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UNIVERSIDADE COMUNITARIA DA REGIO DE CHAPEC UNOCHAPEC

REA DE CINCIAS EXATAS E AMBIENTAIS

CROMATOGRAFIA GASOSA

ACADMICAS:
Lauana
Kassia Thais Giehl
Suelen Mai

Chapec- SC, 2015.

Universidade Comunitria da Regio de Chapec UNOCHAPEC

Otimizao dos parmetros de operao


Determinao da concentrao de timol por cromatografia gasosa

Relatrio apresentado disciplina de


Anlise Instrumental, que faz parte da
grade curricular do curso de Engenharia
de
Alimentos,
da
Universidade
Comunitria da Regio de Chapec
UNOCHAPEC.
Professores: Jacir Dal Magro/Jaqueline
Scapinello.

Chapec-SC, 2015.

Introduo
A definio de cromatografia gasosa (CG) se d como um mtodo fsicoqumico de separao que ocorre entre duas fases imiscveis, tornando a tcnica
extremamente verstil e de muitas aplicaes. O termo cromatografia foi usado a
primeira vez por um botnico russo que descreveu a separao dos componentes de um
extrato em uma coluna de vidro contendo silicato de clcio, nesta coluno houve a
passagem de ter de petrleo. Essa experincia resultou em faixas coloridas (origem do
seu termo chrom = cor e graphie = escrita). (DEGANI, CASS, VIEIRA, 1998).
Essa tcnica pode ser utilizada para identificar compostos atravs de comparao
com padres. A cromatografia pode ser classificada pela sua forma fsica, pelo tipo de
fase mvel e/ou estacionria alm do modo de separao. (DEGANI, CASS, VIEIRA,
1998).

Figura 1. Representao grfica dos diferentes tipos de cromatografia.


O tipo de cromatografia utilizada nesse trabalho a cromatografia gasosa (CG).
A cromatografia gasosa permite que substncias sejam identificadas com alto grau de
confiabilidade. uma tcnica baseada na separao de misturas contendo substncias
volteis, onde tem-se a introduo por vaporizao de um gs com fase mvel. O tubo
na qual o gs passar, contem uma fase estacionria (FE) denominada coluna
cromatogrfica. nessa coluna que ocorre a separao das substncias presentes na
mistura. A FE que d o nome dos tipos de equipamentos utilizados para essa anlise.
A cromatografia gs-slido possui FE como um slido adsorvente; a cromatografia gslquido com coluna empacotada/recheada possui FE como um filme de um lquido

pouco voltil envolto em um slido inerte; e a cromatografia gs de alta resoluo


possui FE como a prpria parede do tubo. (REGO, 2008).
A fase estacionria um lquido e a fase mvel gasosa. considerada uma
tcnica analtica muito utilizada, por ser muito sensvel, podendo detectar substncias
em escala nano e picogramas. No entanto, esse mtodo pode utilizar apenas substncias
volteis e termicamente estveis, j que substncias no volteis apenas so
identificadas em escala micro e mili, no podendo se obter assim um resultado
confivel. A cromatografia gasosa pode se classificar em apenas gasosa (CG) e em de
alta resoluo (CGAR). A diferena entre as duas est no tamanho e dimetro da coluna,
alm de ter fase slida em contato direto com a coluna. Dessa forma, a CGAR
considera mais eficiente. (DEGANI, CASS, VIEIRA, 1998).

Figura 2. Componentes bsicos de um cromatogrfo. (a) cilindro do gs de arraste


mantido sobre alta presso, (b) injetor, (c) coluna, (d) detector e (e) registrador.
uma tcnica bem confivel, pois sua eficincia complementada com
detectores, hardware e software para cada aplicao em especfico. A identificao de
substncias em alimentos, aromas naturais, petrleo e seus derivados, perfumes, leos
essenciais e bebidas alcolicas possuem grande desafio pela quantidade de componentes

que podem ser em traos, dificultando a anlise. (ZINI, 2009).

