Universidade Federal da Grande Dourados UFGD

Faculdade de Cincias Biolgicas e Ambientais - FCBA

Disciplina de Engenharia Gentica I
Curso de Biotecnologia 5 Semestre

Resumo do projeto
Grupo: Alex Santos Oliveira, Brenda Rodrigues Ramires Ferreira, Nathanya Nayla de
Oliveira, Otavio G. Benites Marques.
Ttulo do projeto: Produo de Lipase do fungo filamentoso Aspergillus niger, atravs da
tcnica do DNA recombinante, utilizando a levedura Pichia pastoris como sistema de
expresso
Resumo: DNA recombinante - O gene precursor da lipase proveniente de Aspergillus niger
ser amplificado por PCR. Clulas de E. coli Top 10 utilizadas como clulas competentes,
sero transformadas por choque trmico, ser feita uma extrao de DNA plasmidial em
pequena escala (miniprep), o plasmdeo ser removido e ser feita uma anlise eletrofortica
de DNA. Uma colnia da levedura Pichia pastoris ser inoculada em YPD. A levedura ser
transformada por eletroporao. Os clones recombinantes sero selecionados em gar
YPDS contendo ampicilina. Uma cultura ser transferida para meio gar contendo YPDS,
ampicilina e 1% de leo de oliva, a fim de verificar se os clones recombinantes esto
expressando lpase ou no. As colnias transformadas sero confirmadas por PCR. Aps for
atingida a biomassa requerida, as clulas sero colhidas por centrifugao e ressuspensas em
50 mL de meio BMMY, o qual conter 0,5% de metanol como nica fonte de carbono. A
colnia que apresentar maior atividade ser transferida para um biorreator de 50 L, visando
ento atingir uma escala industrial. RESULTADOS ESPERADOS: expresso e secreo de
lipase em P. pastoris e alto teor de enzima secretada, para que posteriormente ocorra mais
estudos a fim de melhorar a porcentagem de enzima secretada em biorreatores, visando
atingir, no futuro, uma escala industrial.

Perguntas:
1. Por que no transformar diretamente o fungo Aspergillus niger para produzir a lipase?
2. Qual a importncia de se produzir lipase por meio da tcnica de DNA recombinante?
Por que visar a produo a nvel industrial?
3. Por que utilizar o fungo Pichia pastoris como sistema de expresso e no outro
microrganismo?
4. Por que foi utilizado o vetor de expresso pPIC9 e este foi clonado em E. coli?
5. Por que fui utilizado metanol como nica fonte de carbono na etapa de transferncia?
6. Por que fazer o uso de sorbitol para transformao de Pichia pastoris?