Biologa

Molecular
Aplicada

Memoria de Prcticas

Bioqumica y Biologa
Molecular Aplicada

ngel Gutirrez Valpars. 4 Biologa

INota: Las anotaciones recogidas durante las prcticas vienen

reflejadas en rojo. El resto de la informacin corresponde al
protocolo utilizado durante su desarrollo.

PRCTICA 1. Purificacin de RNA total a partir de tejido heptico de rata.

(Tri-Reagent).

A partir de unos 100 mg de tejido heptico extrado de rata y conservado a -70C, nos
propusimos hacer una extraer RNA.
*El trabajo con RNA requiere una atencin especial en el procedimiento, hay que ser muy
cuidadoso y usar guantes. Tanto las puntas de micro pipeta como los tubos Eppendorf
empleados han de ser estriles. Se ha de tratar de mantener el tubo cerrado en todo momento
no tocar la boca del tubo ni pasar por encima de las muestras
Para ello, se cogi un trozo de tejido ultracongelado y, mientras an estaba congelado, ya que
la tarea se vuelve ms difcil cuando el tejido se descongela, lo trituramos con ayuda de una
varilla de vidrio tratada con hidroxil sdico y agua pura en un horno durante un da, para
eliminar las RNAsas, que son muy resistentes al calor. Para lisar las clulas se empleo 1 ml de
Tri-Reagent, un reactivo comercial que contiene un agente caotrpico, el tiocianato de
guanidinio, que desnaturaliza protenas y disgrega el tejido, adems el reactivo contiene fenol
en un tampn de acetato sdico a pH acido (pH 5) que contribuye a la disgregacin del tejido,
lisis celular y extraccin de molculas hidrofbicas durante la etapa de separacin de fases.
Tras mezclar bien para lograr la lisis total de las clulas, se incubo a temperatura ambiente
durante 5 minutos. Posteriormente se aadieron 0,2 ml de cloroformo, se agito y se dej
incubando a temperatura ambiente de 2 a 15 minutos, hasta que se observ que la muestra l
estaba bien disgregada.
Se centrifugo a mxima velocidad en la microcentrifuga, 14 RPM, que se corresponde con una
fuerza centrfuga relativa de 20817 G, este ltimo valor es el realmente interesante de cara a
reproducir el experimento ya que no solo depender de las RMP del aparato, sino tambin del
radio del rotor, durante 15 minutos a 4C. Esta centrifugacin separa la mezcla en tres fases:
la fase orgnica que contiene protenas y componentes celulares hidrofbicos, una interfase
que contiene el DNA, a pesar de ser hidrfilo y de gran tamao, atrapado en complejos DNA-
protena y la fase acuosa superior e incolora que contiene el RNA (hidrfilo).
Se transfiri la fase acuosa a otro tubo Eppendorf limpio y se aadi 0,5 ml de isopropanol,
asumiendo que tenamos 1 ml de reactivo. Se mezcl bien y se incubo 10 minutos a
temperatura ambiente. De nuevo se puso a centrifugar a mxima velocidad durante 10
minutos. Con esto el RNA precipito en el fondo del tubo.
Se elimin el sobrenadante y se lav el sedimento aadiendo 1ml de etanol al 75%. Tras esto
se volvi a centrifugar a mxima velocidad durante 1 minuto.
Se sec bien, arrastrando las gotas muy pequeas para que se evaporaran. Se procur evitar
que la muestra se resecara, reducindose as la solubilidad. Se resuspendi y disolvi en 50 l
agua milQ (agua desionizada).
A partir de esta mezcla, se prepararon 200 l de disolucin 1/100. Se cuantifico la
concentracin del RNA obtenido mediante la medida de la absorbancia a 260 y a 280 nm,
conservando la preparacin a -20 C hasta su utilizacin.
Normalmente se suelen obtener unos 6-10 g de RNA
por cada mg de tejido, y con un grado de pureza

expresado en una relacin de absorbancia 260/280 1,7.

