Fundamentos de Electroforesisi Capilar

FUN DA MEN T OS DE
E LE CT ROFORES IS C API LAR Y

APLI CA CI ON ES
Contenido del Curso

Introduccin a la Electroforesis Capilar
(EC).
Fundamentos de EC
Modalidades de separacin por EC.
Principales variables y respuestas en EC.
Desarrollo de Mtodos por EC.
Problemas y soluciones
Aplicaciones
Dr.VictorH.AbregoReyes
INTRODUCCIN
Introduccin
Es una de las tcnicas de separacin ms
utilizadas en el primer mundo.
De gran importancia en el anlisis y
purificacin de biomolculas
Introduccin
Descripcin de migracin debida a la aplicacin de un campo
elctrico 1a vez Reuss 1809
Corrienteelctrica
Bateria
Ctodo
nodo
Arena
Introduccin
Michaelis sugiere el nombre de electroforsis
(1909)
Anie Tiselius perfecciona un instrumento
para llevar a cabo la electroforesis de zona
(1937)
Empleo de tubos capilares para mejorar la
disipacin del calor, DI 1-3mm, giraban en
su propio eje para ser enfriados. Hjertn
electroforesis capilar.(1967)
FUNDAMENTOS
Electroforesis
Es la migracin de especies cargadas
que
se
encuentran
disueltas
o
suspendidas en un electrolito, por
influencia del campo elctrico, de esta
manera los cationes migran hacia el
electrodo negativo (ctodo) y los aniones
migran hacia el electrodo positivo
(nodo).
Electroforesis Capilar
Electrofore
sis
Tradiciona
l
Electrofor
esis Capilar
Es la migracin de
especies cargadas por
influencia del campo
elctrico que se
encuentran disueltas o
suspendidas en un
electrolito.
Tcnica analtica instrumental de

separacin,
que
permite
la
identificacin y cuantificacin de
analitos en muestras que tienen una
matriz compleja. Usando el principio
de la Electroforesis convencional.
ctodo
nodo
Electroforesis convencional
Capilar de slice fundida
Compartimento
termostatizado
Detector
Entradadelcapilar
Electrodo
Electrodo
Salidadelcapilar
Reservorio
Fuente de
alimentacin de
voltaje
Reservori
o
Esquema bsico de un equipo de

Adquisicin
De
Datos
Principios bsicos de EC
El entorno dentro del capilar
Entorno
Analito
(muestra)
Buffer
(medio)
Campo
elctrico
Pared del
capilar
Influencia de las propiedades del analito
Entorno
Analito
(muestra)
Buffer
(medio)
Campo
elctrico
Tamao y
forma
Carga
neta
Masa
Pared del
capilar
Influencia de las propiedades del medio
Entorno
Analito
(muestra)
Buffer
(medio)
Campo
elctrico
Fuerza inica
Temperatura
pH
Viscosidad
Constante dielctrica
Pared del capilar
Efecto
deJoule.
la temperatura
Calor de
Ya que una corriente elctrica
pasa a travs del capilar esta se convierte en
calor.
Este depende tambin del dimetro interno
del capilar y el ambiente externo.
Un gradiente de temperatura es generado de
manera radial
Efecto de la temperatura
Calor de Joule excesivo
Incrementa la mobilidad aproximadamente
2%/C
Incrementa el ancho del pico
Puede producir micro-burbujas las cuales sern
detectadas como picos falsos.
El buffer puede hervir, causando una cada de
corriente debido a la interrupcin de la
conductividad
Mtodos de
control
Influencia de las propiedades del campo
elctrico
Entorno
Analito
(muestra)
Buffer
(medio)
Campo
elctrico
Voltaje
aplicado
Longitud
Fuerzas
conductoras
Pareddel
capilar
CE Fundamental Equations
Terminology
Detector
Ld
Length to
Detector
Capillary
Inlet
Reservoir
Capillary
Outlet
Reservoir
Lt
Total Capillary
Length
Flujo electrosmtico
Influencia de las propiedades del capilar
Entorno
Pareddel
capilar
Buffer
(medio)
Cargasuperficial
Recubrimiento
Flujoelectrosmtico
Campo
elctrico
Analito
(muestra)
El capilar
Vidrio
Cubierto permanentemente con polimida
La superficie interna puede encontrarse
cargada
La carga en la superficie puede ser
manipulada
Responsable del flujo electroosmtico
Ionizacin de los silanoles
Los grupos silanol son fcilmente

