Prctica N 1 MICROSCOPA

Blgo. Walter Fernando Manya Agurto

INTRODUCCIN:
Hay 3 grandes problemas que dificultan la observacin de estructuras biolgicas
microscpicas:
1) Las pequeas dimensiones de las clulas y sus organelas.
2) Su transparencia a la luz visible; lo cual origina la falta de contraste entre las
diferentes estructuras y entre stas y el medio que los rodea.
3) Su falta de estabilidad en el tiempo.
Para superar el primer problema se inventaron, construyeron y perfeccionaron
microscopios capaces de aumentar significativamente las imgenes revelando los
pormenores de las estructuras.
Para resolver el segundo problema, se desarrollaron tcnicas de coloracin y tincin,
que permiten aumentar el contraste entre las diferentes estructuras y entre ellas y su
entorno hacindolas claramente visibles y diferenciables.
La estabilidad y preservacin de las estructuras biolgicas llev al desarrollo de
tcnicas de deshidratacin, fijacin e inclusin que nos permiten tener muestras
permanentes.
Todo esto dio origen al desarrollo de disciplinas como la Citologa, la Histologa, la
Microscopa, etc.
MICROSCOPIO.- Es un instrumento ptico que nos permite observa una imagen
amplificada de un objeto pequeo; siempre y cuando sus dimensiones estn dentro
del lmite de resolucin del microscopio.
La cantidad de detalles que puede registrar un sistema ptico depende de la
naturaleza ondulatoria de la luz.
Como se aprecia en la Figura 1; si P es un punto luminoso que irradia ondas
luminosas en todas las direcciones; stas llevan informacin del punto P, pero solo
una fraccin de ellas es captada por la lente AB y son utilizadas para formar la
imagen P1 del punto P. Es por esta razn que ni el mejor instrumento ptico
conocido puede darnos una imagen perfectamente puntual del objeto bajo
observacin.

APERTURA NUMRICA.- Es la expresin numrica de la fraccin de ondas

luminosas que emitidas por el objeto atraviesan la lente y sirven para formar su
imagen.
En la Figura 2 podemos observar que la lente AB recibe un cono de rayos luminosos
provenientes del punto P; si 2u es el ngulo de este cono, la expresin:

AN

n . Sen u

Donde:
AN = Apertura numrica
n = ndice de refraccin del medio entre el punto P y la lente
Sen u = Seno del ngulo de apertura
mide la cantidad de rayos que penetran en la lente y se denomina Apertura Numrica.
Puesto que la funcin Seno est definida en el intervalo [-1 , 1] entonces el Sen u no
puede ser mayor de 1, y dado que el ndice de refraccin de los mejores medios
pticos conocidos no es mayor de 1.6; usando aceite de inmersin, podemos deducir
que la mxima Apertura Numrica que puede lograrse en una lente es de 1.4.
La Apertura Numrica es una constante ptica para cualquier lente y determina la
capacidad de la lente para dar detalles finos del objeto observado.
Su valor est grabado en las lentes objetivo.

PODER DE RESOLUCIN.- Es la capacidad del sistema ptico que nos permite

distinguir 2 puntos situados uno muy cerca del otro como si fueran unidades
independientes y por lo tanto formando imgenes separadas.
Dos puntos forman imgenes separadas entre s siempre y cuando entre ellos exista
una distancia mnima.
LMITE DE RESOLUCIN.- Es la distancia mnima que debe existir entre 2 puntos
para que puedan ser visualizados como entidades independientes.
Si la distancia que separa a los 2 puntos es menor que el lmite de resolucin,
formarn una sola imagen es decir, sus imgenes se superponen.

