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Recebido em 11/06/05.

Aceito em 19/12/05

Caractersticas fsico-qumicas e qumicas e estudo preliminar


de estabilidade de tinturas preparadas com espcies de arnica
Lychnophora em comparao com Arnica montana

Artigo

Revista Brasileira de Farmacognosia


Brazilian Journal of Pharmacognosy
16(1): 99-104, Jan./Mar. 2006

Renata L. Maciel1, Lgia M. Moreira-Campos2, Breno C. Silva2, Maria G. Lins Brando1*


1

Laboratrio de Farmacognosia, Departamento de Produtos Farmacuticos, Faculdade de Farmcia, Universidade


Federal de Minas Gerais, Av. Antnio Carlos, 6627, 31270-901, Belo Horizonte, MG, Brasil
2
Laboratrio de Controle de Qualidade de Produtos Farmacuticos e Cosmticos, Departamento de Produtos
Farmacuticos, Faculdade de Farmcia, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antnio Carlos, 6627,
31270-901, Belo Horizonte, MG, Brasil
RESUMO: Arnica o nome originalmente atribudo espcie Arnica montana L.(Asteraceae),
planta de origem Europia e utilizada em vrias partes do mundo. A medicina tradicional brasileira
atribui o nome de arnica tambm a outras espcies da famlia Asteraceae, especialmente algumas
do gnero Lychnophora. No presente estudo foram determinadas as caractersticas fsico-qumicas
(organolptica, teor alcolico, densidade, pH, porcentagem de resduo seco) e qumicas (CCD e
CLAE) de tinturas preparadas com as arnicas L. pinaster e L. rupestris, em comparao com a A.
montana. As amostras foram ento submetidas a estudo de estabilidade, a partir da sua permanncia
em estufa climatizada por seis meses e em prateleira por 10 meses. Os resultados demonstraram
alguma semelhana entre as tinturas de espcies de Lychnophora e a A. montana, especialmente
entre seus perfis em CCD. Todas as tinturas sofreram alteraes aps o perodo de permanncia
na estufa, sendo o mais significante a reduo no valor dos teores de resduos secos, indicando
degradao das substncias e perda por volatilizao. O conjunto das anlises permitiu distinguir as
tinturas de cada uma das espcies e confirmou a necessidade de determinar prazos de validade para
as mesmas, devido sua a instabilidade ao longo do tempo.
Unitermos: Lychnophora, Arnica montana, arnica, tintura, qualidade, estabilidade.
ABSTRACT: Physico-chemical and chemical characteristics and stability study of tincture
from the arnicas Lychnophora and Arnica montana. Arnica is the name attributed to Arnica
montana L. (Asteraceae), an european species used in several parts of the world. The Brazilian
traditional medicine also attributes the name of arnica to other species of the Asteraceae, especially
some Lychnophora. In the present study physical-chemical characteristics (organoleptic, alcoholic
graduation, density, pH, percentage of dry residue) and chemical (TLC and HPLC profiles) of
tinctures prepared with L. rupestris, L. pinaster and A. montana has been determined. The samples
had been then submitted the thermal stability testing. The results demonstrated some similarity
between tinctures of the species of Lychnophora and A. montana, especially by their profiles in
CCD. All tinctures altered after six months by thermal stability testing, being the most significant
the reduction of percentage of dry residues, indicating degradation and loss of substances. The
results allowed to distinguish tincture from the different species of arnica and confirmed their
instability on the time.
Keywords: Lychnophora, Arnica montana, arnica, tincture, quality, stability.