As substncias so identificadas atravs de um detector que gera sinais eltricos,


formando picos ao longo do tempo. Cada pico representa uma substncia, possibilitando
anlises quantitativas e qualitativas. Isso tudo o que chamamos de cromatograma.
Alm disso, com maior frequncia utilizado o Detector de Ionizao de Chama (DIC).
Utilizando gs hidrognio e ar, uma chama acessa eletricamente. Nesta chama, a
maioria dos solventes orgnicos so pirolisados, produzindo ons e eltrons
caractersticos de cada substncia. (REGO, 2008).
O comprimento da coluna de CG de 3m e o dimetro de 3mm. Utiliza gases
inertes, sendo eles normalmente nitrognio, hidrognio e hlio.
A utilizao da cromatografia gasosa como determinao de etanol
considerada referencia. Esse mtodo muito utilizado mundialmente para deteco de
etanol em sangue e/ou urina. (REGO, 2008)
Cada mtodo de cromatografia gasosa tem suas particularidades em relao do
equipamento disponvel, tipo de coluna, preparao da amostra, gs de arraste, tipo de
detector e padro interno. Porm podem-se considerar como parmetros universais para
esse tipo de anlise, como o DIC para anlises de etanol e metanol. (REGO, 2008)
O organo tem por seus componentes principais, o timol e o carvacrol. Esses
compostos podem ser identificados e quantificados quando em estado de leo essencial
por cromatografia. (SILVA, et. al., 2010).
O objetivo do trabalho familiarizar-se com o mtodo de CG, desenvolver o
protocolo para anlise e separao de diferentes lcoois, entender os efeitos provocados
na separao e identificao dos componentes de uma amostra pela variao da
temperatura e fluxo de arraste, alm de introduzir uma metodologia analtica para
determinao de componentes em leo essencial, neste caso o leo de organo.
2. Materiais e Mtodos
2.1. Materiais

Cromatgrafo a gs (Intercrom, Modelo: Gerao 8000);

Microseringa 5L;

Bckers 25 mL;

Micropipetador 1000L.

2.2. Solventes

Metanol;

Etanol;

Isopropanol;

n-butano;

lcool etlico;

Padro timol;

leo essencial de Thymus sp (Sigma Aldrich).

3. Procedimento Experimental
3.1. Otimizao dos parmetros de operao
Primeiramente preparou-se uma soluo 1:1:1:1 de metanol, etanol, isopropanol
e n-butanol, o que totalizou 4 mL. Aps esse procedimento, foi realizado o processo de
otimizao do fluxo do gs de arraste. Para isso, injetou-se 0,5L da soluo em 4
diferentes presses de gs 10; 12,5 e 15 psi. Atravs da anlise que continha melhor
fluxo, realizou-se mais 3 injees em temperaturas distintas da coluna, 55; 65 e 80C.
Dessa forma, identificou-se a melhor programao para anlise da mistura, obtendo-se o
cromatograma individual dos solventes atravs da injeo de 0,5L dos mesmos na
programao escolhida como padro.
3.2. Determinao da concentrao de timol por cromatografia gasosa
Realizou-se a soluo padro de timol atravs de 17,5mg de timol, solubilizado
em 500L de lcool etlico e a partir dessa soluo foram feitas outras quatro solues
nas seguintes concentraes: 35,00; 15,55; 6,91 e 3,07 mg/mL.
Com o cromatograma nas seguintes condies: temperatura do detector de 250
C, presso do gs de arraste de 15 psi, temperatura do injetor de 280 C, e temperatura
da coluna programada com aquecimento de 130 C at 200 C, com aquecimento de 4
C/min, injetou-se 0,5L de cada soluo padro (da maior para a menor) para obter os
cromatogramas.

4. Resultados e Discusses
4.1. Otimizao dos parmetros de operao
Para avaliar o processo de cromatografia, foi utilizada a soluo preparada
1:1:1:1 de metanol, etanol, isopropanol e n-butanol, nas diversas temperaturas e
presses estimadas. Atravs dessas variaes obteve-se o fluxo de arraste timo,
notando a diferena no tempo de reteno dos compostos. Para iniciar as anlises,

optou-se por fixar a temperatura em 65C, variando a presso do gs em 10; 12,5; 15 e


20 psi.

Figura 3. Cromatograma da soluo 1:1:1:1 de metanol, etanol, isopropanol e nbutanol, nas condies de 65C e 10 psi.

Figuras 4. Cromatograma da soluo 1:1:1:1 de metanol, etanol, isopropanol e nbutanol, nas condies de 65C e 12,5 psi.

