REGION CIUDAD DE MXICO

CAMPUS COYOACN
LICENCIATURA EN MEDICINA

Protocolo de prcticas
AGRESIN Y DEFENSA

Asignatura: AGRESIN Y DEFENSA

Profesor Titular teora: Q.F.B. MNICA RODRGUEZ
Profesor de Laboratorio: Q.F.B. MNICA RODRGUEZ
Auxiliar de Laboratorio:

Grupo: 3

Horario del Laboratorio: Lunes 16:00 19:00

Prctica No. 4
Temtica: Cultivos
Nombre de la prctica: TCNICAS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS Y
LEVADURAS
Nmero de sesiones que se utilizarn para esta prctica: 2
Equipo nmero 2
Integrantes
1. Alejo Snchez Katia Itzel
2. Armendriz Nagore Nydia Iliana
3. Baez Tello Tirza Vania
4. Gonzlez Corts Rosa Laura
5. Ruiz Altamirano Michelle
6. Snchez Lli Luna Edgar Ral
Coordinador del equipo: Baez Tello Tirza Vania
INTRODUCCIN:
La identificacin de hongos y bacterias es dependiente de la morfologa de las colonias cuando
crecen en medio slidos, as como su crecimiento y morfologa de estructuras reproductivas.
Para la identificacin de las levaduras es importante la actividad fisiolgica en cultivos en el
laboratorio.
En la bacteriologa, se necesita usar tipos diversos de medios para el cultivo corriente.
Los cultivos en caldo, que son medios altamente enriquecidos, son importantes como formas
de respaldo de los resultados de los tejidos para biopsia y lquidos corporales. Con los caldos
se pueden obtener resultados positivos si no proliferan los microorganismos en medios slidos,
ante el escaso nmero de bacterias que tiene el inculo.
Muchas levaduras proliferan en agar sangre. Los hongos en fase bifsica y de micelio crecen
mejor en los medios elaborados de modo especfico para hongos.
CLASES DE MEDIOS DE CULTIVO.
Medios simples.
Agar Nutritivo

 Caldo Nutritivo
Agar Base Sangre
MARCO TERICO:
Las bacterias deben ser cultivadas en medios de cultivo de laboratorio para caracterizar su
crecimiento, hacer su identificacin y determinar sus actividades metablicas. Un medio de
cultivo es una solucin acuosa de diferentes compuestos que contiene todos los elementos
indispensables que requieren los microorganismos para crecer.
Generalmente las bacterias son inoculadas o introducidas en medios lquidos (caldos) o
solidificados con agar para su propagacin y/o conservacin, as como para estudiar sus
caractersticas de crecimiento.
Es importante recordar que la inoculacin de los microorganismos en los medios de cultivo,
siempre debern realizarse en zona asptica (cerca del mechero o en campana de flujo
laminar), condiciones que limitan la presencia de microorganismos indeseables o
contaminantes.
Las tcnicas de aislamiento, permiten la obtencin de microorganismos a partir de muestras
complejas (suelo, agua, alimentos, etc.) en las que hay una gran diversidad microbiana, as
como para comprobar la pureza de los cultivos obtenidos. Los cultivos puros estn formados
por un solo tipo de microorganismo; y son indispensables para conocer las caractersticas
morfolgicas, propiedades de tincin, actividad bioqumica, patogenicidad, sensibilidad a
antibiticos e identificacin de las especies microbianas.
El aislamiento de cultivos microbianos puede realizarse por mtodos de dilucin, en medios
slidos por estra en placa o en medios lquidos. En el primer caso se considera que cada
clula bacteriana que se separa dar origen a una poblacin que formar una colonia
caracterstica, visible a simple vista.
La limitacin principal de estas tcnicas de dilucin, es que no es prctica para el aislamiento a
partir de mezclas donde el microorganismo de inters se encuentra en pequeas cantidades,
donde solamente se obtendrn las bacterias dominantes. Para favorecer el aislamiento de
cultivos de baja intensidad, se aplican mtodos de cultivo especiales, en los que se utilizan
medios que contienen nutrientes especiales, antibiticos, altas concentraciones de sales y/o
condiciones de pH, luz o temperatura para favorecer el crecimiento de microorganismo de
inters y se conocen como selectivos o de enriquecimiento.
En ocasiones se pueden agregar a los medios de cultivo otros componentes como: sangre,
colorantes, indicadores, etc. Para distinguir especies bacterianas diferentes por la forma en que
metabolizan los sustratos que se manifiesta por cambios en la apariencia o modificacin del pH
del medio de cultivo. Estos medios se conocen como medos diferenciales y son de gran utilidad
para la caracterizacin e identificacin de especies bacterianas.
Almacenamiento y conservacin de medios de cultivo.
Los medios de cultivo deben ser conservados en lugares secos, protegidos de la luz, a una
temperatura entre 15 y 30oC, en envases bien cerrados y dispuestos preferiblemente de forma
horizontal. Despus de haber sido retirada una cantidad de medio de los envases, estos deben
cerrarse firmemente.
Los medios de cultivo preparados y esterilizados listos para su uso son utilizables por tiempos
cortos, mximo de una semana y lo ms conveniente es almacenarlos a temperatura de
refrigeracin (mximo 4oC); aunque algunos medios que contienen tioglicolato, se conservan
mejor a temperatura ambiente y protegidos de la luz por un tiempo mximo de 4 das. Bajo