INTRODUO
Arnica montana L. (Asteraceae) uma espcie
nativa da Europa extensivamente utilizada na medicina
tradicional daquele continente no tratamento de contuses,
inflamaes, dores musculares e reumticas (Blumenthal,
1998). A droga vegetal, constituda pelos captulos florais
secos, encontra-se inscrita em Farmacopias de vrios
pases, inclusive nas trs primeiras edies da Farmacopia
* E-mail: mbrandao@farmacia.ufmg.br, Tel. + 55-31-34996970

Brasileira (Farmacopia, 1926; 1959; 1977). Estudos


em animais confirmaram a atividade antiinflamatria
de extratos da planta, sendo esta atribuda presena de
lactonas sesquiterpnicas do tipo helenalina (Hall et al.,
1979; Lyss et al., 1997). Essa atividade est relacionada
inibio da ativao do fator de transcripo NF kappa
(Rungeler et al., 1999; Klass et al., 2002). As lactonas
sesquiterpnicas desencadeiam tambm ao citotxica
ISSN 0102-695X

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Renata L. Maciel, Lgia M. Moreira-Campos, Breno C. Silva, Maria G. Lins Brando

contra hepatcitos humanos (Woerdenbag et al., 1994)


e alergnica sobre a pele (Reider et al., 2001; Picman,
1986). Devido a isso, nos Estados Unidos a A. montana
considerada pela FDA como planta perigosa e seu uso
no permitido em medicamentos por via oral (Newall;
Anderson; Phillipson, 2002).
A medicina tradicional brasileira atribui o
nome de arnica tambm a outras espcies da famlia
Asteraceae, entre elas algumas dos gneros Solidago e
Lychnophora. O uso da S. microglossa como arnica,
por exemplo, muito antigo, estando a mesma inscrita
na Farmacopia Brasileira 1a Edio sob o nome de
arnica silvestre (Farmacopia, 1926; Khawali et al.,
1986; Chicourel et al., 1997/1998). J as espcies de
Lychnophora vm sendo mais recentemente muito
usadas e comercializadas. A explorao comercial da
espcie L. ericoides, por exemplo, faz com que a mesma
seja at considerada vulnervel (em perigo de extino)
pela Sociedade Brasileira de Botnica (Cabral; Lopes;
Lopes, 2000). Estudos farmacolgicos confirmaram a
atividade antiinflamatria de extratos de L. ericoides
(Cerqueira, 1997; Borsato et al., 2000) e esta ao foi
atribuda presena de flavonides, triterpenos e lactonas
sesquiterpnicas (Borella et al., 1998). Mais recentemente,
Santos et al. (2005) relacionaram a atividade analgsica
de extratos hidroalcolicos da planta presena de cidos
caficos. O conjunto desses resultados parece justificar a
vasta utilizao popular dessa espcie como sucedneo
da A. montana.
Em Minas Gerais, Lychnophora pinaster Mart e
L. rupestris Semir & Leito-Filho so as mais utilizadas
como sucedneo da A. montana. Nessa pesquisa foram
determinadas as caractersticas fsico-qumicas e
qumicas de tinturas fitoterpicas (TF) e homeopticas
(TH) preparadas com essas espcies, em comparao
com outras preparadas com A. montana. As tinturas
foram ento submetidas a estudo de estabilidade, a partir
da sua permanncia em estufa climatizada por seis meses
e em prateleira por 10 meses. O objetivo da pesquisa
foi verificar as semelhanas entre essas preparaes e
verificar as alteraes sofridas com o tempo, de forma a
contribuir no seu controle de qualidade.
MATERIAIS E MTODOS
Material botnico
Arnica montana L.: Captulos florais secos e
rasurados de A. montana foram adquiridas da Farmcia
REFORMHAUS WIELAND KOLLE, Osterode am Harz
(Alemanha), em junho de 2001.
Lychnophora pinaster Mart.: Partes areas de
L. pinaster Mart. foram coletadas no municpio de Catas
Altas (MG), em 2001 e identificada pelo Prof. Joo R.
Stehmann, do Departamento de Botnica do ICB/UFMG
(BHCB 28335).
Lychnophora rupestris Semir & Leito-Filho:
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Rev. Bras. Farmacogn.