Ejemplo: El lmite de resolucin del ojo humano es de 0.1mm por lo que, 2 puntos
separados por una distancia menor a 0.1 mm (100 micras) sern visualizados como
uno solo. Por otro lado, el lmite de resolucin del microscopio de luz visible es de 0.2
micras (0.0002 mm); por lo que los puntos sern visualizados como independientes.
El lmite de resolucin es una constante ptica y su valor puede ser calculado por la
siguiente frmula:
--

r = 0.61

AN

Donde:
r = Lmite de resolucin
= Longitud de onda de la luz empleada en la observacin
En general, la radiacin de una determinada longitud de onda no puede ser usada
para observar detalles ms pequeos que su propia longitud de onda; este hecho
representa una limitacin fundamental en todo microscopio compuesto.
Como hemos visto, la mxima apertura numrica que puede lograrse es de 1.4 por lo
tanto, el lmite de resolucin de un microscopio compuesto depende, en ultima
instancia, de la longitud de onda de la luz empleada en la observacin; la cual est en
el rango de 0.4 0.7 micras dependiendo de su color.
En trminos prcticos, las bacterias y la mitocondrias, las cuales estn alrededor de
0.5 micras (500 nanmetros), son las estructuras ms pequeas que pueden ser
vistas con el microscopio compuesto. Estructuras ms pequeas que estas no podrn
ser visualizadas por efectos de la difraccin ptica.

UNIDADES USADAS EN MICROSCOPA

1 milmetro
= 1mm
1 micra
= 1
1 nanmetro = 1nm

= 1000 micras
=
= 1000 nanmetros =
=
10 Angstrom
=

10 3
103 nm
10 A0

MECANISMO DE LA FORMACIN DE IMGENES EN EL MICROSCOPO

Para el caso del microscopio compuesto nos interesa conocer el mecanismo de
formacin de imgenes a travs de lentes biconvexas.
Una manera fcil de entender el funcionamiento del microscopio es, considerarlo
como un sistema ptico formado por dos lentes convergentes: el ocular y el objetivo.
La imagen formada por estas lentes puede construirse por simple geometra.

FORMACIN DE LA IMAGEN EN LA LENTE OBJETIVO.- Como puede apreciarse

en la Figura 3, la imagen resultante, P1Q1 es ms grande que el objeto PQ y adems
es invertida. Esta se conoce como imagen primaria; pues es la primera que se forma
y es real; porque puede recogerse en una pantalla situada en el plano de la imagen,
puede proyectarse y fotografiarse.

FORMACIN DE LA IMAGEN EN LA LENTE OCULAR.- Como puede observarse

en la Figura 4, la lente ocular toma como objeto la imagen formada por la lente
objetivo, P1Q1 para producir su propia imagen, P2Q2. La imagen resultante es ms
grande e invertida con respecto a la imagen del objetivo y derecha con respecto al
objeto. Esta imagen se conoce como imagen secundaria pues es la segunda imagen
que se forma y virtual porque no puede ser recogida en una pantalla, no puede
proyectarse ni fotografiase.

En la Figura 5 se aprecia el mecanismo completo de la formacin de la imagen en un

microscopio compuesto, es importante sealar que tambin interviene una tercera
lente que es el cristalino del ojo del observador.

PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

PARTE MECNICA.- La parte mecnica de un microscopio compuesto consta de:
Tubo ptico.- Cilindro metlico relacionado en su parte superior con la lente ocular y
en la parte inferior con el revlver que porta a las lentes objetivo. En su parte posterior
posee un engranaje llamado cremallera. Cuando el microscopio posee un solo tubo
ptico se llama monocular y si posee 2 se llama binocular.
Brazo.- Dispositivo metlico que en su parte postero-superior lleva un engranaje que
coincide con la cremallera; sirve para fijar el tubo ptico. En su parte inferior se
relaciona con la base por medio de un tornillo llamado charnela el cual permite
inclinar el brazo del microscopio. El brazo porta adems los tornillos macromtrico y
micromtrico.
Tornillo macromtrico.- Situado en la parte superior y lateral de brazo, sirve para
desplazar rpidamente el tubo ptico acercando los objetivos al objeto. Nos da un
enfoque grosero del objeto observado.

 Tornillo micromtrico.- Situado en la parte inferior y lateral del brazo, sirve para
desplazar lentamente el tubo ptico y enfocar al objeto. Nos da un enfoque fino del
objeto observado.

Platina.- Placa metlica que se encuentra fija en la parte inferior del brazo, presenta
una abertura central llamada abertura de la platina destinada a dar paso a los rayos
luminosos proyectados por el espejo y a travs de la cual puede observarse la lente
condensador. En la parte posterior y lateral lleva pinzas que sirven para fijar la lmina
porta objeto.