condiciones ptimas de almacenamiento, los medios deshidratados conservan sus cualidades

durante el tiempo indicado.
CUESTIONARIO

1. Describir una tcnica de aislamiento bacteriano a partir de una fuente natural.

- Tcnica se aislamiento y recuento. Banco de diluciones.
- Tcnica que consiste en obtener una suspensin de la mezcla de microorganismos y hacer
diluciones seriadas que se vierten en una placa Petri hasta conseguir colonias aisladas.
- Estras escocesas: se procede de forma similar al caso anterior, en lo que se
respecta al mtodo general para la siembra en placa y permite tambin obtener colonias
aisladas

2. Describe cul es la tcnica de aislamiento en tubo.

- Tcnica de placa vertida: esta tcnica consiste en hacer la dilucin de la muestra en tubos de
ensayo con Agar fundido y enfriado. Para hacer las diluciones se requieren de ms de dos
tubos, para obtener colonias aisladas. El medio de cultivo se mantiene en estado lquido a 45
C para permitir la mayor reproduccin y distribucin de la muestra. Una vez hecha la muestra
se coloca en la caja petri y se incuban. Se procede a aislar bacterias, que es el principal
objetivo de esta tcnica aislar tipos de bacterias en forma cuantitativa y cualitativa.
- Tcnica de aislamiento en una sola clula: para obtener un solo microorganismo, para su
estudio se necesita de equipo especial como el micromanipulador. Este aparato permite al
investigador o cientfico controlar los movimientos con una sola micropipeta. Al observando
bacterias, si se desea investigar, a una en especial se atrapa a la clula. Esta tcnica se utiliza
en estudios especializados con operadores o investigadores especializados.
- Tcnica de Enriquecimiento de Cultivo: esta tcnica es crear un tipo de ambiente adecuado
para cierta bacteria u otros organismos para su proliferacin.

3. Qu es un cultivo axnico o puro?

Un cultivo puro o axnico es aquel que contiene un solo tipo de microorganismo.
En el cultivo axenico es un grupo de bacterias en cultivo, pero sin control, y en el cultivo puro,
se lleva un control de reproduccin para que se conserve sus caractersticas genticas puras.

4. Qu importancia tiene la obtencin de un cultivo puro?

Una vez que se obtiene un cultivo puro, normalmente se ha de propagar (se le hace crecer de
nuevo). Para cultivar microorganismos en el laboratorio, se ha de preparar un medio de cultivo,
lquido o slido, con todos los nutrientes necesarios para su crecimiento. Los medio slidos se
hacen generalmente, aadiendo agar a los lquidos

5. Mencionar 5 Colecciones de Cultivos suministradoras de cultivos microbianos Puros.

Medios Sintticos o Definidos

Medios Selectivos
Medios Complejos o Indefinidos

Medios Enriquecidos
Medios Diferenciales

6. Qu tipo de bacterias son encontradas con mayor frecuencia en nuestra piel y se pretenden
aislar en esta prctica?
Los ms frecuentes son los Staphylococcus y los Streptococcus.

