.
A massa molecular do DNA tambm pode ser determinada, entretanto, pela tcnica
eletrofortica, a qual baseada, simplificadamente, pela locomoo em gel de molculas
possuidoras de cargas residuais na presena de um campo eltrico externo (100 110 V). No
presente caso, utilizou-se o gel de agarose 0,8%, com tampo TAE (bsico, pH = 8). Assim,
as molculas de DNA se encontravam com carga residual negativa (presena dos grupos
fosfato) e migraram para a direo do polo positivo do campo eltrico.

Existe a necessidade da adio de um corante, uma vez que essa tcnica realizada de
maneira comparativa, na presena de diversos padres analticos de massas conhecidas, e a
soluo incolor. A Figura Y apresenta o resultado da eletroforese em gel de agarose,
mostrando a migrao da amostra de DNA considerada (evidenciada com uma seta) devido a
presena do campo eltrico. Comparando-se com a escala (migrao MM) presente no
equipamento, pode-se estimar a massa molar do DNA avaliando-se sua migrao no gel.
Sabendo que...
Figura Y: Eletroforese em gel de agarose, utilizando-se tampo TAE e o corante Blue Green
Loading Dye I, da amostra de DNA extrada da cebola.

Concluso
Notou-se que a tcnica de extrao do DNA, em geral, necessita de condies
especficas, alm de cautela experimental em especial na retirada do DNA da superfcie da
soluo, uma vez que ele se encontra gelatinoso . Na soluo extratora, a presena de uma
espcie solubilizadora das membranas celulares (dodecil sulfato de sdio) e tambm uma
espcie (cloreto de sdio) que promove a dissociao do DNA das protenas imprescindvel.
Em especial, o EDTA possui um papel bastante importante, considerando seu carter
complexante: preveno do incio da apoptose.
A caracterizao do DNA bastante relativa, considerando que outras
macromolculas tambm podem ser extradas juntamente com ele. Dentre essas
macromolculas, possvel citar protenas e RNA como exemplo. Dessa forma, a pureza do
DNA obtida pela razo da absorbncia da amostra na regio do ultravioleta, 260 nm e 280
nm ( A260/A280), sendo a primeira relacionada as bases nitrogenadas do DNA e a segunda dos

resduos de aminocidos das protenas. A amostra investigada no presente trabalho se


mostrou impura, pois o valor da razo anterior encontrado foi inferior a 1,8 mdia 1,3
para todas as trs solues. Portanto, a devida cautela durante a extrao no foi atingida de
maneira satisfatria.
A determinao da massa, levando em conta o que foi exposto no pargrafo anterior,
no agrega para a caracterizao da amostra, pois parte dela proveniente da presena de
protenas e no somente de DNA.

Questes
1 - Por que a presena de SDS, EDTA e NaCl nesta prtica?
O SDS, dodecil sulfato de sdio, responsvel por solubilizar as membranas celulares
e auxiliar na inativao de algumas enzimas, considerando seu carter de detergente, alm de,
assim como o cloreto de sdio, promover a dissociao do DNA das protenas, mantendo seu
enovelamento. Por sua vez, o EDTA um agente complexante, o qual previne a apoptose se
processar ao se ligar com ons magnsio e clcio.
2 - Explique o efeito observado pelo aquecimento da soluo aquosa do DNA.
Ao medir-se a absorbncia da soluo aquecida de DNA, notou-se que houve o
aumento da absorbncia no comprimento de onda em que o DNA absorve naturalmente (260
nm). Tal efeito pode ser explicado pelo fato do DNA ser sensvel a mudanas de temperatura,
pois com o aumento dela h seu desenovelamento e, consequentemente, as bases
nitrogenadas se tornam mais expostas ao meio, facilitando a absoro de luz UV.
Quando a soluo, que fora aquecida, foi resfriada lentamente, o DNA pde se
enovelar novamente de forma a reconstruir sua estrutura inicial, o que no foi observado
quando a soluo foi resfriada rapidamente.
3 - Por que o uso de luz UV para revelar as amostras de DNA presentes no gel de agarose?
Pois o gel utilizado foi corado com uma espcie que pode ser visualizada apenas em
luz ultravioleta.
4 - Como seria realizada a anlise do DNA, considerando-se um qumico forense?

Referncias Bibliogrficas
[1] - Rosa D.D., Mtodo rpido de extrao de DNA de bactrias Summa phytopathol (2008).
[2] Janine P., Jerson V. C. G., Deise C., Ivair V., Mirian B., Comparao de trs protocolos
de extrao de DNA. (2010).
[3] Saraste A., Pulkki K., Morphologic and biochemicalhallmarks of apoptosis. (2000).
[4] Ivana G., Andra R., Adriana B. R., Morte celular por apoptose. (2007).
[5] Eduardo R., Ana C. M. B., Extrao de DNA de plantas. (1999).
[6] Barrato C. M. Megiolaro F., Comparao de diferentes protocolos de extrao de DNA
de bactrias para utilizao em RAPD-PCR (2012).
[7] Fernanda A. K., Marisa A., Juliana R. A., O uso de etanol e isopropanol na extrao de
DNA de plantas. (2013).
[8] Mrcia. C. S. O., Luciana. C. A R., Alexandre D. R., Denilson G. A., Epaminondas P.,
Mrcia M. P., Sandra M. M. S., Wilston H B T., Silvia N. Jardim., Fundamentos tericoprticos e protocolos de extrao e de amplificao de DNA por meio da tcnica de reao
em cadeira da polimerase. (2007).