Figura 5. Cromatograma da soluo 1:1:1:1 de metanol, etanol, isopropanol e nbutanol, nas condies de 65C e 15 psi.

Figura 6. Cromatograma da soluo 1:1:1:1 de metanol, etanol, isopropanol e nbutanol, nas condies de 65C e 20 psi.
Sabendo-se que a coluna responsvel por obter a distncia entre os picos e nas
condies observadas, os cromatogramas com melhores resultados, ou seja, sem
sobreposio dos primeiros compostos, so de 10 e 12,5 psi. No entanto, o
cromatograma de 10 psi possui uma velocidade reduzida para obter todos os compostos
de forma otimizada. Dessa forma, determinou-se como presso otimizada de 12,5 psi.
Dessa maneira, fixou-se essa presso variando as temperaturas do forno da
coluna, avaliando dessa forma fator temperatura que influencia o calor de vaporizao

das molculas e dos diferentes arranjos moleculares. Isso pode ser um fator que
modificar a velocidade de sada dos compostos da coluna.

Figura 7. Cromatograma da soluo 1:1:1:1 de metanol, etanol, isopropanol e nbutanol, nas condies de 55C e 12,5 psi.

Figura 8. Cromatograma da soluo 1:1:1:1 de metanol, etanol, isopropanol e nbutanol, nas condies de 80C e 12,5 psi.
Ao analisar os grficos 7 e 8 pode-se chegar a concluso que uma substncia
eluir mais rapidamente quanto mais aquecido estiver o forno da coluna, no entanto
ocorrer a sobreposio dos primeiros picos. Alm disso, a substncia ficar mais tempo
em contato com a fase estacionria, quanto menos aquecido estiver o forno, aumentando
o tempo de anlise. Dessa forma, definiu-se como fatores timos a temperatura de 65C

e a presso de 12,5 psi. O tempo requerido para essa anlise otimizada foi de 9,323
minutos, tempo at o cromatgrafo ler o ltimo composto presente na mistura.
Atravs dessa definio, obteve-se os grficos das substncias padres para
posterior identificao de cada substncia presente na mistura, conforme apresentados
nas figuras 9, 10, 11 e 12.

Figura 9. Cromatograma do etanol padro, nas condies de 65C e 12,5 psi.

Figura 10. Cromatograma do isopropanol padro, nas condies de 65C e 12,5 psi.

Figura 11. Cromatograma do metanol padro, nas condies de 65C e 12,5 psi.

Figura 12. Cromatograma do n-butanol padro, nas condies de 65C e 12,5 psi.
Comparando a figura 4, que descreve o processo timo, com as figuras 9, 10, 11 e 12,
pode-se identificar os compostos, pelo tempo de anlise necessria para ocorrer o pico
no cromatograma. A tabela 1, demonstra o tempo em que cada substncia da mistura
obteve seu pico.

Substncia

Tempo (minutos)

3,748

4,007

4,098

4
9,323
Tabela 1. Substncias da mistura em ordem de aparecimento de pico em relao ao
tempo
Sabe-se que o tempo encontrado para o metanol padro de 3,798 minutos,
dessa forma ele pode ser identificado como a substncia 1. O tempo encontrado para o
isopropanol de 4,090 e do etanol de 4,182 minutos, valores muito prximos, mas
quando analisa-se a tabela 1, pode-se identificar a substncia 2 como isopropanol e a
substncia 3 como etanol, por fim, o n-butanol padro possui tempo de 9,673 minutos.
Sabendo o comprimento da coluna (25m), pode-se obter a quantidade de pratos
tericos para o ltimo pico atravs da equao 1.
N= 16 (tR/wB)2

(01)

Onde N o nmero de pratos tericos, tR o tempo de reteno, que no ltimo


pico de 9,323 minutos e wB a largura da base do pico que de aproximadamente
0,25 minutos. Logo o nmero de pratos tericos presentes de 22251,09.

4.2. Determinao da concentrao de timol por cromatografia gasosa


Inicialmente, realizou-se leitura em CG utilizando timol como substncia
padro, calculando a concentrao de timol em uma amostra, fazendo o cromatograma
para curva de calibrao. As figuras 14, 15, 16 e 17 so os cromatogramas das solues
padro e as concentraes apresentadas na tabela 2 da soluo de timol:cool etlico e a
figura 13 mostra o cromatograma do leo de timol 40%.