Revlver.- Sistema discoidal giratorio que va montado en la parte inferior del tubo
ptico, posee 3 4 aberturas donde se atornillan las lentes objetivo. Este dispositivo
permite el intercambio de las lentes objetivo las cuales al girar deben disponerse en el
retn indicando que se encuentran en posicin de observacin.
Tornillo del condensador.- Permite desplazar verticalmente el condensador. Para
una ptima observacin; el condensador debe estar en su posicin ms alta.

Base.- Llamada tambin pie o estativo; sirve para dar estabilidad al microscopio.

PARTE PTICA.- La parte ptica de un microscopio compuesto consta de:

Ocular.- Situado en la parte superior del tubo ptico. Recibe ese nombre por ser la
lente situada ms cerca al ojo del observador. Existen oculares de diferentes poderes
de amplificacin: 4x, 5X, 10x, 12x, y 16x. Su valor se encuentra grabado en la lente
la cual acta como una lupa proporcionando una imagen ms grande, virtual y
derecha de la imagen del objetivo.

Objetivo.- Lentes dispuestas en el revlver, en la parte inferior del tubo ptico.

Reciben este nombre por ser las lentes que se sitan ms cerca al objeto.
Existen objetivos de diferentes poderes de amplificacin : 4x, 10x, 40x, 43x, 63x y
100x.
El objetivo de 100X recibe el nombre de objetivo de inmersin.
Cada objetivo lleva grabado 2 nmeros que corresponde a su poder de amplificacin
y a su apertura numrica. Los objetivos nos proporcionan una imagen amplificada,
real e invertida del objeto.
Condensador.- Concentra los rayos luminosos sobre el objeto.
Diafragma.- Situado debajo del condensador, es un dispositivo con una abertura
central la cual puede ser regulada aumentando o disminuyendo su dimetro. Sirve
para regular la intensidad luminosa y es muy til cuando los objetos observados son
muy trasparentes puesto que nos permite contrastarlos sobre un fondo luminoso.

 Espejo.- Se encuentra situado debajo de la platina y est montado es un soporte

que permite girarlo en cualquier direccin.
Es un elemento fundamental del sistema de iluminacin del microscopio puesto que
al dirigirlo hacia la fuente de luz permite reflejar los rayos luminosos hacia el objeto.
Posee una cara plana que es usada cuando se trabaja con luz natural y una cara
cncava que se utiliza cuando se trabaja con luz artificial.

En microscopios modernos es reemplazado por un foco.

PODER DE AMPLIFICACIN TOTAL
El poder de amplificacin total de un microscopio compuesto, para cualquier
combinacin de oculares con objetivos, se obtiene multiplicando los respectivos
poderes de amplificacin.
Ejemplo: Si usamos un ocular de 10x combinando con un objetivo de 40x entonces, el
poder de amplificacin total es de 400x
Al usar esta combinacin de lentes observamos una imagen amplificada 400 veces el
dimetro del objeto.
OBJETIVOS:

Reconocer cada una de las partes de un microscopio compuesto.

Determinar la funcin que cumple cada una de la partes.
Conocer lo cuidados que deben tenerse para el uso correcto del microscopio.
Lograr un uso eficiente del microscopio.

MATERIALES:
Del estudiante:
1 franela
3 lminas portaobjetos
3 lminas cubre objeto (laminillas).
1 frasco gotero.
Papel lente
Tijera, pinza, bistur y estilete
Hebras de lana y algodn
Papel bond escrito a maquina
Papel milimetrado.
Del laboratorio:
Microscopio compuesto
Aceite de inmersin
Alcohol absoluto : ter etlico (1 : 2)