ionizables cerca del pH 4.
La pared del capilar estar cargada
negativamente
La cantidad de cargas es controlada
por el pH del buffer.
Parmetros importantes
en EC
Fuerza del campo elctrico
Velocidad electrofortica
Movilidad electrofortica
Efecto del pH del buffer
Efecto del campo elctrico
Flujo electrosmtico
MOVILIDAD ELECTROOSMTICA
- - - - - - - - - - - - - - - - - -
- - - - - - - - - - - - - - - - - OH
Si
pH alto
pH bajo
OSi
EO
EO
FEO
MOVILIDAD ELECTROFORTICA
Y ELECTROOSMTICA
EO
EF=0
V
t
ANALITO
S
NEUTRO
S
EO
EF
EO
EF
V
CATIONE
t
S
tm < tm <
tm
V
ANIONES
t
EL PERFIL DE FLUJO
Perfil de velocidad electroosmtica
Perfil de velocidad electrodinmica

(flujo laminar)
FLUJO ELECTROOSMTICO
El
FEO
puede
ser
eliminado
permanentemente, si se modifica la pared
del capilar o temporalmente, recubriendo
la pared del capilar con algn polmero
adicionado al electrolito soporte.
El FEO puede ser invertido.
PARMETROS QUE
AFECTAN AL FEO
Campo elctrico
pH del buffer
Fuerza inica o concentracin del buffer
Temperatura
Modificadores orgnicos
Surfactantes
Cubrimientos covalentes
Polmeros hidroflicos neutros
TIPOS DE
SEPARACIN
Tipos de separacin
Electroforesis capilar de Zona (ECZ)
Electrocromatografa Capilar (ECC)
Cromatografa Electrocintica capilar
(CECM)
EC en gel o redes polimricas (ECG)
Isoelectroenfoque Capilar (IEC)
Isotacoforesis (ITF).
CZE
ISOELECTROENFOQUE CAPILAR
Se usa un capilar neutro empacado con algn
gel.
Se administran anfolitos generado un gradiente
de pH dentro del capilar.
La muestra se prepara en un medio que permita
tenerla con carga elctrica y se inyecta en el
capilar.
Los compuestos se separan de acuerdo a su PI,
al aplicar un potencial.
Deteccin en lnea
ISOELECTROENFOQUE CAPILAR
PRESIN
-+
+
+
- -
+
-+
-+
Se
al
+
+
+
+
+
-
Tiempo de migracin
EC EN GELES O REDES POLIMRICAS

Tcnica muy usada en biologa para la
separacin de protenas y cidos
nucleicos.
Las molculas se separan al moverse a
travs de una red de polmero que acta
como tamiz molecular.
Las molculas grandes poseen una
trayectoria ms obstaculizada que las
pequeas, por lo que su tiempo de
migracin es mayor.

El proceso es similar a la electroforesis
en gel de poliacrilamida, pero con las
ventajas de usar un capilar.
En un inicio se usaban geles anclados
que se report, proporcionan hasta 23
millones de platos tericos.
Actualmente se usan redes polimricas
(polmeros lquidos).
Se
al
Tiempo de migracin

Matrices de Polmeros para ECG
Polmero
Crosslinked polymers
Poliacrilamida
Aplicacin
Oligonucleotidos, Secuenciacin de ADN,