Este es un detalle de los resultados mostrados en pantalla en el anlisis de nuestra muestra.
Los resultados obtenidos fueron los siguientes:
Grupo
A260/A280
[RNA]
Equipo A
1,78
3,46 g/ l*
Equipo B
1,86
7,34 g/ l
II
1,81
9,68 g/ l
LOC
1,73
11,35 g/ l
*El bajo resultado en la concentracin del primer grupo puede ser debido a no haber agitado
bien la muestra antes de la medida.

PRCTICA 2. Sntesis de cDNA a partir del RNA total obtenido en la

Prctica 1, utilizando oligo dT como cebador.

Se utiliz el protocolo adaptado que acompaa a la transcriptasa reversa RevertAid H minus
reverse transcriptase (de la casa comercial Fermentas).
Todos los reactivos fueron conservados a -20C, por recomendacin de la casa comercial,
hasta su uso.
En un tubo Eppendorf de 1,5 ml se mezclaron 2 l de la solucin de RNA purificado en la
sesin anterior, con la intencin de tener 4-5 g de RNA. Tambin se aadi 1 l de oligo dT y
9,5 l de agua para completar los 12,5 l de volumen.
Tras esto se puso a incubar a 65Cdurante 5 minuto, para deshacer las estructuras
secundarias, e inmediatamente despus se coloc la muestra en hielo, ya que a temperatura
baja los puentes de hidrogeno entre T y A sern ms estables, es decir entre el oligo dT y la
cola de poliA.
A cada reaccin* se le aadi 4 l de tampn de reaccin 5X, 0,5 l de inhibidor de RNAsa
(RiboLockTM), 2 l dNTPs 10 mM y 1 l de transcriptasa reversa RevertAid H minus reverse
transcriptase (de Fermentas), consiguiendo un volumen total de 20 l.
Se incubo a 42 C durante 1 hora y, tras esto, se par la reaccin calentando a 70C durante 10
minutos, inactivado as el enzima, finalmente se guard el cDNA a -20C hasta su utilizacin en
el anlisis de la expresin de genes.
*En estos casos, lo que se realiza es una premezcla. Se multiplica todo por 6 (para preparar
cuatro reacciones y que an sobre). Por lo tanto para la preparacin de la premezcla
emplearemos 24 l de tampn de reaccin 5X, 3 l de inhibidor de RNAsa (RiboLockTM), 12 l
dNTPs 10 mM y 6 l de transcriptasa reversa RevertAid H minus reverse transcriptase y luego
pipetearemos 7,5 l de la premezcla a cada reaccin. LA ventaja es que na vez preparado solo
pipetearemos con una sola pipeta, evitando as errores en experimentos comparativos.
En este caso el oligo dT es un 9 mer, es decir, un polmero formado por 9 monmeros.

Se recomienda quitar la punta sin soltar el embolo y manualmente, para evitar el

acumulo de aerosoles.

Los tubos se tapan con parafilm al meterlos en la centrifugadora y la incubadora

(bao) para evitar la entrada de impurezas. El parafilm se suele colocar con la parte no
expuesta pegada al tubo.

P PRCTICA 3. Estudio de la expresin de algn gen mediante la

amplificacin del cDNA (obtenido en la prctica 2) por la Reaccin en
Cadena de la Polimerasa (PCR)