MTODO:
El microscopio es un instrumento de precisin, delicado y caro. Por ms slido que
parezca no debe ser sometido a un trato rudo pues esto afectara su delicado
mecanismo. Es necesario familiarizarse con sus partes y a continuacin seguir los
siguientes pasos:
El microscopio se transporta cogiendo con una mano el brazo y con la otra se
soporta la base.
Limpie la mesa de trabajo con un pao limpio.
Elegir un lugar, en la mesa de trabajo, de manera que el microscopio est
estable.
Limpie la parte mecnica del microscopio: tubo ocular, brazo, platina, tornillos
macromtrico y micromtrico, tornillo del condensador y base. Use un pao limpio
y seco.
Proceda a limpiar el sistema ptico: ocular, objetivos, condensador y espejo. Esta
limpieza se lleva a cabo usando nicamente PAPEL LENTE y cuidando de no
colocar los dedos sobre las lentes.
Seleccione el objetivo de menor aumento.
Desplazar el tubo ptico a su mnima posicin.
Verificar que el diafragma est completamente abierto.
Con ayuda del respectivo tornillo, desplace el condensador a su posicin ms alta.
Verifique que entre el espejo y la fuente de luz no existan obstculos.
Mirando por el ocular, dirigir el espejo, por su cara cncava, hacia la fuente de luz
hasta que el campo de microscopio se ilumine intensamente y en forma
homognea.
Una vez completado este procedimiento, el microscopio est enfocado, apto para
proceder a la observacin de las muestras deseadas y no debe ser cambiado de
lugar pues la posicin del espejo con respecto a la fuente de luz varia y habra que
enfocarlo nuevamente.
DESARROLLO EXPERIMENTAL:
Limpie una lmina porta objeto con un pao limpio y seco. Maneje la lmina
nicamente por los bordes.
Con sumo cuidado limpie una lmina cubre objeto.
Con un gotero, coloque una o dos gotas de agua en el centro de la lmina porta
objeto.
Recorte una letra e minscula y, con ayuda de la pinza y el estilete, colquela en
la gota de agua en posicin de lectura.
Cubra la muestra con una laminilla cubre objeto evitando la formacin de burbujas
de aire.
Seque el exceso de agua con papel absorbente.

 Disponga esta preparacin; llamada preparacin hmeda, sobre la platina y

sujtela con las pinzas.
Proceda a observar con el objetivo de menor aumento. Dibuje sus observaciones.
Observando por el ocular cierre lentamente del diafragma anotando los cambios
en la imagen.
Desplace la lmina porta objeto hacia arriba, luego hacia abajo y describa el
desplazamiento de la muestra.
Desplace la lmina porta objeto hacia la derecha, luego hacia la izquierda y
describa el desplazamiento de la muestra.
Gire el revlver para seleccionar el objetivo de mediano aumento. Dibuje sus
observaciones.
Realice la misma operacin para el objetivo de mayor aumento.
Una vez terminada la prctica, limpie la parte mecnica con la franela y el sistema
ptico con papel lente. Seleccione el
objetivo de menor aumento, abra
completamente el diafragma, coloque el tubo ocular en su mnima posicin y guarde
el microscopio.

CUESTIONARIO
1.- Qu es difraccin ptica. Explique cmo influye este fenmeno en microscopia.
2.- Qu es refraccin y como influye en microscopia.
3.- La fuente luminosa de un microscopio compuesto es radiacin ultravioleta, de
2000 de longitud de onda y lo usamos con objetivos de apertura
Numrica 0.25 y 0.65. Calcular el lmite de resolucin del microscopio para cada
uno de lo objetivos.
4.- El PPLO (organismo del tipo de la pleuroneumona) mide 0.1 u de dimetro.
Exprese su tamao en milmetros, nanmetros y ngstrom.
5.- De qu factores depende el aumento microscopio?
6.- Qu otros tipos de microscopios existen?
BIBLIOGRAFA
BAKER, J. W. & ALLEN, G.E. Biologa e Investigacin Cientfica. 1970. Fondo Educativo
Interamericano S.A.
BRUCE, A.; BRAY, D.; LEWIS, J; RAFF, M, ROBERTS, K. & W.ATSON J.D. Molecular
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Dcima Edicin. Editorial El Ateneo.
WALD, G.; ALBERSHEIM, P.; DOG. J.; HOPKINS, J. & LACKS, S. Twenty six afternoons
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VILLEE, C.A. Biologa. 1978. Sptima Edicin. Nueva Editorial Interamericana. Mxico.