7. Qu finalidad tiene humedecer el hisopo con solucin salina estril?

Para que al tomar la muestra de la garganta de nuestro compaero no lo contamine con
algunas otras bacterias en el aire y tambin para que el hisopo este limpio y nos permita
realizar la muestra.

8. Por qu no es recomendable utilizar el mismo hisopo para descargar en varias cajas de

petri con los medios ya preparados?
Porque si no habra una envoltura de bacterias, tambin tomando en cuenta que solamente se
prepararon los medios especialmente para las bacterias en las que son adecuadamente para
ellas, tambin se tomara en cuenta la higiene que tendramos al hacer nuestro trabajo.

9. Por qu se recomienda enfriar el asa de platino en el medio de cultivo ya preparado antes

de realiza el sembrado por estras de los microorganismos?
Para que el asa quede estril completamente y no se deshaga lo que es el agar y se pueda
realizar el cultivo adecuadamente.

10. En qu consiste el aislamiento por estras?

Consiste en cargar el asa con la muestra y hacer estras paralelas en la cuarta parte de la
superficie de la placa; se quema el asa, se enfra, se gira la placa 90 y se vuelve a estriar
tocando 3 o 4 veces el rea sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de placa. Por ltimo,
sin quemar el asa, se estra el resto de la superficie sin sembrar.
OBJETIVO GENERAL:
Que el alumno aplique diferentes tcnicas de siembra y aislamiento de cultivos de bacterias y
levaduras en medios slidos. Comprobar la utilidad que tienen los medios de cultivos de uso
general, diferenciales y selectivos.
OBJETIVO ESPECFICO:
Aprender a utilizar y a diferenciar los diferentes tipos de tcnicas de siembra y aislamiento de
cultivos de bacterias, as como la tincin de Gram.
PREGUNTAS DE INVESTIGACIN:
Cules son los diferentes tipos de cultivos? Cules son los tipos de aislamiento de
bacterias?
HIPTESIS
Si realizamos de manera correcta los aislamientos, los cultivos y las tinciones entonces
podremos observar al microscopio los tipos de bacterias que proliferaron en nuestras muestras

MATERIAL, EQUIPO Y SUSTANCIAS:

POR EQUIPO

POR GRUPO

EQUIPO 1: 6 cajas Petri con 15 ml de Agar Sabouraud

1 incubadora a 30C

EQUIPO 2: 6 cajas Petri con Agar Sangre (AS)

1 refrigerador para guardar los

medios de

EQUIPO 3: 6 cajas Petri con 15 ml de Agar Estafilococo

cultivos
EQUIPO 4: 6 cajas Petri con agar 15 ml Eosina Azul de
Metileno (EMB)
2 pares de guantes de asbesto
EQUIPO 5: 24 tubos inclinados con 3 ml Agar Nutritivo escobillones, fibra, detergente y
(AN)
toallas de papel
EQUIPO 6: 24 tubos con Papa Dextrosa (PDA)
-

2 mecheros Bunsen

2 asas de inoculacin

1 piceta con agua destilada

papel estraza, algodn y gasa

1 autoclave con base, canastilla y
vlvula
1 balanza analtica

PROCEDIMIENTO:
Cada equipo preparo el medio de cultivo segn la lista de materiales, los cuales se prepararon,
esterilizaron y guardaron en refrigeracin.
A. Dividir cada una de las cajas Petri por la parte de atrs en cuatro cuadrantes. Esterilizar el
asa con calor en el mechero.
B. Dejar enfriar el asa y tomar la muestra de una colonia.
C. Inocular la muestra haciendo 4 o 5 estras simples muy juntas de lado a lado sobre el primer
cuadrante de la caja, cerrar la caja. Flamear el asa de inoculacin y hacer girar la caja Petri un
cuarto de vuelta.
D. Abrir nuevamente la caja con el asa de siembra esterilizada y fra, tocar la superficie de la
estra recin hecha en un punto alejado del inicio.
Hacer un segundo grupo de estras como en el caso anterior. Realizar el mismo procedimiento
en el tercer cuadrante y en el ltimo cuadrante, sin flamear el asa de siembra har una estra
ms abierta (simple).
F. Las cajas con la base hacia arriba se incuban a 35C durante 24-48 horas.
Siembra en tubos y condiciones de incubacin
A. Despus de la incubacin de los cultivos, seleccionar, de las cajas Petri, la colonia ms
aislada de cada cepa.