Braz J. Pharmacogn.
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Partes areas de L. rupestris Semir & Leito-Filho foram


coletadas no municpio de Cardeal Mota (MG), em
setembro de 2001 e identificadas pelo Prof. Joo Semir
(Unicamp) (BHCB 47135).
Preparao das tinturas
Aps secagem, os materiais foram modos em
moinhos de facas e a granulometria foi determinada.
As tinturas fitoterpicas (TF) foram preparadas por
percolao, em soluo hidroalcolica a 70% (V/V),
na concentrao de 20% (p/V) da droga. As tinturas
homeopticas (TH) foram preparadas por macerao
em soluo hidroalcolica a 70% (V/V) por 20 dias, na
concentrao de 10% (p/V) da droga (Farm. Hom. Bras.
II, 1997).
Caracterizao fsico-qumica e qumica das tinturas
Caracterizao
organolptica:
Foram
observados aspectos relacionados cor, odor e sabor das
amostras.
Teor alcolico: As tinturas foram colocadas em
provetas e o teor alcolico foi determinado por meio de
alcometro.
Densidade: Foi determinada pelo mtodo do
picnmetro.
pH: Foi determinado diretamente em
potencimetro.
Porcentagem de resduo seco total: Exatamente
1 mL de cada tintura foi pipetado e transferido para
cpsulas de porcelana previamente taradas. As cpsulas
foram colocadas em banho-maria at secura e, em
seguida, levadas estufa a 110 C, at peso constante.
Aps resfriarem em dessecador, as cpsulas foram
pesadas, sendo a porcentagem de resduo seco calculada.
Perfil em CCD: Foram determinados perfis para
lactonas sesquiterpnicas (terpenides) e flavonides.
Utilizaram-se placas de vidro prontas de slica-gel
(Merck, Ref 105721) e eluentes e reveladores indicados
por Wagner & Bladt (1996): (i) para terpenides tolueno:
acetato de etila (93:7) e revelao com reagente de
Zimmerman (ZM); (ii) para flavonides acetato de
etila: cido actico: cido frmico: gua (100:11:11:26),
revelao com NP/PEG, seguida de observao no
UV (365 nm). Como referncia, utilizou-se solues
metanlicas de quercetina (5 mg/20 mL) e rutina (5 mg/10
mL), isoladas de Dimorphandra mollis, e de licnofoldeo
(5 mg/20 mL), isolada de L. rupestris.
Identificao dos marcadores qumicos por
CLAE: Teve como objetivo verificar a presena de
quercetina e licnofoldeo nas tinturas e avaliar a variao
no teor das mesmas no decorrer do tempo. Utilizou-se um
cromatgrafo a lquido de alta eficincia HP 1100, com
detector DAD, em 254 nm, e coluna Chromolith RP-18
(Merck). A fase mvel utilizada para a anlise de lactonas
sesquiterpnicas foi uma mistura de metanol e gua

Caractersticas fsico-qumicas e qumicas e estudo preliminar de estabilidade de tinturas preparadas com espcies de arnica Lychnophora

(50:50), em modo isocrtico, com fluxo de 1 mL/min.


Para a separao dos flavonides, foi utilizada eluio em
gradiente (tabela abaixo), utilizando, como solvente A,
acetonitrila contendo 1% de cido fosfrico 3,3 x 10-2 M
e, como solvente B, cido fosfrico 3,3 x 10-4 M (fluxo de
1 mL/min).