Protenas SDS
Polmeros Lineales
Poliacrilamida, Polivinil alcohol, dextran
Fragmentos de restriccin
Oligonucleotidos, Secuenciacin de ADN,
Protenas
Agarosa
Fragmentos de restriccin
Protenas
CROMATOGRAFA
ELECTROCINTICA MICELAR
CROMATOGRAFA
Permite la separacin de compuestos neutros (q=0) o con
movilidades electroforticas muy similares.
La separacin se debe a diferencias en la movilidad
electrofortica y a diferencias en interacciones con la fase
pseudoestacionaria que presenta cada compuesto.
s
+
Porcin
Porcin
hidroflic hidrofbica
a
s
CROMATOGRAFA
Es una tcnica hbrida entre la cromatografa

lquida de alta resolucin y la electroforesis
Capilar.
El solvente es transportado por medio del
flujo electrosmtico y no por presin como en
HPLC.
El empaque usado puede usarse con tamao
de partcula menor (0.5-2 micras).
CROMATOGRAFA
Permite la separacin de analitos neutros y

con carga.
Es posible manipular la selectividad del
proceso al variar la composicin de la fase
mvil y de la estacionaria.
Aplicaciones
APLICACIONES
MOLCULAS DE INTERES BIOQUMICO.
Frmacos, Anlisis Clnicos.

Productos Naturales, Industria Alimentaria.
Quelatos Metlicos
Contaminantes
Explosivos
Ismeros
APLICACIONES
MOLCULAS DE INTERS BIOQUMICO:
Prtidos, Aminocidos, Amino-azcares.
Pptidos
cidos Nucleicos
Purinas y Pirimidinas, Nuclesidos

Nucletidos y Oligonucletidos
Fragmentos de DNA.
Perfiles protenicos en leche
Pesos Moleculares de protenas
Eritropoyetina Anlisis de Isoformas

segn Farmacopea Europea.
ApplyingtheEuropeanPharmacopoeiaCapillaryZoneElectrophoresisMethodfortheSeparationofRecombinantHuman
Erythropoietin(rhEPO).AplicacintcnicaBeckamnCoulter.Enwww.beckman.com
EC PARA LA EVALUACIN DE BIOCOMPATIBILIDAD DE

PROTENAS TERAPUTICAS Y VACUNAS
Pureza
Heterogeneidad
Identidad
MEJOR RESOLUCIN Y CUANTIFICACIN

0.008
mAU
45
40
kD
35
30
200
0.006
25
20
15
116.3
97.4
10
10
12
14
16
18
min
0.004
AU
66.3
55.4
36.5
6
5
4
3
31
21.5
0.002
0.000
13
14
15
16
17
18
19
Minutes
CE-SDS reduced / UV (220nm)

20
21
22
RESOLUCIN DE IMPUREZAS EN IgG
RESOLUCIN DE IMPUREZAS EN VACUNAS
Polisacridos en vacunas
Ms de IgG
Hirudina
A. Separacinderhirudindeunamuestraprovenientedeunfermentador.
B. Muestraderhirudinpurificada.
HORMONA DE CRECIMIENTO
Separacindehormonadelcrecimientohumana
A. recombinante.
B. natural
Glicanos
|
Anlisisdeviruscompletos
DetectordeFluorescencia
Otra aplicaciones. Separaciones Quirales
Drogas de abuso
Orina
Cabello
Residuos de Disparo
Polvora
Anlisis Gentico
Gracias

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Tcnica analtica instrumental de

Esquema bsico de un equipo de

Pared del capilar

Ionizacin de los silanoles

Los grupos silanol son fcilmente

Fuerza del campo elctrico

Efecto del pH del buffer

Efecto del campo elctrico

Perfil de velocidad electroosmtica

Perfil de velocidad electrodinmica

EC EN GELES O REDES POLIMRICAS

EC EN GELES O REDES POLIMRICAS

EC EN GELES O REDES POLIMRICAS

EC EN GELES O REDES POLIMRICAS

Oligonucleotidos, Secuenciacin de ADN,

Es una tcnica hbrida entre la cromatografa

Permite la separacin de analitos neutros y

MOLCULAS DE INTERES BIOQUMICO.

Frmacos, Anlisis Clnicos.

Purinas y Pirimidinas, Nuclesidos

Perfiles protenicos en leche

Pesos Moleculares de protenas

Eritropoyetina Anlisis de Isoformas

EC PARA LA EVALUACIN DE BIOCOMPATIBILIDAD DE

MEJOR RESOLUCIN Y CUANTIFICACIN

CE-SDS reduced / UV (220nm)

RESOLUCIN DE IMPUREZAS EN IgG

RESOLUCIN DE IMPUREZAS EN VACUNAS

Otra aplicaciones. Separaciones Quirales

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