B. Transferir con el asa, previamente esterilizada y fra, una pequea muestra de la colonia a
un tubo con medio.
C. Transferir de la misma forma una muestra de la misma colonia inoculando por estra los
tubos inclinados.
D. Incubar los tubos a 35C durante 24-48 hrs. Observar la aparicin de colonias y reportar la
forma de crecimiento de los microorganismos.
RESULTADOS:
Rehidratamos 6.5g del medio en 100ml de
agua destilada. Dejamos reposar de 10 a 15
minutos
y
calentamos
agitando
frecuentemente hasta el punto de ebullicin
y se esteriliz en autoclave.
Terminado el tiempo de la esterilizacin
dejamos enfriar el agar y colocamos en
cajas Petri estriles.

Cada equipo recibi una caja de Petri con agar

sabouraud, agar sangre, agar estafilococo y agar EMB; y 8
tubos, dos con agar nutritivo y dos con agar PDA. De los
cuales los tubos fueron inoculadas con orina y exudado
farngeo (un AN y un PDA para cada muestra) y el resto de
los tubos permanecieron en refrigeracin.
Despus de 3 das de la inoculacin, realizamos los
raspados de las muestras crecidas en los tubos a las cajas
de Petri.
Las muestras en tubos con PDA dieron negativo, por lo cual
no presentaron ningn hongo o levadura.
Mientras en los tubos de AN con exudado farngeo y orina, encontramos colonias con las
cuales llevamos a cabo la siembra en las cajas de Petri.
1. Agar
Sabouraud
Sin colonias

2. Agar Sangre
Colonias en:
- Orina

3. Agar
Estafilococo
Colonias en:
- Orina

4. Agar EMB
Colonias en:
- Orina

Pasados 4 das, durante nuestra segunda sesin tomamos de nuestras cajas de Petri muestras
de las colonias que crecieron, dependiendo del agar. Como podemos observar no tuvimos
cultivos en el agar Saboraud.
AGAR

MUESTRA

COLOR

TAMAO

APARIENCIA

HEMLISIS

EMB

orina

verde

metlico

no

Sangre

orina

Amarillo/verdoso

cremoso

Estafilococo

orina

hueso

cremosa

no

Realizamos una tincin Gram para cada muestra.

Agar Sangre- orina
Estafilococos Gram (+)

Agar EMB - orina

Estafilococo Gram (+)

Agar Estafilococo - orina

Gram (+)

DISCUSIN DE LOS RESULTADOS:

Solo obtuvimos bacterias en los sembrados en Agares sangre, Staphilococo y EMB, los dems
fueron negativos al no presentar crecimiento de ningn patgeno.
Las muestras positivas fueron obtenidas en las zonas designadas para raspados provenientes
de orina, en todas las muestras hubo presencia de Staphilococos gram + debido a que

presentaron una coloracin morada despus de la tincin de gram.

CONCLUSIONES:
El objetivo general de la prctica fue que el alumno aplique diferentes tcnicas de siembra y
aislamiento de cultivos de bacterias y levaduras en medios slidos. Comprobar la utilidad que
tienen los medios de cultivos de uso general, diferenciales y selectivos.
Dicho objetivo se cumpli, hicimos muchos medios de cultivos slidos para diferentes tipos de
bacterias. Tales como PDA, agar sangre, AS, AN y EMB. Cada equipo realiz varios cultivos
diferentes los cuales repartieron a los dems equipos. Posteriormente se hizo una tincion de
gram para poder ver las bacterias al microscopio. En nuestro caso en todos los cultivos
crecieron cepas y todas se observaron al microscopio anotando sus caractersticas.
Gracias a esta prctica perfeccionamos la tcnica de esterilizacin de la zona, diferenciacin
del material que se debe usar en la siembra y como esterilizarlo, siembra de cultivos slidos,
tincin de gram y observar al microscopio.
BIBLIOGRAFA:
Karen C. Carroll, MD. (2010). Principios de microbiologa mdica diagnstica. En Microbiologa
Mdica(705-712 ). Mxico: Mc Graw Hill.
Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. (1983). Prcticas de laboratorio en Microbiologa. Ed. Limusa.
Mxico.