Tempo (min)
1
20
30
40
50
55

No tempo zero, todas as tinturas apresentaram


caractersticas organolpticas muito semelhantes,
apresentando colorao avermelhada, odor amadeirado e
sabor ligeiramente amargo. Os teores alcolicos no tempo
zero foram variados sendo os mais baixos observados
para as tinturas preparadas com A. montana (AMTF =
60% e AMTH = 62%) em relao s preparadas com as

Solvente A (%)
95
80
70
20
5
95

Estudo da estabilidade das tinturas

Solvente B (%)
5
20
30
80
95
5

espcies de Lychnophora (LPTF e LRTF = 63%; LRTH


= 65% e LPTH = 67%). Os valores de densidade e pH
tambm variaram no tempo zero entre as tinturas de
cada espcie, sendo que as preparadas com A. montana
apresentaram valores mais elevados (Tabela 1). As TFs
apresentaram porcentagem de resduo seco maiores
que as THs, conforme o esperado, mas LPTF e LPTH
apresentaram porcentagem de resduo muito superiores
as preparadas com as outras espcies (Tabela 1).
A Farmacopia Europia descreve que as flores
da A. montana devem apresentar, no mnimo, 0,4% (p/p) de
lactonas sesquiterpnicas totais, sendo aproximadamente
50% de helenalina e 11,13-diidrohelenalina (European,
2001). Lactonas sesquiterpnicas tambm esto presentes
em espcies de Lychnophora. Das partes areas de L.
pinaster foram identificados 15-desoxigoiazensoldeo
e cido licnofico (Duarte, 1999), enquanto em L.
rupestris foram identificadas licnofolido, eremantolido
C, eremantina, 15-acetoxi-eremantolido C e 15-acetoxy11(13)-diidroeremantina (Cunha et al., 1995). O perfil
cromatogrfico obtido para terpenides em AMTF
e AMTH apresentou quatro manchas cinzas com o
reagente de ZM, nos Rfs 0,2, 0,32, 0,43 e 0,61, atribudas
s lactonas sesquiterpnicas do tipo helenalina e 11,13diidrohelenalina (Wagner; Bladt, 1996). As amostras
LRTF e LRTH apresentaram duas manchas cinzas nos Rfs
0,55 e 0,70, atribudas essa mesma classe de substncias.
Essas manchas no foram detectadas em LPTF e LPTH.

Em estufa climatizada por seis meses: Trezentos


mL de cada tintura, armazenados em frasco mbar e
hermeticamente fechados, foram colocados em estufa
climatizada, temperatura de 30 C e 70% de umidade
relativa (UR). As amostras permaneceram na estufa pelo
perodo mximo de 6 meses. Alquotas de 20 mL de cada
amostra foram retiradas mensalmente, para a realizao
dos ensaios fsico-qumicos e qumicos descritos
anteriormente.
Em vida de prateleira por dez meses: 10,0 mL
de cada uma das tinturas foram armazenados em vidro
mbar e temperatura ambiente. Aps 10 meses as
amostras foram submetidas s mesmas anlises fsicoqumicas e qumicas.
RESULTADOS E DISCUSSO
Nesse estudo, foram determinadas as
caractersticas fsico-qumicas e qumicas de tinturas
fitoterpicas (TF) e homeopticas (TH) preparadas com
flores de Arnica montana (AMTF e AMTH), partes
areas de Lychnophora pinaster (LPTF e LPTH) e L.
rupestris (LRTF e LRTH). Cada uma das caractersticas
foi determinada antes (tempo zero) e aps a permanncia
em estufa climatizada a 30oC e 70% UR, por seis meses,
e em prateleira por 10 meses.

Tabela 1. Caractersticas fsico-qumicas das tinturas fitoterpicas (TF) e homeopticas (TH) preparadas com as trs espcis de
Arnicas no tempo zero, aps seis meses em estufa climatizada e dez meses em prateleira.
TINTURAS

AMTF
LPTF
LRTF
AMTH
LPTH
LRTH

DENSIDADE

0,9203
0,9119
0,9087
0,9197
0,8934
0,8994

TEMPO ZERO
PH
5,66
5,47
5,49
5,61
5,44
5,46

RESDUO SECO
4,78(0,32)
5,99(1,21)
3,34(0,46)
1,97(0,90)
2,45(0,28)
1,60(0,40)