Para la PCR se utiliza la Taq polimerasa de Thermus aquaticus recombinante suministrada por
la casa comercial Sigma-Aldrich y en el procedimiento se incluyen las recomendaciones de uso
que acompaan al enzima.
En un microtubo, adecuado al aparato de PCR que se vaya a utilizar y mantenido en hielo se le
aaden las siguientes cantidades de los componentes de la reaccin*: 1 l de cDNA, 2,5 l
tampn 10X (sin Mg2+ ), 2,5 l MgCl2 25 mM, 0,5 l dNTPs 10 mM, 1 l primer forward,1 l
primer reverso, 0,5 l Taq polimerasa y Agua hasta 25 l, es decir 16 l de agua.
Para cada tipo de muestra de amplificacin se debe poner un control que lleve todos los
componentes excepto el cDNA molde, en sustitucin pondremos 1 l de agua.
El tubo (o tubos) de las distintas reacciones se colocan en el termociclador previamente
programado de acuerdo con las siguientes premisas:
En cada ciclo ha de haber tres etapas:
1) Desnaturalizacin a 94 C durante 30 segundos
2) Hibridacin a la temperatura ligeramente inferior a la de las Tm del par de
oligodesoxirribonucletidos cebadores, en este caso 50 C, durante 30 segundos.
3) Sntesis a 72 C durante un tiempo a razn de 1 min/Kb
Este ciclo de 3 etapas se repetir 30-35 veces y a estos 30-35 ciclos le seguir una nica etapa
de elongacin a 72 C durante 2 min.
*En este caso, tambin se preparara una premezcla inicial con todos los componentes, salvo el
cDNA, multiplicando las cantidades por 10, teniendo as cantidad para las muestras de 2
grupos (4 muestras por grupo, 2 controles y dos muestras de amplificacin con primers
diferentes) y aun nos sobra material.
Para evitar amplificar DNA, se utilizan primers e genes reparados por intrones grandes. A
partir de los primers utilizados podemos, mediante BLAST, deducir a que genes corresponden
el mRNa que tratamos de amplificar.
Primers Gen 1.
P155
P156

55,7 C
55 C

Left primer
Right primer

5-AACTTCGATGCTGAGAGGGA-3
5-AAAATCACCGTCTCCAGGTG-3

Estos primers tratan de amplificar el mRNA de Mus musculus annexin A2 (Anxa2).

Primers Gen 2.
P169
P170

54,2 C
51,9 C

Left primer
Right primer

5-CCACAACTTTGGCTGGTTTT-3
5-AAGCCAAAATCATGGATTGC-3

Estos primers tratan de amplificar el mRNA de Mus musculus annexin A10 (Anxa10).

PRCTICA 4. Anlisis electrofortico de los resultados de la PCR.

Obtencin de imgenes, documentacin y discusin de los resultados
obtenidos.
Para la preparacin de geles de poliacrilamida al 7 % de 0,75 mm (con los que se necesitara
menos cantidad de muestra y correr ms deprisa). Las bandas son de tamaos lo
suficientemente pequeas para resolverlas en poliacrilamida.
Permiten separar las bandas en condiciones nativas, no desnaturalizantes.
Para dos geles del miniprotean II se necesitaron 9,5 ml de agua desionizada, 4 ml de solucin
de acrilamida (30%)/Bis-acrilamida (0,8%), 1,5 ml de tampn TBE 10X, 280 l de persulfato
amnico al 10% y 12 l de TEMED.
Para la preparacin de la muestra, se tomaron 10 l de muestra y 5 l de tampn de carga.
Posteriormente, tras que el gel solidifique, se llev a cabo la electroforesis. La separacin
electrofortica de los productos de la(s) PCRs se llev a cabo a voltaje constante de 200 voltios,
en tampn TBE 1X, durante aproximadamente 45 min.
Una vez finalizada la electroforesis los geles fueron incubados en una solucin conteniendo
bromuro de etidio y fotografiados utilizando un equipo que analiza la imagen fluorescente
emitida por el agente intercalante al ser iluminado con luz ultravioleta.
Los marcadores de tamao utilizados fueron obtenidos dl DNA del fago X: 174 cortadas con
HaeIII.
La posicin de las muestras en el gel de agarosa es la siguiente:
1. Control del Gen 1 del grupo B.

6. Muestra del Gen 2 del grupo B.

2. Calle perdida debido a contaminacin.

7. Control del Gen 1 del grupo A.

3. Muestra del Gen 1 del grupo B.

8. Muestra del Gen 1 del grupo A

4. Marcadores de tamao.

9. Control del Gen 2 del grupo A

5. Control del Gen 2 del grupo B.

10. Muestra del Gen 2 del grupo A

En ambos grupos se observa que el gen 1, es decir, Mus musculus annexin A2, se expresa en el
tejido analizado, a diferencia del gen 2, es decir, Mus musculus annexin A10. Este gen se sita
a la altura de las bandas de 271- 310 pb.