Figura 13. Cromatograma do leo de timol 40%.

Figura 14. Cromatograma da soluo de timol: lcool etlico na concentrao de


35mg/mL.

Figura 15. Cromatograma da soluo de timol: lcool etlico na concentrao de


15,55mg/mL.

Figura 16. Cromatograma da soluo de timol: lcool etlico na concentrao de


6,91mg/mL.

Figura 16. Cromatograma da soluo de timol: lcool etlico na concentrao de


3,07mg/mL.
A tabela 2, mostra as solues realizadas com timol padro e lcool etlico e sua
respectiva rea do pico da substncia presente na soluo.

Solues

Concentrao (mg/ml)

rea x 10-4 (unidade de rea)

35,00

93,97

15,55

39,94

6,91

13,89

3,07

3,71

Tabela 2. Solues de timol e lcool etlico.

Atravs dos cromatogramas obteve-se a curva de calibrao relacionando a rea


e a concentrao das solues. Conhecendo o ponto de ebulio das substncias
presentes na mistura (etanol e timol), foi visualizado que o primeiro pico referente ao
etanol (PE: +/- 70C) e o segundo ao timol (PE: +/- 200C).
O grfico 1 demonstra a equao de calibrao e o R2=0,9997 e obteve-se a
equao Y = 2,8368x - 5,0493.

REA X 10^(-4)

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0

10

20
CONCENTRAO

30

40

Grfico 1. Curva de calibrao do timol.


Atravs disso, obteve-se o cromatograma da amostra pura do leo essencial de
Thymus sp (Sigma Aldrich) 40%, dessa forma obteve-se a rea de 503,34 unidades de
rea e por meio da equao da curva de calibrao foi possvel encontrar o valor da
concentrao do leo essencial, que foi de 179,42 mg/mL. Sabendo que a densidade do
leo de 0,917g/mL, encontrou-se o valor em porcentagem da concentrao que de
19,57%. Pode-se visualizar que a concentrao calculada aproximadamente 50 vezes
menor que a esperada. Acredita-se que, utilizar o leo puro sem diluir, tenha sido um
fator para no chegar ao valor esperado, j que o procedimento correto seria diluir em
torno de 10 vezes a amostra.
Atravs das frmulas 2 e 3, foram obtidos o limite de deteco e limite de
quantificao.
LD = 3,3x(b/a)

(02)

LQ = 10x(a/b)

(03)

Dessa forma, LD = 5,87 e LQ = 5,62.


Atravs do cromatograma, observa-se que existem outros componentes presentes
no leo de timol. Para identifica-los, deve-se saber a composio dele, e com o
cromatograma da substncia padro isolada nas condies especificadas de presso e
temperatura onde foi realizado o cromatograma do leo essencial de timol. Segundo
SILVA (2010), as substncias presentes so o timol e o carvacrol.

5. Referncias
DEGANI, Ana Luiza G. CASS, Quezia B. VIEIRA, Paulo C. Cromatografia: um
breve ensaio. QUMICA NOVA NA ESCOLA Cromatografia n 7, MAIO 1998.
REGO, Teresa Cristina Epifnio Digenes. Avaliao de um Mtodo de
Cromatografia em Fase Gasosa head space e Estudo de Estabilidade do Etanol
em Amostras de Sangue. Dissertao (Mestrado). Programa de Ps-graduao em
Cincias Farmacuticas. Centro de Cincias da Sade. Universidade Federal do Rio
Grande do Norte Natal RN, 2008.
SILVA, Janine Passos Lima. et. al. leo essencial de organo: interferncia da
composio qumica na atividade frente a Salmonella Enteritidis. Cinc. Tecnol.
Aliment., vol.30, supl.1, Campinas SP, Maio 2010.
ZINI, Cludia Alcaraz. Cromatografia Gasosa Bidimensional. Universidade Federal
do Rio Grande do Sul, Instituto de Qumica, LAAO, Laboratrio de Qumica Analtica
Ambiental e Oleoqumica Porto Alegre (RS). Scientia Chromatographica, volume 1,
n. 1. 2009.