SEIS MESES EM ESTUFA


RESDUO SECO
PH
5,03
2,06(0,18)
5,19
1,95(0,44)
5,09
1,31(0,53)
5,49
1,06(0,30)
5,22
1,25(0,25)
5,28
1,09(0,09)

DENSIDADE

0,9254
0,9176
0,9120
0,9054
0,8999
0,9118

DEZ MESES EM PRATELEIRA


RESDUO SECO
PH
0,9173
5,22
2,71(0,12)
0,9142
5,31
2,35(0.32)
0,9132
5,28
2,35(0,23)
0,9092
5,50
1,33(0,24)
0,8942
5,40
1,21(0,23)
0,9012
5,22
1,25(0,23)

DENSIDADE

AMTF = A. montana tintura fitoterpica, LPTF = L. pinaster tintura fitoterpica, LRTF = L. rupestris tintura fitoterpica, AMTH =
A. montana tintura homeoptica, LPTH = L. pinater tintura homeoptica e LRTH = L. rupestris tintura homeoptica.
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Renata L. Maciel, Lgia M. Moreira-Campos, Breno C. Silva, Maria G. Lins Brando

% de resduo seco

Para os flavonides, a Farmacopia Europia


especifica que o teor em A. montana deve se encontrar
entre 0,4% e 0,6%, sendo a quercetina, campferol,
patuletina e 6-metoxicampferol os mais importantes. A
planta deve conter tambm at 1% de cidos carboxlicos
(clorognico e cafico) e cumarinas, sendo a umbeliferona
e escopoletina as mais importantes (Blumenthal, 1998).
Diversos flavonides e cidos orgnicos tambm
j foram identificados em espcies de Lychnophora,
entre eles cido cafeico, cido isoclorognico, vitexina,
isovitexina e quercetina (Silveira et al., 2005). Na anlise
em CCD no tempo zero, todas as tinturas apresentaram
manchas caractersticas para flavonides nos Rfs 0,50,
e 0,30, alm de duas manchas azuis nos Rfs 0,85 e
0,75, atribudas aos cidos cafico e isoclorognico,
respectivamente (Wagner; Bladt, 1996). LPTF e LPTH
apresentaram perfis cromatogrficos para flavonides
muito semelhantes aos apresentados por AMTF e AMTH,
tendo sido observada a presena de manchas atribudas
rutina e quercetina. Essas substncias no foram
observadas em L. rupestris. As tinturas de L. pinaster
diferenciaram-se das demais por apresentarem manchas
de colorao azul nos Rf 0,60 e amarela no Rf 0,40. Os

resultados demonstram diferenas importantes nos perfis


em CCD para lactonas sesquiterpnicas, flavonides
e cidos orgnicos entre as tinturas de arnica, o que
contribui diretamente na identificao das mesmas no
controle de qualidade.
A estabilidade a capacidade de uma formulao
manter-se dentro das especificaes fsico-qumicas,
microbiolgicas, teraputicas e toxicolgicas ao longo
do tempo. Vrios fatores, como temperatura, umidade,
radiao, luz, ar (especificamente oxignio, dixido de
carbono e vapor de gua), pH, propriedades dos solventes,
recipientes (frascos de acondicionamento) e a presena de
outras substncias qumicas contaminantes podem afetar
qualquer componente de uma frmula farmacutica,
influindo na sua estabilidade (Lachman; Luka; Akers,
1986). Dentre esses, temperatura e umidade so os
principais fatores de instabilidade das formulaes, pois
podem facilmente induzir a degradao das substncias,
mesmo em curto prazo (Brasil, 2001).
No caso das tinturas em anlise, as coloraes,
odores e sabores caractersticos apresentaram-se menos
intensas aps o teste de estabilidade. Este comportamento
foi mais acentuado para as TFs em relao s TMs. As

7
6
5
4

LPTF
AMTF
LRTF
LPTH

3
2
1
0

AMTH
LRTH

meses
Figura 1. Reduo da % de resduo seco ao longo dos seis meses em estufa

0,18
0,16
0,14
0,12

quercetina

0,1

licnofoldeo

0,08
0,06
0,04
0,02
0
1

m eses

Figura 2. Reduo do teor de licnofoldeo em LRTH e quercetina em AMTH ao longo


dos seis meses

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Caractersticas fsico-qumicas e qumicas e estudo preliminar de estabilidade de tinturas preparadas com espcies de arnica Lychnophora

demais alteraes sofridas encontram-se descritas na


Tabela 1. Observou-se, para a maioria das tinturas,
uma tendncia ao aumento da densidade, conseqncia
provvel de perda de certa quantidade de solvente, por
evaporao. J os valores de pH foram reduzidos devido,
provavelmente, degradao qumica das substncias.
As mudanas mais significativas, ao final de cada
perodo, foram as redues das porcentagens de resduo
seco, principalmente aps a permanncia em estufa a 30oC
e 70% (UR) por seis meses (Tabela 1). As porcentagens
de perda de massa para as AMTF, LPTF e LRTF foram
de 56,90%, 67,45% e 69,78%, respectivamente. Para as
THs, as porcentagens foram de 46,18% para AMTH,
48,98% para LPTH e 32,0% para LRTH. A Figura 1
ilustra a perda progressiva de massa ao longo dos seis
meses, para em cada uma das tinturas. Observa-se uma
expressiva perda de massa j a partir do primeiro ms de
armazenamento, revelando a rapidez com que o produto
se degrada, naquelas condies.
Os perfis em CCD, por outro lado, no
apresentaram diferenas significativas ao final dos
testes. Foram observadas as mesmas manchas com as
mesmas intensidades que no tempo zero. A degradao
dos marcadores qumicos foi confirmada nas anlises
em CLAE. Nas condies cromatogrficas utilizadas, a
quercetina apresentou tempo de reteno de cerca de 26
minutos e o licnofoldeo de 9 minutos. A partir da medida
da rea dos picos para quercetina no perfil cromatogrfico
de AMTH e licnofoldeo em LRTH foi possvel observar
o declnio na concentrao dessas substncias ao longo
do tempo. Aps o perodo de seis meses, a porcentagem
de quercetina era de 81% em relao concentrao
original, enquanto a de licnofoldeo chegou a 45,5%
(figura 2). A bibliografia descreve que, no caso dos
produtos fitoterpicos, os constituintes teraputicamente
ativos devem apresentar um limite de 10% em relao
concentrao inicial, aps o estudo da estabilidade
(Bilia et al., 2001; Schmidt; Matthiensen; Willuhn,
2000). Apesar da cintica da degradao no haver
sido determinada nesta pesquisa ( objeto de estudos
posteriores), os resultados obtidos j indicam o quanto as
tinturas de arnica so instveis no decorrer do tempo.
CONCLUSO
Os resultados da pesquisa demonstraram
diferenas importantes entre as tinturas de arnica que
contribuem diretamente na sua identificao e controle de
qualidade. Foi demonstrado tambm que, nas condies
de calor mido, todas as preparaes apresentam
algum problema de estabilidade, j no primeiro ms de
armazenamento. As tinturas armazenadas em condies
de vida de prateleira apresentaram alteraes menos
marcantes. A anlise em CCD no permitiu verificar
a degradao dos marcadores qumicos, que pde ser
detectada apenas por CLAE. O conjunto dos resultados
demonstra a instabilidade de extratos vegetais ao longo

do tempo e confirma a necessidade de se determinar


prazos de validade para os mesmos.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Joo Calegari (USP, Ribeiro Preto)
pela doao da amostra de licnofoldeo utilizada como
padro de referncia, ao Prof. Joo Stehmann (ICB/
UFMG) pela indentificao da amostra de L. pinaster e
ao Prof. Joo Semir (UNICAMP) pela identificao da
amostra de L. rupestris.
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